Name: Profilowanie wrażliwości na terapie celowane w organoidach pochodzących od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca z mutacją EGFR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Poznaj metodę oceny wrażliwości na leki w organoidach pochodzących od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca z mutacją EGFR. Technika ta umożliwia testowanie terapii celowanych i kombinowanych w celu poprawy leczenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy laboratoriom Jeroena P Roose'a (UCSF) i Calvina J Kuo (Stanford) za ich wkład w hodowlę organoidów i rozwój protokołu. Ponadto dziękujemy Oghenekevwe M. Gbenedio (Roose lab, UCSF) za protokoły i wkład w ustalenie próbki. Ten projekt badawczy został przeprowadzony przy wsparciu NIH [U54CA224081]. F. Haderk był wspierany przez stypendium podoktorskie Mildred Scheel z German Cancer Aid.

W przypadku badań z udziałem ludzi uzyskano świadomą zgodę, a pobieranie tkanek przeprowadzono zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komisję Bioetyczną (Internal Review Board) UCSF (IRB, nr protokołu: #13-12492 lub CC#17-23309). Ustanowienie kultur organoidów z zanonimizowanych próbek klinicznych przeprowadzono we współpracy z partnerami badawczymi zgodnie z wcześniej opisanymi metodami13,14,15,16. Kultury organoidów pobierano do dalszej hodowli oraz eksperymentów z eskalacją dawek leków w trzecim pasażu lub później. Wszystkie poniższe procedury przeprowadzono w warunkach aseptycznych w laboratorium hodowli tkanek ssaków.
<img alt="Schemat zanurzonej hodowli organoidów BME2, eskalacja dawki leku oraz odczyt 3D CTG do analizy wzrostu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63039/63039fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat protokołu przedstawiający przebieg prac i krytyczne etapy techniki. (A) Schemat eksperymentalny obejmujący wysiew organoidów w formacie 96-dołkowym, traktowanie narastającymi dawkami leku w 7. dniu po wysiewie oraz pomiar przeżywalności komórek metodą luminescencyjną w 5. dniu po traktowaniu przy użyciu czytnika płytek ELISA. (B) Obraz przykładowy EGFRdel19dodatni pod kątem TH107 i EGFRL858RKultury organoidów NSCLC TH330 dodatnie pod kątem [insert missing term]. Przedstawiono kultury pierwotne, komórki w momencie wysiewu (dzień 0) oraz organoidy w momencie rozpoczęcia leczenia, 7 dni po wysiewie (dzień 7). Pasek skali = 100 µmZmiany średnicy organoidów w początkowym 7-dniowym okresie hodowli zostają ilościowo określone i wskazują na &gt;2-krotny wzrost rozmiaru organoidów. Relatywne zmiany krotności rozmiarów w 7. dniu w porównaniu z średnim rozmiarem w dniu 0 przedstawiono pod reprezentatywnymi obrazami. Dla TH107 zaobserwowano 2,38-krotną zmianę w ciągu 7 dni, co wskazuje na czas podwojenia wynoszący 5,88 dnia (141,12 h). Dla TH330 zaobserwowano 2,41-krotną zmianę w ciągu 7 dni, co wskazuje na czas podwojenia wynoszący 5,81 dnia (139,42 h). Ilościowe określenie zmian rozmiaru organoidów oraz ocena statystyczna zostały przedstawione (po prawej). Istotność statystyczną obliczono za pomocą nieparzystego testu t, p &lt; 0.0001. (C) Schemat potraktowania w celu eskalacji dawki leku w formacie 96-dołkowej płytki z organoidami. Wskazano liczbę powtórzeń technicznych oraz przykładowe dawki, w tym kontrolę negatywną. Schematy zostały przygotowane za pomocą BioRender, internetowego narzędzia do tworzenia ilustracji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/63039fig1v2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
1. Przygotowania eksperymentalne
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę wzrostową (GM) zgodnie z wcześniejszymi opisami15: DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Ham's nutrient mixture F12) z L-alanyl-L-glutaminą, uzupełnioną o 100 U/mL penicyliny/streptomycyny, 10 mM HEPES, 25 nM hRspondin, 1x B27, 5 mM nikotynamidu, 1,25 mM N-acetylocysteiny, 500 nM A-8301, 500 nM SB202190, 50 µg/mL Primocin, 100 ng/mL hNoggin, 100 ng/mL hFGF-10, 25 ng/mL hFGF-7 (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Mieszać delikatnie, aby uniknąć pienienia, i filtrować przez system filtrujący 0,22 µm. Podgrzać pożywkę do 37 °C w czasie do 1 h przed użyciem.</li>
	<li>Przygotować pożywkę o niskiej zawartości czynników wzrostu (LGM) zgodnie z wcześniejszymi opisami16, bez dodatku czynnika wzrostu naskórka (EGF): Advanced DMEM/F-12 (Advanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Ham's nutrient mixture F12), uzupełnioną o 1 mM HEPES, 1x L-alanyl-L-glutaminę, 1x Penicillin-Streptomycin-Glutamine, 10 mM nikotynamidu, 1 mM N-acetylocysteiny, 1x B27, 500 nM A-8301, 100 ng/mL hNoggin. 
	UWAGA: Mieszać delikatnie, aby uniknąć pienienia, i filtrować przez filtr 0,22 µm. Podgrzać pożywkę do 37 °C w czasie do 1 h przed użyciem.</li>
	<li>Rozmrozić BME2 (Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, patrz Tabela materiałów) na lodzie, w temperaturze 4 °C, przez noc.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek i wysiew komórek
<ol>
	<li>Dysocjuj zanurzoną kulturę organoidów w BME2 zgodnie z opisem w następnych krokach (2.1.1-2.1.6).
	<ol>
		<li>Ostrożnie odessaj pożywkę z płytek hodowlanych. Unikaj dotykania zanurzonej kultury organoidów w BME2. 
		UWAGA: Odessanie pożywki można przeprowadzić w preferowany przez badacza sposób, np. za pomocą podstawowego systemu aspiracji cieczy lub pipety. Unikaj dotykania organoidów zatopionych w BME2, ponieważ może to doprowadzić do utraty biomasy organoidów.</li>
		<li>Poddaj zanurzoną kulturę organoidów w BME2 trypsynizacji za pomocą odpowiedniego enzymu rekombinowanego (patrz Tabela materiałów). W formacie płytki 6-dołkowej dodaj 2 mL na dołek. Mechanicznie rozbij BME2 poprzez wielokrotne pipetowanie w górę i w dół. Inkubuj płytki w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórek przez 5 min.</li>
		<li>Przenieś zawiesinę do probówki wirówkowej o pojemności 15 mL i wiruj przy 600 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Ostrożnie odessaj enzym rekombinowany, nie dotykając osadu z organoidów. 
		UWAGA: Mogą pozostać resztki BME2. W razie potrzeby powtórz trawienie enzymatyczne.</li>
		<li>Resuspenduj osad z organoidów w GM (krok 1.1). Dodaj DNazę I 1x 100 U/mL i inkubuj przez 5 min w temperaturze pokojowej (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Wiruj przy 600 x g przez 3 min w temperaturze pokojowej. Ostrożnie odpipetuj pożywkę, nie dotykając osadu z organoidów, i wylej ją. Resuspenduj w świeżej pożywce GM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiew zawiesiny pojedynczych komórek organoidów
	<ol>
		<li>Podgrzej nową czarną płytkę 96-dołkową z przezroczystym dnem w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórek przez 10 min. 
		UWAGA: Stosowanie płytek z przezroczystym dnem jest niezbędne do monitorowania wzrostu organoidów i odpowiedzi na leki.</li>
		<li>Do zliczenia przygotuj rozcieńczenie zawiesiny komórek w PBS w stosunku 1:5 (objętość całkowita: 500 µL) i policz zawiesinę komórek za pomocą analizatora komórek (patrz Tabela materiałów). 
		UWAGA: Pamiętaj o pomnożeniu przez czynnik rozcieńczenia (x 5), aby otrzymać końcowe stężenie komórek. Można zastosować alternatywne metody liczenia, takie jak komora hemocytometryczna. Żywotność komórek należy monitorować za pomocą testu barwienia żywotności (np. błękitem Trypan Blue17). Przy użyciu analizatora komórek żywotność jest oceniana automatycznie. Żywotność zawiesin pojedynczych komórek organoidów oceniona przez analizator komórek powinna wynosić ≥95% (Rysunek uzupełniający 1).</li>
		<li>Oblicz objętość zawiesiny komórek potrzebną do wysiewu w eksperymencie. 
		UWAGA: Stężenie wysiewu wynosi 1500 komórek/µL BME2, przy zapotrzebowaniu 5 µL BME2 na dołek (liczba całkowita: 7500 komórek/dołek). Dla jednej płytki 96-dołkowej wymagane jest 6 x 10E5 komórek. Obejmuje to wysiew 60 dołków z kopułami organoidów (4,5 x 10E5) oraz nadwyżkę eksperymentalną (obliczenia dla łącznie 80 dołków).</li>
		<li>Przygotuj jedną alikwot zawiesiny komórek w probówce mikrocentryfugowej 1,5 mL na każdą płytkę 96-dołkową zaplanowaną do wysiewu, jeśli w eksperymencie uczestniczy wiele płytek 96-dołkowych. 
		UWAGA: Nadwyżka eksperymentalna i oddzielne alikwoty dla każdej wysiewanej płytki 96-dołkowej są konieczne, aby uwzględnić zwiększony błąd eksperymentalny wynikający z manipulacji BME2.</li>
		<li>Aliquotuj komórki z zawiesiny pojedynczych komórek zgodnie z obliczeniami (krok 2.2.3) po starannym resuspendowaniu poprzez pipetowanie w górę i w dół. Odwiruj komórki przy 600 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usuń pożywkę za pomocą pipety P200, nie dotykając osadu komórkowego. Umieść osad komórkowy na lodzie na krótko (~1 min) i resuspenduj osad w BME2. 
		UWAGA: Pozostałości pożywki mogą naruszyć strukturę i sztywność BME2. Ostrożnie odpipetuj całą pożywkę. Umieść komórki na lodzie na krótko, aby zaadaptować osad komórkowy i umożliwić resuspensję komórek w BME2 bez tworzenia grudek. Przechowuj BME2 stale na lodzie, aby utrzymać je w stanie ciekłym. Dla jednej płytki 96-dołkowej do resuspensji osadu komórkowego potrzeba 400 µL BME2. Resuspenduj osady komórkowe ostrożnie, unikając wprowadzania pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Przechyl podgrzaną czarną płytkę 96-dołkową z przezroczystym dnem w swoją stronę. Wysiej komórki, używając 5 µL zawiesiny komórek na dołek, tworząc kopuły komórkowe na pozycji godziny 6 w każdym dołku (Rysunek 1A). Wysiej kopuły komórkowe w pozostałych wewnętrznych dołkach (kolumny 2-10 i wiersze B-G płytki 96-dołkowej). 
		UWAGA: Podczas pracy z BME2 zaleca się stosowanie pipetowania odwróconego18.</li>
		<li>Nie przesuwaj płytki 96-dołkowej i inkubuj świeżo wysiane kopuły komórkowe w komorze z laminarnym przepływem powietrza do hodowli komórek przez 5 min w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś płytkę do inkubatora do hodowli komórek i inkubuj przez 10 min w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Ostrożnie dodaj 100 µL GM do każdego dołka zawierającego organoidy (kolumny 2-10 i wiersze B-G płytki 96-dołkowej). Do zewnętrznych dołków na obrzeżu płytki dodaj 100 µL PBS.</li>
		<li>Hoduj organoidy zatopione w BME2 w pożywce GM w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórek przez łącznie 7 dni. Regularnie sprawdzaj wzrost organoidów pod mikroskopem świetlnym. 
		UWAGA: Przykładowy postęp wzrostu od momentu wysiewu do dnia rozpoczęcia zabiegu znajduje się na Rysunku 1B oraz w Tabeli uzupełniającej 1.</li>
		<li>Wymień pożywkę raz po 3-4 dniach hodowli: obróć płytkę zgodnie z ruchem wskazówek zegara o 180° (organoidy znajdują się teraz na pozycji godziny 12), ostrożnie odessaj GM z pozycji przeciwnej do kopuły organoidu, używając w razie możliwości pipety wielokanałowej, a następnie dodaj świeżą pożywkę GM.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Leczenie farmakologiczne
<ol>
	<li>Przygotować rozcieńczenia seryjne wybranego leku, np. osimertynibu, w pożywce LGM do traktowania organoidów NSCLC z mutacją EGFR. Należy uwzględnić kontrolę negatywną (pożywka LGM + 0,1% DMSO). Przygotować odpowiednią liczbę alikwotów leku dla wszystkich dawek, uwzględniając liczbę obsianych dołków oraz nadmiar eksperymentalny. 
	UWAGA: W przypadku inhibitorów celowanych zaleca się przygotowanie serii rozcieńczeń obejmującej ≥8 dawek w zakresie od 1 nM do 10 µM.</li>
	<li>Obrócić płytkę z organoidami o 180° zgodnie z ruchem wskazówek zegara (organoidy znajdą się teraz na pozycji godziny 12:00). Ostrożnie odessać pożywkę GM, najlepiej przy użyciu pipety wielokanałowej. 
	UWAGA: Podczas odsysania pożywki GM należy unikać dotykania kopuły organoidu, ponieważ może to doprowadzić do utraty biomasy organoidu i wpłynąć na wyniki.</li>
	<li>Dodać 100 µL kontroli (np. pożywka LGM + 0,1% DMSO) lub roztworu leku do każdego dołka. 
	UWAGA: Schemat traktowania z eskalacją dawek leku w formacie płytki 96-dołkowej znajduje się na Rysunku 1C.</li>
	<li>Inkubować traktowane organoidy w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 5 dni.</li>
</ol>
4. Odczyt za pomocą luminescencyjnego testu przeżywalności
<ol>
	<li>Zbiór i odczyt przeżywalności
	<ol>
		<li>Przeprowadzić analizę przeżywalności zgodnie z Referencją19.
		<ol>
			<li>Rozmrozić odczynnik (patrz Tabela materiałów) przez noc w temperaturze 4 °C. Przed użyciem doprowadzić odczynnik do temperatury pokojowej w kąpieli wodnej przez 30 min i wymieszać poprzez odwracanie naczynia.</li>
			<li>Do każdej studzienki dodać taką samą objętość odczynnika (100 µL na studzienkę). Wymieszać dokładnie, pipetując w górę i w dół, umieszczając końcówkę pipety w miejscu kopuły organoidu. Inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
			<li>Za pomocą pipety wielokanałowej przenieść około 75% (150 µL) lizatu (krok 4.1.1.2) do nowej białej płytki 96-dołkowej z nieprzezroczystym dnem. 
			UWAGA: Przeniesienie 75% lizatów do nowej płytki zapewnia brak pęcherzyków powietrza podczas późniejszego odczytu, nie wpływając na czułość analizy.</li>
			<li>Inkubować przez dodatkowe 25 min w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zarejestrować luminescencję przy użyciu czytnika płytek ELISA (czas całkowania 0,25-1 s/studzienka) (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Zapisać dane w odpowiednim formacie, np. w tabeli danych zawierającej wszystkie surowe odczyty oraz zapis układu płytki i użytych leków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza danych przy użyciu oprogramowania do analizy statystycznej (patrz Tabela materiałów)
	<ol>
		<li>Utworzyć nową tabelę XY i wprowadzić dane w formacie XY: Wiersze (X) stanowią kontrolę negatywną, a następnie rosnące dawki leku, gdzie dawki zapisano jako log [Inhibitor] w stężeniu molowym. Kolumny (Y) to wartości odczytów, w których powtórzenia są ułożone w stosy wraz z kolumnami. 
		UWAGA: Stężenie kontroli negatywnej powinno być wskazane jako wartość minimalna (ponieważ w skali logarytmicznej wartość 0 nie jest możliwa), np. log [Inhibitor], M = -10.</li>
		<li>Znormalizować wartości, wybierając Analyze &gt; Normalize i stosując następujące parametry: normalizacja każdej podkolumny oddzielnie, Y = 0 jako 0 %, „ostatnia wartość w każdej podkolumnie (lub pierwsza, zależnie od tego, która jest większa)” jako 100 %, wyniki w procentach, wykreślić wyniki.</li>
		<li>Dopasować krzywą regresji nieliniowej do znormalizowanych danych, wybierając Analyze &gt; XY analyses &gt; Non-linear regression &gt; Dose response - Inhibition &gt; log (inhibitor) vs . normalized response -- Variable slope.</li>
		<li>Przedstawić wyniki w formie tabeli wartości IC50 uzyskanych po analizie regresji nieliniowej oraz wykresu krzywej odpowiedzi, zawierającego znormalizowane punkty danych jako średnia +/- odchylenie standardowe oraz dopasowaną krzywą regresji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>de Bono, J. S., Ashworth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+cancer+research+into+targeted+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Translating cancer research into targeted therapeutics.</a> Nature. 467 (7315), 543-549 (2010).</li>
<li>Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+heterogeneity+and+resistance+to+cancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).</li>
<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li>
<li>Tiriac, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+profiling+identifies+common+responders+to+chemotherapy+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer.</a> Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).</li>
<li>Ooft, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+can+predict+response+to+chemotherapy+in+metastatic+colorectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients.</a> Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).</li>
<li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li>
<li>Dijkstra, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+establishing+pure+lung+cancer+organoids+limit+their+utility+for+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Challenges in establishing pure lung cancer organoids limit their utility for personalized medicine.</a> Cell Reports. 31 (5), 107588(2020).</li>
<li>Lo, Y. -H., Karlsson, K., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+organoids+for+cancer+biology+and+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cancer%22%5BJournal%5D)">Applications of organoids for cancer biology and precision medicine.</a> Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).</li>
<li>Bivona, T. G., Doebele, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+framework+for+understanding+and+targeting+residual+disease+in+oncogene-driven+solid+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A framework for understanding and targeting residual disease in oncogene-driven solid cancers.</a> Nature Medicine. 22 (5), 472-478 (2016).</li>
<li>Jabs, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+drug+effects+in+patient-derived+cancer+cells+links+organoid+responses+to+genome+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Screening drug effects in patient-derived cancer cells links organoid responses to genome alterations.</a> Molecular Systems Biology. 13 (11), 955(2017).</li>
<li>Tashiro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+ex+vivo+cetuximab+sensitivity+assay+using+three-dimensional+primary+culture+system+to+stratify+KRAS+mutant+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo and ex vivo cetuximab sensitivity assay using three-dimensional primary culture system to stratify KRAS mutant colorectal cancer.</a> PLoS One. 12 (3), 0174151(2017).</li>
<li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+derivation+of+a+living+organoid+biobank+of+colorectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li>
<li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+Modeling+of+the+Tumor+Immune+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li>
<li>Hysenaj, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+infection+studies+in+lung+organoids+identify+TSPAN8+as+novel+mediator%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 infection studies in lung organoids identify TSPAN8 as novel mediator.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).</li>
<li>Salahudeen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+identification+and+SARS-CoV-2+infection+in+human+distal+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids.</a> Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocol+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocol in Immunology. , Appendix 3, Appendix 3B (2001).</li>
<li>Pushparaj, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+the+micropipetting+techniques+in+biomedical+sciences%3A+A+fundamental+prerequisite+in+good+laboratory+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformation%22%5BJournal%5D)">Revisiting the micropipetting techniques in biomedical sciences: A fundamental prerequisite in good laboratory practice.</a> Bioinformation. 16 (1), 8-12 (2020).</li>
<li>Promega Corporation. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellTiter-Glo+3D+Cell+Viability+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Promega+Corporation%22%5BJournal%5D)">CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay.</a> Promega Corporation. , (2021).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+lung+cancer+organoids+as+in+vitro+cancer+models+for+therapeutic+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Patient-derived lung cancer organoids as in vitro cancer models for therapeutic screening.</a> Nature Communication. 10 (1), 3991(2019).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cancer+organoids+analyzed+on+microwell+arrays+predict+drug+responses+of+patients+within+a+week%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Lung cancer organoids analyzed on microwell arrays predict drug responses of patients within a week.</a> Nature Communication. 12 (1), 2581(2021).</li>
<li>Shi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+cultures+as+preclinical+models+of+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Organoid cultures as preclinical models of non-small cell lung cancer.</a> Clinical Cancer Research. 26 (5), 1162-1174 (2020).</li>
<li>Collisson, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+profiling+of+lung+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma.</a> Nature. 511 (7511), 543-550 (2014).</li>
<li>Ramalingam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overall+Survival+with+Osimertinib+in+untreated%2C+EGFR-mutated+advanced+NSCLC%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Overall Survival with Osimertinib in untreated, EGFR-mutated advanced NSCLC.</a> New England Journal of Medicine. 382 (1), 41-50 (2019).</li>
<li>Soria, J. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osimertinib+in+untreated+EGFR-mutated+advanced+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Osimertinib in untreated EGFR-mutated advanced non-small-cell lung cancer.</a> New England Journal of Medicine. 378 (2), 113-125 (2017).</li>
<li>Rotow, J., Bivona, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+and+targeting+resistance+mechanisms+in+NSCLC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Understanding and targeting resistance mechanisms in NSCLC.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (11), 637-658 (2017).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+AXL+kinase+causes+resistance+to+EGFR-targeted+therapy+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Activation of the AXL kinase causes resistance to EGFR-targeted therapy in lung cancer.</a> Nature Genetics. 44 (8), 852-860 (2012).</li>
<li>Kanda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erlotinib+resistance+in+lung+cancer+cells+mediated+by+integrin+%CE%B21%2FSrc%2FAkt-driven+bypass+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Erlotinib resistance in lung cancer cells mediated by integrin β1/Src/Akt-driven bypass signaling.</a> Cancer Research. 73 (20), 6243-6253 (2013).</li>
<li>Bruun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+from+multiple+colorectal+cancer+liver+metastases+reveal+moderate+intra-patient+pharmacotranscriptomic+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids from multiple colorectal cancer liver metastases reveal moderate intra-patient pharmacotranscriptomic heterogeneity.</a> Clinical Cancer Research. 26 (15), 4107-4119 (2020).</li>
<li>Hafner, M., Niepel, M., Chung, M., Sorger, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+rate+inhibition+metrics+correct+for+confounders+in+measuring+sensitivity+to+cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Growth rate inhibition metrics correct for confounders in measuring sensitivity to cancer drugs.</a> Nature methods. 13 (6), 521-527 (2016).</li>
<li>Yuki, K., Cheng, N., Nakano, M., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+tumor+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Organoid models of tumor immunology.</a> Trends in Immunology. 41 (8), 652-664 (2020).</li>
<li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> New England Journal of Medicine. 366 (10), 883-892 (2012).</li>
<li>McGranahan, N., Swanton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+therapeutic+impact+of+intratumor+heterogeneity+in+cancer+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Biological and therapeutic impact of intratumor heterogeneity in cancer evolution.</a> Cancer Cell. 27 (1), 15-26 (2015).</li>
<li>Rambow, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+minimal+residual+disease-directed+therapy+in+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Toward minimal residual disease-directed therapy in melanoma.</a> Cell. 174 (4), 843-855 (2018).</li>
<li>Marine, J. C., Dawson, S. J., Dawson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-genetic+mechanisms+of+therapeutic+resistance+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Non-genetic mechanisms of therapeutic resistance in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 20 (12), 743-756 (2020).</li>
<li>Frismantas, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+drug+response+profiling+detects+recurrent+sensitivity+patterns+in+drug-resistant+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ex vivo drug response profiling detects recurrent sensitivity patterns in drug-resistant acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 129 (11), 26-37 (2017).</li>
<li>Drusbosky, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+response+to+BET+inhibitors+using+computational+modeling%3A+A+BEAT+AML+project+study%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Research%22%5BJournal%5D)">Predicting response to BET inhibitors using computational modeling: A BEAT AML project study.</a> Leukemia Research. 77, 42-50 (2019).</li>
</ol>

T.G.B. jest doradcą Array Biopharma, Revolution Medicines, Novartis, AstraZeneca, Takeda, Springworks, Jazz Pharmaceuticals, Relay Therapeutics, Rain Therapeutics, Engine Biosciences oraz otrzymuje fundusze na badania od Novartis, Strategia, Kinnate i Revolution Medicines.

Niniejszy manuskrypt rozwija i opisuje znormalizowany protokół oceny wrażliwości leku w modelach 3D PDO pochodzących z NSCLC. Oprócz badań nad wrażliwością na leki, potrzebna jest dalsza charakterystyka dostępnych modeli organoidowych w celu określenia podstawowych przyczyn różnic we wrażliwości na leki. Może to obejmować profilowanie genetyczne organoidów i próbek od pacjentów oraz inne analizy dostępne dla organoidów, takie jak barwienie immunohistochemiczne dla markerów różnicowania oraz ogólne biomarkery i fizjologia sygnalizacji komórkowej 13,29.
Krytyczne kroki w protokole Protokół opisany w niniejszym dokumencie zapewnia ustandaryzowany przepływ pracy, który umożliwia dokładne i powtarzalne analizy wrażliwości leków, jeśli jest uważnie przestrzegany. Szczególną ostrożność należy zwrócić na następujące etapy: trawienie trypLE i DNAzy I podczas wytwarzania zawiesin jednokomórkowych, wysiewanie zawiesin jednokomórkowych w BME2, monitorowanie wzrostu organoidów do momentu leczenia, zmiany pożywki oraz rozerwanie i liza organoidów osadzonych w BME2 podczas odczytu przeżycia komórek na podstawie luminescencji. (1) Podczas gdy dodatkowe trawienie DNAzy I po dysocjacji organoidów opartej na Tryple nie jest niezbędne do rozszerzania modeli organoidów podczas regularnej konserwacji hodowli, trawienie DNAzy I nie powinno być pomijane podczas wysiewu do eksperymentów eskalacji leków, ponieważ zapewnia lepsze rozdzielenie klastrów organoidów na zawiesiny jednokomórkowe i dokładne liczenie komórek. (2) Wysiew zawiesiny jednokomórkowej w BME2 stanowi krytyczny krok, biorąc pod uwagę krzepnięcie BME2 w temperaturze pokojowej. W związku z tym należy wysiać maksymalnie 1-2 rzędy jednocześnie, a próbki należy umieścić na lodzie przed wysianiem dodatkowych rzędów. Należy zauważyć, że komórki muszą być pipetowane w górę i w dół, gdy wysiew jest kontynuowany, aby umożliwić jednorodną zawiesinę komórek. (3) Wzrost organoidów musi być dokładnie monitorowany podczas 7-dniowej ekspansji od siewu do zaprawienia. Przykład oczekiwanego rozwoju przedstawiono na rysunku 1B i w tabeli uzupełniającej 1. Warto zauważyć, że ocena zmian wielkości organoidów za pomocą mikroskopii jasnego pola i analizy obrazu, jak pokazano na rysunku 1B , może pozwolić na precyzyjną ocenę różnic we wzroście organoidów i czasach podwajania. Podwojenie czasu może mieć wpływ na reakcje na leki, co zostało ostatnio omówione w literaturze30. Jeżeli tempo wzrostu organoidów znacznie przekracza przedstawiony przykład, można rozważyć krótszy czas ekspansji do rozpoczęcia leczenia i krótszy czas trwania leczenia. (4) Ponadto należy zachować szczególną ostrożność przy zmianie pożywki, aby uniknąć zasysania organoidów. Pozycja wysiewu organoidów osadzonych w BME2 w pozycji godziny 6 pozwala na bezpieczne zasysanie pożywki, gdy płytki są obracane zgodnie z ruchem wskazówek zegara o 180°, a pożywka jest zasysana w pozycji przeciwnej do organoidów. (5) Wreszcie, dokładna liza organoidów osadzonych w BME2 podczas odczytu przeżycia jest niezbędna do uzyskania dokładnych wyników. Zgodnie z instrukcjami producenta, próbki powinny być wielokrotnie pipetowane w górę i w dół, najlepiej przy użyciu niefiltrowanych końcówek, aby zapewnić prawidłową lizę. Czasy inkubacji powinny być przestrzegane zgodnie z opisem. Co więcej, przeniesienie 75% lizatu (zamiast całkowitej objętości) na białą, nieprzezroczystą płytkę 96-dołkową w celu ostatecznego odczytu za pomocą czytnika płytek ELISA pozwala na odpowiednią ocenę, ponieważ zapewnia to taką samą objętość w każdym dołku i brak pęcherzyków powietrza, które można wprowadzić przez energiczne pipetowanie.
Warto zauważyć, że profilowanie odpowiedzi na leki w kulturach organoidów osadzonych w BME2 może wykazywać wyższe odchylenie standardowe niż obserwowane w zwykłych hodowlach linii komórkowych (Figura 2, Figura 3A). Wyższe odchylenie standardowe opiera się na kilku czynnikach, w tym zwiększonym prawdopodobieństwie niewielkich zmian w wysiewie podczas pracy z BME2 oraz różnicach w tempie wzrostu poszczególnych organoidów w dołkach w początkowym 7-dniowym okresie wzrostu. W związku z tym należy wysiać równe lub więcej niż cztery kontrpróby techniczne na stężenie leku.
Co najważniejsze, należy dokładnie ocenić obecność komórek nowotworowych będących nosicielami mutacji onkogennej i ograniczone zanieczyszczenie przez normalne komórki nabłonka dróg oddechowych. Wyzwania związane z powstawaniem NSCLC mogą sprzyjać wzrostowi normalnych komórek nabłonka dróg oddechowych7. Profilowanie liczby kopii lub podejścia oparte na PCR i sekwencjonowaniu w celu potwierdzenia obecności onkogennych mutacji napędowych są metodami z wyboru w celu zapewnienia jakości kultur organoidów NSCLC.
Modyfikacje i rozwiązywanie problemów z metodą Pożywki i odpowiednie czynniki wzrostu dodawane do podstawowych roztworów pożywek mogą znacząco wpływać na odpowiedź na leki na celowane inhibitory. Aktywują receptory omijające i szlaki sygnałowe, które wpływają i ograniczają odpowiedź na leki (np. FGF, HGF, EGF)26. Podczas gdy bogata w czynniki wzrostu i dostosowana pożywka może być optymalna dla rozszerzania hodowli organoidów, eskalacja leku i oceny wrażliwości powinny być przeprowadzane w pożywce o zmniejszonym współczynniku wzrostu, jak opisano powyżej. Opiera się to na wewnętrznych doświadczeniach porównujących różne preparaty pożywek i dane dotyczące odpowiedzi na leki (ryc. 3C). Podczas gdy roztwory pożywek mogą wpływać na stopień wrażliwości na niektóre leki i mogą przesuwać wartości IC50, silne fenotypy wrażliwości lub oporności są widoczne niezależnie od składu pożywki (Figura 3C,D). Ponadto zaleca się ogólną spójność formułowania pożywek i profilowanie reakcji na leki w kulturach organoidów, a także konieczne jest wysiewanie równych lub więcej niż czterech kontrprób technicznych na stężenie. Jest to szczególnie ważne w przypadku zakresów porównawczych czułości vs. odporność na Inhibitor będący przedmiotem zainteresowania.
Ograniczenia metody Przedstawiony tutaj protokół opisuje wrażliwość modeli organoidów nowotworowych NSCLC 3D na celowane inhibitory podczas hodowli komórek nowotworowych pochodzących od pacjenta. Dodatkowe eksperymenty, w tym analiza farmakodynamiczna dotycząca hamowania szlaku i analiza sekwencjonowania pod kątem obecności onkogenu napędowego i mutacji wtórnych, są potrzebne do szczegółowej charakterystyki oporności i wrażliwości na leki. Co więcej, czynniki postronne, takie jak bodźce mikrośrodowiskowe pochodzące z interakcji lub czynniki wydzielane przez nienowotworowe komórki postronne w mikrośrodowisku guza, nie są brane pod uwagę, a nowe protokoły są potrzebne w przypadku prób kohodowli modeli organoidów z komórkami odpornościowymi lub zrębowymi. Ostatnie prace zwróciły uwagę na wykorzystanie modeli organoidowych do podsumowania interakcji mikrośrodowiska guza i profilowania odpowiedzi na inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych, takie jak leczenie anty-PD-L113,31.
Znaczenie metody w odniesieniu do istniejących/alternatywnych metod Modele 3D organoidów nowotworowych podsumowują różnorodność genetyczną i determinanty odpowiedzi na leczenie obecne w pierwotnym guzie 4,5,6. Warto zauważyć, że niejednorodność przestrzenna i czasowa może sprzyjać ewolucji guza, a równoległe pojawianie się i sekwencyjny rozwój subklonów guza mogą wystąpić32,33. Niejednorodność wewnątrz guza jest istotna dla selekcji bardziej odpornych komórek nowotworowych pod presją terapeutyczną 9,34,35. Przedstawiony tutaj protokół pozwala na szybką ocenę wrażliwości na leczenie celowanymi inhibitorami w próbkach bliskich pacjentowi. W związku z tym modele organoidowe mają przewagę nad bardziej konwencjonalnymi jednorodnymi modelami linii komórkowych pozbawionymi różnorodności genetycznej lub długoterminowymi badaniami z wykorzystaniem linii komórkowych lub ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów. Co więcej, obecny protokół umożliwia skalowanie do wielu ramion leczenia i podejść do leczenia skojarzonego z niewielkimi ograniczeniami dotyczącymi kosztów i zdolności analitycznych. W związku z tym, dodanie drugiego interesującego leku w ustalonej dawce przy jednoczesnej eskalacji pierwotnie docelowego inhibitora i porównanie go z eskalacją pierwotnie ukierunkowanego inhibitora pozwala na efektywną ocenę potencjalnych efektów kombinatorycznych i przy minimalnym wymaganym dodatkowym wzroście biomasy (Rysunek Uzupełniający 3). W porównaniu z ocenami opartymi na obrazowaniu stosowanymi do monitorowania rozwoju organoidów i odpowiedzi na leki, opisany tutaj test przeżycia komórek oparty na luminescencji ma podobną czułość przy minimalnym sprzęcie i wymaganym szkoleniu.
Znaczenie i potencjalne zastosowania metody w poszczególnych obszarach badawczych Opracowanie ustandaryzowanego potoku, który pozwoli na tworzenie modeli organoidów nowotworowych na podstawie próbek pobranych od pacjentów, a następnie profilowanie wrażliwości na leki, ma znaczny potencjał zastosowań klinicznych. Profilowanie farmakologiczne ex vivo zyskało uznanie w wykrywaniu podatności i cech związanych z opornością w nowotworach, korelując z odpowiedzią na leczenie u pacjentów36,37. Co istotne, profilowanie ex vivo wrażliwości na leki może pomóc w doborze leczenia w klinice i projektowaniu racjonalnych terapii skojarzonych zajmujących się mechanizmami oporności. Ogólnie rzecz biorąc, podejście to może pomóc w umożliwieniu udoskonalenia spersonalizowanych strategii terapii molekularnej lub skojarzonych schematów leczenia. To ostatnie może pomóc we wczesnym określeniu tolerancji i oporności na leki oraz pogłębieniu odpowiedzi klinicznej w celu poprawy wyników leczenia pacjentów w przyszłości.

Spersonalizowane terapie przeciwko czynnikom onkogennym zrewolucjonizowały leczenie raka, poprawiając przeżywalność pacjentów i zmniejszając skutki uboczne związane z leczeniem1. Ostatnie postępy w diagnostyce molekularnej i technologiach sekwencjonowania uwypukliły złożoność ludzkich nowotworów, przy czym niejednorodność przestrzenna i czasowa wpływa na odpowiedź na leczenie2. Rekapitulacja tych subklonalnych różnic w modelach hodowli komórkowych przez długi czas ograniczała się do badania wybranych zmian będących przedmiotem zainteresowania w skądinąd jednolitych liniach komórkowych. Nowo opracowane modele 3D PDO generowane z biopsji guza lub chirurgicznych resekcji guza pozwalają na lepsze odwzorowanie złożoności komórkowej i przesłuchów sygnałowych w tkance nowotworowej pochodzącej od pacjenta3. W związku z tym udało się wygenerować organoidy nowotworowe pochodzące z raka przewodu pokarmowego i trzustki, które rekapitulują różnorodność genetyczną i determinanty odpowiedzi na leczenie4,5,6. W przypadku niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC) uznaje się wyzwania związane z rozwojem i zakładaniem organoidów, a optymalizacja technik hodowli i selektywnych czynników pożywek jest konieczna, aby umożliwić szersze i bardziej systematyczne stosowanie PDO NSCLC w przyszłości7,8.
Opracowanie terapii kombinatorycznych ukierunkowanych na resztkowe komórki nowotworowe, które wytrzymują początkowe leczenie farmakologiczne, jest niezbędne do zahamowania rozwoju oporności i ostatecznie do poprawy przeżywalności pacjentów9. Biorąc pod uwagę złożoność architektoniczną kultur organoidów, klasyczne parametry odpowiedzi na lek muszą zostać zoptymalizowane, aby umożliwić dokładne i powtarzalne testowanie wrażliwości na leki. Odczyty oparte na obrazowaniu10,11 oraz klasyczne testy żywotności komórek mierzące obfitość komórkowego ATP6,12, wśród innych technik, są dostępne do profilowania odpowiedzi na leki w kulturach PDO. W tym miejscu opracowujemy i opisujemy znormalizowany protokół oceny wrażliwości leku na terapię celowaną w stosunku do znanych czynników klinicznych w modelach niedrobnokomórkowego raka płuca PDO.

<table><tbody><tr><td>Probówki 1,5 ml Probówki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>wirówkowe 15 ml</td></tr><tr><td>500 ml System filtrów próżniowych/butelek do przechowywania, 0,2 i mikro; m Pore 33,2 cm2 Nylonowa membrana</td><td>Corning</td><td>430773</td><td>dla obu mediów</td></tr><tr><td>96-Well, poddane hodowli komórkowej, płaska, przezroczysta płytka z czarnym dnem</td><td>Corning</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>96-Well, poddana hodowli komórkowej, solidna biała mikropłytka z płaskim dnem</td><td>Corning</td><td>3917</td><td></td></tr><tr><td>A-8301</td><td>Tocris Bioscience</td><td>293910</td><td>dla obu pożywek</td></tr><tr><td>Zaawansowany DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td>dla LGM</td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>12587010</td><td>dla obu mediów</td></tr><tr><td>BioRender 2021</td><td>https://biorender.com/</td><td></td> <td>oprogramowanie do ilustracji naukowych</td></tr><tr><td>online BME2 (ekstrakt z błony podstawnej Cultrex RGF, typ 2)</td> <td>R& Systemy D</td><td>353301002</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli komórkowych (37 &deg; C, 5% CO2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Test żywotności komórek CellTiter-Glo 3D</td> Odczynnik do odczytu <td>Promega</td><td>G9682</td><td>3D-CTG</td></tr><tr><td>Wirówka mieszcząca 15 ml probówek</td><td></td><td></td><td></td>wirówkowych</tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza I (DNAza I)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18047019</td><td></td></tr><tr><td>Buforowany fosforanem roztwór soli Dulbecco</td><td></td><td>Corning MT21031CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, suplement GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10565018</td><td>dla GM</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>dla oprogramowania LGM</td></tr><tr><td>GraphPad Prism (wersja 9.2.0)</td><td>Oprogramowanie do analizy statystycznej</td> <td>GraphPad</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>dla obu mediów</td></tr><tr><td>hFGF-10</td><td>PeproTech</td><td>100-26-100ug</td><td>dla GM</td></tr><tr><td>hFGF-7</td><td>PeproTech</td><td>100-19-50ug</td><td>dla GM</td></tr><tr><td>hNoggin</td><td>PeproTech</td><td>120-10C-100ug</td><td>dla obu mediów</td></tr><tr><td>hRspondin</td><td>PeproTech</td><td>120-38-100ug</td><td>dla końcówek</td></tr><tr><td>do pipet GM o niskiej retencji, 20 i mikro; L (P20)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2149P-05-HR</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet o niskiej retencji, 200 &mikro; L (P200)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2069-05-HR</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet o regularnej długości, 1000 i mikro; L (P1000)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2179-HR</td><td></td></tr><tr><td>Wielokanałowa pipeta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-acetylocysteina</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-424-777</td><td>dla obu mediów</td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636-100G</td><td>dla obu mediów</td></tr><tr><td>Ozymertynib</td><td>Selleck Checm</td><td>S7297</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td>dla LGM</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Cytiva HyClone</td><td>SV30010</td><td>do</td></tr><tr><td>pipet GM (różne rozmiary)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Sprzęt SpectraMax M5</td><td>, można stosować alternatywne czytniki</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>dla GM</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Selleck Chem</td><td>S1077</td><td>dla GM</td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme</td><td>Gibco</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>Pompa próżniowa i rurki Analizator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>komórek Vi-CELL XR Analizator</td><td>komórek</td> <td>Beckman Coulter</td><td>Vi-CELL XR</td></tr></tbody></table>

profilowanie wrażliwości na terapie celowane w organoidach pochodzących od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca z mutacją egfr

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

Nowatorskie hodowle organoidów nowotworowych 3D pochodzące z klinicznych próbek pacjentów stanowią ważny system modelowy do oceny niejednorodności wewnątrzguzowej i odpowiedzi na leczenie ukierunkowanych inhibitorów w raku. Pionierskie prace nad nowotworami przewodu pokarmowego i trzustki uwypukliły potencjał organoidów pochodzących od pacjentów (PDO) jako systemu hodowli bliższej pacjentowi, przy czym pojawia się coraz więcej modeli. Podobnie, prace nad innymi typami nowotworów koncentrowały się na tworzeniu modeli organoidowych i optymalizacji protokołów hodowli. Warto zauważyć, że trójwymiarowe modele organoidów nowotworowych utrzymują złożoność genetyczną oryginalnych próbek guza, a tym samym przekształcają dane sekwencjonowania pochodzące z guza na leczenie za pomocą genetycznie poinformowanych terapii celowanych w warunkach eksperymentalnych. Co więcej, PDO mogą sprzyjać ocenie racjonalnych terapii skojarzonych w celu przezwyciężenia adaptacji nowotworów związanej z opornością w przyszłości. Ten ostatni koncentruje się na intensywnych wysiłkach badawczych nad niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC), ponieważ rozwój oporności ostatecznie ogranicza skuteczność leczenia celowanych inhibitorów. Wczesna ocena mechanizmów terapeutycznie ukierunkowanych za pomocą PDO z niedrobnokomórkowym rakiem płuca może pomóc w opracowaniu racjonalnego leczenia skojarzonego. Niniejszy manuskrypt opisuje znormalizowany protokół oceny wrażliwości leków na leki na celowane inhibitory w 3D PDO pochodzących z NSCLC, z potencjalną możliwością adaptacji do leczenia skojarzonego i innych metod leczenia.

Odnotowano znaczne trudności w tworzeniu organoidów NSCLC7. W związku z tym, niezwykle interesujące są niedawne prace dotyczące tworzenia organoidów raka płuc i wykorzystywania ich w testach leczenia farmakologicznego20,21,22. Mutacje EGFR występują w 11,3% przypadków NSCLC23. Leczenie celowane inhibitorami EGFR stanowi opcję leczenia pierwszego rzutu w NSCLC z mutacją EGFR i poprawiło ogólną przeżywalność oraz bezpieczeństwo terapii u pacjentów24. W niniejszej pracy określono wrażliwość na zatwierdzony przez FDA inhibitor tyrozynowej kinazy EGFR, osimertynib24,25, w organoidach NSCLC z mutacją EGFR. Organoidy NSCLC z mutacją EGFR wyhodowano z preparatów z resekcji chirurgicznej lub biopsji guza pacjentów z NSCLC, a obecność wskazanej mutacji onkogennej potwierdzono za pomocą sekwencjonowania DNA. Zgodnie z powyższym opisem, modele organoidów NSCLC z mutacją EGFR poddano działaniu rosnących dawek osimertynibu, a żywotność PDO oceniono za pomocą luminescencyjnego odczytu przeżywalności komórek pięć dni po rozpoczęciu leczenia. Podczas gdy organoidy TH107 dodatnie pod kątem mutacji EGFR (EGFRdel19) wykazały wrażliwość na leczenie osimertynibem z połową maksymalnego stężenia hamującego (IC50) wynoszącą 56 nM (Rycyna 2A), organoidy TH116 dodatnie pod kątem mutacji EGFR (EGFRL858R) były oporne na leczenie osimertynibem z IC50 powyżej 1 µM (Rycina 2B). Wrażliwości NSCLC TH107 dodatniego pod kątem EGFRdel19 towarzyszyły istotne zmiany transkrypcyjne, w tym zmniejszenie ekspresji sygnatur genów związanych z cyklem komórkowym oraz wzrost ekspresji sygnatur genów związanych z apoptozą (Rycina uzupełniająca 2A,B). Jako punkt odniesienia przedstawiono dane dotyczące odpowiedzi wrażliwej linii komórkowej NSCLC PC9 dodatniej pod kątem EGFRdel19 (Rycina 3A,B). Ostatnia z nich obejmuje analizę przeżywalności przy rosnących dawkach osimertynibu za pomocą 2D luminescencyjnego testu przeżywalności (Rycina 3A) oraz badanie supresji sygnalizacji na poziomie szlaku EGFR-MAPK za pomocą Western blot (Rycina 3B). Ogólnie te dane podkreślają dokładność niniejszego protokołu w określaniu odpowiedzi na leki i rozróżnianiu wrażliwych od opornych modeli PDO w NSCLC. Dalsze analizy organoidów TH116 dodatnich pod kątem EGFRL858R oraz dostępnych preparatów klinicznych są niezbędne do określenia możliwych zmian związanych z opornością.
<img alt="Wykres dawka-odpowiedź; mutacja EGFR; żywotność w funkcji stężenia osimertynibu; analiza IC50." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63039/63039fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Krzywa odpowiedzi na leczenie modeli organoidów NSCLC z mutacją EGFR przy zwiększających się dawkach osimertynibu. (A) Odpowiedź na osimertynib w wrażliwym modelu organoidów NSCLC TH107 z obecnością EGFRdel19. (B) Odpowiedź na osimertynib w opornym modelu organoidów NSCLC TH116 z obecnością EGFRL858R. Punkty danych przedstawiono jako wartości znormalizowane ukazujące średnią +/- odchylenie standardowe, z dopasowaną nieliniową krzywą regresji. TH107, n = 6 powtórzeń technicznych na punkt danych. TH116, n = 4 powtórzenia techniczne na punkt danych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/63039fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy IC50 dla ozymertynibu i analiza blot: żywotność komórek i analiza białek w badaniu mutacji EGFR." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63039/63039fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Dane porównawcze odpowiedzi na leczenie ozymertynibem w wrażliwej linii komórkowej NSCLC z mutacją EGFR oraz w modelach organoidów hodowanych w różnych mediach. (A) Odpowiedź na ozymertynib w wrażliwej linii komórkowej NSCLC PC9 z pozytywnym wynikiem dla EGFRdel19, określona za pomocą standardowego testu 2D-CTG. (B) Supresja sygnalizacji w komórkach PC9 po dwudniowym leczeniu ozymertynibem (2 µM). (C) Odpowiedź na ozymertynib w wrażliwym modelu hodowli organoidów NSCLC TH330 z pozytywnym wynikiem dla EGFRL858R w mediach LGM i GM. (D) Odpowiedź na ozymertynib w opornym modelu organoidów NSCLC AZ021 w mediach LGM i GM. Potwierdzenie onkogennej mutacji EGFRL858R w AZ021 nie powiodło się, co może być przyczyną braku odpowiedzi na ozymertynib. Dla A oraz C-D punkty danych przedstawiono jako wartości znormalizowane wykazujące średnią +/- odchylenie standardowe, z dopasowaną do danych krzywą regresji nieliniowej. PC9, n = 3 powtórzeń technicznych na punkt danych. TH330, n = 5 powtórzeń technicznych na punkt danych. AZ021, n = 6 powtórzeń technicznych na punkt danych. W celu określenia istotności statystycznej przeprowadzono test rang Wilcoxona na znormalizowanych danych. Dla TH330 (C), LGM vs. GM, ** p = 0.0078. Dla AZ021 (D), LGM vs. GM, ns p = 0.0742. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/63039fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Rysunek uzupełniający 1: Reprezentatywne wyniki analizy komórkowej w celu zliczania i oceny żywotności modeli organoidów z mutacją EGFR. Oznaczenia TH107 i TH107BC odnoszą się do różnych modeli organoidów, a A i B do powtórzeń biologicznych. Dla każdego modelu i powtórzenia biologicznego zliczono trzy powtórzenia techniczne; wszystkie wykazały żywotność ≥95%. Po prawej stronie przedstawiono reprezentatywny obraz z procesu zliczania komórek, wykazujący wysoką żywotność i dysocjację do pojedynczych komórek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/Suppl-Fig1-R2.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 2: Analiza wzbogacenia zbiorów genów (GSEA) z wykorzystaniem danych z sekwencjonowania bulk RNA uzyskanych dla organoidów NSCLC TH107 z mutacją EGFR, porównująca kontrolę nieleczoną (DMSO) oraz komórki traktowane Osimertinibem przez 3 dni (OSI_D3). (A-B) Po zastosowaniu leczenia celowanego wrażliwe komórki ulegną zatrzymaniu cyklu komórkowego w fazie G1 i zaprzestaną aktywnej proliferacji. Ponieważ ekspresja genów cyklu komórkowego G2M wiąże się z aktywną proliferacją, oczekiwane jest nominalne wzbogacenie ekspresji w nieleczonej kontroli (DMSO). W przypadku genów związanych z apoptozą oczekiwane jest nominalne wzbogacenie w komórkach leczonych (OSI_D3). Oba zjawiska potwierdzono w modelu organoidów NSCLC TH107 z mutacją EGFR traktowanych Osimertinibem: (A) GSEA dla sygnatury ekspresji Hallmark G2M (po lewej) wykazuje wzbogacenie w komórkach traktowanych DMSO. Nominalny wskaźnik wzbogacenia (NES): +1,708, FDR &lt; 0,0001. (B) GSEA dla sygnatury ekspresji Hallmark Apoptosis (po prawej) wykazuje wzbogacenie w komórkach traktowanych Osimertinibem. NES: -1,075, FDR: ns, 0,3275. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/Suppl-Fig2-R2.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 3: Kombinatoryczne leczenie farmakologiczne w modelu organoidów TH330 z mutacją EGFR, poddanych eskalacji dawki Osimertinibu w obecności drugiego inhibitora addytywnego w stałym stężeniu. Zmiany związane z opornością w NSCLC z mutacją EGFR, tj. aktywacja SRC i AXL26,27,28, były celem farmakologicznym w leczeniu kombinacyjnym z zastosowaniem inhibitora SRC Saracatinibu (100 nM) lub inhibitora AXL R428 (500 nM), n = 6 powtórzeń technicznych dla każdego punktu danych. Obie terapie kombinowane doprowadziły do zwiększenia odpowiedzi na leczenie, przy czym istotność statystyczną odnotowano dla kombinacji Osimertinibu z inhibitorem SRC Saracatinibem. Istotność statystyczną oceniono za pomocą testu rang Wilcoxona: Osimertinib versus Osimertinib + Saracatinib, *p = 0,0195; Osimertinib vs. Osimertinib + R428, ns, p = 0,2500. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/Suppl-Fig3-R2.pdf" target="_blank">Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Zmiana wielkości organoidów od momentu wysiewu (d0) do 7 dni po zastosowaniu leczenia (d7). (A) Rozwój wzrostu w organoidzie NSCLC TH107 wykazującym obecność EGFRdel19. (B) Rozwój wzrostu w organoidzie NSCLC TH330 wykazującym obecność EGFRL858R. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63039/63039_Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Ten protokół opisuje standaryzowaną ocenę wrażliwości leków na ukierunkowane inhibitory sygnalizacji w modelach organoidowych pochodzących od pacjentów z NSCLC.

Profilowanie wrażliwości na terapie celowane w organoidach pochodzących od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca z mutacją EGFR

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ skuteczna praca z organoidami polega na szczegółach, a w tej dziedzinie brakuje jasnych, szczegółowych protokołów, na podstawie których mogliby budować inni. Największą zaletą tej techniki jest skala czasowa, niskie zapotrzebowanie na biomasę oraz skalowalność przy niskich kosztach. Chociaż potrzeba znacznie więcej pracy, technika ta może pomóc w ulepszeniu leczenia raka płuc, umożliwiając testowanie bardziej precyzyjnych terapii indywidualnych lub skojarzonych, które można przełożyć klinicznie.Największym wyzwaniem jest obsługa BME2, powszechnie znanego jako Matrigel. Zdecydowanie zalecam ćwiczenie pipetowania i obchodzenia się z płynem BME2 przed wprowadzeniem cennych organoidów. Rozpocznij od dysocjacji zanurzonej kultury organoidowej BME2 poprzez ostrożne odsysanie pożywki z płytek hodowlanych, unikając dotykania kultury.Trypsynizować zanurzoną kulturę organoidów BME2 za pomocą odpowiedniego enzymu rekombinowanego, dodając dwa mililitry rekombinowanego enzymu na studzienkę na płytkę sześciodołkową. Mechanicznie rozbić BME2 poprzez wielokrotne pipetowanie w górę i w dół i inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli komórkowych przez pięć minut. Pod koniec inkubacji przenieść zawiesinę do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i wirować przy 600 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Ostrożnie odessać rekombinowany supernatant enzymatyczny bez dotykania osadu organoidowego i ponownie zawiesić osad organoidowy w pożywce wzrostowej. Po dodaniu DNazy 1 inkubować zawiesinę przez pięć minut w temperaturze pokojowej i odwirowywać w temperaturze 600 razy G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Ostrożnie wyrzucić pożywkę, nie dotykając osadu organoidowego i ponownie zawiesić osad w świeżej pożywce wzrostowej.Podgrzej nową czarną przezroczystą płytkę 96-dołkową w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 10 minut, a następnie przygotuj zawiesinę komórek w PBS, aby policzyć komórki za pomocą analizatora komórek. Po obliczeniu objętości zawiesiny komórkowej wymaganej w doświadczeniu, należy podzielić komórki z zawiesiny jednokomórkowej i osadzać w dół przez odwirowanie, jak wykazano wcześniej. Po wyrzuceniu pożywki należy trzymać komórki na lodzie przez około minutę przed ponownym wymieszaniem w BME2.Przechylić wstępnie podgrzaną, czarną, przezroczystą płytkę 96-dołkową z dnem w kierunku ciała i wysiać pięć mikrolitrów zawiesiny komórek na studzienkę, a następnie wysiać kopuły komórek w pozycji godziny szóstej dołka. Napełnij zewnętrzne studzienki na krawędzi płytki 96-dołkowej PBS i zasiej kopuły komórek w pozostałych dołkach wewnętrznych. Inkubować świeżo wysiane kopuły komórkowe w kapturze z przepływem laminarnym do hodowli komórkowych przez pięć minut bez przesuwania płytki, a następnie przenieść płytkę do inkubatora do hodowli komórkowych w celu inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut.Ostrożnie dodać 100 mikrolitrów pożywki wzrostowej na studzienkę do wszystkich studzienek zawierających organoidy i 100 mikrolitrów PBS do zewnętrznych studzienek na krawędzi płytki. Hoduj organoidy w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez siedem dni, zmieniając pożywkę zgodnie ze wskazówkami podanymi w rękopisie tekstu, regularnie kontrolując wzrost organoidów pod mikroskopem świetlnym. Przygotować seryjne rozcieńczanie leku w pożywce o niskim współczynniku wzrostu dla ozymertynibu w leczeniu organoidów niedrobnokomórkowego raka płuca z mutacją EGFR.Uwzględnij kontrolę negatywną, dodając pożywkę o niskim współczynniku wzrostu i 0,1% DMSO. Obrócić płytkę organoidu zgodnie z ruchem wskazówek zegara o 180 stopni, tak aby organoidy znalazły się teraz w pozycji godziny 12 i ostrożnie zassać pożywkę wzrostową, najlepiej za pomocą aparatu wielokanałowego. Dodaj 100 mikrolitrów roztworu kontrolnego lub leczniczego na studzienkę.Ponownie inkubować poddane działaniu substancji organoidy w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze do hodowli komórkowych przez pięć dni. Rozpocznij przeprowadzanie testu przeżycia od rozmrożenia odczynnika przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przed użyciem zrównoważyć odczynnik w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej przez 30 minut i wymieszać przez odwrócenie.Dodać 100 mikrolitrów odczynnika do każdej studzienki i dokładnie wymieszać, pipetując w górę iw dół z końcówką pipety umieszczoną w miejscu kopuły organoidu. Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieść około 150 mikrolitrów lizatu na nową, białą, nieprzezroczystą płytkę z dnem 96-dołkowym, a następnie inkubować płytkę przez dodatkowe 25 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.Rejestruj luminescencję za pomocą czytnika płytek ELISA. Zapisz dane w odpowiednim formacie tabeli danych zawierającej wszystkie surowe odczyty i nagrania układu tabliczek i użytych leków. Organoidy TH107 z mutacją EGFR wykazywały wrażliwość na leczenie ozymertynibem z połową maksymalnego stężenia hamującego wynoszącego 56 nanomolów, podczas gdy organoidy TH116 z mutacją EGFR były oporne na leczenie ozymertynibem z połową maksymalnego stężenia hamującego większego niż jeden mikromolowiec.Wrażliwości komórek niedrobnokomórkowego raka płuca TH107 EGFR-dodatnich towarzyszyły znaczące zmiany transkrypcyjne, w tym zmniejszenie ekspresji sygnatur genów związanych z cyklem komórkowym i wzrost ekspresji sygnatury genów związanej z apoptozą. Odpowiedź wrażliwego TH330 z mutacją EGFR na ukierunkowane inhibitory jest znacząco dotknięta w pożywkach wzrostowych w porównaniu z pożywkami o niskim współczynniku wzrostu. Leczenie skojarzone w TH330 z mutacją EGFR skutkowało zwiększoną odpowiedzią na leczenie.Takie podejście ulepsza spersonalizowane strategie terapii molekularnej lub skojarzonych schematów leczenia. Ta ostatnia metoda pomaga wcześnie ukierunkować mechanizmy tolerancji i oporności na leki, aby pogłębić odpowiedź kliniczną i poprawić wyniki leczenia pacjentów.

profiling-sensitivity-to-targeted-therapies-egfr-mutant-nsclc-patient

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Prezentowany tutaj jest protokół do badania reakcji farmakologicznych w organoidach nabłonka prostaty. Organoidy bardzo przypominają biologię in vivo i podsumowują genetykę pacjenta, co czyni je atrakcyjnymi systemami modelowymi. Organoidy prostaty można ustalić z prostaty typu dzikiego, genetycznie modyfikowanych modeli myszy, łagodnych tkanek ludzkich i zaawansowanego raka prostaty.

Hodowle organoidów prostaty jako narzędzia do translacji genotypów i profili mutacji na odpowiedzi farmakologiczne

Opisano metodę tworzenia organoidów przy użyciu ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta (PDX) do badań przesiewowych in vitro, co daje dopasowane pary modeli in vivo/in vitro. Guzy PDX zostały zebrane/przetworzone na małe kawałki mechanicznie lub enzymatycznie, a następnie metodą Cleversa do wyhodowania organoidów nowotworowych, które zostały pasażowane, kriokonserwowane i scharakteryzowane w stosunku do oryginalnego PDX.

Tworzenie dopasowanych par modeli in vivo/in vitro pochodzących od pacjentów PDX i organoidów pochodzących z PDX do badań farmakologicznych nad nowotworami

Wysoce dokładny system wysokoprzepustowych testów in vitro został opracowany do oceny leków przeciwnowotworowych przy użyciu organoidów nowotworowych pochodzących od pacjenta (PDO), podobnych do tkanek nowotworowych, ale nie nadaje się do wysokoprzepustowych systemów testów in vitro z płytkami 96-dołkowymi i 384-dołkowymi.

Wysokoprzepustowy test in vitro z wykorzystaniem organoidów nowotworowych pochodzących od pacjenta

Protokół ten opisuje półautomatyczną metodę średnioprzepustowych i wysokoprzepustowych badań leków organoidów oraz niezależne od mikroskopu, zautomatyzowane oprogramowanie do analizy obrazów służące do ilościowej i wizualizacji wieloparametrycznej, pojedynczej odpowiedzi lekowej w celu uchwycenia heterogeniczności wewnątrznowotworowej.

Wieloparametryczne badanie leków na leki w nowotworach organoidalnych z wykorzystaniem obrazowania szerokopolowego z użyciem żywych komórek do analizy objętości i pojedynczych organoidów

Ten protokół opisuje kluczowe kroki do wygenerowania i scharakteryzowania mysich organoidów 3D ustno-przełykowych, które reprezentują normalne, przednowotworowe i płaskonabłonkowe zmiany rakowokomórkowe wywołane przez chemiczną kancerogenezę.

Modelowanie raka płaskonabłonkowego jamy ustnej i przełyku w organoidach 3D

Wzrost liczby biomarkerów molekularnych do testowania w leczeniu leczenia niepłaskonabłonkowym niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NS-NSCLC) skłonił do opracowania szybkich i niezawodnych metod wykrywania molekularnego. Opisujemy przebieg pracy do oceny zmian genomowych u pacjentów z NS-NSCLC przy użyciu podejścia ultraszybkiego sekwencjonowania nowej generacji (NGS).

Ultraszybkie sekwencjonowanie nowej generacji oparte na amplikonie w niepłaskonabłonkowym niedrobnokomórkowym raku płuca

Tutaj przedstawiamy kompleksowy protokół generowania i wykorzystywania laboratoryjnie zaprojektowanych organoidów glejaka (LEGO) do badania zależności genotyp-fenotyp i badania potencjalnych leków do leczenia glejaka.

Laboratoryjnie zmodyfikowana hodowla organoidów glejaka wielopostaciowego i badania przesiewowe leków

Protokół ten określa uproszczoną metodę generowania raka wątrobowokomórkowego, stosowania leczenia farmakologicznego oraz sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek przed i po leczeniu w celu scharakteryzowania zmian transkrypcyjnych związanych z leczeniem.

Generowanie i analiza transkryptomiczna pojedynczokomórkowych raków trzębowokomórkowych po leczeniu farmakologicznym

Wykorzystanie guzów pochodzących od pacjentów w podskórnym modelu przedklinicznym to doskonały sposób na badanie skuteczności nowych terapii, predykcyjnego odkrywania biomarkerów i ścieżek oporności na leki. Model ten, w procesie opracowywania leków, ma zasadnicze znaczenie dla określenia losu wielu nowatorskich terapii przeciwnowotworowych przed rozpoczęciem badań klinicznych.

Opracowanie i utrzymanie przedklinicznego modelu ksenoprzeszczepu nowotworu pochodzącego od pacjenta w celu zbadania nowych terapii przeciwnowotworowych

Poniższy protokół skupia się na ustanowieniu pierwotnej hodowli mięsaka tkanek miękkich (STS) pochodzącego od pacjenta. Model ten może pomóc nam lepiej zrozumieć podłoże molekularne i profil farmakologiczny tych rzadkich nowotworów złośliwych i może stanowić punkt wyjścia do dalszych badań mających na celu poprawę leczenia STS.

Ustanowienie pierwotnej hodowli mięsaka tkanek miękkich pochodzącego od pacjenta

Poznaj metodę oceny wrażliwości na leki w organoidach pochodzących od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca z mutacją EGFR. Technika ta umożliwia testowanie terapii celowanych i kombinowanych w celu poprawy leczenia.

Profilowanie wrażliwości na terapie celowane w organoidach pochodzących od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca z mutacją EGFR (Wideo) | JoVE Journal

Profilowanie wrażliwości na terapie celowane w organoidach pochodzących od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca z mutacją EGFR

Przeglądaj więcej filmów