Name: Test glikozylazy uracylo-DNA za pomocą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Poznaj bezpośrednią detekcję aktywności glikozylazy uracylo-DNA za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF. Ta metoda bez znaczników umożliwia szybką i specyficzną analizę produktów zawierających miejsca apuryniczne/apirymidynowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy NCFPB Integrated Core Facility for Functional Genomics (Tajpej, Tajwan) oraz NRPB Pharmacogenomics Lab (Tajpej, Tajwan) za ich wsparcie techniczne. Prace te były wspierane przez Ministerstwo Nauki i Technologii Tajwanu, R.O.C. [grant nr MOST109-2314-B-002 -186 dla K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 dla S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 dla W.-h.F.]. H.-L. C. jest stypendystką National Taiwan University. Finansowanie w ramach opłaty za otwarty dostęp: Ministerstwo Nauki i Technologii, R.O.C.

1. Przygotowanie podłoża/szablonu
<ol>
	<li>Zaprojektuj dupleks z uracylu o zrównoważonej zawartości G+C ~50 ± 10% i minimalnej temperaturze topnienia 50 °C dla obszaru dupleksu. 
	UWAGA: Jedna różnica nukleotydów między substratami 18 nt a matrycami 19 nt (Tabela 1 i <silna klasa = "xfig" >Rysunek 1) pomaga w lepszej interpretacji sygnału MS i odpowiednim wyżarzaniu. Nić matrycowa służy jako komplementarne DNA do generowania niedopasowań A-U lub G-U (Tabela 1), ale może być również używana jako sygnał odniesienia w pomiarach MS. Zastosowanie syntetycznych oligonukleotydów oczyszczonych metodą HPLC jest zadowalające dla tego badania.</li>
	<li>Rozpuścić DNA w 1 mM EDTA i 10 mM Tris-HCl (pH 8,0 w 25 °C) (TE) w stężeniu 100 μmol/l jako podstawa i przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozcieńczyć ten 20 μl bulionu TE do końcowej objętości 800 μL (25-krotne rozcieńczenie do 4 μmol/l). Zmierzyć absorbancję roztworu DNA w spektrofotometrze w zakresie widzialnym w promieniowaniu UV przy λ = 260 nm, aby zapewnić stężenie przypisane przez producenta. Na przykład: A260 = 0,204 dla 4 μmol/L U+9 i A260 = 0,192 dla 4 μmol/L T1 (tabela 1).</li>
	<li>Wykonaj analizę MS MALDI-TOF (sekcje 4-6) w celu kontroli jakości oligonukleotydów, sprawdzając unikalne sygnały szczytowe przy wyznaczonych wartościach m/z, a także sprawdzając, czy stosunek sygnału do szumu wynosi >100 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B i <silna klasa = "xfig" > Rysunek 1D).</li>
</ol>
2. Test glikozylazy DNA
<ol>
	<li>Używając substratu G:U dupleksu T1/U+9 (Tabela 1 i <klasa silna = "xfig" >Rysunek 1A) do reakcji glikozylazy, na przykład w sterylnej probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, dodaj 70 μlH2O, 10 μl buforu reakcyjnego 10x UDG, 5 μl materiału T1 i 5 μl materiału U+9 (krok 1.2.). 
	UWAGA: Wybierz odpowiedni typ mikropipety i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby poradzić sobie z wymaganą objętością. Na przykład użyj pipety o pojemności 2 μl do dozowania 0,1-2 μl płynu, użyj pipety o pojemności 10 μl do dozowania 2-10 μl płynu i użyj pipety o pojemności 100 μl do dozowania 20-100 μl płynu, aby zapewnić dokładność i precyzję wyników. Opisana objętość mieszaniny odczynników jest przeznaczona dla 10 testów; Dostosuj głośność do żądanej liczby reakcji. Bufor reakcyjny 1x UDG zawiera 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitol i 20 mM Tris-HCl (pH 8,0 w 25 °C). Patrz Tabela materiałów, aby zapoznać się ze źródłem 10x buforu reakcyjnego UDG.</li>
	<li>Dokładnie zamknąć probówkę; inkubować w łaźni wodnej przez 30 minut w temperaturze 65 °C, następnie przez 30 minut w temperaturze 37 °C, a na koniec na lodzie przez 3 minuty, aby zapewnić prawidłowe wyżarzanie substratu/matrycy dupleksowej.</li>
	<li>W sterylnej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml dodać 49 μl lodowatego buforu reakcyjnego 1x UDG i 1 μl UDG (5 000 jednostek/ml; patrz Tabela materiałów), rozcieńczając do 0,1 jednostki/μl. Wykonać seryjne rozcieńczenia 1x buforem UDG do pożądanych stężeń enzymów 0,05, 0,02 lub 0,01 jednostki/μl. Zawsze trzymaj rozcieńczony UDG na lodzie. 
	UWAGA: W reakcji 10 μl 0,1 jednostki UDG mogą rozszczepić ponad 30 pmol uracylu z dupleksu T1/U+9 w ciągu 3 minut.</li>
	<li>Do sterylnej probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml dodać 9,0 μl mieszaniny substratu z kroku 2.2 i podgrzać probówkę do temperatury 37 °C. Dodać 1,0 μl rozcieńczonego UDG z kroku 2.3. Użyj timera, aby określić czas reakcji i przesuń probówkę, aby wymieszać zawartość. 
	UWAGA: W przypadku testu z definicją jednostki czas inkubacji wynosi 30 minut. W przypadku testu kinetycznego należy użyć analizy przebiegu w czasie wynoszącej 0,5, 1, 2, 3, 5 minut, aby uzyskać szybkość początkową. W przypadku testu inhibicji UGI czas reakcji wynosi 15 minut.</li>
	<li>Odwirować probówki z mieszaniną reakcyjną przez 3-5 s w temperaturze 3 200 × g w temperaturze otoczenia. Następnie natychmiast przenieść reakcję do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Zakończenie reakcji
	<ol>
		<li>Przygotować roztwory 0,25 M HCl i 0,23 M zasady Tris. W probówce o pojemności 15 ml dodaj 10 ml roztworu 1 mM EDTA i 20 mM Tris-HCl (pH 8,0 w 25 °C), aby naśladować 1x bufor reakcyjny UDG. Zakwasić 1 ml 0,25 M HCl i sprawdzić za pomocą pH-metru, aby upewnić się, że pH wynosi ~2 ± 0,5. Zneutralizować za pomocą 1 ml 0,23 M zasady Tris i sprawdzić za pomocą pH-metru, czy końcowe pH wynosi 6,5 ± 0,5, 
		UWAGA: Korzystanie z pasków testowych pH to szybki i łatwy sposób na ponowne potwierdzenie poziomu pH mieszaniny odczynników.</li>
		<li>Dodać 1 μl 0,25 M HCl w celu zakwaszenia 10 μl mieszaniny reakcyjnej w celu dezaktywacji enzymu i umieścić go na lodzie na 6 minut. Dodać 1 μl 0,23 M zasady Tris w celu zneutralizowania produktów DNA, aby uniknąć pęknięcia miejsca AP przez długotrwałe wystawienie na działanie kwasu. Dodać 13 μl TE, aby zwiększyć objętość mieszaniny produktów do transferu wiórów matrycowych, a następnie umieścić ją na lodzie. 
		UWAGA: Produkt AP jest niestabilny chemicznie i powinien zostać przeanalizowany przez MALDI-TOF MS w ciągu 2 dni. Po długotrwałym przechowywaniu przez ponad tydzień, akumulacja znacznej części pęknięć nici następuje w wyniku reakcji eliminacji produktów AP β/δ (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1D-G).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść wszystkie 25 μl produktów reakcji UDG z probówek mikrowirówek na 384-dołkową płytkę do mikromiareczkowania. 
	UWAGA: Wysokie stężenia kationów, takich jak sód lub potas w, powodują zakłócenia w analizie MALDI-TOF MS i dlatego wymagają odsalania. Ponieważ bufor reakcyjny UDG E. coli zawiera bardzo niskie stężenia kationów, odsalanie nie jest konieczne. Należy jednak zmodyfikować ten protokół, aby zmierzyć inne reakcje glikozylazy DNA zawierające kationy metali, które wymagają odsalania, jak opisano wcześniej35.</li>
</ol>
3. Przenieś produkty reakcji UDG do układu matrycowego
<ol>
	<li>Otwórz drzwiczki dozownika nanolitrów (patrz Tabela materiałów) i załaduj 384-dołkową płytkę do mikromiareczkowania z kroku 2.7 na uchwyt płytki pokładu.</li>
	<li>Włóż matrycę chipową do odpowiedniej pozycji płytki zwiadowczej. Umieść załadowaną płytkę zwiadowczą na pokładzie obróbczym dozownika nanolitrów i zamknij drzwiczki.</li>
	<li>Dotknij przycisku uruchamiania na ekranie transferu i poczekaj, aż urządzenie zacznie dozować próbki z 384-dołkowej płytki mikromiareczkowej do chipa matrycy.</li>
	<li>Użyj opcji zakładki Wizja, aby wyświetlić obraz chipa i objętości dozowania dla każdego miejsca podczas dozowania. Upewnij się, że zauważona wolumin na chipie mieści się w zakresie 5-10 nL.</li>
</ol>
4. Ustaw parametry testu na spektrometrze masowym
<ol>
	<li>Za pomocą programu aplikacyjnego (patrz Tabela materiałów) przygotuj plik .xlsx zawierający przewidywaną wartość sygnału m/z do importu. 
	UWAGA: Ustawienia w PLIKU I.xlsx (Tabela 2) są przykładowymi ustawieniami dla testu UDG substratu G:U w sekcji 2.</li>
	<li>Użyj aplikacji, aby utworzyć i zdefiniować nowy test UDG, klikając prawym przyciskiem myszy opcję Importuj grupę testów w formacie projektanta i wybierając plik .xlsx z listy rozwijanej (np. PLIK I.xlsx z kroku 4.1).</li>
	<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy przycisk Klient:Projekt:Płyta i kliknij na górze rozwijanego drzewa opcji, aby ustanowić nową płytkę testową. W oknie dialogowym wpisz nazwę pliku (np. CTT20210620 kodu laboratoryjnego i daty testu), a następnie z listy rozwijanej typu płytki wybierz typ płytki 384-dołkowej i naciśnij przycisk OK. Poszukaj pustej płytki, która pojawi się po prawej stronie ekranu.</li>
	<li>Kliknij opcję Test; wybierz test (np. FILE I.xlsx) z listy rozwijanej.</li>
	<li>Aby przypisać wybrany test (np. FILE I.xlsx) do każdej pozycji plamki próbki na płytce, przesuń kursor do każdej pozycji pustej płytki, kliknij, aby podświetlić studzienkę, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać Dodaj pleks.</li>
	<li>Za pomocą komputera stacjonarnego lub laptopa przygotuj listę roboczą w formacie .xlsx bez nagłówka (np. 0620.xlsx z tabeli 3) dla wszystkich próbek na chipie z kroku 2.7. Kliknij przycisk Dodaj nowy przykładowy projekt; Wybierz plik (np. 0620.xlsx) z listy rozwijanej, aby zaimportować listę roboczą.</li>
	<li>Poszukaj wszystkich kodów próbek testowych na liście roboczej (np. od 0620.xlsx) po lewej stronie ekranu. Kliknij przykładowy kod na liście roboczej i kliknij prawym przyciskiem myszy odpowiednią pozycję płytki, aby połączyć testy z każdą pozycją.</li>
</ol>
5. Działanie spektrometru masowego
<ol>
	<li>Użyj aplikacji, aby połączyć spektrometr mas (patrz tabela materiałów) z chipem próbki (z sekcji 3), który ma być analizowany.</li>
	<li>Kliknij ustawienie domyślne. W oknie dialogowym wpisz nazwę pliku z kroku 4.3 (np. CTT20210620); w polu Nazwa eksperymentu wpisz identyfikator chipa w kodzie kreskowym chipa i zapisz ustawienia.</li>
	<li>Uruchom program sterujący spektrometrem mas (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Naciśnij przycisk In/Out spektrometru mas i pozwól pokładowi się wysunąć. Wyjmij uchwyt na wióry i włóż sample chip z kroku 3.4 do uchwytu na wióry. Umieść załadowany uchwyt na wióry na przedłużonym pokładzie i naciśnij przycisk Wejście/Wyjęcie, aby sample chip wszedł do urządzenia.</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie ikonę Pobierz w aplikacji. W oknie Acquire (Akwizycja) kliknij zakładkę auto run, aby uruchomić instrument i uzyskać widma masy z próbek na chipie.</li>
</ol>
6. Przeglądanie widm mas i analiza danych
<ol>
	<li>Uruchom program do analizy danych (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Przejrzyj drzewo bazy danych i wybierz identyfikator chipa z kroku 5.2. Kliknij, aby podświetlić pole docelowe na chipie, a następnie kliknij ikonę widma, aby wyświetlić widmo masowe.</li>
	<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać opcję Okno dialogowe dostosowywania, aby przyciąć określony zakres widma w nowym oknie. Kliknij oś X, aby wpisać górną i dolną granicę m/z, a następnie naciśnij OK, aby wyświetlić określone spektrum zakresu, w tym interesujące sygnały. 
	UWAGA: Ilość DNA jest proporcjonalna do intensywności piku przy każdej jednostce wartości m/z.</li>
	<li>Zmierz wysokość piku wartości m/z sygnałów odpowiadających podłożem U, produktowi AP i szablonowi. Kliknij szczyt i wyświetl wysokość szczytu w lewym górnym rogu ekranu. 
	UWAGA: Widmo 1,600 szerokości/1,200 jednostki to rozsądny wymiar do kontroli na ekranie komputera, a także do prowadzenia dokumentacji.</li>
	<li>Aby zapisać widmo do prowadzenia dokumentacji, kliknij prawym przyciskiem myszy Eksportuj i wybierz typ pliku JPEG z listy rozwijanej. Kliknij Miejsce docelowe i Przeglądaj dysk, aby wybrać urządzenie pamięci masowej z listy rozwijanej (np. dysk flash E:). Wpisz nazwę pliku (np. 0620_1-2.jpg) i kliknij przycisk Eksportuj.</li>
	<li>W razie potrzeby wydrukuj wyeksportowany plik JPEG i ręcznie zmierz wysokość piku za pomocą linijki.</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W artykule przedstawiono szczegółową procedurę stosowania metody oznaczania UDG MALDI-TOF MS do bezpośredniego wykrywania produktów DNA zawierających AP. Głównymi zaletami tej metody jest to, że podłoża zawierające uracyl są bezznacznikowe, skalowalne, łatwe w obróbce i zapewniają większą elastyczność w projektowaniu substratów.
Zalecana przez dostawcę UDG ekstrakcja fenolu/chloroformu umożliwia inaktywację enzymu, aby zapobiec degradacji DNA produktu. Jednak protokół ekstrakcji fenolu wiąże s...

Chociaż uracyl jest normalną zasadą w RNA, jest to powszechna i wysoce mutagenna zmiana w genomowym DNA. Uracyl może powstać w wyniku spontanicznej/enzymatycznej deaminacji hydrolitycznej deoksycytydyny. W każdej żywej komórce ta deaminacja zachodzi 100-500 razy dziennie w warunkach fizjologicznych1,2. Jeśli te zmiany nie zostaną naprawione, może dojść do zmiany w składzie sekwencji DNA, powodując mutację. Ponieważ uracyl w DNA preferuje parowanie z dATP podczas replikacji, jeśli cytozyna deaminuje się do uracylu, w dwóch zdarzeniach replikacji nastąpi nowa mutacja przejściowa G:C do A:T w połowie potomstwa DNA3.
Wśród strategii komórkowych mających na celu utrzymanie stabilności genetycznej, naprawa przez wycinanie zasad (BER) jest podstawowym mechanizmem naprawiającym uszkodzone zasady, takie jak uracyl, w DNA4. BER jest procesem wysoce konserwatywnym ewolucyjnie. Istnieją dwie ogólne ścieżki BER: ścieżka krótkiej łaty prowadząca do drogi naprawczej pojedynczego nukleotydu i ścieżka długiej łaty, która wytwarza drogę naprawczą składającą się z co najmniej dwóch nukleotydów5. BER to skoordynowany mechanizm, który składa się z kilku etapów. Pierwszym krokiem w BER jest enzymatyczna hydroliza uszkodzonej zasady nukleotydowej przez specyficzną dla uszkodzenia glikozylazę DNA w celu wytworzenia miejsca pośredniego apurynowego/apirymidynowego (AP)6. Następnie następuje rozszczepienie szkieletu cukrowo-fosforanowego w miejscu AP przez endonukleazę, oczyszczenie końców DNA przez liazę, wypełnienie luki przez polimerazę DNA i uszczelnienie końcowego nacięcia za pomocą ligazy5.
Glikozylaza uracylo-DNA (UDG) hydrolizuje uracyl z DNA zawierającego uracyl na BER w Escherichia coli. Konwencjonalne testy UDG wykorzystujące znakowane radioaktywnie DNA z wykorzystaniem różnych technik separacji6,7,8,9,10,11,12,13 są zwykle czasochłonne, pracochłonne, wiążą się z kosztownymi odczynnikami do etykietowania, skomplikowanymi procedurami oraz wymagają intensywnego szkolenia i praktyki w celu zmniejszenia ryzyka narażenia na materiały radioaktywne. Fluorometryczne testy oligonukleotydowe zostały opracowane jako zamiennik znakowania radioizotopowego14, oprócz molekularnych latarni i technologii transferu energii rezonansu Förster15,16,17,18,19,20. Jednak dla wszystkich wyżej wymienionych metod wymagane jest specjalne etykietowanie. Niedawno opracowano testy biosensorów bez etykiet21,22,23 oraz metody kolorymetryczne oparte na tworzeniu G-quadruplex24,25,26. Jednak wiele par A:U lub specjalnie zaprojektowane sekwencje w sondach komplikują definicję jednostek enzymatycznych.
MALDI-TOF MS to technologia, która może być bardzo przydatna w analizie DNA. Opracowane aplikacje obejmują genotypowanie polimorfizmu pojedynczego nukleotydu27,28, zmodyfikowaną analizę nukleotydów29 oraz pośrednią identyfikację naprawy DNA30,31,32,33,34. MALDI-TOF MS powinien być łatwo stosowany do analizy glikozylazy DNA w celu wykrycia produktów DNA zawierających miejsce AP. Jednak miejsca AP w DNA są podatne na pękanie nici w wielu warunkach eksperymentalnych33. Przedstawiono tutaj test UDG wykorzystujący MALDI-TOF MS do bezpośredniego pomiaru produkcji AP bez znacznego szumu zrywania nici. Ta bezznacznikowa metoda jest łatwa w obsłudze i ma duży potencjał w farmaceutycznych zastosowaniach badań przesiewowych inhibitorów glikozylazy DNA.

<table><tbody><tr><td>2-amino-2-hydroksymetylo-propano-1,3-diol (zasada Tris)</td><td>J.T baker</td><td></td><td>Protokół 1,2</td></tr><tr><td>Autoklawizowana woda dejonizowana</td><td>MILLIPORE</td><td></td><td>Protokół 1,2</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>J.T Baker</td><td></td><td>Protokół 1,2</td></tr><tr><td>Rękawice</td><td>AQUAGLOVE</td><td></td><td>Protokół 1,2,3</td></tr><tr><td>Kwas solny (HCl)</td><td>SIGMA</td><td></td><td>Protokół 1,2</td></tr><tr><td>Wiadro na lód</td><td>Taiwan.Inc</td><td></td><td>Protocol 2</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet o niskiej retencji (0,5-10 i mikro; L)</td> <td>dodatkowy gen</td><td></td><td>Protokół 1,2</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet o niskiej retencji (1,250 i mikro; L)</td> <td>krajowe zaopatrzenie naukowe co, Inc.</td><td></td><td>Protokół 1,2</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet o niskiej retencji (200 &mikro; L)</td> <td>krajowe zaopatrzenie naukowe co, Inc.</td><td></td><td>Protokół 1,2</td></tr><tr><td>MassARRAY</td><td>&nbsp; Agena Bioscience, CA</td><td></td><td>Protocol 4, 5 Programy kontrolne spektrometrii mas obejmują Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE i Start RT Process.</td></tr><tr><td>MassARRAY Nanodozownik</td><td>AAT Bioquest, Inc.</td><td>RS1000</td><td>Protokół 3</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Kubota</td><td></td><td>Protokół 2</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Clubio</td><td></td><td>Protokół 2</td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek (1,5 ml)</td> <td>National scientific supply co, Inc.</td><td></td><td>Protokół 2</td></tr><tr><td>Stojak na probówki do mikrowirówek</td><td>Taiwan.Inc</td><td></td><td>Protokół 1,2</td></tr><tr><td>Mikropipeta&nbsp; (P1000)</td><td>Mikropipeta z protokołem</td> <td>Gilsona</td><td></td> 1,2</tr><tr><td>&nbsp; (P2)</td>Protokół <td>Gilsona</td><td></td><td>1,2</td></tr><tr><td>Mikropipeta (P10)</td>Protokół <td>Gilsona</td><td></td><td>1,2</td></tr><tr><td>Mikropipeta (P100)</td>Mikropipeta <td>Gilsona</td><td></td><td>1,2</td></tr> (<tr><td>P200)</td>Mikropipeta <td>Gilsona</td><td></td><td>1,2</td></tr> (<tr><td>SL2)</td><td>Protokół Rainin</td><td></td><td>1,2</td></tr><tr><td>Oligonukleotydy</td><td>Zintegrowane technologie DNA (Singapur)</td><td></td><td>Protokół 1,2</td></tr><tr><td>Kalkulator wykresu zadań IC50 (v.1)</td><td>AAT Bioquest, Inc.</td><td></td><td>Rys. 4 https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1</td></tr> Układ SpectroCHIP <tr><td>wodorotlenku sodu (NaOH)</td><td>WAKO</td><td></td><td>Protocol 2</td></tr><tr><td></td><td>&nbsp; Agena Bioscience, CA</td><td>#01509</td><td>Protokół 3, 5</td></tr><tr><td>Timer</td><td>Taiwan.Inc</td><td></td><td>Protokół 2</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Typer 4.0</td><td>&nbsp; Agena Bioscience, CA</td><td>#10145</td><td>Protocol 6 Typer 4.0 składa się z czterech programów, w tym Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor i Typer Analyzer.</td></tr><tr><td>Bufor reakcyjny UDG (10x)</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>B0280S</td><td>Protokół 2</td></tr><tr><td>Inhibitor glikozylazy uracylu</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>M0281S</td><td>Protokół 2</td></tr><tr><td>Glikozylaza uracylo-DNA</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>M0280L</td><td>Protokół 2</td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV-VISBLE UV-1601</td><td>SHIMADZU</td><td></td><td>Protokół 1</td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>ZETA ZC-4000 ( Taiwan.Inc)</td><td></td><td>Protokół 2</td></tr></tbody></table>

test glikozylazy uracylo-dna za pomocą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą

Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

Glikozylaza uracylo-DNA (UDG) jest kluczowym składnikiem szlaku naprawy przez wycinanie zasady do korekcji uracylu powstałego z hydrolitycznej deaminacji cytozyny. W związku z tym ma kluczowe znaczenie dla utrzymania integralności genomu. Opracowano wysoce specyficzną, nieznakowaną, nieradioizotopową metodę pomiaru aktywności UDG. Syntetyczny dupleks DNA zawierający specyficzny dla miejsca uracyl został rozszczepiony przez UDG, a następnie poddany analizie spektrometrii mas czasu przelotu z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-TOF MS). Ustanowiono protokół mający na celu zachowanie produktu miejsca apurynowego/apirymidynowego (AP) w DNA bez pęknięcia nici. Zmianę wartości m/z z substratu na produkt wykorzystano do oceny hydrolizy uracylu przez UDG. Do analizy kinetycznej UDG użyto substratu G:U, który dał Km = 50 nM, Vmax = 0,98 nM/s i Kcat = 9,31 s-1. Zastosowanie tej metody do testu inhibitora glikozylazy uracylu (UGI) dało wartość IC50 wynoszącą 7,6 pM. Swoistość UDG przy użyciu uracylu w różnych pozycjach w jednoniciowych i dwuniciowych substratach DNA wykazała różną skuteczność rozszczepiania. Tak więc ta prosta, szybka i wszechstronna metoda MALDI-TOF MS może być doskonałą metodą referencyjną dla różnych monofunkcyjnych glikozylaz DNA. Ma również potencjał jako narzędzie do badań przesiewowych inhibitorów glikozylazy DNA.

Szablony i substraty 
Na przykładzie syntetycznych oligonukleotydów z uracylem w centrum (U+9) sparowanych z matrycą zawierającą guaninę (Rycina 1A), można wykorzystać kontrolę bez dodatku enzymu, zawierającą stechiometryczne ilości matrycy i substratu z uracylem, do kontroli jakości czystości syntetycznych oligonukleotydów (Rycina&#160;1B; sygnały odpowiadają wyznaczonym wartościom m/z, a tło jest niskie). W analizie danych MS mierzono wys...

Nieoznakowana, nieradio-izotopowa metoda oznaczania aktywności glikozylazy uracylo-DNA została opracowana przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF do bezpośredniej analizy produktu zawierającego miejsce apurinowe/apirymidynowe. Test okazał się dość prosty, specyficzny, szybki i łatwy w użyciu do pomiaru glikozylazy DNA.

Test glikozylazy uracylo-DNA za pomocą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is a key component in the base excision repair pathway for the correction of uracil formed from hydrolytic deamination of ...

Mechanizmy naprawy DNA są bardzo ważne dla utrzymania integralności genomu we wszystkich organizmach żywych. Glikozylaza uracylo-DNA jest kluczowym białkiem naprawczym DNA w podstawowym szlaku naprawy tkanek. Za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF możemy bezpośrednio wykryć produkt AP do testu aktywności enzymatycznej.Konwencjonalny test glikozylazy wymaga pracy substratowej. Metoda ta nie wymaga etykietowania i bezpośrednio wykrywa zmianę masy z substratu uracylu na produkt AP. Inne zalety to wysoka specyficzność, wszechstronność, skalowalność, szybkość i łatwość wykonania.Jako przykład użyliśmy glikozylazy uracylo-DNA E.coli. Metodę tę można łatwo zmodyfikować dla innych testów glikozylazy DNA. Niezbędny jest dobrze wyszkolony personel laboratoryjny posiadający umiejętności dokładnego pipetowania i rozcieńczania.Należy używać świeżo przygotowanych odczynników i o niskiej zawartości soli, aby uzyskać lepsze sygnały i mniejszy szum tła. Procedurę zademonstruje Hui-Lan Chang, doktorant z mojego laboratorium. W przypadku testu glikozylazy DNA przy użyciu substratu zawierającego zasadę guaniny-uracylu dupleksu T1 U + 9 dodaj 70 mikrolitrów wody, 10 mikrolitrów glikozylazy 10X uracylo-D

uracil-dna-glycosylase-assay-matrix-assisted-laser

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Twórca metody przedstawia sposób przygotowania próbek z wykorzystaniem ureazy do analizy GC/MS metabolitów pośrednich. Metoda ta umożliwia jednoczesne, jednowykrokową analizę uzupełniającą w ramach przesiewowych badań noworodków w kierunku wrodzonych błędów metabolizmu za pomocą tandemowej spektrometrii mas, poprzez ilościowe oznaczenie węglowodanów, kwasów organicznych i aminokwasów w jednym procesie.

Jednoetapowa metabolomika: ilościowe oznaczanie węglowodanów, kwasów organicznych i aminokwasów w ramach jednej procedury

Wiązka molekularna sprzężona z przestrajalnym próżniowym spektrometrem masowym fotojonizacji ultrafioletowej w synchrotronie dostarcza wygodnego narzędzia do badania struktury elektronowej izolowanych cząsteczek i klastrów fazy gazowej. Za pomocą tej techniki wyjaśniono mechanizmy transferu protonów w dimerach zasad DNA.

Spektrometria mas wiązki molekularnej z przestrajalnym próżniowym promieniowaniem synchrotronowym ultrafioletowym (VUV)

Ten artykuł zawiera szczegółową procedurę syntezy, oczyszczania i charakterystyki dodekamerów RNA modyfikowanych w pozycji C2'-O. Analizy fotometryczne UV-vis i dichroizmu kołowego służą do ilościowego określania i charakteryzowania aspektów strukturalnych, tj. jednoniciowych lub dwuniciowych.

Protokół syntezy w fazie stałej oligomerów RNA zawierających modyfikację 2'-O-tiofenylometylu i charakterystykę za pomocą dichroizmu kołowego

Tutaj prezentujemy protokół skutecznego jednoetapowego oczyszczania aktywnej, nieoznakowanej, ludzkiej translokacji 10-jedenaście (TET2) 5-metylocytozynowej dioksygenazy za pomocą chromatografii jonowymiennej i jej testu opartego na chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas (LC-MS/MS).

Skuteczne oczyszczanie i opracowywanie testów opartych na LC-MS/MS dla dioksygenazy 5-metylocytozynowej translokacji Ten-Eleven-2

Nieoznakowana, nieradio-izotopowa metoda korekty polimerazy DNA i testu naprawy DNA została opracowana przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF o wysokiej rozdzielczości i strategii przedłużania pojedynczego nukleotydu. Test okazał się bardzo specyficzny, prosty, szybki i łatwy do wykonania w przypadku korekty i naprawy łatek krótszych niż 9-nukleotydy.

Korekta i test naprawy DNA przy użyciu przedłużenia pojedynczego nukleotydu i analizy spektrometrii mas MALDI-TOF

Tutaj prezentujemy protokół zależnego od DNAzymu podziału RNA. Umożliwia to szybką i zależną od miejsca analizę 2'-O-metylacji RNA. Podejście to można wykorzystać do wstępnej lub głównej oceny aktywności snoRNA.

Zależna od DNAzymu analiza 2'-O-metylacji rRNA

Opisujemy tutaj metody czułego i dokładnego oznaczania zmian 8-okso-7,8-dihydro-2'-deoksyguanozyny (8-oxodGuo), 1,N 6-etheno-2'-deoksyadenozyny (1,N 6-dAdo) i 1,N 2-etheno-2'-deoksyguanozyny (1,N 2-dGuo) w DNA. Metody te zastosowano do oceny wpływu drobnego pyłu zawieszonego (PM2,5) w tkankach (płuca, wątroba i nerki) narażonych myszy A/J.

Kwantyfikacja trzech zmian DNA za pomocą spektrometrii mas i ocena ich poziomów w tkankach myszy narażonych na działanie drobnego pyłu zawieszonego w otoczeniu

Tutaj opisujemy dwie modyfikacje testu włókien DNA w celu zbadania jednoniciowych luk w DNA podczas replikacji DNA po indukcji zmiany. Test włókien S1 umożliwia wykrycie luk poreplikacyjnych za pomocą endonukleazy S1 specyficznej dla ssDNA, podczas gdy test wypełniania luk umożliwia wizualizację i ilościowe określenie naprawy luki.

Wykrywanie akumulacji i naprawy luk poreplikacyjnych w komórkach ludzkich za pomocą testu włókien DNA

MALDI-TOF został użyty do scharakteryzowania fragmentów uzyskanych z reaktywności pomiędzy utlenionym RNA a egzorybonukleazą Xrn-1. Niniejszy protokół opisuje metodologię, która może być stosowana do innych procesów z udziałem RNA i/lub DNA.

Identyfikacja fragmentów RNA powstałych w wyniku degradacji enzymatycznej za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF

Przedstawiamy szczegółowy protokół uwalniania O-glikanów z mucyn oraz późniejszego odsolania, permetylacji i analizy za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF.

Profilowanie permetylowanych mulynowych O-glikanów za pomocą laserowej desorpcji/jonizacji wspomaganej matrycą w czasie przelotu

Poznaj bezpośrednią detekcję aktywności glikozylazy uracylo-DNA za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF. Ta metoda bez znaczników umożliwia szybką i specyficzną analizę produktów zawierających miejsca apuryniczne/apirymidynowe.

Test glikozylazy uracylo-DNA za pomocą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą

Przeglądaj więcej filmów