Zintegrowany zestaw narzędzi do analizy sygnałów komórkowych: sił, ruchu, morfologii i fluorescencji

Przylegające komórki wywierają siły na swoje otoczenie, a siły te obejmują siły, które komórki wywierają na podłoże, pokazane tutaj na zielono, oraz siły, które komórki wywierają na swoich sąsiadów, pokazane na czerwono. Siły te można mierzyć w monowarstwach komórkowych za pomocą techniki zwanej monowarstwową mikroskopią naprężeniową. Krótko mówiąc, technika polega na przygotowaniu hydrożeli zawierających maleńkie kulki fluorescencyjne, tuż pod górną powierzchnią, oraz duże koraliki fluorescencyjne, które są przyklejane do szkła.

Na tym hydrożelu widzi się komórki i hoduje je do konfluencji lub dowolnego stanu, w którym pragnie się mierzyć siły. Pomiar sił wymaga zobrazowania monowarstwy komórkowej, wykonania obrazów komórek w świetle przechodzącym oraz obrazów w świetle fluorescencyjnym maleńkich i dużych kulek. Każdy z tych obrazów jest uzyskiwany na tej samej płaszczyźnie wokalnej.

Obrazy te są uzyskiwane, gdy komórki są przyłączane i odłączane od hydrożelu. Porównanie tych dwóch zestawów obrazów dostarcza nam danych, które są niezbędne do ilościowego określenia wszystkich tych sił. W tym miejscu do gry wchodzą AcTrM i AnViM.

Po umieszczeniu komórek na płytce, aby uzyskać obrazy dokładnie w tym samym miejscu, w dowolnym żądanym momencie, protokół ten jest programowany w AcTrM, a następnie analizuje te dane i wizualizuje wyniki, co jest celem AnViM. W ciągu najbliższych kilku minut przeprowadzimy Cię przez proces pozyskiwania obrazów dla monowarstwy komórki konfluencji. Krok zerowy akcji monituje użytkownika o wybranie typu pozyskiwania.

Nowe przejęcie w celu rozpoczęcia nowego eksperymentu lub ciągłe pobieranie w celu wznowienia wcześniejszego eksperymentu. Kliknij opcję Fresh Acquisition, aby utworzyć listę pozycji. Pierwszy krok akcji zawiera listę wszystkich następnych kroków.

A te działania zostaną podjęte w oknie listy pozycji sceny tutaj. Kliknij opcję Na żywo w Micro-Managerze, aby zwizualizować próbkę do ręcznych korekt. W podglądzie na żywo przyjrzymy się fazie.

Tutaj sprawa jest jasna. Teraz trzeba będzie spojrzeć na koraliki. Tutaj koraliki można wizualizować we fluorescencji.

Wybierz więc kanał odpowiedni dla górnych koralików. Ważne jest również, aby być w stanie zobaczyć kilka dolnych koralików, więc spójrzmy na kanał dla dolnych koralików. To, co tutaj widzisz, to rozmazany obraz dolnych koralików i to jest całkowicie w porządku, o ile możesz stwierdzić, że dolne koraliki tam są, co możesz zrobić na tym obrazie.

Pozycja listy, kliknij przycisk Oznacz. W ten sposób tworzy się listę pozycji. Po utworzeniu listy pozycji, która została omówiona w poprzednim filmie, postępuj zgodnie z krokami wymienionymi w kroku drugim, korzystając z okna akwizycji wielowymiarowej.

Załóżmy, że chcemy wykonać długi film poklatkowy. W tym miejscu wskażę liczbę zdjęć, które chcemy zrobić. Pierwszy kanał będzie kanałem fazowym.

Następny będzie z górnych koralików, a następny będzie dolnymi koralikami. Kliknij przycisk Zamknij w oknie akwizycji wielowymiarowej i kliknij przycisk OK w kroku drugim AcTrM. Dane wyjściowe zostaną zapisane w katalogu zidentyfikowanym w oknie akwizycji wielowymiarowej.

Trzeci krok działania spowoduje pytanie, czy eksperyment wymaga odzyskania. Odpowiedź zazwyczaj będzie brzmiała: tak. W tym miejscu iTACS, czy chcemy przeprowadzić wyrafinowane odzyskiwanie?

Ta pierwsza część przybliży nas do wyrafinowanego powrotu do zdrowia, ale dolna część jeszcze bardziej przybliży nas do większej dokładności zmiany pozycji. Jeśli odzyskiwanie ma zostać wykonane przy użyciu ograniczonego pola widzenia, ta opcja jest oferowana, ale w tym eksperymencie nie wybierzemy tej opcji. W tym momencie akwizycja zestawu obrazów referencyjnych jest zakończona i Micro-Manager może zostać zamknięty.

W celu uzyskania obrazu należy uruchomić AcTrM. Wybierz powiększenie i wybierz katalog zawierający foldery danych. Wybierz opcje zmiany położenia blachy wraz z kanałem używanym do zmiany położenia.

Dostępny jest interfejs do dopasowywania tego, co jest aktualnie widoczne w aparacie, do zapisanych obrazów. Jeśli obrazy nakładają się na siebie, obrazy będą wyświetlane w kolorze czerwonym i zielonym wraz z czarnym i można wykonać ręczną regulację. W przeciwnym razie naciśnij przycisk akceptuj, a pobieranie będzie kontynuowane.

Możemy teraz rozpocząć FIDŻI. Wybierz pierwszą opcję z menu rozwijanego MSM oznaczoną jako przetwarzanie wstępne. Następnie wybierz folder zawierający folder tnimgs.

Następnie będziemy musieli określić, który kanał odpowiada jakiemu obrazowi. W tym przykładzie kanał 0 jest obrazem światła przechodzącego, który jest obrazem kontrastu fazowego komórek. Dolny obraz koralika to Kanał 2, a górny obraz koralika to Kanał 1.

A następnie, gdzie krzyżują się komórki i po której stronie obrazu. W tym przypadku komórki są monowarstwą przesuwającą się w kierunku prawej krawędzi, więc usuniemy zaznaczenie prawej i kontynuujemy. Tutaj mały obszar górnych koralików, znajdujący się daleko od monowarstwy, służy temu samemu celowi, co obrazy dolnych koralików, które wydawałyby się rzadsze i większe niż te pokazane tutaj.

Teraz nas, czy chcemy zmienić jasność i kontrast, aby koraliki były widoczne. Dostosowujemy więc za pomocą suwaków w menu, a gdy koraliki pojawią się widoczne, kliknij OK. A teraz zajmiemy się korektą pozycji. Jeśli nastąpi jakaś zmiana, pozbędzie się jej.

A po zakończeniu utworzy folder analizy. Wewnątrz folderu analizy zostanie utworzony folder pozycji, P0, a wybory, których dokonaliśmy w poprzednich menu przetwarzania wstępnego, są przechowywane w opcjach analizy, takich jak przecięte krawędzie, rozmiar pikseli, który obraz ma kontrast fazowy i inne. Z menu rozwijanego jednowarstwowej mikroskopii naprężeniowej lub MSM wybierz opcję Deformacja żelu MSM.

Stąd wybierzemy opcję, która jest odpowiednia dla naszego rozkładu koralików. A podczas przetwarzania danych można zauważyć, że w folderze pozycji pojawił się nowy folder przemieszczeń. Będzie to miejsce, w którym będą przechowywane wszystkie pliki wyjściowe

Oznacza to, że analiza została zakończona. Przyjrzymy się, jak obliczyć siły, które są wywierane na połączenie komórka-ECM i połączenie komórka-komórka, a także cytoszkielet poszczególnych komórek monowarstwy. W tym celu wybierz trzecią opcję.

I jeden z nich wybierze katalog zawierający tnimgs i folder analizy, co oznacza, że wybierze katalog przykładowy, a nie którykolwiek z tych katalogów. Naciśnij select, a zapyta Cię, jaki jest moduł ścinania tego żelu? Moduł ścinania wynosi 1250, a grubość hydrożelu w tym przykładzie wynosi 118 mikronów.

Przewidywany poziom hałasu jest podany tutaj. Następnie występuje flaga średniego przemieszczenia wynosi zero, która w tym przypadku nie jest sprawdzana. Wybierz przycisk OK, a implementacja, która oblicza trakcję, jest wykonywana za pomocą funkcji MATLAB, czyli w taki sposób, w jaki jest implementowana w tej wersji AnViM.

Teraz jest gotowy do wykonania obliczeń dla sił komórka-komórka lub cytoszkieletu. Pierwszym pytaniem, które należy zadać, jest, czy monowarstwa jest zlewająca? W tym konkretnym przypadku mamy do czynienia z postępującą monowarstwą, a po prawej stronie ramki znajduje się obszar bez komórek.

Odpowiedź brzmi, że monowarstwa nie zlewa się, więc powiemy nie. Teraz jesteśmy proszeni o narysowanie wielokąta wokół największego obiektu niebędącego komórką. Dobieramy odpowiednie metody segmentacji.

Tutaj prosi nas o wskazanie koloru komórek w metodzie trzeciej i czwartej, więc tutaj komórki są czarne, więc wybierzemy. Segmentacja, która jest wytwarzana za pomocą tych różnych metod, kończy się kilkoma w monowarstwie komórki i kilkoma białymi obszarami w obszarze bez komórki. Tutaj możemy wybrać, wypełnić plamy automatycznie i trafić OK.So teraz wszystkie miejsca są wypełnione w monowarstwie i nie ma obszaru komórki.

Następnie obliczymy naprężenia mechaniczne w monowarstwie komórkowej. Wykonaliśmy już część pierwszą, w której podzieliliśmy komórki na segmenty z obszaru bez komórek, więc zaczynamy ten krok od części drugiej, czyli segmentacji poszczególnych komórek i obrazów. Jednym z nich jest wybranie segmentacji dla poszczególnych komórek.

A tutaj prosi nas o wybranie katalogu pozycji. I jest tutaj trochę więcej informacji dla tych parametrów. Następnie prosi o narysowanie wielokąta wokół najmniejszej normalnej komórki.

Tak więc to, co tutaj narysujesz, służy do obliczania powierzchni i będzie zastrzegać, że wszystko, co jest mniejsze niż to, nie jest zdefiniowane jako komórka. A następnie o największą komórkę. Następnie rysujemy wielokąt wokół największej normalnej komórki, a następnie pytamy, która z nich jest jaśniejsza?

Czy interfejs komórka-komórka jest jaśniejszy, czy też środki komórek są jaśniejsze? Więc w tym przypadku interfejs komórka-komórka jest jaśniejszy, więc wybiorę interfejs komórka-komórka. Oznacza to, że obliczenia zostały zakończone.

Zacznijmy od wybrania mapy intensywności komórek. Po pierwsze, iTACS prosi użytkownika o wybranie katalogu pozycji, który jest również znany jako folder P0. Po zakończeniu kliknij przycisk Wybierz.

Następnie użytkownik jest pytany, czy chce, aby iTACS wykrywał podział komórek, czy określał ilościowo fluorescencję komórkową. W tym przypadku nie mamy żadnych białek fluorescencyjnych wewnątrz komórki, dlatego zdecydujemy się na wykrycie podziału komórki. Następny slajd umożliwia użytkownikowi zdefiniowanie rozmiaru sąsiedniego regionu, jest to unikalna analiza, którą wykonuje AnViM, w której przygląda się właściwościom poszczególnych komórek, a także właściwościom sąsiedniego regionu komórek.

Tutaj użytkownik może wybrać szerokość sąsiedniego regionu komórek. W tym przypadku definiujemy sąsiednie regiony za pomocą 60 pikseli. Pierwsze pole wyboru, czy chcemy, aby iTACS zbierał właściwości komórek, tak, a to pole wyboru, czy chcemy, aby iTACS zbierał właściwości sąsiadów, tak, chcemy, aby iTACS również to robił.

Poniżej tych pól wyboru iTACS udostępnia więcej informacji na temat pól wyboru, jeśli użytkownik chciałby uzyskać więcej informacji na temat każdego pola wyboru. Oznacza to, że analiza została zakończona. Ponownie iTACS prosi użytkownika o wybranie katalogu pozycji.

Następnie użytkownik ma możliwość mapowania danych siły, tworzenia obrazów danych siły, mapowania danych prędkości i tworzenia obrazów danych prędkości. Ważne jest, aby pamiętać, że tworzenie obrazów wymaga czasu, więc można to zrobić teraz lub poczekać, aby zrobić to później. Dlatego użytkownik ma możliwość wyboru opcji lub nie.

W tym przypadku iTACS prosi użytkownika o ponowne określenie rozmiaru sąsiedniego regionu i możesz użyć tego samego rozmiaru, który określiłeś dla intensywności mapowania, czyli w naszym przypadku 60 pikseli. I ponownie, użytkownik jest proszony o zebranie właściwości komórek, a także sąsiedniego regionu. Oznacza to, że analiza została zakończona.

Z menu rozwijanego jednowarstwowej mikroskopii naprężeń lub MSM wybierz dane śledzenia wyników. Po pierwsze, iTACS prosi użytkownika o wybranie katalogu pozycji, który jest również znany jako folder P0. Po zakończeniu kliknij przycisk Wybierz.

W tym miejscu iTACS, od którego numeru ramki użytkownik chce, aby iTACS rozpoczął śledzenie danych. Rozpoczęcie śledzenia od klatki numer dwa jest całkiem bezpieczne, ponieważ nie można określić prędkości dla klatki numer jeden. W tym przypadku iTACS prosi użytkownika o wskazanie maksymalnej liczby działek do jednoczesnego wypełnienia.

Zasadniczo jest to sposób na przyspieszenie śledzenia danych. Po zakończeniu kliknij przycisk OK, a opcje wybierania zmiennych podczas śledzenia są prezentowane w podobny sposób, jak opcje generowania map cieplnych. Typowe właściwości, które Cię interesują, znajdują się w polu tekstowym w górnej części okna.

Ale jeśli chcesz dostosować swoje zmienne, wystarczy usunąć wszystko z pola tekstowego i wybrać określone właściwości wymienione poniżej. Z menu rozwijanego jednowarstwowej mikroskopii naprężeniowej lub MSM wybierz wykres wyników. Następnie iTACS użytkownika, czy chce ograniczyć drukowanie do komórek z nieprzerwaną ścieżką.

Jeśli nie chcesz ograniczać drukowania do niepodzielonych ścieżek, kliknij przycisk Nie.Jeśli jednak chcesz ograniczyć drukowanie do komórek z niepodzielonymi ścieżkami, kliknij przycisk Tak W tym miejscu iTACS, ile zmiennych użytkownik chce, aby program wykreślił. iTACS jest w stanie wykreślić do trzech zmiennych, a w tym przypadku wykreślimy tylko dwie zmienne, aby zobaczyć związek między tymi czynnikami. Z jednowarstwowej mikroskopii naprężeń lub menu rozwijanego MSM wybierz obraz wyników.

Oto katalog pozycji, a po zakończeniu kliknij przycisk Wybierz. Następnie iTACS prosi nas o wybranie ramki początkowej. Tutaj wybraliśmy klatkę numer dwa.

Opcje tworzenia map cieplnych są przedstawione w podobny sposób, jak opcje wykreślania ścieżek czasowych poszczególnych komórek. Na tym kończymy, jak zrobić mapę cieplną. Oto ślad czasowy prędkości komórkowej w napięciu cytoszkieletu dla komórki numer jeden.

Właściwości są wyświetlane na współdzielonej osi pionowej, a oś pozioma wskazuje numer instancji czasu, w którym klatki są pobierane w odstępach 15-minutowych. Drugim wynikiem jest tablica map ciepła po godzinie eksperymentu. Pokazane tutaj właściwości obejmują obszar rozsiewu, orientację, kołowość, prędkość, kierunek ruchu, maksymalną orientację napięcia, napięcie cytoszkieletu, trakcję substratu i anizotropię napięcia poszczególnych komórek.

To jest rzut oka na jeden zestaw eksperymentów. Istnieje kilka innych sytuacji eksperymentalnych, w których AnViM i AcTrM mogą pomóc użytkownikowi w przeprowadzeniu eksperymentu w sposób powtarzalny, a kontakty te są wymienione w manuskrypcie. Niektóre z kluczowych cech iTACS obejmują automatyzację protokołu eksperymentalnego, automatyczną analizę danych i nie jest wymagane żadne zaplecze inżynierskie.