Name: Testy oparte na chemiluminescencji do wykrywania tlenku azotu i jego pochodnych z autooksydacji i związków nitrozowanych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Poznaj metodę chemiluminescencji do wykrywania tlenku azotu i jego metabolitów w próbkach biologicznych. Ta technika umożliwia precyzyjne pomiary bez konieczności zatrudniania specjalistów na miejscu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Protokoły opisane w tym manuskrypcie były możliwe dzięki skumulowanemu wkładowi poprzednich współpracowników laboratorium Dr. Warrena Zapola Anestezjologii w Intensywnej Terapii, Oddziału Anestezjologii w Massachusetts General Hospital. Doceniamy wkład dr Akito Nakagawy, Francesco Zadka, Emanuele Vasseny, Chong Lei, Yasuko Nagasaki, Ester Spagnolli i Emanuele Rezoagli.

L.B. otrzymuje wsparcie płacowe od K23 HL128882/NHLBI NIH jako główny badacz za swoją pracę nad hemolizą i tlenkiem azotu. LB otrzymuje granty z "Fast Grants for COVID-19 research" w Mercatus Center of George Mason University oraz od iNO Therapeutics LLC. B.Y. B.Y. jest wspierany przez granty z NHLBI/#R21HL130956 i DOD/The Geneva Foundation (W81XWH-19-S-CCC1, Log DM190244). B.Y. otrzymał patenty w MGH na elektryczne wytwarzanie tlenku azotu.
L.B. i B.Y. złożyli wniosek patentowy na brak podawania w chorobie COVID-19 Numer wniosku PCT: PCT/US2021/036269 złożonego 7 czerwca 2021 r. RWC otrzymuje wsparcie płacowe od Unitaid jako główny badacz w zakresie rozwoju technologii mającej na celu zdecentralizowaną diagnostykę gruźlicy u dzieci znajdujących się w środowiskach o niskich zasobach.

Ze względu na wysoką czułość, testy oparte na chemiluminescencji do oznaczania NO i związków pokrewnych mają wysokie ryzyko zanieczyszczenia NO2- . Każdy odczynnik (zwłaszcza roztwór blokujący NO2) i rozcieńczalnik (w tym ddH2O) użyty w doświadczeniu powinien zostać przetestowany pod kątem zawartości NO2- w celu skorygowania sygnału tła. Azotyny są niezwykle reaktywne z okresem półtrwania we krwi pełnej około 10 minut i szybko wytwarzają NO...

<table><tbody><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma</td><td>45754</td><td>500 ml - płyn</td></tr><tr><td>Emulsja przeciwpieniąca B</td><td>Sigma</td><td>A5757</td><td>250 ml - płyn</td></tr><tr><td>DETA NONOate</td><td>Cayman</td><td>82120</td><td>10 mg</td></tr><tr><td>Gibco DPBS (1x) bez wapnia, bez magnezu</td><td>ThermoFisher</td><td>14190144</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Kwas solny 37% (1 M)</td><td>Sigma</td><td>258148</td><td>500 ml - płynny</td></tr><tr><td>Jod</td><td>SAFC</td><td>207772</td><td>100 g - stały</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Od>czynnik ACS Mercury (II) Chloride 99,5%</td><td>Sigma</td><td>215465</td><td>100 g - stały (rozpuścić w wodzie)</td></tr><tr><td>System oczyszczania wody Mili-Q</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Model 705 RN 50 &mu; Strzykawka L</td><td>Hamilton</td><td>80530</td><td>Strzykawka mikrolitrowa</td></tr><tr><td>Model 802 N 25 &mu; L Strzykawka</td><td>Hamilton</td><td>84854</td><td>Mikrolitrowa strzykawka</td></tr><tr><td>N-etylomaleimid</td><td>Sigma</td><td>4260</td><td>25 g - Analizator krystalicznego</td></tr><tr><td>tlenku azotu + oprogramowanie w pakiecie - Naczynie odpowietrzające</td><td>Zysense</td><td>NOA 280i</td><td>Detektor chemiluminescencji</td></tr><tr><td>Nonidet p-40&nbsp; (NP-40)</td><td>ThermoFisher</td><td>85125</td><td>10% - 500 ml</td></tr><tr><td>Odczynnik ACS heksacyjanożelazianu (III) potasu&ge; 99%</td><td>Sigma</td><td>244023</td><td>100 g -</td></tr><tr><td>odczynnik ACS w proszku> 99%</td><td>Sigma</td><td>221945</td><td>100 g - stały</td></tr><tr><td>kryształ azotynu potasu. Do analizy EMSURE ACS</td><td>Supelco</td><td>105067</td><td>250 g - krystaliczny</td></tr><tr><td>PowerGen 125</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-359-251</td><td>Homogenizator mechaniczny</td></tr><tr><td>RV3 Dwustopniowa rotacyjna pompa łopatkowa</td><td>Pompa</td> próżniowa Edwards <td>A65201906</td><td>- W zestawie z analizatorem</td></tr><tr><td>Heparyna sodowa - BD Hemogard Clo</td><td>BD Biosciences</td><td>BD367871</td><td>75 jednostek USP</td></tr><tr><td>Odczynnik ACS bezwodny wodorotlenek sodu &ge; 97%</td><td>Sigma</td><td>795429</td><td>1 kg - granulki</td></tr><tr><td>Azotan sodu Odczynnik ACS &ge; 99%</td><td>Sigma</td><td>221341</td><td>500 g - proszek</td></tr><tr><td>Azotyn sodu &ge; 99%</td><td>Sigma</td><td>S2252</td><td>500 g - krystaliczny</td></tr><tr><td>Sulfanilamid &ge; 98%</td><td>Sigma</td><td>S9251</td><td>100 g - stały</td></tr><tr><td>Chlorek wanadu (III)</td><td>Sigma</td><td>112393</td><td>25 g - stały - Uwaga (egzotermiczny)</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna Whatman 1</td><td>Sigma</td><td>WHA10010155</td><td></td></tr></tbody></table>

testy oparte na chemiluminescencji do wykrywania tlenku azotu i jego pochodnych z autooksydacji i związków nitrozowanych

Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds

Aktywność tlenku azotu (NO) in vivo to połączone wyniki jego bezpośrednich efektów, działania jego pochodnych generowanych przez autooksydację NO oraz efektów związków nitrozowanych. Pomiar metabolitów NO jest niezbędny do badania aktywności NO zarówno na poziomie naczyniowym, jak i w innych tkankach, szczególnie w warunkach eksperymentalnych, w których podawany jest egzogenny NO. Testy chemiluminescencyjne oparte na ozonie umożliwiają precyzyjne pomiary metabolitów NO i NO zarówno w płynach (w tym w osoczu, homogenatach tkankowych, kulturach komórkowych), jak i mieszaninach gazów (np. w wydychanym powietrzu). NO reaguje z ozonem, wytwarzając dwutlenek azotu w stanie wzbudzonym. Wynikająca z tego emisja światła umożliwia fotodetekcję i generowanie sygnału elektrycznego odzwierciedlającego zawartość NO w próbce. Podwielokrotności z tej samej próbki można wykorzystać do pomiaru specyficznych metabolitów NO, takich jak azotany, azotyny, S-nitrozotiole i kompleksy żelazo-nitrozyl. Ponadto NO zużywane przez hemoglobinę bezkomórkową jest również oznaczane ilościowo za pomocą analizy chemiluminescencyjnej. Przedstawiono ilustrację wszystkich tych technik.

Analizę zużycia NO przez bezkomórkową Hb zastosowano w próbkach zawierających znane stężenia bezkomórkowej oxyHb (Rysunek 4). Ponieważ jeden hem oxyHb stechiometrycznie uwalnia jedną cząsteczkę NO w tym teście, oczyszczona bezkomórkowa oxyHb służy do zbudowania krzywej kalibracyjnej dla analizy (Rysunek uzupełniający 3).
Zależność dawka-odpowiedź między wolną hemoglobiną Hb (mierzoną za pomocą testu kolorymetrycznego) a zużyciem NO u pacjentów po ...

Tutaj prezentujemy protokoły wykrywania tlenku azotu i jego biologicznie istotnych pochodnych za pomocą testów opartych na chemiluminescencji o wysokiej czułości.

Testy oparte na chemiluminescencji do wykrywania tlenku azotu i jego pochodnych z autooksydacji i związków nitrozowanych

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the ...

Protokół ten umożliwia naukowcom sprawne wykorzystanie detektora chemiluminescencji do pomiaru metabolitów tlenku azotu bez wskazówek lub kosztów związanych z zatrudnieniem dedykowanego personelu na miejscu. Test oparty na chemiluminescencji jest najbardziej czułą metodą wykrywania minimalnych zmian w poziomach tlenku azotu i jego metabolitów w dowolnej próbce biologicznej. Wdychany tlenek azotu jest gazem leczniczym stosowanym w wielu różnych chorobach.Bardzo ważne jest, aby postęp choroby i powrót do zdrowia były dokładnie skorelowane z poziomem metabolitów tlenku azotu. Wziewny tlenek azotu, środek przeciwdrobnoustrojowy, jest obiecujący w leczeniu pacjentów z chorobami zakaźnymi dróg oddechowych. Metoda chemiluminescencyjna dostarcza informacji na temat korelacji dawki tlenku azotu i jego metabolitów ze zmianami mikrobiologicznymi i patofizjologicznymi.Aby przygotować roztwór DETA-NONOate, dodać 10 miligramów DETA-NONOate do 610 mikrolitrów 10-milimolowego wodorotlenku sodu w PBS o pH 7,4, aby wytworzyć 100 milimoli DETA-NONOate i trzymać go na lodzie. Aby kontynuować, podłącz przewód tlenowy do detektora chemiluminescencji i otwórz butlę tlenu pod ciśnieniem zgodnym z instrukc

chemiluminescence-based-assays-for-detection-nitric-oxide-its

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W niniejszej pracy proponujemy proste metody testowania i oceny obecności reaktywnych form tlenu w komórkach.

Produkcja i detekcja reaktywnych form tlenu (ROS) w nowotworach

Endogenna produkcja tlenku azotu (NO) reguluje szeroki wachlarz funkcji biologicznych. Coraz wyraźniej staje się jasne, że zaburzenia lub dysregulacja sygnalizacji opartej na NO są zaangażowane w wiele ludzkich chorób. Metody ilościowego oznaczania odpowiednich metabolitów NO mogą dostarczyć nowych diagnostycznych lub prognostycznych biomarkerów chorób ludzkich.

Techniki analityczne do badania bioaktywności tlenku azotu

Oksydaza NADPH jest głównym źródłem reaktywnych form tlenu (ROS) w fagocytach. Ze względu na efemeryczną naturę ROS, pomiar i monitorowanie poziomu ROS u żywych zwierząt jest trudne. Opisano mało inwazyjną metodę seryjnego oznaczania ilościowego ROS u żywych myszy.

Obrazowanie bioluminescencyjne aktywnościy oksydazy NADPH w różnych modelach zwierzęcych

W tym artykule opisujemy dostosowaną, stosunkowo łatwą metodę wykorzystującą barwnik fluorescencyjny diaminofluoresceiny-2 dioctan (DAF-2DA) i dihydroetydyd (DHE) do jednoczesnego wykrywania i wizualizacji wewnątrz komórkowego tlenku azotu (NO) i anionu ponadtlenkowego (O2.−) w świeżo wyizolowanych nienaruszonych aortach mysiego modelu otyłości.

En Face Wykrywanie tlenku azotu i ponadtlenku w warstwie śródbłonka nienaruszonych tętnic

Ten protokół opisuje nową technikę obrazowania śródoperacyjnego, która wykorzystuje kompleks rutenu jako źródło chemiluminescencyjnej emisji światła, wytwarzając w ten sposób wysokie proporcje sygnału do szumu podczas obrazowania in vivo. Obrazowanie śródoperacyjne to rozwijająca się dziedzina, która może zrewolucjonizować sposób wykonywania zabiegów chirurgicznych.

Nowatorska technika generowania i obserwacji chemiluminescencji w środowisku biologicznym

Tlenek azotu (NO) jest ważną cząsteczką sygnałową w homeostazie naczyń krwionośnych. Produkcja in vivo NIE jest zbyt niska do bezpośredniego pomiaru. Chemiluminescencja dostarcza użytecznych informacji na temat cyklu NO poprzez pomiar jego prekursorów i produktów utleniania, azotynów i azotanów. Wyjaśniono oznaczanie azotynów / azotanów w tkankach i płynach ustrojowych.

Pomiar azotynów i azotanów, metabolitów na szlaku tlenku azotu, w materiałach biologicznych metodą chemiluminescencji

Ten manuskrypt przedstawia protokoły zastosowania nowych genetycznie kodowanych sond tlenku azotu (NO•) (geNOps) do monitorowania fluktuacji NO• pojedynczej komórki w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Powstawanie NO• wywołane przez Ca2+ na poziomie pojedynczych komórek śródbłonka uwidoczniono poprzez połączenie geNOps z chemicznym czujnikiem Ca2+.

Zastosowanie genetycznie kodowanych fluorescencyjnych sond tlenku azotu (NO•), geNOps, do obrazowania w czasie rzeczywistym sygnałów NO• w pojedynczych komórkach

Przedstawiamy protokoły dla trzech różnych metod homogenizacji czterech różnych grup mięśni szkieletowych tkanki mięśniowej szczura do pomiaru i porównania poziomów azotanów i azotynów. Ponadto porównujemy różne masy próbek, aby zbadać, czy wielkość próbki tkanki wpływa na wyniki homogenizacji.

Przygotowanie homogenatów mięśni szkieletowych szczurów do pomiarów azotanów i azotynów

Uchwycenie dynamicznych zmian w aktywacji białek wyłuszczonych czerwonych krwinek stanowi wyzwanie metodologiczne, takie jak zachowanie dynamicznych zmian w ostrych bodźcach do późniejszej oceny. Prezentowany protokół opisuje techniki przygotowania i barwienia próbek, które umożliwiają zachowanie i analizę istotnych zmian białkowych, a następnie ich wykrycie.

Immunologiczne wykrywanie dynamicznych zmian w białkach krwinek czerwonych

Ten protokół opisuje metodę ilościowego określania produkcji tlenku azotu (NO) w kulturach nabłonka dróg oddechowych zróżnicowanych na granicy powietrze-ciecz (ALI) poprzez pomiar azotynów w sekretach wierzchołkowych za pomocą testu chemiluminescencyjnego opartego na trijodku.

Ocena produkcji tlenku azotu w kulturach ludzkich komórek nabłonkowych przewodów oddechowych zróżnicowanych na granicy powietrze-płyn

Poznaj metodę chemiluminescencji do wykrywania tlenku azotu i jego metabolitów w próbkach biologicznych. Ta technika umożliwia precyzyjne pomiary bez konieczności zatrudniania specjalistów na miejscu.

Testy oparte na chemiluminescencji do wykrywania tlenku azotu i jego pochodnych z autooksydacji i związków nitrozowanych

Przeglądaj więcej filmów