Testy oparte na chemiluminescencji do wykrywania tlenku azotu i jego pochodnych z autooksydacji i związków nitrozowanych

Protokół ten umożliwia naukowcom sprawne wykorzystanie detektora chemiluminescencji do pomiaru metabolitów tlenku azotu bez wskazówek lub kosztów związanych z zatrudnieniem dedykowanego personelu na miejscu. Test oparty na chemiluminescencji jest najbardziej czułą metodą wykrywania minimalnych zmian w poziomach tlenku azotu i jego metabolitów w dowolnej próbce biologicznej. Wdychany tlenek azotu jest gazem leczniczym stosowanym w wielu różnych chorobach.

Bardzo ważne jest, aby postęp choroby i powrót do zdrowia były dokładnie skorelowane z poziomem metabolitów tlenku azotu. Wziewny tlenek azotu, środek przeciwdrobnoustrojowy, jest obiecujący w leczeniu pacjentów z chorobami zakaźnymi dróg oddechowych. Metoda chemiluminescencyjna dostarcza informacji na temat korelacji dawki tlenku azotu i jego metabolitów ze zmianami mikrobiologicznymi i patofizjologicznymi.

Aby przygotować roztwór DETA-NONOate, dodać 10 miligramów DETA-NONOate do 610 mikrolitrów 10-milimolowego wodorotlenku sodu w PBS o pH 7,4, aby wytworzyć 100 milimoli DETA-NONOate i trzymać go na lodzie. Aby kontynuować, podłącz przewód tlenowy do detektora chemiluminescencji i otwórz butlę tlenu pod ciśnieniem zgodnym z instrukcją producenta podaną w tekście. Następnie podłącz przewód filtra dielektrycznego pola intensywnego do detektora chemiluminescencji.

Na interfejsie detektora chemiluminescencji rozpocznij uruchamianie programu detekcji do testów fazy ciekłej, upewniając się, że dopływ tlenu jest odpowiedni, a detektor rozpocznie pobieranie próbek, wskazując wykrycie sygnałem w miliwoltach, w przeciwnym razie wywoła ujemny sygnał diagnostyczny. Aby przygotować naczynie odpowietrzające, zamknij naczynie odpowietrzające na wszystkich trzech portach, całkowicie przykręcając zawór iglicowy w prawo i zamykając kurki odcinające wlot i wylot. Zdjąć korek z naczynia do odpowietrzania.

Dodać do komory reakcyjnej wystarczającą ilość odczynnika specyficznego dla planowanego testu, tak aby igła strzykawki używana do wstrzykiwania próbek mogła dotrzeć do kolumny płynu, sprawdzając jednocześnie obecność stabilnej, pożądanej linii podstawowej. Aby rozpocząć przepływ gazu płuczącego, należy upewnić się, że zbiornik gazu obojętnego jest wyposażony w dwustopniowy reduktor i połączyć zbiornik gazu obojętnego z wlotem gazu do zbiornika. Następnie otwórz wylot naczynia przepłukującego i otwórz gaz o ciśnieniu wylotowym na regulatorze od jednego do pięciu funtów na cal kwadratowy.

Następnie otwórz wlot naczynia odpowietrzającego i powoli otwórz zawór iglicowy naczynia odpowietrzającego, aby umożliwić dopływ gazu i sprawdzić, czy w naczyniu przedmuchującym nie ma bulgotania. Aby wyregulować przepływ gazu, należy zarejestrować ciśnienie w ogniwie zmierzone przez detektor chemiluminescencji za pomocą linii filtra dielektrycznego pola intensywnego pobierającej próbki powietrza z otoczenia. Ponownie załóż korek na naczynie odpowietrzające i podłącz przewód filtra dielektrycznego w polu intensywnym do naczynia odpowietrzającego.

Użyj zaworu iglicowego, aby osiągnąć takie samo ciśnienie ogniwa na poziomie detektora chemiluminescencji, które jest rejestrowane w otaczającym powietrzu. Aby uruchomić program akwizycji sygnału chemiluminescencji, należy podłączyć port szeregowy detektora chemiluminescencji do portu szeregowego komputera, w którym zainstalowano program akwizycji. Następnie uruchom program do analizy.

Kliknij Pobierz, a następnie wybierz folder, w którym chcesz zapisać plik danych, wpisz nazwę pliku i kliknij Zapisz. Przygotowując się do wstrzyknięcia próbki, dostosuj skalę napięcia na ekranie, aby mieć kontrolę nad docelową linią bazową, klikając przyciski minimum i/lub maksimum, a następnie wprowadzając żądaną wartość. Aby wykonać wstrzyknięcie próbki, przed pobraniem każdej próbki należy przepłukać strzykawkę co najmniej dwa razy lub więcej wodą dejonizowaną i destylowaną i zapewnić niezakłócony wyrzut wody podczas wycierania roboczego.

Następnie włożyć strzykawkę do probówki z próbką, trzymając zarówno strzykawkę, jak i probówkę w bliskiej odległości i pociągnąć tłok do żądanej objętości, upewniając się, że nie zostały uwięzione pęcherzyki powietrza ani niehomogenizowane części stałe. Oczyścić końcówkę strzykawki za pomocą wycieraczki zadaniowej i włożyć strzykawkę do nasadki nastawczej w porcie iniekcji. Po sprawdzeniu, czy końcówka strzykawki znajduje się w fazie ciekłej, wstrzyknąć próbkę do komory reakcyjnej.

Aby oznaczyć wstrzyknięcie w oprogramowaniu, wpisz nazwę próbki, klikając szare pole w obszarze Nazwy próbek, a następnie kliknij Oznacz wstrzyknięcie, sprawdzając, czy wstrzyknięcie powoduje zmianę w górę sygnału lub w dół zużycia tlenku azotu za pomocą bezkomórkowego testu hemoglobiny. Zależność między hemoglobiną bezkomórkową a zużyciem tlenku azotu mierzono za pomocą chemiluminescencji po obejściu krążeniowo-oddechowym. Można przypuszczać, że w wymiatającym tlenek azotu w stanie utlenionym występuje wysokie stężenie grup hemowych.

U pacjentów otrzymujących tlenek azotu podczas krążenia pozaustrojowego większość grup hemowych jest zmniejszona i nie zużywa tlenku azotu. Pomiary stężenia hemoglobiny bezkomórkowej wykazały powolną eliminację z osocza w ciągu 12 godzin po obejściu krążeniowo-oddechowym. Jednak spożycie tlenku azotu osiągnęło szczyt po 15 minutach i nie odzwierciedlało eliminacji hemoglobiny bezkomórkowej.

Krzywe regresji liniowej zużycia tlenku azotu przez hemoglobinę bezkomórkową wykazały występowanie hemoglobiny utlenionej i zużywającej tlenek azotu po 15 minutach, w przeciwieństwie do bardziej zredukowanej hemoglobiny na początku badania 4 godziny i 12 godzin po obejściu krążeniowo-oddechowym. Monitorowano wpływ podawania gazowego tlenku azotu na zużycie tlenku azotu. Gdy pacjenci byli leczeni gazowym tlenkiem azotu w trakcie i po operacji, obserwowany wzrost wolnej hemoglobiny po obejściu krążeniowo-oddechowym nie był połączony ze wzrostem zużycia tlenku azotu.

Wyniki wykazały, że egzogennie podawany tlenek azotu zmniejszył większość wolnej hemoglobiny i zapobiegł wymiataniu tlenku azotu. Eksperyment jest ważny tylko wtedy, gdy wszystkie warunki pozostają takie same. Jeśli wysokość poziomu cieczy przekracza kolumnę reakcyjną, musimy się zatrzymać i przeprowadzić nową kalibrację.