Name: Zmodyfikowane tkanki płuc przygotowane z bezkomórkowych plastrów płuc (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Poznaj metodę inżynierii tkanki płucowej poprzez repopulację bezkomórkowych plastrów płuc komórkami nabłonkowymi typu 2, fibroblastami i komórkami śródbłonka. Ta technika umożliwia badania w dziedzinie medycyny regeneracyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Lorenzo Sewananowi i Jorge Nunezowi za ich pracę nad projektem kasety do hodowli tkankowej użytej w tym protokole, laboratorium Kamińskiego za użycie ich wibratomu, Maurizio Chioccioli i Jessice Nouws za pomoc w krojeniu płuc, Allie LaRocco za pomoc w początkowych eksperymentach pilotażowych oraz Hong Qian za uważne przeczytanie protokołu. Praca ta była wspierana przez granty NIH F30HL143880 (K.L.L.), Medical Scientist Training Program Training Grant T32GM136651 (K.L.L.) i U01HL145567 (L.E.N.); oraz dzięki nieograniczonemu darowi badawczemu od Humacyte Inc. (L.E.N.).

L.E.N. jest założycielem i udziałowcem Humacyte, Inc, która jest firmą zajmującą się medycyną regeneracyjną. Humacyte wytwarza zmodyfikowane naczynia krwionośne z allogenicznych komórek mięśni gładkich do chirurgii naczyniowej. Małżonek L.E.N. posiada udziały w Humacyte, a L.E.N. zasiada w Radzie Dyrektorów Humacyte. L.E.N. jest wynalazcą na podstawie patentów, które są licencjonowane przez Humacyte i które generują tantiemy dla L.E.N. L.E.N. otrzymała nieograniczony dar badawczy na wsparcie badań w swoim laboratorium w Yale. Humacyte nie miał wpływu na przebieg, opis ani interpretację ustaleń zawartych w tym raporcie.

W artykule opisano zastosowanie decelularnych, precyzyjnie wyciętych wycinków płuc jako platformy do generowania zmodyfikowanych tkanek płuc in vitro, które zawierają wieloliniowe struktury podobne do pęcherzyków płucnych. Łącząc strategie, które wcześniej opracowaliśmy w celu ponownego zasiedlenia bezkomórkowych rusztowań płuc ECM o wysokiej wierności do inżynierii całego płuc22,31, z naszym solidnym systemem do hodowli zmodyfikowanych tkanek serca na małą skalę30, protokół ten umożliwia wykorzystanie fizjologicznie istotnego ECM płuc jako substratu do hodowli tkankowej, w sposób powtarzalny i o umiarkowanej przepustowości.
Przedstawione tutaj metody szczegółowo opisują przygotowanie rusztowania ELT z płuc szczura, które są łatwo osiągalne, mogą być ekstrahowane en bloc z bezpośrednim dostępem do nienaruszonych dróg oddechowych w celu nadmuchania agarozy i mają większy rozmiar niż płuco myszy. Jednak każda tkanka płucna, która może być nadmuchana agarozą i uzyskać plastry o długości co najmniej 9 mm, może być wykorzystana w tym systemie. Niezależnie od źródła tkanki, równomierne napompowanie tkanki płucnej agarozą jest najważniejszym krokiem zapewniającym powodzenie dalszego krojenia tkanek, przycinania i obchodzenia się z tkankami. Niedopompowana tkanka płucna ma tendencję do nieczystego krojenia, podczas gdy nadmiernie napompowana tkanka może się rozerwać podczas przycinania. Po żelowaniu agarozy odpowiednio napompowane obszary tkanek są jędrne, ale nieco ustępują, gdy delikatnie uciskają kleszcze. W przypadku nienaruszonych płuc szczurów stwierdziliśmy, że kilkukrotne wstępne napompowanie pobranych płuc powietrzem, a następnie nadmuchanie agarozy tak szybko, jak to możliwe po ekstrakcji, skutkuje najlepszymi wynikami krojenia i najlepszą jakością powstałych rusztowań tkankowych. Odpowiednia objętość agarozy musi być zoptymalizowana empirycznie; w przypadku płuc szczura objętość wymagana do napełnienia płuc do całkowitej pojemności płuc wynosi około 30 ml/kg masy zwierzęcia (np. 10,5 ml agarozy w przypadku płuc szczura o masie 350 g). W przypadku większych wyciętych tkanek płucnych z mniej prostym dostępem do dróg oddechowych (takich jak te od dawców ludzkich), może być konieczne dodatkowe rozwiązywanie problemów w celu nadmuchania tkanki przez oskrzela32. Podczas kolejnego krojenia płuc wybór i orientacja tkanki na tłoku jest kolejnym ważnym krokiem w kierunku 1) zapewnienia, że plastry są wystarczająco duże, aby wytworzyć paski tkanki, które można przypiąć do kaset do hodowli tkankowych i 2) zmaksymalizować obszar tkanki miąższowej (pęcherzykowej), z wyłączeniem dużych dróg oddechowych lub naczyń.
Wpinanie PCLS do kaset do hodowli tkankowych może być początkowo trudnym krokiem, ale kasety znacznie upraszczają obsługę tkanek podczas decelularyzacji i wysiewu. Dwa potencjalne problemy, które mogą się pojawić, to rozrywanie tkanek (zarówno podczas procesu przycinania, jak i podczas decelularyzacji) lub umiejscowienie tkanek w klipsach, co skutkuje słabym wysiewem w dół (np. Brak wysiewu lub wysiew tylko na końcach). Rozdarcie może być wynikiem nadmiernego napompowania agarozy, nadmiernego rozciągnięcia tkanki podczas zakładania zakładki lub pozostawienia zbyt małego zwisu, aby zapewnić odpowiednią przyczepność tkanki podczas wkładania zakładek. Należy pamiętać, że plastry, które rozrywają się na jednym końcu klipsa, mogą być z powodzeniem wysiewane, jednak trudno je uwidocznić pod mikroskopem podczas hodowli, ponieważ tkanka nie jest płaska. Słabe wysiewanie tkanek (takie jak na rysunku 6C) jest prawdopodobnie wynikiem tego, że plasterek nie leży płasko między dwoma klipsami, a tym samym słabo styka się z podstawą kąpieli wysiewającej, gdy jest odwrócony do góry nogami. Inną możliwą przyczyną jest niewłaściwe osadzenie kasety na dnie wanny wysiewającej. Jeśli chodzi o przycinanie, podczas zakładania drugiego klipsa należy nieco mocniej naprężyć tkankę, aby leżała płasko. Niektóre plastry mają lekką wklęsłość; W takich przypadkach przytnij plasterek wypukłą stroną do góry. Po nabraniu wprawy zazwyczaj doświadczamy nieudanego siewu z mniej niż 2% plastrów.
Jednym z ograniczeń tego protokołu jest wymóg posiadania specjalistycznego sprzętu - wycinarki laserowej i drukarki 3D - do generowania wstępnych materiałów do przygotowania ELT. Jednak po utworzeniu kaset do hodowli tkankowych i kąpieli wysiewających nie są wymagane żadne dodatkowe materiały specjalne. Etapy krojenia płuc i decelularyzacji przygotowania rusztowania ELT są umiarkowanie czasochłonne; Kroki te można jednak wykonać z wyprzedzeniem lub w liczbie wystarczającej do przygotowania się do wielu eksperymentów w tym samym czasie. Wiele PCLS (>100 w przypadku optymalizacji pod kątem obszarów miąższowych) można wyciąć z jednego płuca i zatrzaskowo zamrozić do późniejszego wykorzystania. Podczas gdy pojedynczy cykl zamrażania i rozmrażania może spowodować niewielkie uszkodzenia ultrastrukturalne ECM46, wykazano, że nawet wielokrotne cykle zamrażania i rozmrażania nie powodują znacznych strat w ECM23,47. PCLS mogą być również przycinane i decellularizowane przed eksperymentem, do wykorzystania w ciągu jednego miesiąca. (Warto zauważyć, że opisany protokół decelularyzacji można przeprowadzić w ciągu około 6 godzin, co stanowi znaczną przewagę nad poprzednio opisanymi metodami, które wymagają dnia lub więcej27,28). Po przygotowaniu rusztowań proces wysiewu komórek jest prosty i szybki, a hodowla ELT nie wymaga specjalistycznych technik.
Zastrzeżeniem opisanej metody ELT jest brak wysiewu specyficznego dla regionu, tj. dostarczania AEC2 specyficznie do przestrzeni pęcherzykowej lub komórek śródbłonka specyficznie do przestrzeni naczyniowej. Niemniej jednak, chociaż komórki są po prostu wysiewane na rusztowaniach tkankowych, wzór recelularyzacji jest nielosowy, z pewnymi pozorami organizacji podobnej do pęcherzyków płucnych, w tym pierścieni nabłonkowych. Podejrzewamy, że interakcje komórka-komórka, a także lokalne różnice w składzie i geometrii ECM20,21, prawdopodobnie przyczyniają się do obserwowanych wzorców recelularyzacji. Na poparcie tej hipotezy, wcześniej opublikowane badanie, w którym fibroblasty zostały wysiane niespecyficznie na pozbawionych komórek wycinkach płuc, wykazało, że wzorzec ponownego zasiedlenia tkanek i związane z nim fenotypy komórkowe różniły się znacznie w zależności od mikroskopijnego regionu tkanki i źródła rusztowania ECM (np. zdrowi kontra chorzy)27. Zaobserwowano również, że fibroblasty wnikają do śródmiąższu - miejsca, w którym znajdują się w natywnej tkance płucnej 1,27. Podstawowa alternatywna metoda, którą możemy sobie wyobrazić, aby hodować komórki na wycinkach płuc w sposób naprawdę specyficzny dla regionu, polegałaby na wysiewaniu nienaruszonych pozbawionych komórek płuc przez drogi oddechowe31,48 i przedziały naczyniowe49,50, a następnie cięcie zrecellularnej tkanki. Jednak ta alternatywa 1) jest znacznie bardziej kosztowna, czasochłonna i zasobożerna; 2) jest mniejszą przepustowością; 3) wymaga zwiększonej liczby zwierząt; oraz 4) wiąże się ze zwiększonym ryzykiem zakażenia ze względu na wyzwania związane z posiewem całego płuca i późniejszym krojeniem wysianego płuca. Chociaż platforma ELT nie podsumowuje wszystkich aspektów natywnej organizacji komórkowej, umożliwia hodowlę komórek płuc na fizjologicznie istotnym podłożu ECM, w sposób dostępny dla znacznie większej liczby laboratoriów.
Elastyczność systemu ELT jest główną zaletą tej platformy i powinna umożliwić hodowlę tkanki płucnej na małą skalę z dowolną liczbą rusztowań tkankowych, komórek lub pożywek hodowlanych. Zastosowanie rusztowań pochodzących z chorej tkanki lub z modeli urazów może pozwolić na badanie interakcji komórka-komórka lub komórka-matryca w warunkach zmienionego chorobą ECM 27,29,51. Należy jednak pamiętać, że protokół decelularyzacji może wymagać dostosowania w celu uwzględnienia różnic w matrycy między gatunkami52. Opisana strategia wysiewu może być stosowana dla dowolnego typu komórek, a oś czasu hodowli dostosowana do potrzeb badacza. Na początek 1 x 106 komórek na rusztowanie powinno dać wysoce komórkową tkankę w ciągu 7 dni hodowli, podczas gdy 1 x 105 komórek ogółem powoduje słabą komórkowość. W przypadku każdej adaptacji osi czasu, kasety z kulturami tkankowymi powinny zostać wyjęte z kąpieli wysiewającej 24 godziny po ostatnim wysiewie tkanek. Tutaj, mając na celu modelowanie części złożoności komórkowej zębodołu płucnego, opisujemy strategię recelularizacji trójkulturowej, która wspiera utrzymanie dobrze zróżnicowanych AEC2 noworodków w strukturach podobnych do pęcherzyków płucnych przez co najmniej 7 dni. Nasze wyniki wskazują również na udane wszczepienie zarówno fibroblastów, jak i komórek śródbłonka w ELT, podkreślając szerokie zastosowanie substratu hodowli i jego przydatność do badań nad współkulturami. Wysiewanie dorosłych komórek w ELT może ułatwić modelowanie bardziej spokojnych struktur pęcherzyków płucnych, podczas gdy wysiewanie AEC2 pochodzących z ludzkich PSC, w tym tych z modyfikacjami genetycznymi, może ułatwić badania translacyjne chorób u ludzi13,53. Ogólnie rzecz biorąc, podejście oddolne, które umożliwia platforma ELT, daje możliwość zbadania wkładu poszczególnych typów komórek w interesujące odczyty, takie jak proliferacja AEC2 lub stan różnicowania.
Podsumowując, protokół ten przedstawia solidny system generowania zmodyfikowanych tkanek płuc do badań nad współhodowlą AEC2, fibroblastów i komórek śródbłonka w bezkomórkowych rusztowaniach ECM do wycinków płuc. ELT reprezentują nowatorską strategię hodowli 3D dla pierwotnych AEC2, które do tej pory zazwyczaj opierały się na mniej fizjologicznych matrycach żelowych w celu utrzymania dobrze zróżnicowanego fenotypu 6,11,12. Obecna platforma opiera się na wcześniejszych pracach nad ponownym zasiedlaniem bezkomórkowych wycinków płuc 24,25,26,27,28,29, ale oferuje kilka zalet: 1) system kaset do hodowli tkankowych ułatwiający obsługę ELT podczas decelularyzacji, wysiewu i hodowli; 2) dostosowana kąpiel wysiewająca w celu precyzyjnego wysiewu znanej liczby komórek na każdym rusztowaniu plasterka; oraz 3) strategia ponownego wysiewu trójkulturowego, która umożliwia ponowne zasiedlenie tkanek pęcherzyków płucnych komórkami nabłonka, mezenchymalnymi i śródbłonka. W związku z tym ELT stanowią ważny krok naprzód w kierunku tworzenia powtarzalnych modeli in vitro, które oddają złożoność komórkową i substratową natywnego zębodołu i niszy komórek macierzystych AEC2.

Pęcherzyki płucne to funkcjonalne jednostki dystalnego płuca, składające się z siatki przestrzeni powietrznych wymieniających gazy, wyłożonych komórkami nabłonka pęcherzyków płucnych typu 1 (AEC1) i komórek typu 2 (AEC2). Pod nabłonkiem znajduje się gęsta sieć naczyń włosowatych, a także mezenchyma podtrzymująca, a wszystko to wsparte rusztowaniem macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), które zapewnia zarówno wytrzymałość, jak i elastyczność tym delikatnym workom powietrznym1. Pęcherzyki płucne są również miejscem urazu w licznych patologiach płuc, w tym idiopatycznego zwłóknienia płuc2, zespołu ostrej niewydolności oddechowej3 i ciężkiej chorobie koronawirusowej-19 (COVID-19)4. Chociaż prace prowadzone w ciągu ostatniej dekady ujawniły niezwykłą plastyczność nabłonka płuc, mechanizmy, które umożliwiają naprawę dystalnych płuc w niektórych warunkach - i które uniemożliwiają naprawę w innych - pozostają obszarem intensywnych badań5. Opracowanie ulepszonych platform in vitro do modelowania zębodołu ułatwiłoby badania nad biologią wyrostka zębodołowego, regeneracją i terapią.
AEC2 samoodnawiają się i różnicują w AEC1, a zatem są uważane za główną komórkę macierzystą dystalnego płuca6,7,8. Jednak komórki te stanowią szczególne wyzwanie dla badań in vitro, biorąc pod uwagę trudności związane z hodowlą pierwotnych AEC2 bez utraty fenotypu9. W konwencjonalnej hodowli dwuwymiarowej (2D) AEC2 spłaszczają się i przyjmują pewne cechy komórek podobnych do AEC110. W przeciwieństwie do tego, strategie hodowli 3D, najczęściej organoidy, wspierają utrzymanie zróżnicowanych cech w pierwotnym AEC2s6,11,12 i pozwalają na długoterminową hodowlę pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC) pochodzących z AEC2s13,14. Organoidy zostały wykorzystane do modelowania rozwoju dystalnych płuc15, infekcja wirusowa11,15, oraz choroby genetycznej związanej z AEC213,16,17, umożliwiając uzyskanie ważnych informacji na temat biologii i regeneracji AEC2. Jednak te modele hodowli zazwyczaj obejmują tylko jedną lub dwie linie komórkowe i osadzają komórki w matrycach żelowych, które nie są w stanie podsumować ani architektury, ani substratu ECM natywnego zębodołu płucnego.
ECM jest krytycznym regulatorem fenotypu i zachowania komórek poprzez molekularne, topologiczne i mechaniczne wskazówki; stanowi kluczowy składnik specyficznych dla tkanek nisz regulujących los komórek macierzystych; i służy jako rezerwuar, który moduluje dostępność lokalnie wydzielanych czynników wzrostu18,19,20,21. Hodowla komórek na natywnym ECM może zatem zwiększyć zdolność predykcyjną systemów in vitro do modelowania biologii tkanek in vivo. Decelularyzacja – proces, który usuwa materiał komórkowy z tkanek za pomocą detergentów, enzymów lub metod fizycznych lub innych, może w dużej mierze zachować rusztowanie ECM rodzimego narządu, jeśli zostanie starannie przeprowadzone22,23. Takie rusztowania można ponownie zasiedlić komórkami do hodowli biomimetycznej 3D. Jednakże, podczas gdy rusztowania bezkomórkowe są szeroko stosowane w zastosowaniach inżynierii tkankowej, ich zastosowanie do rutynowych hodowli komórkowych jest ograniczone. Kilka wcześniejszych badań donosiło o decelularyzacji i recelularyzacji wycinków płuc lub małych segmentów tkanki płucnej. Oprócz badań potwierdzających słuszność koncepcji24,25,26, do badania adhezji fibroblastów-matrycy wykorzystano ponownie zaludnione wycinki płuc27,28 oraz do zbadania wpływu chorych matryc płuc na fenotyp fibroblastów27,29. Dzięki ulepszonym technologiom generowania precyzyjnie ciętych wycinków tkanek, bezkomórkowe wycinki płuc mogą stanowić wygodną i niewielką platformę do hodowli komórek, przy jednoczesnym zachowaniu podstruktur pęcherzyków płucnych, dróg oddechowych i naczyń krwionośnych. Włączenie wielu typów komórek umożliwiłoby badania interakcji między komórkami w fizjologicznie istotnym środowisku 3D. Potrzebne są jednak ulepszone strategie, aby ułatwić obchodzenie się z tkankami w całym procesie hodowli oraz zapewnić kontrolowane i powtarzalne wysiewanie tkanek o znanej liczbie komórek.
Tutaj prezentujemy protokół do generowania zmodyfikowanych tkanek płuc (ELT) poprzez ponowne zaludnienie decelularnych, precyzyjnie wyciętych wycinków płuc (PCLS) pierwotnymi komórkami śródbłonka, AEC2 i fibroblastami. W adaptacji naszego wcześniej opisanego zmodyfikowanego systemu tkanek serca30 oraz strategii decelularyzacji i recelularyzacji całych płuc22,31, opisujemy procedury wycinania PCLS z płuc szczurów i przycinania plastrów do kaset wielokrotnego użytku do hodowli tkankowych, które upraszczają i standaryzują dalsze manipulacje. Przycięte plastry są decelularyzowane w celu utworzenia bezkomórkowych rusztowań ECM, które są ponownie zasiedlane w dostosowanych kąpielach wysiewających. Rusztowania do wycinków płuc zachowują krytyczne komponenty i architekturę ECM oraz wspierają wzrost AEC2 w wieloliniowych strukturach przypominających pęcherzyki płucne przez co najmniej 7 dni. ELT reprezentują nowy system kohodowli pęcherzyków płucnych w fizjologicznie istotnej matrycy 3D, który powinien wspierać rozwój strategii inżynierii tkanki płucnej, ułatwiając jednocześnie podstawowe badania biologiczne AEC2 i pęcherzyka płucnego.

<table><tbody><tr><td>Drukarka 3D: Form 2</td><td>Formlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-izobutylo-1-metyloksantyna (IBMX)</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>8-Bromo cAMP</td><td>Sigma</td><td>B7880</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza, UltraPure LMP</td><td>Invitrogen</td><td>15517-014</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Sigma</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Kolczasta złączka redukcyjna, 3/8 cala x 1/4 cala</td><td>McMaster-Carr</td><td>5121K271</td><td></td></tr><tr><td>Nukleaza benzonazy</td><td>Sigma</td><td>E1014</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA) Frakcja V</td><td>Gemini</td><td>700-104P</td><td>Do podłoża wzrostowego AEC2</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA), standardowa klasa</td><td>Gemini</td><td>700-100P</td><td>Do buforu benzonazy</td></tr><tr><td>Zawór zwrotny, polipropylen, 1/8 cala króciec węża</td><td>Cole-Parmer</td><td>SK-98553-10</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>PeproTech</td><td>2520691</td><td></td></tr><tr><td>Clear Resin, 1 L</td><td>Formlabs</td><td>RS-F2-GPCL-04</td><td></td></tr><tr><td>Klej cyjanoakrylowy, taki jak Krazy Maximum Bond Permanent Glue</td><td>Dowolny sprzęt, rzemiosło lub apteka</td><td>KG483 lub podobny</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (niski poziom glukozy)</td><td>Gibco</td><td>11885-084</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (wysoki poziom glukozy)</td>Test DNA <td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>(zestaw do oznaczania Quant-iT PicoGreen dsDNA)</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0,5 M, pH 8,0</td><td>Zestaw AmericanBio</td><td>AB00502-01000</td><td></td></tr><tr><td>EdU (zestaw do proliferacji komórek Click-iT EdU do obrazowania, Alexa Fluor 647)</td><td>Invitrogen</td><td>C10340</td><td>Używany zgodnie ze wskazówkami producenta</td></tr><tr><td>Łącznik kolankowy, 3/8 cala</td><td>McMaster-Carr</td><td>5121K907</td><td></td></tr><tr><td>F12</td><td>Gibco</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS), charakteryzowana</td><td>Hycon</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan gentamycyny</td><td>Gemini</td><td>400-100P</td><td>Rozpuszczony w diH2O do roztworu podstawowego o sile 50 mg/ml</td></tr><tr><td>Maszynki do strzyżenia włosów</td><td>Wahl</td><td>MiniArco</td><td></td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS), bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna sodowa do wstrzykiwań, USP, 1000 U/ml</td><td>Sagent</td><td>NDC: 25021-400-30</td><td>Do wstrzykiwań dootrzewnowych i dosercowych</td></tr><tr><td>Sól sodowa heparyny</td><td>Sigma</td><td>H4784</td><td>Do perfuzji tętnicy płucnej; przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 100 U/ml w PBS</td></tr><tr><td>HEPES Buffer</td><td>Corning</td><td>25-060-CL</td><td></td></tr><tr><td>Trójnik liniowy, 3/8 cala x 1/8 cala</td><td>McMaster-Carr</td><td>5121K851</td><td></td></tr><tr><td>Pętla do zaszczepiania, jednorazowa</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-600</td><td></td></tr><tr><td>Insulina z trzustki bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina do wstrzykiwań, 100 mg/ml</td><td>Covetrus (Butler Animal Health)</td><td>010177</td><td></td></tr><tr><td>KGF, rekombinowana ludzka</td> Wycinarka laserowa <td>PeproTech</td><td>100-19</td><td></td></tr><tr><td>, VLS 3.50 30 W</td><td>Universal Laser</td><td></td><td></td>Systems</tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Luer-lock, żeński, 3/32 cala</td><td>Cole-Parmer</td><td>45508-02</td><td></td></tr><tr><td>Luer-lock, męski, 1/8 cala</td><td>Cole-Parmer</td><td>30800-24</td><td></td></tr><tr><td>Luer-lock, męski, 1/4 cala</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K146</td><td></td></tr><tr><td>MCDB-131 Kompletny bez surowicy</td><td>VEC Technologies</td><td>MCDB-131 WOFBS</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2), 1 M</td><td>AmericanBio</td><td>AB09006-00100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>American Bioananalytical</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), bez Ca2+ i Mg2+, 10X</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td>Rozpuszcza się do 1X z diH2O</td></tr><tr><td>Fosforan buforowany solą fizjologiczną (PBS), z Ca2+ i Mg2+</td><td>Gibco</td><td>21300-058</td><td></td></tr><tr><td>PDMS - SYLGARD 184 Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna (10 000 U/ml penicyliny/10 000 &mu; g/ml streptomycyny)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego, 150 mm</td><td>Falcon</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>Folia z tworzywa sztucznego (parafilm)</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Rurka Pharmed BPT, LS 16</td><td>Masterflex</td><td>06508-16</td><td></td></tr><tr><td>Rurka Pharmed BPT, LS 17</td><td>Masterflex</td><td>06508-17</td><td></td></tr><tr><td>Rurka silikonowa utwardzana platyną, LS 14</td><td>Masterflex</td><td>96420-14</td><td></td></tr><tr><td>Rurka silikonowa utwardzana platyną, LS 16</td><td>Masterflex</td><td>96420-16</td><td></td></tr><tr><td>Rurka silikonowa utwardzana platyną, LS 36</td><td>Masterflex</td><td>96410-36</td><td></td></tr><tr><td>Poloxamer 407 (Pluronic F-127)</td><td>Sigma</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Podkładki przygotowawcze z powidonem/jodem, 10%</td> <td>Dynarex Corporation</td><td>1108</td><td></td></tr><tr><td>Arkusz PTFE o grubości 0,060 cala (1/16 cala)</td><td>ePlastics</td><td>PTFENAT0.060X12X12</td><td>Do zakładek kaset do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>Arkusz PTFE, grubość 0,093 cala (3/32 cala)</td><td>ePlastics</td><td>PTFENAT0,093X12X12</td><td>Do ramek i klipsów kaset do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>Napęd pompy perystaltycznej: Masterflex L/S Napęd cyfrowy o zmiennej prędkości</td><td>Cole-Parmer</td><td>ZM-07528-30</td><td></td></tr><tr><td>Głowica pompy perystaltycznej: Głowica pompy Masterflex L/S Easy-Load II</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-77202-60</td><td></td></tr><tr><td>Szczur, Sprague Dawley</td><td>Charles River</td><td>Kod szczepu: 400</td><td></td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>Dowolny sklep z narzędziami lub rękodziełem</td><td>Personna 94-120-71 lub podobny</td><td></td></tr><tr><td>Kwas retinowy</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza obrotowe, 28 mm</td><td>Omnigrid</td><td>2046</td><td></td></tr><tr><td>Nóż obrotowy, 28 mm</td><td>Olfa</td><td>Model 9551</td><td></td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu (SDC)</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Nitrorusydek sodu (SNP)</td><td>Sigma</td><td>71778</td><td></td></tr><tr><td>Kran, 4-drożny</td><td>szew Edwards</td><td>594WSC</td><td></td></tr><tr><td>, monofilamentowa polipropylenowa</td> strzykawka <td>4-0 Covidien</td><td>VP-557-X</td><td></td></tr><tr><td>, strzykawka 10 ml</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>, 50 ml</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowej, 35 mm</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych, 100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Płytka do hodowli tkankowej, 6-dołkowa</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Płytka do hodowli tkankowej 12-dołkowa</td><td>Falcon</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Transferyna ludzka</td><td>Sigma</td><td>T8158</td><td></td></tr><tr><td>Tris, 1 M roztwór, pH 8,0</td><td>AmericanBio</td><td>AB14043-01000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02025-00500</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome, Compresstome VF-300-0Z</td><td>Precisionary Instruments LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna, 100 mg/ml</td><td>Henry Schein</td><td>NDC: 11695-4022-1</td><td></td></tr><tr><td>Złącze Y, 1/16 cala kolczaste</td><td>Cole-Parmer</td><td>30614-43</td><td></td></tr></tbody></table>

zmodyfikowane tkanki płuc przygotowane z bezkomórkowych plastrów płuc

Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices

Istnieje potrzeba ulepszonych trójwymiarowych (3D) modeli płuc, które podsumowują architektoniczną i komórkową złożoność rodzimego pęcherzyka płucnego ex vivo. Niedawno opracowane modele organoidów ułatwiły ekspansję i badanie progenitorów nabłonka płuc in vitro, ale platformy te zazwyczaj opierają się na macierzy i/lub surowicy pochodzącej z guza myszy i obejmują tylko jedną lub dwie linie komórkowe. W tym miejscu opisujemy protokół generowania zmodyfikowanych tkanek płuc (ELT) oparty na wieloliniowej recelularyzacji decelularyzowanych, precyzyjnie wyciętych plastrów płuc (PCLS). ELT zawierają struktury podobne do pęcherzyków płucnych, obejmujące nabłonek pęcherzyków płucnych, mezenchymę i śródbłonek, w substracie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) bardzo przypominającym natywne płuca. Aby wytworzyć tkanki, płuca szczurów są napompowywane agarozą, krojone w plastry o grubości 450 μm, krojone w paski i decelularizowane. Powstałe w ten sposób bezkomórkowe rusztowania ECM są następnie ponownie wysiewane pierwotnymi komórkami śródbłonka, fibroblastami i komórkami nabłonka pęcherzyków płucnych typu 2 (AEC2). AEC2 mogą być utrzymywane w kulturze ELT przez co najmniej 7 dni przy użyciu chemicznie zdefiniowanej pożywki wzrostowej bez surowicy. W trakcie procesu przygotowania tkanek i hodowli plastry są przycinane w systemie kasetowym, który ułatwia obsługę i standaryzowany wysiew komórek wielu ELT równolegle. Te ELT stanowią organotypową platformę hodowli, która powinna ułatwić badania interakcji komórka-komórka i komórka-macierz w zębodole, a także sygnałów biochemicznych regulujących AEC2 i ich niszę.

Przedstawiono przegląd procesu generowania ELT, obejmujący krojenie płuc na plastry, przycinanie plastrów i decelularyzację oraz ponowną populację rusztowania, w Rysunek 3Prezentowane tutaj ELT hodowano z wykorzystaniem pierwotnych komórek śródbłonka naczyń włosowatych płuc szczura (patrz Tabela materiałów), neonatalne AEC2 szczura oraz wzbogacone w lipofibroblasty neonatalne fibroblasty płuc szczura36Komórki AEC2 wyizolowano bezpośrednio za pomocą sortowania opartego na kuleczkach magnetycznych zgodnie z wcześniej opisaną procedurą37; alternatywne protokoły izolacji zostały szczegółowo opisane i omówione w innych opracowaniach38,39,40Czystość wyizolowanych komórek AEC2 szczura można ocenić za pomocą cytometrii przepływowej z wykorzystaniem swoistego dla szczura markera powierzchniowego AEC2 RTII-70.41lub poprzez barwienie cytocentryfugowanej próbki komórek w kierunku RTII-70 lub probiałka surfingowego białka C (pSPC). Fibroblasty płuc szczura izolowano od szczurząt w 7.–9. dobie po urodzeniu zgodnie z adaptacją opublikowanego protokołu42 i wykorzystywane w pasażach 1-2; alternatywne protokoły izolacji zostały opisane w innych opracowaniach43,44Czystość wyizolowanych fibroblastów można ocenić poprzez barwienie hodowanych lub cytocentryfugowanych komórek na marker mezenchymalny vimentynę, a stopień wzbogacenia w lipofibroblasty można ocenić za pomocą barwienia Oil Red O.45.
Gdy tkanka płucna jest równomiernie wypełniona agarozą, a fragmenty tkanki są strategicznie dobierane i orientowane do cięcia w celu maksymalizacji całkowitej powierzchni tkanki oraz miąższu, jeden płuc szczura może dostarczyć materiału do &gt;100 ELT pęcherzyków płucnych. Paski PCLS wykazują wystarczającą integralność mechaniczną, aby można było je przymocować do kaset tkankowych z niewielką liczbą (&lt;5%) przypadków rozdarć (Rysunek 3B).
Protokół decelularyzacji skrawków płuc opiera się w dużym stopniu na naszym wcześniej opublikowanym protokole decelularyzacji całych płuc, w którym za pomocą proteomiki ilościowej wykazano zachowanie wielu komponentów ECM na poziomach nieistotnie różniących się od tych w natywnym płucu22. Decelularyzowane rusztowania skrawków zachowują natywną architekturę pęcherzyków płucnych, co obrazuje barwienie hematoksyliną i eozyną (H&amp;E) (Rycina 4A,B) oraz mikroskopia kontrastowa (Rycina 4C). Zazwyczaj wykluczamy rusztowania zawierające duże drogi oddechowe lub naczynia (Rycina 4D) bądź pęknięcia, choć te pierwsze mogą zostać uwzględnione, jeśli są przedmiotem zainteresowania badacza. Decelularyzacja prowadzi do 96% redukcji zawartości DNA w tkance, zmierzonej za pomocą testu na dwuniciowe DNA (patrz Tabela materiałów; odpowiednio 0,50 µg/mg ± 0,073 µg/mg w tkance natywnej i 0,018 µg/mg ± 0,0035 µg/mg w tkance decelularyzowanej, średnia ± SEM) (Rycina 5A), przy czym barwienie hematoksyliną nie wykazuje obecności DNA (Rycina 4B). Barwienia histologiczne i immunofluorescencyjne decelularyzowanych rusztowań ujawniają zachowanie białek ECM: kolagenu, elastyny, kolagenu IV i lamininy, przy architekturze i ilości zbliżonej do tej w natywnych skrawkach płuc (Rycina 5B-E). Należy zauważyć, że jądra w tkankach natywnych barwią się na niebiesko/czarno w barwieniach trichrome (dla kolagenu) i EVG (dla elastyny). Barwienie immunofluorescencyjne wykonano zgodnie z wcześniejszym opisem, stosując standardowe metody barwienia tkanek37. Wykorzystane przeciwciała oraz ich odpowiednie stężenia wymieniono w Tabeli 4.
Pomyślne ponowne zasiedlenie rusztowania prowadzi do powstania wysoko komórkowych ELT po 7 dniach, z widocznym w mikroskopii świetlnej wzorcem ponownego zasiedlenia przypominającym pęcherzyki płucne (Rycina 6A-C). W niektórych przypadkach, przy bardzo wysokiej gęstości komórek, mogą być widoczne struktury typu organoidy (Rycina 6A,B). Nieudane zasiewanie tkanki można zwizualizować za pomocą mikroskopii fazokontrastowej podczas hodowli (Rycina 6C). Po hodowli rusztowań tkankowych z AEC2, fibroblastami i komórkami śródbłonka, ELT są gęsto zasiedlone strukturami przypominającymi pęcherzyki płucne, obejmującymi wszystkie trzy linie komórkowe (Rycina 6D,E). W 7. lub 8. dniu AEC2 zachowują morfologię sześcienną i wykazują ekspresję białka surfaktantu B (SPB) oraz białka ciałek lamelarnych ABCA3, bez oznak znaczącego różnicowania w AEC1 (Rycina 6E,F). Komórki AEC2 wykazują wysoką proliferację w ELT, co potwierdza wbudowanie 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU) po 2 h impulsie w stężeniu 10 µM (Rycina 6G).
<img alt="Schemat systemu perfuzji z strzykawką, tłumikiem pulsacji i pompą perystaltyczną do podawania heparyny/SNP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat systemu perfuzji do ekstrakcji i oczyszczania płuc. (A) System perfuzji składa się z odnogi grawitacyjnej, używanej do początkowej kaniulacji tętnicy płucnej w warunkach przepływu, oraz odnogi napędzanej pompą, służącej do efektywnego oczyszczania płuc po początkowej kaniulacji. Linia pompy zawiera „tłumik pulsacji”, który niweluje skoki ciśnienia powodowane przez pompę. Konstrukcja kaniul tchawiczych i tętnic płucnych przedstawiona jest po lewej stronie. SNP = nitroprusyd sodu. (B) Szczegóły zestawu tłumika pulsacji. BPT i silikon odnoszą się do rodzajów rurek. (C) Pozycje kaniul tchawiczych i tętnic płucnych umieszczonych podczas ekstrakcji płuc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig01large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat osi czasu hodowli komórek AEC2; wysiew, zmiany pożywki, proces pozyskiwania tkanki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Oś czasu hodowli dla recelularyzacji trójliniowej. Proponowana oś czasu dla wysiewu i hodowli trójliniowego ELT, obejmująca harmonogram dwufazowego wysiewu. Wskazano liczbę komórek do wysiewu oraz pożywkę hodowlaną dla każdej fazy. Szczegóły dotyczące pożywek hodowlanych znajdują się w Tabeli 3. AEC2 = pęcherzykowy nabłonek typu 2. EC = komórka śródbłonka. FB = fibroblast. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces inżynierii tkanki płucnej: schemat przedstawia krojenie, decelularyzację i konfigurację hodowli rusztowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Schemat przygotowania inżynieryjnej tkanki płucnej. (A) Naturalna tkanka płucna jest cięta na plastry przy użyciu wibratomu. (B) Precyzyjnie wycięte plastry płuc są dzielone na ustandaryzowane paski o szerokości 3 mm, mocowane w kasetach do hodowli tkanek z politetrafluroetylenu (PTFE) i poddawane decelularyzacji detergentowej w celu uzyskania acellularnych rusztowań macierzy zewnątrzkomórkowej. (C) Rusztowania są ponownie zasiewane w specjalistycznych kąpielach do zasiewu, które ograniczają obszar zasiewu do powierzchni tkanki, a następnie hodowane w standardowej płytce wielodołkowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Przekroje tkanki natywnej i zdecelularyzowanej; obraz mikroskopowy ukazujący różnice strukturalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Struktura zdecelularyzowanych rusztowań płucnych. Barwienie H&amp;E skrawków płuc natywnych (A) i zdecelularyzowanych (B) wykazujące zachowanie architektury pęcherzyków płucnych po decelularyzacji. (C,D) Przykłady zdecelularyzowanych rusztowań ECM obrazowane przy 5-krotnym powiększeniu za pomocą mikroskopii kontrastowej, składające się głównie z tkanki pęcherzykowej (C) lub zawierające duże rozgałęzione drogi oddechowe i naczynia (D, czarne i czerwone groty strzałek). Paski skali, 50 µm (A,B); 500 µm (C,D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza histologiczna i fluorescencyjna: zawartość DNA, kolagen, laminina w tkance natywnej/decelularyzowanej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rysunek 5Usuwanie DNA i zachowanie macierzy w decelularyzowanych rusztowaniach płucnych. (A) Ilościowe oznaczenie DNA w natywnych i decelularyzowanych skrawkach płuc (średnia ± SEM, n = 5). Test Welcha t test, **P &lt; 0.01. Decell = zdecelularyzowany. (B,C) Barwienie histologiczne natywnych i decelularyzowanych przekrojów płuc na kolagen (B) oraz elastynę (C). Groty strzałek: elastyna zachowana w pierścieniach wejść pęcherzykowych tkanki decelularyzowanej. (D,E) Barwienie immunofluorescencyjne natywnych i decelularyzowanych przekrojów płuca pod kątem kolagenu IV (D) i lamininy (E). Paski skali, 50 µmNa wszystkich panelach przerywane ramki obrysowują obszar obrazu, który został powiększony po prawej stronie w każdym z odpowiednich paneli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Analiza tkanki płucnej, mikroskopia immunofluorescencyjna, markery DAPI SPB ABCA3, morfologia komórkowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Repopulacja komórkowa inżynieryjnych tkanek płucnych. (A-C) Przykłady recelularyzowanych ELT w 7. dniu hodowli, wizualizowane podczas hodowli za pomocą mikroskopii kontrastowej. Wzór recelularyzacji odzwierciedla strukturę pęcherzykową tkanki. W niektórych obszarach o wysokiej gęstości komórkowej mogą formować się struktury przypominające organoidy (groty strzałek). (A) i (B) przedstawiają udaną repopulację komórek, natomiast (C) przedstawia niski poziom recelularyzacji po 7 dniach hodowli. (D-G) Barwienie recelularyzowanych ELT w 7. lub 8. dniu hodowli. (D) Barwienie H&amp;E wykazujące repopulację komórkową przegród pęcherzykowych. (E) Barwienie immunofluorescencyjne znakuje wszczepione fibroblasty proCollagenIα1+, komórki AEC2 ABCA3+ oraz komórki śródbłonka CD31+. (F) Tkanki zawierają liczne komórki AEC2 SPB+, ale niewiele komórek AEC1 RTI-40 (podoplanina)+ w tych warunkach. (G) Wiele komórek AEC2 proliferuje w ELT, co zmierzono poprzez wbudowywanie EdU. Paski skali, 500 µm (A-C); 25 µm (D-G). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela 1: Roztwory do decelularyzacji. Szczegóły przygotowania roztworów do decelularyzacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%201%20-%20Decellularization%20solutions_Revised.xlsx" target="_blank">Aby pobrać tę tabelę, kliknij tutaj.</a>
Tabela 2: Protokół decelularyzacji. Szczegóły protokołu decelularyzacji plastrów płuc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%202%20-%20Decellularization%20protocol.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 3: Pożywki hodowlane. Szczegóły przygotowania pożywek wzrostowych dla komórek śródbłonka i AEC2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%203%20-%20Culture%20media.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 4: Przeciwciała użyte do immunobarwienia. Szczegóły dotyczące przeciwciał i ich stężeń zastosowanych do immunobarwienia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%204%20-%20Antibodies%20used%20for%20immunostaining.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Plik uzupełniający 1: Projekt ramek kaset do hodowli tkankowej do wycinania laserowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: Projekt klipsów do kaset hodowli tkankowej do wycinania laserowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%202.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 3: Projekt zakładek kasety do hodowli tkankowej do cięcia laserowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%203.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 4: Plik CAD dla podstawy formy kąpieli do wysiewu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%204.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 5: Plik CAD pierścienia formy do kąpieli wysiewczej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%205.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten protokół opisuje metodę generowania powtarzalnych, małych tkanek płuc, poprzez ponowne zaludnienie decelularyzowanych, precyzyjnie wyciętych wycinków płuc komórkami nabłonka pęcherzyków płucnych typu 2, fibroblastami i komórkami śródbłonka.

Zmodyfikowane tkanki płuc przygotowane z bezkomórkowych plastrów płuc

There is a need for improved 3-dimensional (3D) lung models that recapitulate the architectural and cellular complexity of the native lung alveolus ex ...

Protokół ten umożliwia powtarzalne wykorzystanie nienaruszonej macierzy zewnątrzkomórkowej płuc jako trójwymiarowego substratu do hodowli tkankowej i umiarkowanej przepustowości. Główną zaletą zaprojektowanego systemu tkanki płucnej jest elastyczność platformy. ELT można dostosować do stosowania różnych rusztowań tkankowych, komórek lub pożywek hodowlanych, które są przedmiotem zainteresowania.Po ekstrakcji płuc napełnij 10-mililitrową strzykawkę agarozą i HBSS bez czerwieni fenolowej. Napompuj płuca około 10 mililitrami powietrza przez kaniulę tchawicy, a następnie natychmiast wstrzyknij przygotowaną agarozę przez kaniulę tchawicy, aż najbardziej dystalne końcówki płatów płuc zostaną napompowane. Zakryj tchawicę, przymocowując białą nasadkę z czterokierunkowego kranu do żeńskiego zamka luer kaniuli tchawicy.Umieść płuco na 150-milimetrowej szalce Petriego na lodzie, aby agaroza mogła się zestalić. Przygotuj plastry płuc zgodnie z protokołem zawartym w rękopisie, a następnie napełnij 100-milimetrową szalkę Petriego 1/3 objętości PBS. Przenieś kasety i zakładki na naczynie za pomocą kleszczy.Jeśli plastry są zamrożone, rozmrażaj jedno naczynie na raz, wlewając PBS o temperaturze pokojowej. Następnie przenieś rozmrożony plasterek na 150-milimetrową szalkę Petriego. Delikatnie rozłóż plasterek za pomocą cienkich kleszczyków lub hemostatu i ostrożnie odessaj nadmiar PBS z okolic tkanki.Następnie odetnij z plastra pasek o szerokości trzech milimetrów i długości co najmniej dziewięciu milimetrów, mocno dociskając żyletkę na całej długości do naczynia i lekko kołysząc nią na boki. Aby przypiąć pasek chusteczki do kasety, unieś go nad kasetą, ostrożnie centrując, aby wystawał poza otwory w klipsach na obu końcach. Umieść zakładkę częściowo w otworze na jednym końcu za pomocą cienkich kleszczy, delikatnie wyprostuj tkankę i ustaw drugą zakładkę.Na koniec użyj kleszczyków, aby całkowicie wcisnąć każdą zakładkę, aby zabezpieczyć tkankę. Po przycięciu wszystkich boków przenieś 100-milimetrową miskę zawierającą kasety do okapu z przepływem laminarnym. Przenieś kasety na sześciodołkowe płytki zawierające pierwszy roztwór decelularyzacyjny, używając zakrzywionego hemostatu do uchwycenia karbowanych boków.Następnie umieść sześciodołkową płytkę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 30 obr./min na 10 minut. Zassaj płyn z każdej studzienki, a następnie zastąp go trzema mililitrami drugiego roztworu decelularyzacyjnego na studzienkę. Umieścić płytkę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 30 obr./min i inkubować przez pięć minut.Powtórz ten proces z każdym roztworem, jak opisano w protokole decelularyzacji w manuskrypcie. Po ostatnim płukaniu PBS przenieść tkanki na sterylne sześciodołkowe płytki zawierające świeży PBS z antybiotykami i środkami przeciwgrzybiczymi i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Po sterylizacji antybiotykami i środkami przeciwgrzybiczymi rusztowania tkanki płucnej można natychmiast wysiać lub przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do 30 dni.Przed użyciem do hodowli inkubuj rusztowania przechowywane w temperaturze czterech stopni Celsjusza ze świeżym PBS oraz antybiotykami i środkami przeciwgrzybiczymi przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza jako dodatkowy etap sterylizacji. Następnie przepłucz rusztowania sterylnym PBS, po pięć mililitrów na studzienkę, trzy razy, przez pięć minut każde. Zbadaj rusztowania pod mikroskopem z kontrastem fazowym przy 5-krotnym powiększeniu, aby wybrać tkanki do wysiewu.Przygotuj zawiesinę komórek śródbłonka w podłożu śródbłonkowym w ilości 5 milionów komórek na mililitr z wystarczającą ilością komórek do zasiania 500 000 komórek śródbłonka na plasterek. Umieścić autoklawowane kąpiele nasienne na 100-milimetrowych szalkach Petriego i ostrożnie przenieść rusztowania płuczące do góry nogami do kąpieli nasiennych. Delikatnie zamieszaj przygotowaną zawiesinę komórkową do wymieszania.Następnie ostrożnie odpipetuj 100 mikrolitrów komórek bezpośrednio na każdą tkankę u podstawy studzienek, uważając, aby nie uszkodzić tkanki końcówką pipety. Przenieś wysiane tkanki do inkubatora do hodowli komórkowych. 24 godziny po wysianiu komórek śródbłonka dodaj 900 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej do każdej studzienki za pomocą ręcznej pipety, a następnie włóż płytkę z powrotem do inkubatora.Po 24 godzinach od wysiewu komórek usuń pożywkę i zastąp jeden mililitr świeżego podłoża śródbłonka na studzienkę. 72 godziny po wysianiu komórek śródbłonka policz AEC2 lub komórki nabłonka pęcherzykowego typu II i fibroblasty za pomocą hemocytometru i przygotuj zawiesinę komórek 1:1 w pożywce wzrostowej AEC2 w ilości 5 milionów komórek na mililitr. Dobrze odpipetować pożywkę z każdej kąpieli wysiewającej i delikatnie zawirować przygotowaną zawiesinę komórkową.Odpipetować 100 mikrolitrów komórek bezpośrednio na każdej tkance u podstawy studzienki. Przenieś wysiane tkanki do inkubatora do hodowli komórkowych. Po dwóch godzinach dodaj 900 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej AEC2 do każdej studzienki, a następnie włóż płytkę z powrotem do inkubatora.Po 24 godzinach hodowli z AEC2 i fibroblastami przygotuj 12-dołkową płytkę z jednym mililitrem wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej AEC2 na dołek, na kasetę. Odpipetować 800 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki kąpieli wysiewającej, a następnie wyjąć kasety z kąpieli wysiewającej i przenieść je prawą stroną do góry na przygotowaną płytkę 12-dołkową, po jednej kasecie na dołek. Ostrożnie zmieniaj pożywkę hodowlaną za pomocą szklanej pipety Pasteura co drugi dzień, aby uzyskać pożądany czas trwania hodowli.Monitoruj stopień ponownego zasiedlenia tkanek za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym przy 5-krotnym powiększeniu przez cały czas trwania hodowli. Barwienie H i E rusztowań tkankowych wykazało zachowaną architekturę pęcherzyków płucnych po decelularyzacji bez widocznych jąder komórkowych. Tkankę wyrostka zębodołowego obserwowano, gdy bezkomórkowe rusztowania macierzy zewnątrzkomórkowej oglądano w 5-krotnym powiększeniu za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym.W niektórych wycinkach widoczne były również duże rozgałęzione drogi oddechowe i naczynia krwionośne. W siódmym dniu hodowli mikroskopia z kontrastem fazowym wykazała, że wzorzec recelularyzacji w zmodyfikowanych tkankach płucnych naśladował strukturę pęcherzyków płucnych w przypadku udanego ponownego zasiedlenia. Widoczna była również słaba recelularyzacjaBarwienie H i E w siódmym lub ósmym dniu wykazało ponowne zasiedlenie przegród pęcherzykowych. Immunofluorescencja wykazała pro-kolagenowe fibroblasty alfa 1-dodatnie typu I, ABCA3-dodatnie AEC2, CD31-dodatnie komórki śródbłonka i liczne SPB-dodatnie AEC2. Co więcej, test tymidyny wykazał wiele proliferujących AEC2.Technika ta ułatwiła opracowanie strategii inżynierii tkanki płucnej i umożliwiła prowadzenie badań nad kolejkami wspomagającymi proliferację i różnicowanie komórek typu II w obrębie zębodołu.

engineered-lung-tissues-prepared-from-decellularized-lung-slices

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opracowaliśmy zdecelularyzowaną macierz zewnątrzkomórkową płuca oraz nowatorski bioreaktor biomimetyczny, które mogą być wykorzystywane do generowania funkcjonalnej tkanki płucnej. Poprzez zasiewanie komórek do macierzy i ich hodowlę w bioreaktorze, otrzymujemy tkankę wykazującą efektywną wymianę gazową po krótkotrwałym przeszczepieniu in vivo.

Procedura inżynierii płuc

Decelularyzacja całego narządu tworzy naturalne biologiczne rusztowania, które mogą być wykorzystane w medycynie regeneracyjnej. Przedstawiono opis modelu regeneracji płuc u naczelnych u zwierząt innych niż człowiek, w którym całe płuca są decelularyzowane, a następnie wysiewane dorosłymi komórkami macierzystymi i komórkami śródbłonka w bioreaktorze ułatwiającym krążenie naczyniowe i wentylację płynnych mediów.

Decelularyzacja i recelularyzacja płuc naczelnych przy użyciu specjalistycznego bioreaktora wielkonarządowego

Tutaj prezentujemy protokół dla modelu raka płuc ex vivo, który naśladuje etapy progresji guza i pomaga wyizolować guz pierwotny, krążące komórki nowotworowe i zmiany przerzutowe.

Bezkomórkowy i komórkowy model płuc do badania przerzutów nowotworowych

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania wypełnionych agarozą precyzyjnie wyciętych ludzkich wycinków płuc z wyciętej tkanki pacjenta, które są odpowiednie do generowania 3D kultur tkanki płucnej do modelowania ludzkich chorób płuc w badaniach biologicznych i biomedycznych.

Generowanie ludzkich kultur 3D tkanki płuc (3D-LTC) do modelowania chorób

Przedstawiony tutaj jest protokół zachowania kurczliwości naczyniowej mysiej tkanki płucnej PCLS, co daje wyrafinowany trójwymiarowy obraz układu oddechowego i dróg oddechowych, który może być zachowany przez okres do 10 dni, który jest podatny na liczne zabiegi.

Precyzyjnie wycięte plastry płuc jako skuteczne narzędzie do badań ex vivo struktury i kurczliwości naczyń płucnych

Protokół opisuje bioreaktor z obsługą obrazowania, który pozwala na selektywne usuwanie endogennego nabłonka z tchawicy szczura i jednorodne rozmieszczenie komórek egzogennych na powierzchni światła, a następnie długoterminową hodowlę in vitro konstruktu komórka-tkanka.

Bioreaktor sterowany obrazowaniem do generowania bioinżynieryjnych tkanek dróg oddechowych

Prezentowany tutaj jest protokół izolacji regionalnej decelularyzowanej tkanki płucnej. Protokół ten zapewnia potężne narzędzie do badania złożoności macierzy zewnątrzkomórkowej i interakcji komórka-macierz.

Rozwarstwienie i izolacja specyficznej dla regionu bezkomórkowej tkanki płucnej

Protokół wyjaśnia dwie różne metodologie decelularyzacji stosowane do rodzimych tkanek płucnych bydła, dostarczając wyczerpującego opisu ich charakterystyki.

Opracowanie i charakterystyka bezkomórkowych hydrożeli do bezkomórkowych płuc

Ten artykuł opisuje, jak stworzyć bioinżynieryjne płuca myszy za pomocą metod decelularyzacji i recelularyzacji. Zawiera również szczegółowe informacje na temat późniejszego ortotopowego przeszczepu płuc.

Przeszczep bioinżynieryjnego płuca przy użyciu pozbawionych komórek płuc myszy i pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka

Siły mechaniczne odgrywają kluczową rolę w rozwoju płuc oraz w ich uszkadzaniu. W niniejszej pracy opisujemy metodę izolacji komórek nabłonkowych typu II oraz fibroblastów z płuc płodowych gryzoni i poddawania ich stymulacji mechanicznej przy użyciu systemu in vitro.

Układ eksperymentalny do badania mechanotransdukcji w komórkach płuc płodu

Poznaj metodę inżynierii tkanki płucowej poprzez repopulację bezkomórkowych plastrów płuc komórkami nabłonkowymi typu 2, fibroblastami i komórkami śródbłonka. Ta technika umożliwia badania w dziedzinie medycyny regeneracyjnej.

Zmodyfikowane tkanki płuc przygotowane z bezkomórkowych plastrów płuc

Przeglądaj więcej filmów