Zmodyfikowane tkanki płuc przygotowane z bezkomórkowych plastrów płuc

Protokół ten umożliwia powtarzalne wykorzystanie nienaruszonej macierzy zewnątrzkomórkowej płuc jako trójwymiarowego substratu do hodowli tkankowej i umiarkowanej przepustowości. Główną zaletą zaprojektowanego systemu tkanki płucnej jest elastyczność platformy. ELT można dostosować do stosowania różnych rusztowań tkankowych, komórek lub pożywek hodowlanych, które są przedmiotem zainteresowania.

Po ekstrakcji płuc napełnij 10-mililitrową strzykawkę agarozą i HBSS bez czerwieni fenolowej. Napompuj płuca około 10 mililitrami powietrza przez kaniulę tchawicy, a następnie natychmiast wstrzyknij przygotowaną agarozę przez kaniulę tchawicy, aż najbardziej dystalne końcówki płatów płuc zostaną napompowane. Zakryj tchawicę, przymocowując białą nasadkę z czterokierunkowego kranu do żeńskiego zamka luer kaniuli tchawicy.

Umieść płuco na 150-milimetrowej szalce Petriego na lodzie, aby agaroza mogła się zestalić. Przygotuj plastry płuc zgodnie z protokołem zawartym w rękopisie, a następnie napełnij 100-milimetrową szalkę Petriego 1/3 objętości PBS. Przenieś kasety i zakładki na naczynie za pomocą kleszczy.

Jeśli plastry są zamrożone, rozmrażaj jedno naczynie na raz, wlewając PBS o temperaturze pokojowej. Następnie przenieś rozmrożony plasterek na 150-milimetrową szalkę Petriego. Delikatnie rozłóż plasterek za pomocą cienkich kleszczyków lub hemostatu i ostrożnie odessaj nadmiar PBS z okolic tkanki.

Następnie odetnij z plastra pasek o szerokości trzech milimetrów i długości co najmniej dziewięciu milimetrów, mocno dociskając żyletkę na całej długości do naczynia i lekko kołysząc nią na boki. Aby przypiąć pasek chusteczki do kasety, unieś go nad kasetą, ostrożnie centrując, aby wystawał poza otwory w klipsach na obu końcach. Umieść zakładkę częściowo w otworze na jednym końcu za pomocą cienkich kleszczy, delikatnie wyprostuj tkankę i ustaw drugą zakładkę.

Na koniec użyj kleszczyków, aby całkowicie wcisnąć każdą zakładkę, aby zabezpieczyć tkankę. Po przycięciu wszystkich boków przenieś 100-milimetrową miskę zawierającą kasety do okapu z przepływem laminarnym. Przenieś kasety na sześciodołkowe płytki zawierające pierwszy roztwór decelularyzacyjny, używając zakrzywionego hemostatu do uchwycenia karbowanych boków.

Następnie umieść sześciodołkową płytkę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 30 obr./min na 10 minut. Zassaj płyn z każdej studzienki, a następnie zastąp go trzema mililitrami drugiego roztworu decelularyzacyjnego na studzienkę. Umieścić płytkę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 30 obr./min i inkubować przez pięć minut.

Powtórz ten proces z każdym roztworem, jak opisano w protokole decelularyzacji w manuskrypcie. Po ostatnim płukaniu PBS przenieść tkanki na sterylne sześciodołkowe płytki zawierające świeży PBS z antybiotykami i środkami przeciwgrzybiczymi i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin. Po sterylizacji antybiotykami i środkami przeciwgrzybiczymi rusztowania tkanki płucnej można natychmiast wysiać lub przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do 30 dni.

Przed użyciem do hodowli inkubuj rusztowania przechowywane w temperaturze czterech stopni Celsjusza ze świeżym PBS oraz antybiotykami i środkami przeciwgrzybiczymi przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza jako dodatkowy etap sterylizacji. Następnie przepłucz rusztowania sterylnym PBS, po pięć mililitrów na studzienkę, trzy razy, przez pięć minut każde. Zbadaj rusztowania pod mikroskopem z kontrastem fazowym przy 5-krotnym powiększeniu, aby wybrać tkanki do wysiewu.

Przygotuj zawiesinę komórek śródbłonka w podłożu śródbłonkowym w ilości 5 milionów komórek na mililitr z wystarczającą ilością komórek do zasiania 500 000 komórek śródbłonka na plasterek. Umieścić autoklawowane kąpiele nasienne na 100-milimetrowych szalkach Petriego i ostrożnie przenieść rusztowania płuczące do góry nogami do kąpieli nasiennych. Delikatnie zamieszaj przygotowaną zawiesinę komórkową do wymieszania.

Następnie ostrożnie odpipetuj 100 mikrolitrów komórek bezpośrednio na każdą tkankę u podstawy studzienek, uważając, aby nie uszkodzić tkanki końcówką pipety. Przenieś wysiane tkanki do inkubatora do hodowli komórkowych. 24 godziny po wysianiu komórek śródbłonka dodaj 900 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej do każdej studzienki za pomocą ręcznej pipety, a następnie włóż płytkę z powrotem do inkubatora.

Po 24 godzinach od wysiewu komórek usuń pożywkę i zastąp jeden mililitr świeżego podłoża śródbłonka na studzienkę. 72 godziny po wysianiu komórek śródbłonka policz AEC2 lub komórki nabłonka pęcherzykowego typu II i fibroblasty za pomocą hemocytometru i przygotuj zawiesinę komórek 1:1 w pożywce wzrostowej AEC2 w ilości 5 milionów komórek na mililitr. Dobrze odpipetować pożywkę z każdej kąpieli wysiewającej i delikatnie zawirować przygotowaną zawiesinę komórkową.

Odpipetować 100 mikrolitrów komórek bezpośrednio na każdej tkance u podstawy studzienki. Przenieś wysiane tkanki do inkubatora do hodowli komórkowych. Po dwóch godzinach dodaj 900 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej AEC2 do każdej studzienki, a następnie włóż płytkę z powrotem do inkubatora.

Po 24 godzinach hodowli z AEC2 i fibroblastami przygotuj 12-dołkową płytkę z jednym mililitrem wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej AEC2 na dołek, na kasetę. Odpipetować 800 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki kąpieli wysiewającej, a następnie wyjąć kasety z kąpieli wysiewającej i przenieść je prawą stroną do góry na przygotowaną płytkę 12-dołkową, po jednej kasecie na dołek. Ostrożnie zmieniaj pożywkę hodowlaną za pomocą szklanej pipety Pasteura co drugi dzień, aby uzyskać pożądany czas trwania hodowli.

Monitoruj stopień ponownego zasiedlenia tkanek za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym przy 5-krotnym powiększeniu przez cały czas trwania hodowli. Barwienie H i E rusztowań tkankowych wykazało zachowaną architekturę pęcherzyków płucnych po decelularyzacji bez widocznych jąder komórkowych. Tkankę wyrostka zębodołowego obserwowano, gdy bezkomórkowe rusztowania macierzy zewnątrzkomórkowej oglądano w 5-krotnym powiększeniu za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym.

W niektórych wycinkach widoczne były również duże rozgałęzione drogi oddechowe i naczynia krwionośne. W siódmym dniu hodowli mikroskopia z kontrastem fazowym wykazała, że wzorzec recelularyzacji w zmodyfikowanych tkankach płucnych naśladował strukturę pęcherzyków płucnych w przypadku udanego ponownego zasiedlenia. Widoczna była również słaba recelularyzacja

Barwienie H i E w siódmym lub ósmym dniu wykazało ponowne zasiedlenie przegród pęcherzykowych. Immunofluorescencja wykazała pro-kolagenowe fibroblasty alfa 1-dodatnie typu I, ABCA3-dodatnie AEC2, CD31-dodatnie komórki śródbłonka i liczne SPB-dodatnie AEC2. Co więcej, test tymidyny wykazał wiele proliferujących AEC2.

Technika ta ułatwiła opracowanie strategii inżynierii tkanki płucnej i umożliwiła prowadzenie badań nad kolejkami wspomagającymi proliferację i różnicowanie komórek typu II w obrębie zębodołu.