Name: Podejścia kartografii chemicznej do badania zakażenia trypanosomatydem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-21T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Poznaj metody kartografii chemicznej do badania zakażenia trypanosomatydem. Protokół obejmuje pobieranie próbek tkanek, ekstrakcję metabolitów oraz generowanie modeli 3D w celu wizualizacji rozkładu metabolitów i pasożytów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Laura-Isobel McCall, PhD, posiada nagrodę Badaczy w dziedzinie Patogenezy Chorób Zakaźnych przyznaną przez Burroughs Wellcome Fund. Autorzy pragną ponadto podziękować za wsparcie ze strony nagrody NIH numer R21AI148886, pilotażowego grantu z Oklahoma Center for Respiratory and Infectious Diseases (OCRID) w ramach nagrody NIH numer P20GM103648 oraz funduszy na rozpoczęcie działalności z University of Oklahoma (dla LIM). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy fundatorów. Autorzy pragną również podziękować twórcom narzędzi wykorzystywanych w tym protokole. W stosownych przypadkach cytowano wszystkie istotne publikacje.

Brak konfliktów interesów do zgłoszenia.

Zrozumienie zakażeń trypanosomatydem ma zasadnicze znaczenie dla opracowywania nowych leków i metod leczenia. Ta metoda kartografii chemicznej jest wyjątkowo gotowa do uzyskania praktycznych informacji na temat związku między metabolizmem a patogenezą choroby trypanosomatidów, odpowiadając w ten sposób na tę potrzebę translacyjną.
Podczas ekstrakcji metabolitów i analiz MS zaleca się stosowanie wyłącznie rozpuszczalników klasy LC-MS, aby zmniejszyć zanieczyszczenie tła. Tam, gdzie to możliwe, należy unikać zanieczyszczeń polimerowych35, powszechnie pochodzących z folii parafinowej i/lub innych tworzyw sztucznych 36,37,38. W szczególności nigdy nie wolno używać parafilmu. Aspekty te są kluczowe, ponieważ jakość danych LC-MS zależy od materiałów użytych podczas przygotowania próbki i ekstrakcji metabolitów. Jakość danych powinna być zapewniona przed wygenerowaniem wykresów. Ponadto generowanie tych kompleksowych przestrzennych map metabolomicznych wymaga pobrania wszystkich próbek przyległych tkanek i ekstrakcji metabolitów ze wszystkich pobranych próbek, aby uniknąć luk w tych mapach. W związku z tym należy wziąć pod uwagę i odpowiednio zaplanować procedury pobierania, logistykę ekstrakcji metabolitów i analizy LC-MS oraz koszty.
Protokół ten może być modyfikowany w celu zaspokojenia potrzeb użytkownika na wiele sposobów. Na przykład polarność i rozpuszczalność rozpuszczalników stosowanych podczas ekstrakcji metabolitów będzie miała wpływ na to, jakie metabolity zostaną wykryte39. Aby zmaksymalizować różnorodność wykrywanych cech metabolitów w nieukierunkowanych analizach kartografii chemicznej, zaleca się połączenie wielu etapów ekstrakcji i rozpuszczalników. Na przykład metoda ta wykorzystuje dichlorometan, metanol i wodę jako rozpuszczalniki ekstrakcyjne, ponieważ umożliwiają one dokładne wykrywanie cząsteczek niepolarnych i polarnych 20,40. Jednak rozpuszczalniki te nie są uniwersalnie odpowiednie dla każdego eksperymentu ze stwardnieniem rozsianym, a naukowcy powinni wybierać rozpuszczalniki ekstrakcyjne w oparciu o cele swojego projektu. Podobnie, można stosować różne warunki LC-MS/MS, takie jak zastąpienie chromatografii z odwróconymi fazami chromatografią z normalnymi fazami. Alternatywne kolumny mogą być również używane do zbierania danych w odwróconych fazach zamiast chromatografii C8, chociaż empirycznie chromatografia C8 jest bardziej odporna na lipidy tkankowe i ma niższą częstotliwość zatykania. Koncepcyjnie protokoły te mogą być również stosowane do innych metod spektrometrii mas, takich jak chromatografia gazowa-spektrometria mas itp.
Alternatywnym podejściem jest obrazowanie za pomocą spektrometrii mas. Rzeczywiście, w przeciwieństwie do metod obrazowania opartych na spektrometrii mas, chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas z natury nie zachowuje informacji przestrzennej10. Podejścia oparte na kartografii chemicznej wypełniają tę lukę, uwzględniając lokalizację pobierania próbek w momencie konceptualizacji projektu, w metadanych próbki oraz na etapach przetwarzania danych. Mocną stroną tego podejścia do kartografii chemicznej, w przeciwieństwie do obrazowania spektrometrii mas, jest możliwość dostarczania pewnych adnotacji (pewność adnotacji poziomu 1 lub poziomu 2 Metabolomics Standards Initiative41), w przeciwieństwie do obrazowania spektrometrii mas, gdzie większość zastosowań opiera się na dokładnej masie tylko do adnotacji. Obrazowanie za pomocą spektrometrii mas umożliwi precyzyjne mapowanie przestrzenne, czasami aż do poziomu pojedynczej komórki, np. 42,43. W przeciwieństwie do tego, podejścia kartografii chemicznej umożliwiają mapowanie dystrybucji metabolitów między narządami na dużą skalę bez konieczności posiadania wysoce specjalistycznych umiejętności kriosekcji na całych zwierzętach. Kartografia chemiczna dostarcza dowodów uzupełniających dla wielu opracowywanych podejść transkryptomicznych przestrzennych, np.44, z tą zaletą, że skupia się na "warstwie omicznej najbliższej fenotypowi"45. Alternatywne metody kwantyfikacji obciążenia pasożytami obejmują pomiar bioluminescencji w czasie pobierania próbki6. Można również pobrać drobne segmenty, aby umożliwić mikroskopię konfokalną lub elektronową w celu oceny miejscowego obciążenia pasożytami i uszkodzeń tkanek. Homogenat wodny, który jest używany do ilościowego oznaczania cytokin w tym protokole i wcześniejszych publikacjach13, może być również wykorzystany do ilościowego określenia markerów uszkodzenia tkanek opartych na białkach.
Istnieje również wiele sposobów uzyskiwania modeli 3D odpowiednich do wykreślania wynikowych danych LC-MS. Oprócz sugerowanej tutaj metody, modele można kupić gotowe od różnych sprzedawców internetowych. Upewnij się, że warunki użytkowania są zgodne z zamierzonym użytkowaniem, zwłaszcza w odniesieniu do publikacji. Modele dużych narządów mogą być generowane de novo za pomocą skanerów 3D zgodnie z instrukcjami skanera. Istnieją alternatywy, takie jak MATLAB, do generowania i wizualizacji modeli 3D dla kartografii chemicznej46, ale zostały one przede wszystkim wdrożone przed opracowaniem 'ili16. MATLAB to pakiet narzędzi do analizy i programowania danych oferujący szeroką gamę aplikacji w wielu dziedzinach. Jednak MATLAB nie jest ani darmowy, ani open-source i wymaga znajomości interfejsów MATLAB, zwłaszcza biorąc pod uwagę, że MATLAB nie został opracowany do przetwarzania danych spektrometrii mas. Alternatywy tej proponowanej metody, a mianowicie SketchUp, Meshlab i 'ili, są swobodnie dostępne, przyjazne dla użytkownika i oferują podobne funkcje jak MATLAB do celów kartografii chemicznej.
Metoda ta jest skuteczna w odniesieniu do przygotowania próbki i ekstrakcji metabolitów. Rozwiązywanie problemów jest najczęściej konieczne na etapie akwizycji danych LC-MS. Wykracza to poza zakres tego artykułu. Czytelników kierujemy do znakomitych publikacji na temat rozwiązywania problemów z akwizycją danych LC-MS, w tym20,47. Podobnie, złożoność adnotacji metabolitów wykracza poza zakres skupienia się tej metody na generowaniu modeli 3D. Przydatne źródła na ten temat to 24,25,48,49.
Chociaż metoda ta skutecznie bada patogenezę choroby, istnieją ograniczenia tego podejścia, z których niektóre są powszechne w każdym eksperymencie metabolomicznym. Jednym z takich ograniczeń jest niski współczynnik adnotacji cech LC-MS50, który jest zależny od dostępności i jakości referencyjnych bibliotek spektralnych. Kolejnym ograniczeniem jest to, że protokół ten nie zachowuje mRNA ze względu na niekompatybilność odczynników do konserwacji RNA, takich jak RNAlater, z analizą LC-MS/MS. Jednak jakość białka jest odpowiednia do dalszych analiz, a zatem może zastąpić analizy oparte na mRNA.
Podejście kartografii chemicznej do patogenezy infekcji bezpośrednio odzwierciedla, w jaki sposób infekcje bakteryjne, wirusowe lub pasożytnicze rozwijają się w układach narządów i powodują miejscową chorobę. Analiza tych regionalnych podpróbek i generowanie modeli 3D ostatecznie pokazuje, w jaki sposób metabolity funkcjonują w przestrzeni trójwymiarowej, rzucając światło na te wcześniej nierozpoznane wymiary przestrzenne biologii molekularnej. Korzystając z tego protokołu, na przykład, lokalizacja metabolitów została porównana z obciążeniem pasożytem Trypanosoma cruzi. Wyniki wyjaśniły związek między patogenem a tkanką gospodarza, a także wykazały dynamikę metaboliczną progresji objawów choroby Chagasa6. Metody kartografii chemicznej zostały również zastosowane do różnych tematów, takich jak interakcja między człowiekiem a środowiskiem zbudowanym przez człowieka 51,52,53, skład chemiczny układów narządów, takich jak ludzka skóra 46 i płuca 54 oraz metabolizm roślin i interakcje środowiskowe55. Przyszłe zastosowania mogą obejmować ocenę miejscowej tolerancji i odporności na choroby lub związku między lokalnymi poziomami metabolitów, tropizmem patogenów i tropizmem chorobowym w modelach innych niż zakażenie trypanosomatidami. Podejście to powinno mieć również szerokie zastosowanie w celu rozszerzenia obecnych protokołów farmakokinetycznych, w celu oceny związku między lokalnymi poziomami leków w tkankach a metabolizmem leków w porównaniu z ogólnym kontekstem metabolicznym, uszkodzeniem tkanek i usuwaniem patogenów. Ogólnie rzecz biorąc, kartografia chemiczna pozwala na unikalną eksplorację rozkładu metabolitów w różnych typach próbek, z zastosowaniami obejmującymi patogenezę chorób, zdrowie ludzkie, interakcje człowiek-środowisko i dynamikę mikrobiologiczną.

Pasożyty trypanosomatidów składają się z gatunków Leishmania, trypanosomów afrykańskich (Trypanosoma brucei) i trypanosomów amerykańskich (Trypanosoma cruzi). Pierwotniaki Leishmania powodują leiszmaniozę, która obejmuje samoleczenie i samoograniczenie miejscowej leiszmaniozy skórnej, leiszmaniozę śluzówkowo-skórną, w której dochodzi do uszkodzenia tkanek błony śluzowej jamy ustnej, nosa i gardła, oraz leiszmaniozę trzewną z tropizmem pasożytniczym do narządów trzewnych powodującym gorączkę i powiększenie wątroby i śledziony1,2. T. brucei powoduje ludzką trypanosomatozę afrykańską (HAT), znaną również jako śpiączka, zgłaszaną głównie w krajach afrykańskich3. Objawy kliniczne obejmują powiększenie wątroby i śledziony, gorączkę, ból głowy, bóle mięśniowo-szkieletowe, powiększenie węzłów chłonnych i niedokrwistość w fazie hemo-limfatycznej, gdy pasożyty lokalizują się w krwiobiegu i naczyniach limfatycznych. Po tym następuje etap oponowo-mózgowy, w którym pasożyty lokalizują się w ośrodkowym układzie nerwowym i powodują zaburzenia snu, zmiany w zachowaniu i ostatecznie śmiertelną śpiączkę4. T. cruzi powoduje chorobę Chagasa, endemiczną dla obu Ameryk. Osoby zakażone doświadczają początkowego ostrego etapu, zwykle bezobjawowego, z szerokim tropizmem pasożytniczym. Około 10%-30% zakażonych osób doświadcza przewlekłych objawów stadium po dziesięcioleciach infekcji, charakteryzujących się megaprzełykiem, okrężnicą i powikłaniami sercowo-naczyniowymi5,6.
Metabolomika bada małe gatunki molekularne (50-1,500 Da), w tym związki biologiczne z pierwotnego lub wtórnego metabolizmu oraz związki pochodzące z zewnątrz, takie jak leki lub cząsteczki pochodzące z żywności. W kontekście interakcji gospodarz-patogen metabolomika może badać wpływ infekcji na środowisko metabolitów gospodarza, co ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dostępu do wpływu patogenu na gospodarza. Może również oceniać adaptacje patogenów do środowiska żywieniowego i immunologicznego gospodarza7,8,9. Spektrometria mas (MS) i spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) są powszechnymi narzędziami metabolomicznymi stosowanymi do identyfikacji, kwantyfikacji i charakterystyki metabolitów. To "omiczne" podejście można również zastosować do odkrywania biomarkerów i opracowywania leków10,11.
Biorąc pod uwagę specyficzny tropizm tkankowy pasożytów trypanosomatidów, przestrzenne analizy metabolomiczne mogą umożliwić znaczący wgląd w patogenezę chorób, które powodują. Mapowanie przestrzennego rozmieszczenia metabolitów ujawniło metabolity lokalnie dotknięte przewlekłym zakażeniem Trypanosoma cruzi w tkance serca myszy oraz ostre i długotrwałe zakażenie Trypanosoma cruzi w przewodzie pokarmowym myszy6,12,13. W szczególności kartografia chemiczna 3D wykazała rozdźwięk między utrzymywaniem się pasożyta a zmianami metabolicznymi w tkance serca myszy przewlekle zakażonych Trypanosoma cruzi. Metabolizm był najbardziej zaburzony w dolnych i wierzchołkowych odcinkach serca, zgodnych z miejscami objawów choroby Chagasa (tętniaki wierzchołkowe serca). Rodziny metabolitów zaburzonych przez zakażenie w określonych miejscach pracy serca i skorelowane z ciężkością choroby obejmują acylokarnityny i glicerofosfocholiny12,13,14. W przewodzie pokarmowym utrzymujące się zmiany metaboliczne zbiegały się z miejscami objawów choroby Chagasa: przełykiem i okrężnicą. W przeciwieństwie do tego, metabolizm jest ponownie normalizowany w miejscach niezwiązanych z objawami choroby Chagasa, takich jak jelito cienkie. Metabolity miejscowo zaburzone przez zakażenie w przewodzie pokarmowym obejmują acylokarnityny, glicerofosfocholiny, kinureninę, tryptofan i kwas cholowy. Ponadto analizy te umożliwiły zidentyfikowanie nowego metabolicznego mechanizmu tolerancji na chorobę Chagasa6. Zastosowanie tych metod do badania leiszmaniozy skórnej ujawniło istotne zaburzenia metaboliczne w miejscu zmiany, ale także specyficzne zmiany metaboliczne w przylegającej do zmiany, makroskopowo zdrowej tkance. Na przykład glutamina była zubożona w miejscu zmiany, podczas gdy glicerofosfocholiny w m/z (stosunek masy do ładunku) 200-299, 400-499, 500-599 i 600-699 były znacznie zwiększone w miejscu zmiany. PC (O-34:1) był zwiększony tylko w miejscach sąsiadujących ze zmianami chorobowymi15.
Celem tego manuskryptu jest pokazanie kroków niezbędnych do wygenerowania modeli 3D rozkładu metabolitów ("kartografia chemiczna") w zastosowaniu do modeli infekcji pasożytami trypanosomatydów (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Podejście to opiera się na kilku kluczowych osiągnięciach w kontekście metabolomiki i przetwarzania danych metabolomicznych, w szczególności na rozwoju oprogramowania 'ili do łatwego nanoszenia danych metabolomicznych na modele 3D16.

<table><tbody><tr><td>Probówki Eppendorf 1,5 ml</td><td>NA</td><td></td><td>NA dowolnej marki, w miarę dostępności</td></tr><tr><td>Butelka 1 L, pyrex</td><td>NA</td><td></td><td>NA dowolna marka, w miarę dostępności</td></tr><tr><td>Butla z podziałką 1 L, pyrex</td><td>NA</td><td></td><td>NA dowolna marka, w miarę dostępności</td></tr><tr><td>Probówki Eppendorf SafeLock 2 ml</td><td>VWR</td><td>20901-540</td><td>używać odpowiedniego modelu probówki dla dostępnego homogenizatora tkanek</td></tr><tr><td>Model 3D (generowany de-novo zgodnie z krokami protokołu lub zakupiony)</td><td>NA</td><td>NA</td> odpowiednio <td>do badanego systemu</td></tr><tr><td>Koralik 5 mm ze stali nierdzewnej</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa</td><td>płytka Fisher</td><td>3252449</td><td></td></tr><tr><td>AATTCCTCCAAGCAGCGGATA primer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>dowolna marka, w miarę dostępności; opublikowane w Piron, M. i wsp. Opracowanie testu PCR w czasie rzeczywistym do wykrywania Trypanosoma cruzi w próbkach krwi. Acta tropica. art. 103 ust. 3, art. 195 ust. 195; 200 (2007).</td></tr><tr><td>waga analityczna</td><td>NA</td><td>dowolnej</td><td>marki, w miarę dostępności</td></tr><tr><td>Starter ASTCGGCTGATCGTTTTCGA</td><td>NA</td><td>NA</td><td>dowolnej marki, w miarę dostępności; opublikowane w Piron, M. et al. Opracowanie testu PCR w czasie rzeczywistym do wykrywania Trypanosoma cruzi w próbkach krwi. Acta tropica. art. 103 ust. 3, art. 195 ust. 195; 200 (2007).</td></tr><tr><td>wirówka stołowa z mikrowirówką, probówką sokoła i płytką 96-dołkową</td><td>NA</td><td></td><td>NA dowolnej marki, w miarę dostępności</td></tr><tr><td>Komora bezpieczeństwa biologicznego</td><td>NA</td><td>NA</td><td>klasa II, typ A2; dowolna marka, w miarę dostępności</td></tr><tr><td>CAGCAAGCATCTATGCACTTAG Starter ACCCC</td><td>NA</td><td>NA</td><td>dowolna marka, w miarę dostępności; opublikowane w Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Szybkie oznaczanie ilościowe Trypanosoma cruzi w tkance gospodarza przez PCR w czasie rzeczywistym. Parazytologia molekularna i biochemiczna. art. 129 ust. 1, art. 53 ust. 53; 59 (2003).</td></tr><tr><td>kamera</td><td>NA</td><td>NA</td><td>dowolnej marki, w miarę dostępności. Kamera w telefonie komórkowym jest odpowiednia dla tego protokołu</td></tr><tr><td>system obrazowania z funkcją chemiluminescencji</td><td>NA</td><td>NA</td><td>dowolny system, jako dostępny</td></tr><tr><td>waciki</td><td>NA</td><td></td><td>NA dowolna marka, jako dostępne</td></tr><tr><td>rękawice kriogeniczne</td><td>VWR</td><td>97008-208</td><td>zastąp na dowolną markę, jako dostępne</td></tr><tr><td>nożyczki preparacyjne</td><td>NA</td><td>NA</td><td>dowolna marka, jako dostępne</td></tr><tr><td>suchy lód</td><td>NA</td><td>NA</td><td>dowolna marka, jako dostępne</td></tr><tr><td>kleszcze o ekstra długości</td><td>NA</td><td>NA</td><td>dowolna marka, jako dostępna</td></tr><tr><td>lodówka łatwopalna</td><td>NA</td><td>NA</td><td>dowolna marka, jako dostępne</td></tr><tr><td>pojemniki do przechowywania zamrażarek na probówki do mikrowirówek</td><td>NA</td><td>NA</td><td>dowolna marka, jako dostępna</td></tr><tr><td>dygestorium</td><td>NA</td><td>NA</td><td>dowolna marka, jako dostępna</td></tr><tr><td>masa o wysokiej rozdzielczości spektrometr</td><td>NA</td><td>NA</td><td>dowolnej marki, w miarę dostępności, np. ThermoFisher Q-Exactive Plus (numer katalogowy 0726030)</td></tr><tr><td>wiaderko na lód</td><td>NA</td><td></td><td>NA dowolnej marki, w miarę dostępności</td></tr><tr><td>oprogramowanie NA</td><td>ili.embl.de</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane</td><td>Covetrus</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>duże tupperware</td><td>NA</td><td>NA</td><td>dowolnej marki, w miarę dostępności; wystarczająco duże, aby wygodnie pomieścić mysz, wacik</td></tr><tr><td>acetonitryl klasy LC-MS</td><td>Fisher Optima</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Dicholoometan klasy LC-MS</td><td>Fisher Optima</td><td>D151-4</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy klasy LC-MS</td><td>Fisher Optima</td><td>A11750</td><td></td></tr><tr><td>Metanol klasy LC-MS</td><td>Fisher Optima</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy LC-MS</td><td>Fisher Optima</td><td>W64</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna do chromatografii cieczowej</td><td>Phenomenex</td><td>00B-4499-AN</td><td>może zostać zmieniona na inne marki i modele, stosownie do metabolitów będących przedmiotem zainteresowania,</td></tr><tr><td>wkład ochronny kolumny do chromatografii cieczowej</td><td>Phenomenex</td><td>AJ0-8784</td><td>może zostać zmieniony na inne marki i modele, zgodnie z potrzebami metabolitów</td></tr><tr><td>Uchwyt kolumny do chromatografii cieczowej</td><td>Phenomenex</td><td>AJ0-9000</td><td>może zostać zmieniony na inne marki i modele, odpowiednio dla metabolitów będących przedmiotem zainteresowania:</td></tr><tr><td>ciekły azot</td><td>NA</td><td></td><td>, dowolna marka, w miarę dostępności,</td></tr><tr><td>lucyferyna</td>, <td>Goldbio</td>, <td>LUCK-1G</td><td></td></tr><tr><td>, oprogramowanie MeshLab</td><td>https://www.meshlab.net/</td> <td>NA</td><td></td>,</tr><tr><td>oprogramowanie Meshmixer</td><td>https://www.meshmixer.com/</td> <td>NA</td><td></td></tr>, <tr><td>MS calibrant</td><td>NA,</td><td>NA</td><td>odpowiedni dla dostępnego instrumentu</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania danych MS</td><td>NA</td><td>NA</td><td>dostępnych jest wiele opcji; autorzy polecają oprogramowanie MZmine</td></tr><tr><td>MSConvert</td><td>http://proteowizard.sourceforge.net/</td> <td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-ONE-W</td><td>inne modele nanodrop są również odpowiednie</td></tr><tr><td>końcówki do pipet p1000</td><td>NA</td><td>NA NA</td><td>użyj odpowiedniej marki, aby pasowały do dostępnych pipet</td></tr><tr><td>P1000 Pipetor</td><td>NA</td><td></td><td>NA dowolna marka, w miarę dostępności</td></tr><tr><td>P20 końcówki do pipet</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Użyj odpowiedniej marki, aby pasował do dostępnych pipet</td></tr><tr><td>P20 Pipeta</td><td>NA</td><td></td><td>NA dowolna marka, w miarę dostępności</td></tr><tr><td>P200 Końcówki do pipet</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Użyj odpowiedniej marki, aby dopasować dostępne pipety</td></tr><tr><td>P200 pipettor</td><td>NA</td><td></td><td>NA dowolna marka, w miarę dostępności</td></tr><tr><td>środki ochrony osobistej (rękawice, fartuch laboratoryjny, okulary/gogle ochronne; osłona twarzy)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>dowolna marka, jako dostępna</td></tr><tr><td>Q-Plex Mouse Cytokine - Screen (16-Plex)</td><td>Quansys biosciences</td><td>110949MS</td><td>może zastąpić innymi testami cytokin na bazie białek, takimi jak inne komercyjne zestawy cytokin ELISA</td></tr><tr><td>Quick-DNA Miniprep Plus Kit (200 preparatów)</td><td>Zymo</td><td>D4069</td><td>zastąp dowolnym marką zestawu do ekstrakcji DNA ssaków, ponieważ jest dostępny</td></tr><tr><td>termocykler w czasie rzeczywistym</td><td>NA</td><td></td><td>NA dowolnej marki, jako dostępny</td></tr><tr><td>solniczka lub zaparzacz do herbaty</td><td>NA</td><td>NA</td><td>dowolnej marki; aby zawierał wacik nasączony izofluranem i zapobiegał kontaktowi ze skórą myszy</td></tr><tr><td>Oprogramowanie SketchUp</td><td>https://www.sketchup.com/</td><td></td> NA <td></td></tr><tr><td>próbka kleszcze</td><td>NA</td><td>NA</td><td>dowolnej marki, jako dostępne</td></tr><tr><td>speedvac z probówką do mikrowirówek i płytką 96-dołkową</td><td>NA</td><td></td><td>NA dowolna marka, jako dostępne</td></tr><tr><td>oprogramowanie do arkuszy kalkulacyjnych</td><td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel</td><td>NA</td><td>można zastąpić innym oprogramowaniem do zarządzania arkuszami kalkulacyjnymi, w zależności od przypadku</td></tr><tr><td>sulfachloropirydazyna</td><td>Sigma</td><td>S9882-100G</td><td></td></tr><tr><td>sulfadymitoksyna</td><td>Sigma</td><td>S7007-10G</td><td></td></tr><tr><td>Sybr zielona mieszanina reakcyjna qPCR</td><td>Fisher</td><td>A25780</td><td>może zastąpić innymi mieszankami reakcyjnymi Sybr green qPCR, zgodnie z potrzebami</td></tr><tr><td>TCCCTCTCATCAGTTCTAT starter GGCCCA</td><td>NA</td><td></td><td>NA dowolnej marce, zgodnie z dostępnością; opublikowane w Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Szybka ocena ilościowa Trypanosoma cruzi w tkance gospodarza metodą PCR w czasie rzeczywistym. Parazytologia molekularna i biochemiczna. art. 129 ust. 1, art. 53 ust. 53; 59 (2003).</td></tr><tr><td>homogenizator tkankowy</td><td>NA</td><td>NA</td><td>dowolnej marki, w zależności od dostępności, np. Qiagen TissueLyser II, numer katalogowy 85300, z zestawem adapterów TissueLyser (2 x 24), numer katalogowy 69982</td></tr><tr><td>próbki tkanek</td><td>NA</td><td>NA z</td><td>odpowiedniego modelu infekcji</td></tr><tr><td>Dozownik jednokulkowy TissueLyser</td><td>Qiagen</td><td>69965</td><td></td></tr><tr><td>UHPLC</td><td>NA</td><td>BRAK</td><td>dowolnej marki, w miarę dostępności, np. ThermoFisher Vanquish (numer katalogowy IQLAAAGABHFAPUMBHV)</td></tr><tr><td>zamrażarka ultraniskotemperaturowa (-80)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>dowolna marka, w miarę dostępności</td></tr><tr><td>kąpiel ultradźwiękowa</td><td>NA</td><td></td><td>NA dowolny system, jako dostępny</td></tr><tr><td>mokry lód</td><td>NA</td> NA <td>dowolna marka, jako dostępna</td><td></td></tr><tr><td>bezstrefowa folia uszczelniająca</td><td>VWR&</td><td>nbsp; Nr kat. 490007-390</td><td></td></tr></tbody></table>

podejścia kartografii chemicznej do badania zakażenia trypanosomatydem

Chemical Cartography Approaches to Study Trypanosomatid Infection

Tropizm patogenów i tropizm chorób odnoszą się do lokalizacji tkanek selektywnie skolonizowanych lub uszkodzonych przez patogeny, co prowadzi do miejscowych objawów choroby. Pasożyty trypanosomatydowe zakaźne dla ludzi obejmują Trypanosoma cruzi, czynnik wywołujący chorobę Chagasa; Trypanosoma brucei, czynnik wywołujący śpiączkę; i gatunki Leishmania, czynniki wywołujące leiszmaniozę. Łącznie dotykają one 20 milionów ludzi na całym świecie. Pasożyty te wykazują specyficzny tropizm: serce, przełyk, okrężnica dla T. cruzi, tkanka tłuszczowa, trzustka, skóra, układ krążenia i ośrodkowy układ nerwowy dla T. brucei, skóra dla dermotropowych szczepów Leishmania oraz wątroba, śledziona i szpik kostny dla trzewnych szczepów Leishmania. Perspektywa przestrzenna jest zatem niezbędna do zrozumienia patogenezy choroby trypanosomatidów. Kartografia chemiczna generuje wizualizacje 3D obfitości małych cząsteczek generowanych za pomocą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas, w porównaniu z parametrami mikrobiologicznymi i immunologicznymi. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób kartografia chemiczna może być stosowana do badania procesów patogennych podczas infekcji trypanosomatydem, począwszy od systematycznego pobierania próbek tkanek i ekstrakcji metabolitów, następnie akwizycji danych za pomocą chromatografii cieczowej i tandemowej spektrometrii mas, a skończywszy na generowaniu map 3D rozmieszczenia metabolitów. Metoda ta może być stosowana do wielu pytań badawczych, takich jak zapotrzebowanie na składniki odżywcze do kolonizacji tkanek przez T. cruzi, T. brucei lub Leishmania, immunometabolizm w miejscach infekcji oraz związek między lokalnymi zaburzeniami metabolicznymi tkanek a klinicznymi objawami choroby, co prowadzi do kompleksowego wglądu w patogenezę choroby trypanosomatidów.

Liczba uzyskanych cech metabolitów zależy od analizowanego rodzaju tkanki oraz parametrów przetwarzania danych. Na przykład protokół ten został wykorzystany do analizy przestrzennego wpływu zakażenia T. cruzi na metabolom przewodu pokarmowego w mysim modelu zakażenia T. cruzi. Wcześniejszym pracach samce myszy C3H/HeJ otrzymały dootrzewnowo iniekcję 1 000 pasożytów T. cruzi szczepu CL + luc32,6. Zwierzęta uśmiercono 12 lub 89 dni po zakażeniu, a następnie przeprowadzono analizę kartografii chemicznej 13 sąsiednich segmentów przewodu pokarmowego zgodnie z opisem w niniejszym protokole. Analiza ta pozwoliła na stworzenie tabeli zawierającej 5 502 cechy, które następnie zwizualizowano w 3D, stosując kroki opisane w tym protokole. Podejście to umożliwia wizualizację cech metabolitów u poszczególnych zwierząt, które wykazują wysokie stężenie w miejscach dużego obciążenia pasożytami (kynurenina, Rycina 2B vs. obciążenie pasożytami, Rycina 2A), metabolitów o zróżnicowanym rozkładzie w obrębie regionów tkankowych (glutamina, Rycina 2C) oraz cech metabolitów występujących na porównywalnych poziomach w jelicie cienkim i grubym (LPE 16:0 Rycina 2D). Kynureninę wybrano do wizualizacji ze względu na jej znaną zależność od stanu zapalnego oraz wcześniejsze publikacje dotyczące zdolności metabolitów pochodnych kynureniny do regulowania obciążenia T. cruzi33. Modele uczenia maszynowego oparte na random forest wykazały wcześniej powiązanie między poziomami kynureniny a statusem zakażenia6. Glutaminę wybrano do wizualizacji na podstawie wcześniejszych publikacji wykazujących związek między dostępnością glutaminy in vitro a wrażliwością T. cruzi na leki34. Zróżnicowany rozkład potwierdzono za pomocą regresji logistycznej, p &lt; 0.05. LPE 16:0 wybrano po wizualnej inspekcji danych w celu zidentyfikowania cech metabolitów występujących na porównywalnych poziomach w różnych miejscach tkankowych.
<img alt="Schemat przebiegu analizy LC-MS; homogenizacja tkanek, ekstrakcja DNA, etapy przetwarzania metabolitów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63255/63255fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przegląd protokołu. Ilustracja została stworzona za pomocą BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63255/63255fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rozkład metabolitów w jelitach; mapa ciepła w skali logarytmicznej, obciążenie pasożytami do LPE 16:0, schemat." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63255/63255fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Analiza kartografii chemicznej. Samcom myszom C3H/HeJ wstrzyknięto domięśniowo 1 000 pasożytów T. cruzi CL+luc32. Zwierzęta uśmiercono 12 lub 89 dni po infekcji, a następnie pobrano i systematycznie podzielono trakt pokarmowy (krok 1)6. Metabolity wyekstrahowano zgodnie z krokiem 2 i przeanalizowano za pomocą LC-MS/MS. Generowanie modelu 3D wykonano przy użyciu oprogramowania SketchUp (krok 5), a dane naniesiono w 3D zgodnie z krokiem 6. (A) Rozkład pasożytów u konkretnej myszy, 12 dni po infekcji. (B) Rozkład metabolitu kynureniny u tej samej myszy, 12 dni po infekcji. (C) Średni rozkład glutaminy u zainfekowanych myszy, 89 dni po infekcji. (D) Porównywalne poziomy m/z 454,292, czas retencji 2,929 min, zidentyfikowany jako 2-heksadekanoylo-sn-glycero-3-fosfoetanolamina (LPE 16:0), u tej samej myszy co na rysunkach A i B, w jelicie cienkim i grubym. Próbki i dane wygenerowano w6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63255/63255fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół opisuje kroki do wygenerowania modelu 3D rozkładu metabolitów podczas infekcji trypanosomatydem, w tym pobieranie próbek, ekstrakcję metabolitów, przegląd akwizycji danych z chromatografii cieczowej i spektrometrii mas tandemowej, generowanie modeli 3D i wreszcie wizualizację danych.

Podejścia kartografii chemicznej do badania zakażenia trypanosomatydem

Pathogen tropism and disease tropism refer to the tissue locations selectively colonized or damaged by pathogens, leading to localized disease symptoms. ...

Protokół ten może być wykorzystany do budowy modeli 3D dystrybucji metabolitów i pasożytów. Może to pomóc w zrozumieniu związku między lokalnymi zaburzeniami metabolicznymi tkanek, rozmieszczeniem pasożytów i klinicznymi objawami choroby. Główną zaletą tej metody jest to, że umożliwia ona mapowanie w skali na żywo między narządami rozmieszczenia metabolitów w porównaniu z dystrybucją patogenów oraz ich analizę statystyczną.Teoretycznie kartografia chemiczna może badać rozwój i wpływ choroby na gospodarza poprzez bezpośrednie badanie metabolitów odpowiedzialnych za patogenezę i efekty leczenia. Zacznij od zważenia i oznaczenia probówek. Tkanki należy systematycznie ciąć po jednym fragmencie na probówkę.Zważyć probówki zawierające próbki tkanek w celu określenia masy próbki i zapisania masy. Aby przeprowadzić homogenizację próbek tkanek na bazie wody, dodaj jeden pięciomilimetrowy koralik ze stali nierdzewnej do dwóch mililitrowych probówek mikrowirówek zawierających próbki tkanek. Przygotuj jedną pustą probówkę zawierającą wodę klasy LCMS.Uzupełnić objętość próbki do 500 mikrolitrów na 50 miligramów, dodając schłodzoną wodę klasy LCMS, a następnie homogenizować próbki w częstotliwości 25 Hz przez trzy minuty. Próbki powinny być dokładnie zhomogenizowane. Zebrać 1/10 objętości homogenizacji do ekstrakcji DNA i innych analiz.Dodać do homogenatu lodowaty metanol klasy LCMS wzbogacony czterema mikromolami sulfachloropirydazyny. Homogenizować próbki w homogenizatorze tkankowym z częstotliwością 25 Hz przez trzy minuty, a następnie wirować przez 10 minut. Zebrać równą objętość supernatantu na płytkę 96-dołkową i utrzymać stałą pozostałość na lodzie podczas zbierania supernatantów.Całkowicie wysuszyć wodny supernatant ekstrakcyjny przy użyciu maksymalnej prędkości i bez podgrzewania. Przeprowadzić ekstrakcję organiczną, dodając 1 000 mikrolitrów wstępnie schłodzonego metanolu dichlorometanowego wzbogaconego dwoma mikromolowymi sulfachloropirydazynami na 50 miligramów próbki pozostałości stałej. Homogenizować próbki w częstotliwości 25 Hz przez pięć minut, a następnie wirować przez 10 minut.Zebrać równą objętość supernatantu na płytkę 96-dołkową. Zrób zdjęcie interesującego nas narządu. Kliknij Plik, a następnie Importuj w programie SketchUp, aby zaimportować zdjęcie interesujących nas narządów.Kliknij narzędzie linii i wybierz opcję odręczną. Użyj narzędzia ołówka, aby obrysować i narysować kontury interesujących nas narządów. Wybierz narzędzie do pchania/ciągnięcia i pociągnij w górę zacieniony obszar, aby przekonwertować rysunek z 2D na 3D.Wyeksportuj plik w formacie dae, klikając Eksport pliku, a następnie Model 3D. Aby poprawić realizm modelu, zaimportuj go do oprogramowania MeshLab, wybierając opcję Plik, a następnie klikając opcję Importuj siatkę. Wybierz opcję Model krawędziowy w górnym menu, a następnie wybierz opcję Filtry, kliknij pozycję Ponowne tworzenie siatki, uproszczenie i rekonstrukcja, a następnie pozycję Punkt środkowy powierzchni podziału.Pozostaw wszystkie wartości jako domyślne i wybierz pozycję Zastosuj dwukrotnie. Wyeksportuj model w formacie sdl, klikając Plik, następnie Eksportuj siatkę jako, a następnie wybierając SDL File Format z menu rozwijanego plików typu. Zapisz to i wybierz OK w następnym menu podręcznym.Otwórz oprogramowanie Meshmixer i zaimportuj plik sdl wygenerowany w poprzednim kroku. Użyj narzędzi do rzeźbienia, pędzli, rzeźby smoka, pędzli, nadmuchiwania, aby wyciągnąć powierzchnie modelu, które należy zaokrąglić. Zapisz go w formacie sdl, gdy model uzyska pożądany wygląd, klikając Plik i Eksportuj.Nazwij plik zgodnie z potrzebami, wybierz format binarny SDL i zapisz. Otwórz model 3D w oprogramowaniu MeshLab. Kliknij OK w wyskakującym oknie przetwarzania po otwarciu.Uzyskaj współrzędne X, Y i Z dla każdego miejsca próbkowania, wybierając narzędzie Wskaż punkty, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy w regularnych odstępach czasu na powierzchni modelu 3D. Po wybraniu wszystkich żądanych współrzędnych kliknij przycisk Zapisz znajdujący się na górze w wyskakującym oknie formularza. W arkuszu kalkulacyjnym otwórz plik pp wygenerowany w poprzednim kroku.Dostosuj wyświetlanie danych, klikając pozycję Tekst danych do kolumn, a następnie Rozdzielany. Kliknij Dalej, a następnie wybierz Spacja i kliknij Zakończ. Sformatuj go tak, aby w komórkach arkusza kalkulacyjnego pozostały tylko wartości liczbowe, wybierając pozycję Szukanie narzędzia głównego i wybierz pozycję Zamień.W polu Znajdź wpisz Y równy płaszcz i pozostaw pole zamiany puste. Kliknij Zamień wszystko, a następnie OK. Powtórz dla X równego koloru i dla Z dla równego płaszcza, a dla warstwy równego dla płaszcza ukośnik większy niż. W tabeli oprogramowania arkusza kalkulacyjnego wiersze odpowiadają każdej pozycji, a kolumny danym.Wklej odpowiednie metadane i obfitość funkcji metabolitów w kolejnych kolumnach arkusza kalkulacyjnego. W kolumnie promień wprowadź żądany rozmiar punktów próbkowania, które mają być wizualizowane na modelu. Określ empirycznie wartości promienia i zapisz plik w formacie CSV.Przejdź do oprogramowania ELI Plot, wybierz Powierzchnia, a następnie przeciągnij i upuść utworzony model 3D do okna przeglądarki. Przeciągnij i upuść utworzoną tabelę elementów do tego samego okna przeglądarki. Użyj legendy w prawym dolnym rogu, aby rzutować żądaną kolumnę danych na model 3D.Kolejno wybierz każdą kolumnę danych, aby ocenić rozkład tej cechy metabolitu w modelu 3D. Analiza ta doprowadziła do powstania tabeli 5 502 obiektów i ich wizualizacji w 3D. Podejście to umożliwia wizualizację cech metabolitów u poszczególnych zwierząt, które są wysokie w miejscu dużego obciążenia pasożytami, metabolitów o zróżnicowanej dystrybucji w różnych regionach tkanek oraz cech metabolitów, które występują na porównywalnych poziomach w jelicie cienkim i grubym.Ważne jest, aby pamiętać o używaniu wyłącznie rozpuszczalników LCMS oraz o zebraniu wszystkich przyległych tkanek i ekstrakcji metabolitów ze wszystkich pobranych próbek, aby uniknąć luk w mapach przestrzennych. Technika ta może być wykorzystana do zbadania zapotrzebowania na składniki odżywcze do kolonizacji tkanek przez pasożyty Trypanosomatidów w celu zrozumienia patogenezy choroby poprzez porównanie map rozmieszczenia metabolitów 3D po zakażeniu.

chemical-cartography-approaches-to-study-trypanosomatid-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten manuskrypt opisuje użycie bioluminescencyjnego szczepu afrykańskich trypanosomów do śledzenia późnych stadiów infekcji i pokazuje, jak obrazowanie na żywo in vivo może być wykorzystane do wizualizacji infekcji w ośrodkowym układzie nerwowym w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie bioluminescencyjne w celu wykrycia późnego stadium zakażenia trypanosomatozą afrykańską

Afrykańskie trypanosomy hodowane in vitro ulegają zmienności antygenowej w niskim tempie, tak że populacje składają się z pasożytów wyrażających dominujący wariant typu glikoproteiny powierzchniowej (VSG) i małej populacji "przełączonych" wariantów.  Protokół ten opisuje szybką metodę wykrywania i ilościowego określania tych populacji.

Wykrywanie zmiany glikoproteiny powierzchniowej wariantu Trypanosoma brucei za pomocą magnetycznego sortowania komórek i cytometrii przepływowej

W tym protokole, fluorescencyjnie znakowane T. cruzi zostały wstrzyknięte do przezroczystych larw danio pręgowanego, a ruchliwość pasożyta zaobserwowano in vivo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem arkusza świetlnego.

Ustanowienie larw danio pręgowanego jako modelu zwierzęcego do badania ruchliwości Trypanosoma cruzi in vivo

Czynnik choroby Chagasa wywołany przez Trypanosoma cruzi powoduje długotrwałe, bezobjawowe infekcje, które nagle przekształcają się w klinicznie rozpoznaną patologię. Poniższy protokół badawczy opisuje krótkoterminowe rodzinne badanie epidemiologiczne mające na celu rozwikłanie infekcji T. cruzi przenoszonej drogą płciową z rodzica na potomstwo.

Przenoszenie płciowe amerykańskich trypanosomów z samców i samic na naiwnych partnerów

Ta metoda oddzielania trypanosomów od krwi zależy od tego, czy ich ładunek powierzchniowy jest mniej ujemny niż u komórek krwi ssaków. Zakażoną krew umieszcza się i poddaje działaniu środka ciężkości na kolumnie wymieniacza anionowego. Ta metoda, najbardziej odpowiednia diagnostyka trypanosomatozy afrykańskiej, dostarcza oczyszczonych pasożytów do badań immunologicznych, biologicznych, biochemicznych, farmaceutycznych i biologii molekularnej.

Oczyszczanie trypanosomów zewnątrzkomórkowych, w tym afrykańskich, z krwi za pomocą wymieniaczy anionowych (kolumny dietyloaminoetylocelulozowe)

Obecny protokół opisuje mikroskopię fluorescencyjną z użyciem arkuszy świetlnych oraz zautomatyzowane metody wspomagane oprogramowaniem, aby wizualizować i precyzyjnie określać ilościowo proliferujące i uśpione pasożyty Trypanosoma cruzi oraz limfocyty T w nienaruszonych, oczyszczonych organach i tkankach. Techniki te zapewniają wiarygodny sposób oceny wyników leczenia i oferują nowe informacje na temat interakcji pasożyt-gospodarz.

Ilościowe obrazowanie 3D komórek zakażonych Trypanosoma cruzi, uśpionych amastigotów i limfocytów T w nienaruszonych, oczyszczonych narządach

To badanie pokazuje szczegółowy protokół do przeprowadzenia mikroskopii ekspansji ultrastruktury w trzech etapach cyklu życia in vitro Trypanosoma cruzi, patogenu odpowiedzialnego za chorobę Chagasa. Uwzględniamy zoptymalizowaną technikę białek cytoszkieletu i znakowania pan-proteomu.

Mikroskopia ekspansji ultrastrukturalnej w trzech etapach cyklu życia Trypanosoma cruzi in vitro

Na całym świecie medyczne pasożyty krwi były automatycznie badane za pomocą prostych kroków na niskokodowej platformie AI. Udoskonalono prospektywną diagnostykę filmów krwi dzięki zastosowaniu metody wykrywania i klasyfikacji obiektów w hybrydowym modelu głębokiego uczenia. Współpraca aktywnego monitorowania i dobrze wyszkolonych modeli pomaga zidentyfikować punkty zapalne transmisji trypanosomów.

Doskonała automatyczna identyfikacja pasożytów trypanosomów dzięki zastosowaniu hybrydowego modelu głębokiego uczenia

Opisujemy metodę badania, jak pH reaguje na sygnały środowiskowe w glikosomy krwiobiegowej formy afrykańskich trypanosomów. Podejście to obejmuje czujnik białka dziedzicznego wrażliwego na pH w połączeniu z cytometrią przepływową w celu pomiaru dynamiki pH, zarówno jako test przebiegu w czasie, jak i w formacie wysokoprzepustowego badania przesiewowego.

Pomiar dynamicznych zmian pH glikosomalnego u żywego Trypanosoma brucei

Protokół tutaj opisuje szczegółowe kroki do przeprowadzenia badań skuteczności leków w bioluminescencyjnym modelu zakażenia Trypanosoma cruzi, z naciskiem na pozyskiwanie, analizę i interpretację danych. Dostępne są również procedury rozwiązywania problemów i kontroli jakości w celu zminimalizowania problemów technicznych.

Demistyczne obrazowanie bioluminescencyjne in vivo mysiego modelu choroby Chagasa do badań skuteczności leków

Poznaj metody kartografii chemicznej do badania zakażenia trypanosomatydem. Protokół obejmuje pobieranie próbek tkanek, ekstrakcję metabolitów oraz generowanie modeli 3D w celu wizualizacji rozkładu metabolitów i pasożytów.

Podejścia kartografii chemicznej do badania zakażenia trypanosomatydem

Przeglądaj więcej filmów