Name: Modelowanie krwotoku śródkomorowego noworodka poprzez dokomorowe wstrzyknięcie hemoglobiny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-25T12:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Poznaj model krwotoku śródkomorowego noworodka z wykorzystaniem dokomorowego wstrzyknięcia hemoglobiny u szczurów. Ta metoda umożliwia badanie patofizjologii hydrocefalii pourazowej i testowanie nowych strategii terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JMS otrzymał dofinansowanie od NIH/NINDS R01 NS110793 i K12 (Neurosurgeon Research Career Development Program). BAM otrzymał dofinansowanie od NIH/NINDS K08 NS112580-01A1, University of Kentucky Neuroscience Research Priority Area Award oraz Hydrocephalus Association Innovator Award.

UWAGA: Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt instytucji. Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, odczynników, sprzętu i oprogramowania użytego w tym protokole można znaleźć w Tabeli materiałów.
1. Przygotowanie roztworów hemoglobiny i płynu mózgowo-rdzeniowego
<ol>
	<li>Przygotować sterylny sztuczny roztwór płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF), dodając 500 μl roztworu aCSF do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml i przechowywać na lodzie.</li>
	<li>Przygotować sterylny roztwór hemoglobiny o stężeniu 150 mg/ml, dodając 75 mg hemoglobiny do 500 μl aCSF w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml i przechowywać na lodzie.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zwierzęcia do wstrzyknięcia
<ol>
	<li>Ustaw poduszkę grzewczą na średnie ustawienie, aby utrzymać temperaturę ciała szczura.</li>
	<li>Znieczulenie szczurów w 4. dobie porodowej (P4) w komorze indukcyjnej wypełnionej 3% izofluranem. 
	UWAGA: Potwierdź wystarczające znieczulenie, stosując reakcję na szczypanie palca/ogona co 15 minut. Monitoruj znieczulenie z wizualną obserwacją koloru tkanek, temperatury ciała i częstości oddechów.</li>
	<li>Znieczulonemu szczurowi należy podać środek przeciwbólowy za pomocą podskórnego wstrzyknięcia karprofenu w dawce 5 mg/kg.</li>
	<li>Umieścić znieczulonego szczura leżącego w aparacie stereotaktycznym z nosem umieszczonym w adapterze anestezjologicznym ze stałym przepływem 1,5% izofluranu.</li>
	<li>Dokręć niepękające pręty uszne na zewnętrznym przewodzie słuchowym, aby zabezpieczyć głowę. 
	UWAGA: Zastosuj maść weterynaryjną, aby oczy były nawilżone, jeśli oczy są otwarte w wieku wstrzyknięcia.</li>
	<li>Wyczyść głowę, na przemian sterylnymi aplikatorami z bawełnianą końcówką nasączonymi betadyną i 70% etanolem.
	<ol>
		<li>Przyłóż aplikator nasączony betadyną do środka skóry głowy i rozprowadź betadynę okrężnymi ruchami, przesuwając się na zewnątrz.</li>
		<li>Powtórzyć krok 2.6.1.1 z aplikatorem nasączonym etanolem.</li>
		<li>Powtórz krok 2.6.1.1 i krok 2.6.1.2 3x.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zastosuj sterylną serwetę chirurgiczną, aby chronić pole operacyjne. </li>
	<li>Za pomocą sterylnego skalpela wykonaj 0,3 cm nacięcie pionowo w dół środka głowy, aby odsłonić bregmę czaszki. 
	UWAGA: W przypadku wstrzykiwania z lambdy, należy odsłonić lambdę czaszki zamiast bregmy.</li>
	<li>Użyj sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką, aby wysuszyć obszar.</li>
</ol>
3. Konfiguracja wtryskiwacza stereotaktycznego
<ol>
	<li>Pobrać roztwór hemoglobiny przygotowany w kroku 1.2 do sterylnej strzykawki o pojemności 0,3 ml z igłą 30G i umieścić strzykawkę w stereotaktycznym systemie wstrzykiwań. 
	UWAGA: W przypadku generowania warunków kontrolnych należy pobrać roztwór płynu mózgowo-rdzeniowego przygotowany w kroku 1.1 do sterylnej strzykawki o pojemności 0,3 ml i postępować zgodnie z protokołem.</li>
	<li>Włącz interfejs wtryskiwacza stereotaktycznego i kliknij przycisk Konfiguracja, aby wprowadzić ustawienia głośności i szybkości wtrysku.
	<ol>
		<li>Kliknij Głośność i ustaw głośność na 20 000 nL (20 μL).</li>
		<li>Kliknij Szybkość infuzji i ustaw szybkość na 8 000 nL/min (8 μL/min).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjdź z konfiguracji, klikając przycisk Resetuj pos.</li>
	<li>Przepłucz końcówkę igły, klikając przycisk Zaparzanie, aż na końcu igły pojawi się mała kulka roztworu hemoglobiny.</li>
	<li>Delikatnie odsączyć roztwór hemoglobiny z końcówki igły za pomocą sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką.</li>
</ol>
4. Wstrzyknięcie zwierzęcia
<ol>
	<li>Ustaw bregma jako zero w stereotaktycznym systemie wstrzykiwaczy, regulując przyśrodkowo-boczne i przednio-tylne położenie strzykawki przed opuszczeniem końcówki przepłukanej igły strzykawki, aby delikatnie dotknąć czaszki na bregmie. 
	UWAGA: W przypadku wstrzykiwania z wyrażenia lambda należy ustawić wartość lambda na zero.</li>
	<li>Zidentyfikuj współrzędne wyboru.
	<ol>
		<li>W przypadku wstrzykiwania z bregmy, u szczurów P4 opisanych tutaj, należy użyć 1,5 mm bocznej, 0,4 mm przedniej i 2,0 mm głębokości od bregma.</li>
		<li>W przypadku wstrzykiwania z lambdy należy użyć następujących współrzędnych dla szczurów P4: 1,1 mm boczny, 4,6 mm z przodu i 3,3 mm głębokości od lambda.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podnieś igłę strzykawki 1 cm nad czaszkę, aby oczyścić skórę głowy. Gdy strzykawka zostanie podniesiona, przystąp do ustawiania współrzędnych przyśrodkowo-bocznych i przednio-tylnych.</li>
	<li>Opuścić igłę strzykawki, aby delikatnie dotknąć czaszki. Sprawdź, czy igła dotyka czaszki.</li>
	<li>Ustaw współrzędną grzbietowo-brzuszną w okresie 30 sekund. 
	UWAGA: Podczas ustawiania współrzędnej grzbietowo-brzusznej igła przebije czaszkę. Należy dołożyć starań, aby strzykawka przeszła przez czaszkę bez deformacji czaszki. Deformacji czaszki unika się, powoli wycofując igłę wzdłuż współrzędnej grzbietowo-brzusznej, jeśli wystąpi deformacja, a następnie umieszczając igłę z powrotem wzdłuż tej samej trajektorii. Dzięki temu igła przechodzi przez otwór w czaszce z mniejszą siłą i bez deformacji.</li>
	<li>W interfejsie wtryskiwacza stereotaktycznego kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć wstrzykiwanie.</li>
	<li>Po zakończeniu wstrzykiwania należy pozostawić igłę strzykawki na miejscu na 2 minuty, aby zminimalizować cofanie się roztworu.</li>
	<li>Powoli wyjmować strzykawkę wzdłuż współrzędnej grzbietowo-brzusznej przez 2 minuty, aż końcówka igły znajdzie się 2 cm nad skórą głowy.</li>
	<li>Obróć ramię wtryskiwacza stereotaktycznego z dala od pola operacyjnego.</li>
</ol>
5. Opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Zamknij skórę głowy szwem monofilamentowym 6-0. Wykonaj jeden prosty przerywany szew w środku nacięcia o długości 0,3 cm.</li>
	<li>Wyjmij szczeniaka ze znieczulenia i umieść go w bezpiecznym miejscu na poduszce grzewczej.</li>
	<li>Zwróć gryzonia do klatki domowej, aby wyzdrowiał po znieczuleniu pod opieką jego matki. 
	UWAGA: Terminowy powrót do opieki nad zaporą zmniejsza wczesną śmiertelność pooperacyjną.</li>
	<li>Monitoruj zwierzęta pod kątem znieczulenia przez utratę odruchu prostującego co godzinę po operacji przez 3 godziny.</li>
	<li>Monitoruj zwierzęta codziennie przez 7 dni pod kątem normalnej aktywności, spożycia pokarmu i przyrostu masy ciała. Monitoruj miejsce nacięcia pod kątem gojenia się rany, zamykania i ponownego pojawienia się sierści w miejscu operacji. 
	UWAGA: W rzadkich przypadkach, gdy podczas monitorowania obserwuje się zmiany neurologiczne, takie jak drgawki, depresja centralna lub zmniejszony apetyt, należy poddać zwierzę eutanazji za pomocą perfuzji wewnątrznaczyniowej lub zwichnięcia szyjki macicy w znieczuleniu.</li>
	<li>Aby zapobiec infekcji po zamknięciu szwu i gojeniu się rany, należy zastosować miejscowy potrójny antybiotyk w miejscu nacięcia.</li>
</ol>
6. Akwizycja i kwantyfikacja MRI
<ol>
	<li>Wykonaj rezonans magnetyczny na skanerze małych zwierząt o masie 4,7 T lub 9,4 T.</li>
	<li>Ustaw poduszkę grzewczą na średnie ustawienie, aby utrzymać temperaturę ciała szczura.</li>
	<li>Wywołać znieczulenie w komorze za pomocą 3% izofluranu. 
	UWAGA: Potwierdź wystarczające znieczulenie, stosując reakcję na szczypanie palca/ogona co 15 minut. Monitoruj znieczulenie z wizualną obserwacją koloru tkanek, temperatury ciała i częstości oddechów.</li>
	<li>Umieścić znieczulonego szczura w pozycji leżącej w rezonansie magnetycznym z nosem umieszczonym w adapterze do znieczulenia ze stałym przepływem 1,5% izofluranu.</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie T2-zależne, wybierając sekwencję szybkiego echa wirowego T2-ważonego.
	<ol>
		<li>W przypadku korzystania ze skanera MRI 4,7 T wprowadź następujące parametry do oprogramowania MRI: czas powtarzania = 3 000 ms, czas echa = 27,50 ms, liczba średnich = 3, pole widzenia = 18,0 mm x 18,0 mm, matryca = 128 x 128, liczba warstw osiowych = 24, grubość = 0,50 mm.</li>
		<li>W przypadku korzystania ze skanera MRI 9,4 T wprowadź następujące parametry do oprogramowania MRI: czas powtarzania = 5 000 ms, czas echa = 66,00 ms, odstępy między echami = 16,50 ms, liczba średnich = 2, powtórzenia = 1, rzadki czynnik = 8, pole widzenia = 16,0 mm x 16,0 mm, matryca = 256 x 256, liczba warstw osiowych = 32, grubość = 0,50 mm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kliknij przycisk Kontynuuj, aby rozpocząć sekwencję.</li>
</ol>
7. Przetwarzanie i analiza obrazu
<ol>
	<li>Użyj natywnych danych ważonych T2 do analizy objętości mózgu. Użyj oprogramowania do segmentacji, aby ręcznie wyznaczyć komory boczne6. Kliknij Tryb pędzla i wybierz kwadratowy styl pędzla. Dostosuj rozmiar pędzla do 1. Kliknij Inspektor układu i wybierz widok osiowy. Kliknij przycisk Powiększenie, aby dopasować. Umieść kursor na obrazie; Śledź i wypełniaj przestrzeń komory bocznej.</li>
	<li>Kliknij Segmentacja na pasku narzędzi | Objętość i statystyki, aby wyświetlić woluminy podzielone na segmenty.</li>
</ol>

<ol><li>Robinson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+posthemorrhagic+hydrocephalus+from+prematurity%3A+Pathophysiology+and+current+treatment+concepts%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%3A+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Neonatal posthemorrhagic hydrocephalus from prematurity: Pathophysiology and current treatment concepts: A review.</a> Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 9 (3), (2012).</li>
<li>Hasselager, A. B., Børch, K., Pryds, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+in+perinatal+care+for+extremely+premature+infants+in+Denmark+from%5BTitle%5D)+AND+%22Danish+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">Improvement in perinatal care for extremely premature infants in Denmark from.</a> Danish Medical Journal. 63 (1), to (1994).</li>
<li>Johnston, P. G., Gillam-Krakauer, M., Fuller, M. P., Reese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence-Based+Use+of+Indomethacin+and+Ibuprofen+in+the+Neonatal+Intensive+Care+Unit%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Perinatology%22%5BJournal%5D)">Evidence-Based Use of Indomethacin and Ibuprofen in the Neonatal Intensive Care Unit.</a> Clinics in Perinatology. 39 (1), (2012).</li>
<li>Mahaney, K. B., Buddhala, C., Paturu, M., Morales, D., Limbrick, D. D., Strahle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraventricular+Hemorrhage+Clearance+in+Human+Neonatal+Cerebrospinal+Fluid%3A+Associations+with+Hydrocephalus%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Intraventricular Hemorrhage Clearance in Human Neonatal Cerebrospinal Fluid: Associations with Hydrocephalus.</a> Stroke. , (2020).</li>
<li>Strahle, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+CSF+Iron+Pathway+Proteins+in+Posthemorrhagic+Hydrocephalus%3A+Associations+with+Ventricle+Size+and+Neurodevelopmental+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Longitudinal CSF Iron Pathway Proteins in Posthemorrhagic Hydrocephalus: Associations with Ventricle Size and Neurodevelopmental Outcomes.</a> Annals of Neurology. 90 (2), (2021).</li>
<li>Strahle, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Hemoglobin+and+Iron+in+hydrocephalus+after+neonatal+intraventricular+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Role of Hemoglobin and Iron in hydrocephalus after neonatal intraventricular hemorrhage.</a> Neurosurgery. 75 (6), (2014).</li>
<li>Garton, T. P., He, Y., Garton, H. J. L., Keep, R. F., Xi, G., Strahle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemoglobin-induced+neuronal+degeneration+in+the+hippocampus+after+neonatal+intraventricular+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Hemoglobin-induced neuronal degeneration in the hippocampus after neonatal intraventricular hemorrhage.</a> Brain Research. 1635, (2016).</li>
<li>SNAP Tutorial and User’s Manual. , Medtext, Inc.. Hinsdale (IL). Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.itksnap.org/docs/fullmanual.php">http://www.itksnap.org/docs/fullmanual.php</a> (2022).</li>
<li>Goulding, D. S., Caleb Vogel,, Gensel, R., Morganti, J. C., Stromberg, J. M., Miller, A. J., A, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+brain+inflammation%2C+white+matter+oxidative+stress%2C+and+myelin+deficiency+in+a+model+of+neonatal+intraventricular+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%3A+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Acute brain inflammation, white matter oxidative stress, and myelin deficiency in a model of neonatal intraventricular hemorrhage.</a> Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 26 (6), (2020).</li>
<li>Strahle, J., Garton, H. J. L., Maher, C. O., Muraszko, K. M., Keep, R. F., Xi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Hydrocephalus+After+Neonatal+and+Adult+Intraventricular+Hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Stroke+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Hydrocephalus After Neonatal and Adult Intraventricular Hemorrhage.</a> Translational Stroke Research. 3, (2012).</li>
<li>Jinnai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Model+of+Germinal+Matrix+Hemorrhage+in+Preterm+Rat+Pups%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Model of Germinal Matrix Hemorrhage in Preterm Rat Pups.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, (2020).</li>
<li>Georgiadis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+acute+brain+injuries+and+neurobehavioral+profiles+in+a+rabbit+model+of+germinal+matrix+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Characterization of acute brain injuries and neurobehavioral profiles in a rabbit model of germinal matrix hemorrhage.</a> Stroke. 39 (12), (2008).</li>
<li>Cherian, S. S., Love, S., Silver, I. A., Porter, H. J., Whitelaw, A. G. L., Thoresen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posthemorrhagic+ventricular+dilation+in+the+neonate%3A+Development+and+characterization+of+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Posthemorrhagic ventricular dilation in the neonate: Development and characterization of a rat model.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 62 (3), (2003).</li>
<li>Balasubramaniam, J., Xue, M., Buist, R. J., Ivanco, T. L., Natuik, S., del Bigio,, R, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+motor+deficit+following+infusion+of+autologous+blood+into+the+periventricular+region+of+neonatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Persistent motor deficit following infusion of autologous blood into the periventricular region of neonatal rats.</a> Experimental Neurology. (1), (2006).</li>
<li>Volpe, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+injury+in+premature+infants%3A+a+complex+amalgam+of+destructive+and+developmental+disturbances%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances.</a> The Lancet Neurology. 8 (1), (2009).</li>
<li>Dobbing, J., Sands, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+the+brain+growth+spurt%5BTitle%5D)+AND+%22Early+Human+Development%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of the brain growth spurt.</a> Early Human Development. 3 (1), (1979).</li>
<li>Craig, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+perinatal+rodent+oligodendrocyte+lineage+progression+and+its+correlation+with+human%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human.</a> Experimental Neurology. 181 (2), (2003).</li>
<li>Lodygensky, G. A., Vasung, L., Sv Sizonenko,, Hüppi, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimaging+of+cortical+development+and+brain+connectivity+in+human+newborns+and+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Neuroimaging of cortical development and brain connectivity in human newborns and animal models.</a> Journal of Anatomy. 217 (4), (2010).</li>
<li>Dean, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-specific+differences+in+perinatal+rodent+oligodendrocyte+lineage+progression+and+its+correlation+with+human%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human.</a> Developmental Neuroscience. 33 (34), (2011).</li>
<li>Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Development of the blood-brain barrier.</a> Cell and Tissue Research. 314 (1), (2003).</li>
<li>Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+are+required+for+blood%C4%9D%E2%82%AC%26%2334%3Bbrain+barrier+integrity+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes are required for bloodĝ€&#34;brain barrier integrity during embryogenesis.</a> Nature. 468 (7323), (2010).</li>
<li>Alles, Y. C. J., Greggio, S., Alles, R. M., Azevedo, P. N., Xavier, L. L., DaCosta, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+preclinical+rodent+model+of+collagenase-induced+germinal+matrix%2Fintraventricular+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">A novel preclinical rodent model of collagenase-induced germinal matrix/intraventricular hemorrhage.</a> Brain Research. 1356, (2010).</li>
<li>Christian, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+hospitalization+of+preterm+infants+with+intraventricular+hemorrhage+and+hydrocephalus+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%3A+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Trends in hospitalization of preterm infants with intraventricular hemorrhage and hydrocephalus in the United States.</a> Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 17 (3), 2000-2010 (2016).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Ten model IVH wykorzystujący wstrzyknięcie hemoglobiny pozwala na badanie patologii IVH, w której pośredniczy hemoglobina. W przypadku badań uzupełniających hemoglobina może być również łatwo dostarczana in vitro i nie myli testów biochemicznych dla białek wytwarzanych przez mikroglej / makrofagi, które są obecne we krwi pełnej.
Wiodące teorie IVH-PHH obejmują mechaniczne utrudnienie krążenia płynu mózgowo-rdzeniowego, rozerwanie rzęsek wyściełających ściany wyściółki, stan zapalny, z...

Noworodkowe IVH wywodzi się z macierzy rozrodczej, miejsca szybkiego podziału komórek, które przylega do bocznych komór rozwijającego się mózgu. Ta wysoce unaczyniona struktura jest podatna na niestabilność hemodynamiczną związaną z przedwczesnym porodem. Krew jest uwalniana do komór bocznych w krwotoku z macierzy rozrodczej (GMH)-IVH, gdy pękają kruche naczynia krwionośne w macierzy rozrodczej. W przypadku IVH stopnia IVH okołokomorowy zawał krwotoczny może również przyczyniać się do uwalniania produktów krwiopochodnych w obrębie mózgu. 1 Kombinacja GMH-IVH może powodować PHH, szczególnie po dużym krwotoku (stopnie III i IV)1. PHH można leczyć poprzez założenie zastawki komorowo-otrzewnowej, ale umieszczenie zastawki nie odwraca uszkodzenia mózgu, które może wystąpić w wyniku IVH. Chociaż współczesna intensywna terapia noworodków obniżyła wskaźniki IVH2, 3, nie ma konkretnych metod leczenia uszkodzenia mózgu lub wodogłowia spowodowanego IVH po jego wystąpieniu. Istotnym ograniczeniem w opracowywaniu metod leczenia zapobiegawczego uszkodzeń mózgu wywołanych zapłodnieniem in vitro i PHH jest niepełne zrozumienie patofizjologii zapłodnienia in vitro.
Ostatnio wykazano, że wczesne poziomy hemoglobiny produktu rozpadu krwi w płynie mózgowo-rdzeniowym są związane z późniejszym rozwojem PHH u noworodków z wysokim stopniem IVH4. Co więcej, poziomy płynu mózgowo-rdzeniowego białek szlaku przenoszenia żelaza - hemoglobiny, ferrytyny i bilirubiny - są związane z wielkością komór w noworodkowym IVH. Wykazano to również w wieloośrodkowej kohorcie niemowląt z wcześniakami PHH, gdzie wyższe poziomy ferrytyny w płynie mózgowo-rdzeniowym były związane z większym rozmiarem komory5.
W tym badaniu opracowaliśmy klinicznie istotny model uszkodzenia mózgu i wodogłowia wywołanego IVH, wykorzystując wstrzyknięcie hemoglobiny do komór mózgu, co pozwala na ilościowe określenie uszkodzenia mózgu i PHH oraz testowanie nowych strategii terapeutycznych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)6, 7. Ten model IVH wykorzystuje nowonarodzone młode szczurów, które są poddawane znieczuleniu ogólnemu na czas zabiegu. Na skórze głowy wykonuje się nacięcie w linii środkowej, a współrzędne wyprowadzone z punktów orientacyjnych czaszki - bregma lub lambda - są używane do celowania w boczne komory do wstrzyknięcia. Powolne wstrzykiwanie za pomocą pompy infuzyjnej dostarcza hemoglobinę do komory. Protokół ten jest łatwy w użyciu, wszechstronny i może modelować różne składniki IVH, które skutkują PHH.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka insulinowa 0,3 ml</td><td>BD Microfine + Strzykawka insulinowa</td><td>230-4533</td><td>0,3-0,5 ml syntezatorki będą działać</td></tr><tr><td>Mikroprobówka 1,5 ml</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td>Nr partii K194642H -3 511</td></tr><tr><td>4,7T Rezonans magnetyczny</td><td>Agilent/Varian</td><td>4,7T/33 cm</td><td>Agilent/Varian DirectDrive 4,7-T (200-MHz) system MRI</td></tr><tr><td>6-0 szew monofilamentowy</td><td>ETHICON</td><td>667G</td><td></td></tr><tr><td>9,4T MRI</td><td>Bruker</td><td>BioSpec 94/20</td><td>Używany w tym protokole bez kriosondy</td></tr><tr><td>Waga analityczna</td><td>CCURIS Instruments</td><td>W3200-320</td><td></td></tr><tr><td>Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF)</td><td>Tocris Bioscience</td><td>3525</td><td>Nr partii: 72A</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>301005-00</td><td>NDC 67618-150-09</td></tr><tr><td>Karprofen (do wstrzykiwań)</td><td>Zoetis Inc.&nbsp;</td><td>PI 4019448</td><td>Rimadyl</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>Sunbeam</td><td>E12107-819</td><td>UL 612A, Z-1228-001</td></tr><tr><td>Hemoglobina</td><td>MP Biomedicals</td><td>100714</td><td>NR PARTII SR02321</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Critical Care</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>Waporyzator izofluranowy</td><td>VETEQUIP</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>Światło do instalacji stereotaktycznej</td><td>Branże Dolan-Jenner</td><td>Fiber-Lite MI-150</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa do mikroiniekcji</td><td>World Precision Instruments</td><td>MICRO21</td><td>Serial 184034 T08K</td></tr><tr><td>Oprogramowanie MRI</td><td>Bruker BioSpin</td><td>Paravision 360 3.2</td><td></td></tr><tr><td>Tlen</td><td>Airgas Opieka zdrowotna</td><td>UN1072</td><td>NUMER PARTII S1432080XA02</td></tr><tr><td>Szczury</td> <td>Sprague DawleyCharles River Laboratories</td><td>Kod szczepu: 001</td><td></td></tr><tr><td>Instrument stereotaktyczny</td><td>KOPF Instuments</td><td>Model 900LS Lazy Susan</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny aplikator z bawełnianą końcówką</td><td>Fischerbrand</td><td>23-400-118</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze chirurgiczne</td><td>covetrus</td><td>#10</td><td></td></tr><tr><td>Miejscowy potrójny antybiotyk</td><td>Maść z potrójnym antybiotykiem</td><td>NDC 51672-2120-1</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do oznaczania ilościowego objętości komór</td><td>ITK-SNAP</td><td>ITK-SNAP 4.0.0 beta</td><td></td></tr></tbody></table>

modelowanie krwotoku śródkomorowego noworodka poprzez dokomorowe wstrzyknięcie hemoglobiny

Modeling Neonatal Intraventricular Hemorrhage Through Intraventricular Injection of Hemoglobin

Noworodkowy krwotok wewnątrzkomorowy (IVH) jest częstą konsekwencją przedwczesnego porodu i prowadzi do uszkodzenia mózgu, wodogłowia pokrwotocznego (PHH) i deficytów neurologicznych na całe życie. Chociaż PHH można leczyć za pomocą tymczasowych i stałych procedur przekierowania płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) (odpowiednio zbiornik komorowy i zastawka komorowo-otrzewnowa), nie ma strategii farmakologicznych zapobiegających lub leczących uszkodzenia mózgu i wodogłowie wywołane zapłodnieniem in vitro. Modele zwierzęce są potrzebne, aby lepiej zrozumieć patofizjologię IVH i przetestować leczenie farmakologiczne. Chociaż istnieją modele IVH u noworodków, te, które niezawodnie prowadzą do wodogłowia, są często ograniczone koniecznością wstrzykiwań o dużej objętości, co może komplikować modelowanie patologii lub wprowadzać zmienność w obserwowanym fenotypie klinicznym.
Ostatnie badania kliniczne wykazały, że hemoglobina i ferrytyna powodują powiększenie komór po IVH. Tutaj opracowujemy prosty model zwierzęcy, który naśladuje kliniczny fenotyp PHH, wykorzystując małe objętościowe wstrzyknięcia dokomorowe produktu rozpadu krwi, hemoglobiny. Oprócz niezawodnego wywoływania powiększenia komór i wodogłowia, model ten powoduje uszkodzenie istoty białej, stan zapalny i infiltrację komórek odpornościowych w obszarach okołokomorowych i istoty białej. W niniejszej pracy opisano tę klinicznie istotną, prostą metodę modelowania IVH-PHH u noworodków szczurów przy użyciu iniekcji dokomorowej i przedstawiono metody ilościowego określania wielkości komór po wstrzyknięciu.

Powodzenie wstrzyknięcia potwierdzono metodami radiologicznymi oraz immunohistochemicznymi. U zwierząt, którym wstrzyknięto hemoglobinę, stwierdzono umiarkowaną ostrą wentrykulomegalię w ocenie MRI (Rycina 2A), przy czym komory boczne były istotnie większe 24 h i 72 h po wstrzyknięciu hemoglobiny w porównaniu do zwierząt, którym wstrzyknięto aCSF (Rycina 2B,C). Choć 38 dni po wstrzyknięciu nie stwierdzono istotnych różnic w objętości komór boczn...

Prezentujemy model krwotoku wewnątrzkomorowego u noworodków na szczurzych szczeniętach, który naśladuje patologię obserwowaną u ludzi.

Modelowanie krwotoku śródkomorowego noworodka poprzez dokomorowe wstrzyknięcie hemoglobiny

Neonatal intraventricular hemorrhage (IVH) is a common consequence of premature birth and leads to brain injury, posthemorrhagic hydrocephalus (PHH), and ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ opracowujemy klinicznie istotny model uszkodzenia mózgu i wodogłowia wywołanego IVH, wykorzystując wstrzyknięcie hemoglobiny do komór, co pozwala na późniejsze ilościowe określenie objętości komór w aplikacji, do testowania nowych strategii terapeutycznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na badanie patologii IVH, w której pośredniczą produkty rozpadu krwi szlaku hemoglobiny i żelaza. Ta technika jest również łatwa w użyciu i wszechstronna.Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku opracowania terapii wodogłowia pokrwotocznego, ponieważ pozwala ona na dalsze zrozumienie patofizjologii IVH i ocenę klinicznie istotnych strategii leczenia w celu zapobiegania następstwom neurologicznym po IVH. Procedurę zademonstruje Sruthi Ramagiri, adiunkt z Laboratorium Australijskiego. Na początek umieść znieczulonego szczura w pozycji leżącej w aparacie stereotaktycznym z nosem umieszczonym w adapterze znieczulającym.Następnie zabezpiecz głowę, zaciskając niepękające pręty uszne na zewnętrznym przewodzie słuchowym. Aby wyczyścić głowę, najpierw dotknij sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką nasączonego Betadine na środku głowy i przesuń na zewnątrz, aby rozprowadzić Betadine w kółko. Następnie powtórz proces z aplikatorem nasączonym 70% etanolem.Następnie za pomocą skalpela wykonaj 0,3 centymetrowe nacięcie pionowo w dół środka głowy, aby odsłonić bregmę czaszki. Następnie osusz obszar za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką. Aby ustawić wstrzykiwacz stereotaktyczny, należy pobrać wcześniej przygotowany roztwór hemoglobiny do strzykawki o pojemności 0,3 lub 0,5 mililitra i umieścić strzykawkę w systemie wstrzykiwacza stereotaktycznego.Następnie włącz interfejs wtryskiwacza stereotaktycznego i kliknij przycisk konfiguracji, aby wprowadzić ustawienia głośności wtrysku i szybkości. Kliknij objętość i ustaw objętość na 20 000 nanolitrów. Następnie kliknij szybkość infuzji i ustaw szybkość na 8 000 nanolitrów na minutę.Kliknij przycisk resetowania pozycji, aby wyjść z konfiguracji. Przepłucz końcówkę igły, klikając przycisk zaparzania, aż na końcu igły pojawi się mała kulka hemoglobiny, a następnie użyj aplikatora z bawełnianą końcówką, aby delikatnie usunąć kulkę. Aby rozpocząć wstrzykiwanie u zwierząt, należy ustawić bregmę na zero w stereotaktycznym systemie wstrzykiwania, regulując przyśrodkowo-boczne i przednio-tylne położenie strzykawki.Następnie opuść igłę strzykawki, aby delikatnie dotknąć czaszki przy bregmie. Po określeniu wybranych współrzędnych podnieś igłę strzykawki o jeden centymetr nad czaszkę, aby oczyścić skórę głowy. Ustaw współrzędne przyśrodkowo-boczne i przednio-tylne.Następnie opuść strzykawkę, aby igła delikatnie dotknęła czaszki i ustaw współrzędną grzbietowo-brzuszną na 30 sekund. Po ustawieniu współrzędnych rozpocznij wstrzykiwanie, klikając przycisk uruchamiania w interfejsie wtryskiwacza stereotaktycznego. Po zakończeniu wstrzykiwania należy pozostawić igłę na miejscu na dwie minuty, aby zminimalizować cofanie się roztworu.Następnie powoli wycofuj strzykawkę wzdłuż współrzędnej grzbietowo-brzusznej przez dwie minuty, aż końcówka igły znajdzie się dwa centymetry nad skórą głowy. Następnie obróć ramię iniektora stereotaktycznego od pola operacyjnego i zamknij skórę głowy szwem monofilamentowym 6-O. W przypadku rezonansu magnetycznego należy wykonać obrazowanie zależne od T2, wybierając sekwencję szybkiego echa wirowego skorygowaną o ważenie T2.Po ustawieniu parametrów MRI zgodnie z opisem w tekście kliknij przycisk kontynuuj, aby rozpocząć sekwencję. Aby przetworzyć obraz i przeprowadzić analizę objętości mózgu, otwórz natywne dane ważone T2 w oprogramowaniu do segmentacji. Aby ręcznie wyznaczyć boczne komory, kliknij tryb pędzla i wybierz kwadratowy styl pędzla, a następnie dostosuj rozmiar pędzla do jednego.Następnie kliknij Inspektor układu, wybierz widok osiowy i kliknij przycisk Powiększ, aby dopasować. Następnie umieść kursor na obrazie i obrysuj i wypełnij przestrzeń komory bocznej. Na koniec kliknij segmentację na pasku narzędzi, a następnie objętość i statystyki, aby wyświetlić podzielone na segmenty woluminy.Zwierzęta, które poddały się wstrzyknięciu hemoglobiny, rozwinęły umiarkowaną powiększenie komór po ocenie za pomocą rezonansu magnetycznego. Ze znacznie większymi komorami bocznymi po 24 godzinach i 72 godzinach po wstrzyknięciu hemoglobiny, w porównaniu ze zwierzętami, którym wstrzyknięto ACSF. Chociaż różnica w objętości komór bocznych między dwiema grupami szczurów nie była znacząca po 38 dniach, skany MRI wykazały, że 44% szczurów otrzymujących hemoglobinę nadal miało nierozwiązaną powiększenie komór.Ponadto, w porównaniu z ACSF, wstrzyknięcie hemoglobiny spowodowało znaczny spadek objętości istoty białej po 38 dniach. Hemoglobina promowała również odpowiedź zapalną in vivo, co widać po znacznie wyższym poziomie prozapalnego czynnika martwicy nowotworu cytokin alfa po wstrzyknięciu hemoglobiny, ale nie soli fizjologicznej ani krwi pełnej. Co więcej, barwienie immunohistochemiczne kwaśnego białka fibrylarnego gleju wykazało znacznie wyższą aktywację astrocytów po wstrzyknięciu hemoglobiny niż po wstrzyknięciu ACSF.Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas wykonywania tej procedury, jest ustawienie prawidłowych współrzędnych wstrzyknięcia, aby zapewnić dostarczenie hemoglobiny do komór bocznych. Zgodnie z tą procedurą, znaczniki płynu mózgowo-rdzeniowego mogą zostać dostarczone do przestrzeni płynu mózgowo-rdzeniowego w celu oceny zmian w krążeniu płynu mózgowo-rdzeniowego i wzorcach wypływu po IVH. Ta dodatkowa metoda dotyczy tego, w jaki sposób przepływ płynu mózgowo-rdzeniowego jest zmieniany w IVH PHH.

modeling-neonatal-intraventricular-hemorrhage-through

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisany w niniejszym protokole model wstrzykiwania autologicznej krwi w celu wywołania krwotoku wewnątrzczaszkowego u myszy wykorzystuje technikę podwójnego wstrzyknięcia, aby zminimalizować ryzyko refluksu krwi wzdłuż kanału igły, nie stosuje przeciwkrzepliwych w systemie pompowania oraz eliminuje całą przestrzeń martwą i rozszerzalne przewody w układzie.

Wtryskiwanie autologicznej krwi w celu modelowania spontanicznego krwotoku wewnątrzczaszkowego u myszy

Klinicznie istotne modele zwierzęce krwotoku wewnątrzczaszkowego (ICH) są niezbędne do poszerzenia naszej wiedzy na temat udaru krwotocznego oraz do badania nowych strategii terapeutycznych. W niniejszym badaniu opisujemy i oceniamy dwa modele ICH, w których stosuje się jednostronne wstrzyknięcia autologicznej krwi pełnej lub bakteryjnej kolagenazy do jąder podstawy (ciała prążkowanego) myszy.

Modelowanie krwotoku wewnątrzczaszkowego u myszy: wstrzykiwanie krwi autologicznej lub bakteryjnej kolagenazy

Ten film przedstawia metodę generowania szczurzego modelu krwotoku dokomorowego u noworodków. W tej procedurze znieczulonemu szczeniakowi szczura wstrzykuje się hemoglobinę do bocznej komory mózgu. Hemoglobina powoduje stres oksydacyjny i uwalnia hem, symulując krwotok dokomorowy. Wynikające z tego uszkodzenie tkanek mózgowych, napędzane przez reaktywne formy tlenu i cytokiny zapalne, prowadzi do powiększenia komór, co jest częstą konsekwencją krwotoku dokomorowego.

Przedkliniczne modele krwotoku śródmózgowego są wykorzystywane do naśladowania pewnych aspektów klinicznej choroby. W ten sposób można badać mechanizmy urazów i potencjalne strategie terapeutyczne. W tym protokole opisano dwa modele krwotoku śródmózgowego, doprążkowiowe (zwoje podstawy) iniekcje krwi autologicznej lub kolagenazy.

Doprążkowiowe wstrzyknięcie krwi autologicznej lub kolagenazy Clostridium jako mysie modele krwotoku śródmózgowego

Zwierzęce modele chorób dziecięcych mogą doświadczyć wczesnego początku i agresywnego postępu choroby. Klinicznie istotne podanie terapii młodym modelom myszy może być technicznie trudne. Protokół ten opisuje nieinwazyjną metodę wstrzykiwań dożylnych dla nowonarodzonych myszy w ciągu pierwszych dwóch dni życia po urodzeniu.

Wstrzyknięcia dożylne u nowonarodzonych myszy

Tutaj opisujemy prostą metodę domózgowego i wewnątrznaczyniowego wstrzykiwania cząsteczek wirusa lub fluorescencyjnych mikrogranulek do mózgu noworodka myszy. Wzorzec lokalizacji wirusa i nanocząstek można wykryć za pomocą oceny mikroskopowej lub hybrydyzacji in situ.

Domózgowo-komorowe i wewnątrznaczyniowe wstrzykiwanie cząstek wirusowych i mikrogranulek fluorescencyjnych do mózgu noworodka

Przedstawiamy protokół do stworzenia modelu masywnego krwotoku pontine u szczura poprzez podwójne wstrzyknięcie krwi autologicznej.

Masywny krwotok mostowy przez podwójne wstrzyknięcie krwi autologicznej

Monitorowanie ciśnienia śródczaszkowego w modelach gryzoni nieurazowego krwotoku śródkomorowego nie jest powszechne w obecnej literaturze. W niniejszym artykule demonstrujemy technikę pomiaru ciśnienia śródczaszkowego, średniego ciśnienia tętniczego i ciśnienia perfuzji mózgowej podczas krwotoku śródkomorowego w modelu zwierzęcym szczura.

Monitorowanie ciśnienia śródczaszkowego w nieurazowym modelu gryzoni z krwotokiem dokomorowym

Ten artykuł ma na celu dostarczenie badaczom szczegółowego i przystępnego przewodnika, jak skonfigurować model wstrząsu krwotocznego u niemowląt świń.

Opis modelu wstrząsu krwotocznego o kontrolowanej objętości u niemowląt świń

Ten protokół ma na celu zademonstrowanie powtarzalnej drogi podawania dożylnego, która może być stosowana u szczurów i myszy przez cały okres noworodkowy. Procedura ta jest ważna dla przedklinicznych badań na gryzoniach, które mają na celu odzwierciedlenie podawania leków na oddziałach opieki neonatologicznej, głównie przy użyciu podawania dożylnego.

Model iniekcji żyły zaoczodołowej u noworodków gryzoni

Pokrwawiąca wodogłowie przedwczesnego (PHHP) można modelować u noworodków szczurów poprzez połączenie zapalenia chorioamnionitisu i krwotoku wewnątrzkomorowego. Połączenie tych wydarzeń prenatalnych i poporodowych wiernie oddaje kliniczne cechy PHHP, w tym makrocefalię, brzuszną omegę oraz podwyższone ciśnienie wewnątrzczaszkowe, przez całe życie.

Modelowanie pokrwaconego wodogłowia przedwczesnego u szczurów

Poznaj model krwotoku śródkomorowego noworodka z wykorzystaniem dokomorowego wstrzyknięcia hemoglobiny u szczurów. Ta metoda umożliwia badanie patofizjologii hydrocefalii pourazowej i testowanie nowych strategii terapeutycznych.

Modelowanie krwotoku śródkomorowego noworodka poprzez dokomorowe wstrzyknięcie hemoglobiny

Przeglądaj więcej filmów