Modelowanie krwotoku śródkomorowego noworodka poprzez dokomorowe wstrzyknięcie hemoglobiny
25 sierpnia 2022
Prezentujemy model krwotoku wewnątrzkomorowego u noworodków na szczurzych szczeniętach, który naśladuje patologię obserwowaną u ludzi.
Protokół ten jest istotny, ponieważ opracowujemy klinicznie istotny model uszkodzenia mózgu i wodogłowia wywołanego IVH, wykorzystując wstrzyknięcie hemoglobiny do komór, co pozwala na późniejsze ilościowe określenie objętości komór w aplikacji, do testowania nowych strategii terapeutycznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na badanie patologii IVH, w której pośredniczą produkty rozpadu krwi szlaku hemoglobiny i żelaza. Ta technika jest również łatwa w użyciu i wszechstronna.
Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku opracowania terapii wodogłowia pokrwotocznego, ponieważ pozwala ona na dalsze zrozumienie patofizjologii IVH i ocenę klinicznie istotnych strategii leczenia w celu zapobiegania następstwom neurologicznym po IVH. Procedurę zademonstruje Sruthi Ramagiri, adiunkt z Laboratorium Australijskiego. Na początek umieść znieczulonego szczura w pozycji leżącej w aparacie stereotaktycznym z nosem umieszczonym w adapterze znieczulającym.
Następnie zabezpiecz głowę, zaciskając niepękające pręty uszne na zewnętrznym przewodzie słuchowym. Aby wyczyścić głowę, najpierw dotknij sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką nasączonego Betadine na środku głowy i przesuń na zewnątrz, aby rozprowadzić Betadine w kółko. Następnie powtórz proces z aplikatorem nasączonym 70% etanolem.
Następnie za pomocą skalpela wykonaj 0,3 centymetrowe nacięcie pionowo w dół środka głowy, aby odsłonić bregmę czaszki. Następnie osusz obszar za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką. Aby ustawić wstrzykiwacz stereotaktyczny, należy pobrać wcześniej przygotowany roztwór hemoglobiny do strzykawki o pojemności 0,3 lub 0,5 mililitra i umieścić strzykawkę w systemie wstrzykiwacza stereotaktycznego.
Następnie włącz interfejs wtryskiwacza stereotaktycznego i kliknij przycisk konfiguracji, aby wprowadzić ustawienia głośności wtrysku i szybkości. Kliknij objętość i ustaw objętość na 20 000 nanolitrów. Następnie kliknij szybkość infuzji i ustaw szybkość na 8 000 nanolitrów na minutę.
Kliknij przycisk resetowania pozycji, aby wyjść z konfiguracji. Przepłucz końcówkę igły, klikając przycisk zaparzania, aż na końcu igły pojawi się mała kulka hemoglobiny, a następnie użyj aplikatora z bawełnianą końcówką, aby delikatnie usunąć kulkę. Aby rozpocząć wstrzykiwanie u zwierząt, należy ustawić bregmę na zero w stereotaktycznym systemie wstrzykiwania, regulując przyśrodkowo-boczne i przednio-tylne położenie strzykawki.
Następnie opuść igłę strzykawki, aby delikatnie dotknąć czaszki przy bregmie. Po określeniu wybranych współrzędnych podnieś igłę strzykawki o jeden centymetr nad czaszkę, aby oczyścić skórę głowy. Ustaw współrzędne przyśrodkowo-boczne i przednio-tylne.
Następnie opuść strzykawkę, aby igła delikatnie dotknęła czaszki i ustaw współrzędną grzbietowo-brzuszną na 30 sekund. Po ustawieniu współrzędnych rozpocznij wstrzykiwanie, klikając przycisk uruchamiania w interfejsie wtryskiwacza stereotaktycznego. Po zakończeniu wstrzykiwania należy pozostawić igłę na miejscu na dwie minuty, aby zminimalizować cofanie się roztworu.
Następnie powoli wycofuj strzykawkę wzdłuż współrzędnej grzbietowo-brzusznej przez dwie minuty, aż końcówka igły znajdzie się dwa centymetry nad skórą głowy. Następnie obróć ramię iniektora stereotaktycznego od pola operacyjnego i zamknij skórę głowy szwem monofilamentowym 6-O. W przypadku rezonansu magnetycznego należy wykonać obrazowanie zależne od T2, wybierając sekwencję szybkiego echa wirowego skorygowaną o ważenie T2.
Po ustawieniu parametrów MRI zgodnie z opisem w tekście kliknij przycisk kontynuuj, aby rozpocząć sekwencję. Aby przetworzyć obraz i przeprowadzić analizę objętości mózgu, otwórz natywne dane ważone T2 w oprogramowaniu do segmentacji. Aby ręcznie wyznaczyć boczne komory, kliknij tryb pędzla i wybierz kwadratowy styl pędzla, a następnie dostosuj rozmiar pędzla do jednego.
Następnie kliknij Inspektor układu, wybierz widok osiowy i kliknij przycisk Powiększ, aby dopasować. Następnie umieść kursor na obrazie i obrysuj i wypełnij przestrzeń komory bocznej. Na koniec kliknij segmentację na pasku narzędzi, a następnie objętość i statystyki, aby wyświetlić podzielone na segmenty woluminy.
Zwierzęta, które poddały się wstrzyknięciu hemoglobiny, rozwinęły umiarkowaną powiększenie komór po ocenie za pomocą rezonansu magnetycznego. Ze znacznie większymi komorami bocznymi po 24 godzinach i 72 godzinach po wstrzyknięciu hemoglobiny, w porównaniu ze zwierzętami, którym wstrzyknięto ACSF. Chociaż różnica w objętości komór bocznych między dwiema grupami szczurów nie była znacząca po 38 dniach, skany MRI wykazały, że 44% szczurów otrzymujących hemoglobinę nadal miało nierozwiązaną powiększenie komór
.Ponadto, w porównaniu z ACSF, wstrzyknięcie hemoglobiny spowodowało znaczny spadek objętości istoty białej po 38 dniach. Hemoglobina promowała również odpowiedź zapalną in vivo, co widać po znacznie wyższym poziomie prozapalnego czynnika martwicy nowotworu cytokin alfa po wstrzyknięciu hemoglobiny, ale nie soli fizjologicznej ani krwi pełnej. Co więcej, barwienie immunohistochemiczne kwaśnego białka fibrylarnego gleju wykazało znacznie wyższą aktywację astrocytów po wstrzyknięciu hemoglobiny niż po wstrzyknięciu ACSF.
Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas wykonywania tej procedury, jest ustawienie prawidłowych współrzędnych wstrzyknięcia, aby zapewnić dostarczenie hemoglobiny do komór bocznych. Zgodnie z tą procedurą, znaczniki płynu mózgowo-rdzeniowego mogą zostać dostarczone do przestrzeni płynu mózgowo-rdzeniowego w celu oceny zmian w krążeniu płynu mózgowo-rdzeniowego i wzorcach wypływu po IVH. Ta dodatkowa metoda dotyczy tego, w jaki sposób przepływ płynu mózgowo-rdzeniowego jest zmieniany w IVH PHH.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia istotny klinicznie i prosty model zwierzęcy do badania wodogłowia powykrwawnego (PHH) następującego po noworodkowym krwotoku do komór mózgu (IVH). Poprzez wstrzyknięcie hemoglobiny do komór bocznych noworodków szczurów, model ten wiarygodnie indukuje powiększenie komór, uszkodzenie białej istoty oraz stan zapalny, ściśle naśladując cechy kliniczne PHH. Protokół zawiera również szczegółowe metody ilościowego pomiaru wielkości komór z wykorzystaniem MRI i analizy obrazu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Zaburzenia rozwoju neurologicznego
- Modelowanie zwierzęce
Wstęp
- IVH jest częstym powikłaniem przedwczesnego porodu, często prowadzącym do PHH i długotrwałych deficytów neurologicznych.
- Obecne metody leczenia PHH ograniczają się do chirurgicznego odprowadzenia CSF; nie istnieją terapie farmakologiczne zapobiegające uszkodzeniom mózgu wywołanym przez IVH lub je leczące.
- Istniejące modele zwierzęce często wymagają iniekcji dużych objętości, co może wprowadzać zmienność i komplikować modelowanie patologiczne.
- W badaniach klinicznych hemoglobinę i ferrytynę powiązano z powiększeniem komór mózgu po IVH.
Cel badania
- Opracowanie prostego, powtarzalnego modelu zwierzęcego PHH wywołanej przez IVH przy użyciu małymi objętościami wstrzykiwanych hemoglobiny.
- Umożliwienie wiarygodnej indukcji wodogłowia i powiązanego z nim uszkodzenia mózgu na potrzeby badań patofizjologicznych.
- Zapewnienie platformy do testowania nowych strategii terapeutycznych ukierunkowanych na IVH i PHH.
Zastosowane metody
- Stereotaktyczne wstrzyknięcie roztworu hemoglobiny do komór bocznych znieczulonych noworodkowych szczurów.
- Precyzyjna kontrola objętości wstrzyknięcia (20 000 nanolitrów) i szybkości podawania (8 000 nanolitrów/minutę) przy użyciu wtryskiwacza stereotaktycznego.
- Obrazowanie MRI po wstrzyknięciu (obrazowanie T2-zależne) w celu oceny powiększenia komór oraz zmian w istocie białej.
- Manualna segmentacja i analiza wolumetryczna komór z wykorzystaniem oprogramowania do przetwarzania obrazów.
- Immunohistochemia i analizy cytokin w celu oceny stanu zapalnego oraz aktywacji astrocytów.
Główne wyniki
- Wstrzyknięcie hemoglobiny wywołało umiarkowaną wentrykulomegalię w 24. i 72. godzinie po wstrzyknięciu w porównaniu z grupą kontrolną.
- W 38. dniu po wstrzyknięciu 44% szczurów z wstrzykniętą hemoglobiną nadal wykazywało nierozwiązaną wentrykulomegalię.
- Po 38 dniach u zwierząt z wstrzykniętą hemoglobiną zaobserwowano istotne zmniejszenie objętości białej istoci.
- Hemoglobina wywołała silną odpowiedź zapalną, w tym podwyższony poziom TNF-alpha oraz zwiększoną aktywację astrocytów.
Wnioski
- Model ten niezawodnie odtwarza kluczowe cechy PHH wywołanego przez IVH, w tym wodogłowia, uszkodzenia białej istoty oraz stan zapalny.
- Protokół jest prosty, powtarzalny i pozwala na precyzyjne badanie patologii pośredniczonej przez hemoglobinę.
- Stanowi on cenną platformę do badania patofizjologii IVH oraz oceny potencjalnych interwencji terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wiarygodne modelowanie noworodkowego krwotoku do komór mózgu (IVH) oraz wodogłowia pozakrwawnego (PHH) jest kluczowe dla neuronauki translacyjnej i odkrywania nowych metod neuroterapii. Ten oparty na hemoglobinie model szczurzy umożliwia precyzyjne badanie mechanizmów uszkodzeń indukowanych hemoglobiną, co zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów na wczesnym etapie oraz w przesiewie terapeutycznym. Podejście to stanowi kluczowy punkt zwrotny w ograniczaniu ryzyka w portfelach leków neurorozwojowych ukierunkowanych na uszkodzenia mózgu wywołane IVH oraz wodogłowia.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w zakresie udziału hemoglobiny i szlaku żelaza w patologii IVH.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów dla szlaków neurostanu zapalnego i uszkodzeń istoty białej.
- Ułatwia opartą na hipotezach ocenę potencjalnych interwencji neuroprotekcyjnych.
Przesiewanie i rozwój testów
- Zapewnia odtwarzalny system in vivo do ilościowej oceny powiększenia komór oraz utraty istoty białej.
- Standaryzuje wolumetryczne odczyty MRI w celu zapewnienia porównywalności między badaniami.
- Umożliwia rzetelny screening środków farmakologicznych ukierunkowanych na mechanizmy uszkodzeń wywołanych przez IVH.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z istotnymi dla choroby punktami końcowymi, takimi jak wodogłowie i neurozapalenie obserwowane w klinicznym PHH.
- Wspiera ciągłość przejścia od odkryć mechanistycznych do przedklinicznych testów skuteczności neuroterapeutyków.
- Ułatwia opracowanie biomarkerów dla badań translacyjnych w zakresie noworodkowego uszkodzenia mózgu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten integruje kontinuum od etapu odkrycia do badań przedklinicznych w zaburzeniach neurorozwojowych, stanowiąc pomost między badaniami mechanistycznymi a oceną kandydatów terapeutycznych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących szlaków zapalnych i uszkodzeń pośredniczonych przez hemoglobinę w urazach mózgu noworodka.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowane, ilościowe wyniki MRI i histologiczne do oceny związków chemicznych.
- Analityka: Zapewnia pomiary objętościowe i poziom cytokin w celu porównania efektów interwencji w różnych kohortach.
- Badania translacyjne: Pozwala na powiązanie wyników przedklinicznych z cechami klinicznymi PHH, wspierając dobór biomarkerów i punktów końcowych.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalną i powtarzalną platformę do ciągłego rozwoju procesów projektowania neuroterapii.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu oraz w minimalizacji ryzyka mechanistycznego dla IVH i PHH.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje modelowanie zwierzęce i kwantyfikację MRI w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go dla kandydatów na leki neuroprotekcyjne i przeciwzapalne.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację programów terapeutycznych ukierunkowanych na noworodkowe uszkodzenia mózgu z uwzględnieniem korekty ryzyka.
Kwestie dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie wstrzykiwań stereotaktycznych oraz pracy z noworodkami zwierząt.
- Wymaga dostępu do obrazowania MRI oraz infrastruktury analizy obrazu w celu kwantyfikacji objętościowej.
- Wymaga rygorystycznej standaryzacji współrzędnych i objętości wstrzykiwań w celu zapewnienia powtarzalności.
- Możliwość adaptacji do dodatkowych badań z użyciem znaczników CSF w celu poszerzenia wiedzy o mechanizmach.
- Ograniczone do modelowania uszkodzeń pośredniczących w hemoglobinie; może nie odzwierciedlać wszystkich etiologii IVH.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:03
Preparation of the Animal for Injection
2:01
Setting up the Stereotactic Injector
3:05
Animal Injection
4:33
MRI Acquisition and Imaging
5:44
Results: Induction of Intraventricular Hemorrhage by Hemoglobin Injection
7:20
Conclusion
