Name: Mapowanie transferu energii rezonansu Förster: nowa metodologia wyjaśniająca globalne cechy strukturalne (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Poznaj metodologię mapowania FRET do identyfikacji miejsc wiązania ligandów i zmian konformacyjnych białek. Technika ta pozwala badać dynamikę molekularną w roztworze z zachowaniem swobody ruchu cząsteczek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez R15GM135904 grantów National Institutes of Health (przyznanych IM) oraz Grantów Narodowych Instytutów Zdrowia GM110552 (przyznanych DBO).

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dzięki zastosowaniu metodologii mapowania FRET zidentyfikowaliśmy miejsce wiązania sekwencji sygnałowej na białku SecA. Co ważne, obecność trójwymiarowej struktury krystalicznej kompleksu znacznie ułatwiła nam badania. Mocną stroną tej metodologii mapowania jest możliwość wykorzystania istniejącej struktury do identyfikacji lokalizacji do etykietowania. Metodologia ta nie może być stosowana do określania struktury 3D; Jednak wyznaczenie elementów konstrukcyjnych56, udoskonalenie istniejącej strukt...

Dla białek, wyjaśnienie dynamiki wraz z trójwymiarową (3-D) wiedzą strukturalną prowadzi do lepszego zrozumienia relacji struktura-funkcja systemów biomolekularnych. Metody strukturalne, takie jak krystalografia rentgenowska i kriogeniczna mikroskopia elektronowa, rejestrują strukturę statyczną i często wymagają określenia wielu struktur w celu wyjaśnienia aspektów wiązania i dynamiki biomolekuł1. W tym artykule omówiono opartą na rozwiązaniach metodę mapowania globalnych elementów strukturalnych, takich jak miejsca wiązania lub interakcje wiązania, które są potencjalnie bardziej przejściowe i trudniej uchwycone metodami statycznymi. Mocnymi systemami kandydującymi do tej metodologii są te, w których struktura 3D została wcześniej określona za pomocą krystalografii rentgenowskiej, spektroskopii NMR lub innych metod strukturalnych. W tym przypadku wykorzystujemy rentgenowską strukturę krystaliczną kompleksu SecA-SecYEG, centralnego gracza w ogólnym szlaku wydzielniczym białka, do mapowania lokalizacji miejsca wiązania peptydu sygnałowego za pomocą rezonansowego transferu energii rezonansu Förstera (FRET) przed transportem preproteiny przez błonę2. Manipulacja systemem biologicznym poprzez modyfikacje genetyczne w połączeniu z naszą wiedzą na temat struktury 3D umożliwiła określenie konformacji sekwencji sygnałowej i wczesnego dojrzałego regionu bezpośrednio przed wprowadzeniem do kanału 3.
FRET polega na bezemisyjnym przenoszeniu energii z jednej cząsteczki (donora) do drugiej (akceptora) w sposób zależny od odległości, czyli przez przestrzeń4,5. Skuteczność tego transferu jest monitorowana poprzez zmniejszenie dawcy lub zwiększenie intensywności fluorescencji akceptora. Efektywność transferu energii można opisać jako
E = R06/(R06 + R6)
w którym wartość R0 to odległość, przy której transfer jest wydajny w 50%6. Technika ta została wcześniej opisana jako linijka molekularna i jest skuteczna w określaniu odległości w zakresie 2,5-12 nm, w zależności od tożsamości barwników donor-akceptor4,7,8,9. Intensywności i czasy życia fluorescencji donora z akceptorem lub bez niego pozwalają określić efektywność transferu, a co za tym idzie, odległości5,8. Ze względu na dostępność technologii, czułość metody i łatwość użycia, FRET znalazł również szerokie zastosowanie w takich dziedzinach jak spektroskopia fluorescencji pojedynczej cząsteczki i mikroskopia konfokalna6. Pojawienie się białek fluorescencyjnych, takich jak białko zielonej fluorescencji, sprawiło, że obserwacja dynamiki wewnątrzkomórkowej i obrazowanie żywych komórek stały się stosunkowo łatwe10,11. Wiele aplikacji FRET, takich jak te, zostało szczegółowo omówionych w tym wirtualnym wydaniu.
W tym badaniu szczególnie skupiamy się na wykorzystaniu pomiarów FRET do uzyskania wartości odległości w celu określenia szczegółów strukturalnych. Wcześniej pomiary FRET były skutecznie wykorzystywane do określania konformacji cząsteczek DNA po związaniu z białkiem12,13,14, wewnętrzna dynamika białek i interakcje wiązania białek15,16,17. Zaletą tej metody jest możliwość wyznaczenia elastycznych i dynamicznych elementów konstrukcyjnych w roztworze o stosunkowo niewielkiej ilości materiału. Co istotne, metoda ta jest szczególnie skuteczna w połączeniu z istniejącymi informacjami konstrukcyjnymi i nie może być stosowana jako sposób określania struktury 3D. Metoda zapewnia najlepszy wgląd i udoskonalenie struktury, jeśli praca opiera się na istniejących informacjach konstrukcyjnych, często w połączeniu z symulacją obliczeniową18,19. W tym miejscu opisano wykorzystanie odległości uzyskanych z pomiarów FRET w stanie ustalonym i rozdzielczym w czasie do mapowania miejsca wiązania, którego lokalizacja nie była znana, na istniejącej strukturze krystalograficznej kompleksu SecA-SecYEG, głównych białek w ogólnym szlaku wydzielniczym3.
Ogólny szlak wydzielniczy, wysoce zachowany system od prokariontów przez eukarionty do archeonów, pośredniczy w transporcie białek przez błonę lub do ich funkcjonalnego miejsca w komórce. W przypadku bakterii Gram-ujemnych, takich jak E. coli, organizm użyty w naszym badaniu, białka są wprowadzane lub przemieszczane przez błonę wewnętrzną do peryplazmy. Bakteryjny kompleks kanałów SecY (określany jako translokon) koordynuje się z innymi białkami w celu translokacji nowo zsyntetyzowanego białka, które jest kierowane do właściwej lokalizacji w komórce poprzez sekwencję sygnałową zwykle zlokalizowaną na N-<końcu klasy sup = "xref">20,21. W przypadku białek związanych z peryplazmą, białko ATPazy SecA wiąże się z tunelem wyjściowym rybosomu oraz z preproteiną po translacji około 100 reszt22. Wraz z białkiem opiekuńczym SecB utrzymuje preproteinę w stanie rozłożonym. SecA wiąże się z translokonem SecYEG i poprzez wiele cykli hydrolizy ATP ułatwia transport białek przez błonę23,24.
SecA to białko wielodomenowe, które występuje w formie cytozolowej i błonowej. Białko homodimeryczne w cytozolu, SecA składa się z domeny wiążącej lub sieciującej preproteiny25, dwóch domen wiążących nukleotydy, domeny skrzydła spiralnego, domeny rusztowania spiralnego i dwóch palców helisy (THF)26,27,28,29 (Rysunek 1). W poprzednich badaniach krystalograficznych kompleksu SecA-SecYEG lokalizacja THF sugerowała, że był on aktywnie zaangażowany w translokację białka, a późniejsze eksperymenty z sieciowaniem z peptydem sygnałowym dodatkowo ustaliły znaczenie tego regionu w translokacji białek30,31. Poprzednie badania, wykorzystujące metodologię mapowania FRET, wykazały, że egzogenne peptydy sygnałowe wiążą się z tym regionem klasy SecA2,32. Aby w pełni zrozumieć konformację i lokalizację sekwencji sygnałowej i wczesnego dojrzałego regionu preproteiny przed insercją do kanału SecYEG, stworzono chimerę białkową, w której sekwencja sygnałowa i reszty wczesnego dojrzałego regionu zostały przyłączone do SecA za pomocą łącznika Ser-Gly (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Korzystając z tego biologicznie żywotnego konstruktu, wykazano ponadto, że sekwencja sygnałowa i wczesny dojrzały region preproteiny wiążą się z THF w sposób równoległy2. Następnie wykorzystano metodologię mapowania FRET w celu wyjaśnienia konformacji i lokalizacji sekwencji sygnałowej oraz wczesnego dojrzałego regionu w obecności SecYEG, jak opisano poniżej3.
Znajomość struktury 3D kompleksu SecA-SecYEG33,34,35 i możliwa lokalizacja miejsca wiązania pozwoliły nam rozsądnie umieścić etykiety darczyńca-akceptor w miejscach, w których przecięcie poszczególnych odległości FRET identyfikuje lokalizację miejsca wiązania. Te pomiary mapowania FRET ujawniły, że sekwencja sygnałowa i wczesny dojrzały region preproteiny tworzą spinkę do włosów, której końcówka znajduje się u ujścia kanału SecYEG, co pokazuje, że struktura spinki do włosów jest szablonowa przed wprowadzeniem kanału.

<table><tbody><tr><td>Laser LED 490 nm</td><td>Horiba</td><td>1684-LED</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimid//DIBO Alkyne</td><td>Life Technologies</td><td>A20347</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Difco</td><td>DF0812</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 C5 Maleimid/DIBO Alkyne</td><td>Life Technologies</td><td>A10254</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne</td><td>Life Technologies</td><td>S10904</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne</td><td>Life Technologies</td><td>S10906</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra&shy; 4 Filtr odśrodkowy (50kDa MWCO)</td><td>Sigma</td><td>UFC805008</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylmaltoside (DDM)</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>E. coli peptyd sygnałowy fosfatazy alkalicznej SP22</td><td>Biomolekuły Środkowy Zachód</td><td>Nie dotyczy</td><td>Zsyntetyzowany niestandardowy element</td></tr><tr><td>rozszerzony peptyd sygnałowy SP41</td><td>Biomolekuły Środkowy Zachód</td><td>Nie dotyczy</td><td>Zsyntetyzowany niestandardowy przedmiot</td></tr><tr><td>FluorEssence</td><td>Horiba</td><td>wersja 2.4</td><td>program akwizycji spektralnej dla spektrofluorometru Fluoromax4</td></tr><tr><td>Spektrofluorometr Fluoromax 4</td><td>Horiba</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>GlobalsWE</td><td>Laboratorium Dynamiki Fluorescencji, Uniwersytet Kalifornijski, Irvine</td><td></td><td>program analizy spektralnej dla rozpadów czasowo-rozdzielczych</td></tr><tr><td>H&shy; 4&nieśmiały; Azido&nieśmiały; Uff nieśmiały; OH</td><td>BACHEM</td><td>4020250.0001</td><td></td></tr><tr><td>LB (Miller) Bulion</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9723</td><td></td></tr><tr><td>Ludox HS-40 krzemionka koloidalna (40% wag. zawiesina w H2O)</td><td></td> <td>Do uzyskania prawidłowego roztworu rozpraszającego potrzebne jest rozcieńczenie</td> <td>420816 Sigma-Aldrich</td>, aby uzyskać prawidłowe rozwiązanie rozpraszające</tr><tr><td>PTI Felix GX</td><td>Horiba</td><td>wersja 4.1.0.4096</td><td>program akwizycji spektralnej dla PTI Time Master Instrument</td></tr><tr><td>PTI Time Master Instrument</td><td>Horiba</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pymol Molecular Graphics Program</td><td>Schrödinger</td><td>wersja 2.4</td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>Thermo Scientific</td><td>NESLAB RTE 10</td><td></td></tr></tbody></table>

mapowanie transferu energii rezonansu förster: nowa metodologia wyjaśniająca globalne cechy strukturalne

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features

Förster resonance energy transfer (FRET) to sprawdzona metoda oparta na fluorescencji, używana do skutecznego pomiaru odległości w i pomiędzy biomolekułami in vitro, jak również w komórkach. W FRET wydajność transferu energii, mierzona zmianami intensywności fluorescencji lub czasu życia, odnosi się do odległości między dwiema cząsteczkami fluorescencyjnymi lub znacznikami. Wyznaczanie dynamiki i zmian konformacyjnych na podstawie odległości to tylko niektóre przykłady zastosowań tej metody w układach biologicznych. W pewnych warunkach metodologia ta może wzbogacić i ulepszyć istniejące struktury krystaliczne promieniowania rentgenowskiego, dostarczając informacji dotyczących dynamiki, elastyczności i adaptacji do powierzchni wiążących. Opisujemy zastosowanie FRET i związanych z nim wyznaczania odległości w celu wyjaśnienia właściwości strukturalnych poprzez identyfikację miejsca wiązania lub orientacji podjednostek dimerów. Dzięki rozsądnemu wyborowi miejsc znakowania i częstemu stosowaniu wielu strategii znakowania, z powodzeniem zastosowaliśmy te metody mapowania do określenia globalnych właściwości strukturalnych kompleksu białko-DNA i systemu translokacji białek SecA-SecYEG. W systemie SecA-SecYEG zastosowaliśmy metody mapowania FRET w celu zidentyfikowania miejsca wiązania preprotein i określenia lokalnej konformacji związanego regionu sekwencji sygnałowej. W badaniu tym przedstawiono etapy wykonywania badań mapowania FRET, w tym identyfikację odpowiednich miejsc etykietowania, omówienie możliwych etykiet, w tym nienatywnych reszt aminokwasowych, procedury znakowania, sposób wykonywania pomiarów i interpretację danych.

Niniejsze badanie koncentrowało się na określeniu lokalizacji miejsca wiązania prebiałka w białku SecA przed wprowadzeniem prebiałka do kanału SecYEG. W celu zmapowania miejsca wiązania przeprowadzono eksperymenty FRET pomiędzy różnymi regionami prebiałka a trzema odrębnymi lokalizacjami w białkach SecA i SecYEG (Rysunek 1A-D). Na podstawie uzyskanych odległości oraz struktur trójwymiarowych SecA, SecYEG i prebiałka przewidziano lokalizację miejsca wiązania ...

Badanie szczegółowo opisuje metodologię mapowania FRET, w tym wybór miejsc etykietowania, wybór barwników, akwizycję i analizę danych. Metodologia ta jest skuteczna w określaniu miejsc wiązania, zmian konformacyjnych i ruchów dynamicznych w układach białkowych i jest najbardziej użyteczna, jeśli jest wykonywana w połączeniu z istniejącymi informacjami strukturalnymi 3D.

Mapowanie transferu energii rezonansu Förster: nowa metodologia wyjaśniająca globalne cechy strukturalne

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) is an established fluorescence-based method used to successfully measure distances in and between ...

Opracowaliśmy metodologię mapowania FRET, która pozwala na identyfikację i charakterystykę miejsc wiązania ligandów, orientacji podjednostek, zmian konformacyjnych związanych z wiązaniem ligandów oraz dynamicznych ruchów białek. Zaletą tej techniki jest to, że można ją wykonywać w roztworze, a cząsteczki mogą się swobodnie poruszać. Odległości mierzone tą techniką są odpowiednie dla systemów biologicznych.FRET ma szerokie zastosowanie w wielu systemach. Mapowanie usprawnia monitorowanie zmian strukturalnych i dynamicznych w dowolnym systemie biomolekularnym i jest szczególnie skuteczne, jeśli istnieją trójwymiarowe informacje strukturalne. Po oczyszczeniu białka najtrudniejszą częścią jest znakowanie z wysoką wydajnością i usunięcie wolnego barwnika.W eksperymentach pomaga mieć jak najmniej wolnego barwnika. Na początek wybierz miejsca znakowania w promieniu od 25 do 75 angstremów od karnego miejsca wiązania oraz w stosunkowo statycznych regionach białka. Odległość określi konkretną parę barwników FRET, która ma być użyta.Zlokalizuj miejsca znakowania w regionach białkowych, które są stosunkowo różne od siebie. Tak więc miejsca opisują wierzchołki trójkąta, z karnym miejscem wiązania znajdującym się w środku. Aby zmierzyć wartości R0, w zależności od pożądanego rozmiaru i objętości kuwety, należy przygotować dwie próbki białka o tym samym stężeniu białka całkowitego.Jeden z białkiem znakowanym tylko barwnikiem donorowym, a drugi z białkiem znakowanym tylko barwnikiem akceptorowym. Włącz fluorometr i otwórz program do akwizycji i analizy spektralnej w oprogramowaniu FluorEssence, jeśli używasz spektrofluorometru. Kliknij na czerwoną literę M, aby podłączyć komputer do instrumentu i wybierz Widma emisji.Wprowadź parametry skanowania za pomocą elementu menu zbierania eksperymentu, takie jak długość fali wzbudzenia, zakres skanowania emisji, temperatura i próbka, zmień swoją pozycję. Kliknij RTC i zoptymalizuj ustawienia instrumentu zgodnie z opisem w manuskrypcie, monitorując emisję fluorescencji w szczycie za pomocą długości fali wzbudzenia ustawionej na maksimum absorpcji barwnika. Umieść próbkę białka znakowanego przez donora w uchwycie na próbkę i kliknij przycisk uruchom, aby wygenerować skan emisyjny białka znakowanego tylko barwnikiem dawcy, poprzez wzbudzenie próbki przy maksimum absorpcji barwnika i skanowanie nad szczytem emisji.Ustal linię bazową dla skanowania, przedłużając skan o 25 do 50 nanometrów po zakończeniu piku. Zmierz wydajność kwantową białka tylko dawcy, wykonując pomiary absorpcji i fluorescencji na próbkach o różnych stężeniach, zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Przygotować próbki białka zawierającego tylko dawcę, białka zawierającego tylko akceptora i białko akceptora dawcy w tym samym stężeniu.Uzyskaj skan tylko dawcy w celu wygenerowania widm emisyjnych fluorescencji. Wzbudzić roztwór przy maksimum absorpcji barwnika donorowego i zeskanować piki emisji donora i akceptora. Zamień próbkę na białko tylko akceptora lub zmień próbkę na kuwetę zawierającą białko tylko akceptorowe.Uzyskać skan emisyjny białka znakowanego wyłącznie barwnikiem akceptorowym. Wzbudzić próbkę na długości fali wzbudzenia donora. Zamień próbkę na próbkę białka donor-akceptor lub zmień próbkę, zmień swoją pozycję na kuwetę zawierającą białko znakowane donor-akceptor.Uzyskaj skan emisyjny próbki białka donor-akceptor przy użyciu tych samych ustawień. Dla wszystkich widm należy skorygować fluorescencję tła, odejmując liczbę tła zmierzoną na końcu skanowania. Użyj programu do graficznego przeglądania 3D, takiego jak PyMOL, aby odwzorować odległości na konstrukcji, wprowadzając bezpośrednio polecenia ze skryptu do okna poleceń z odpowiednimi informacjami o odległości.Wygeneruj powłokę dla każdej zmierzonej odległości i skojarzonego błędu. Odznacz pozycję poprzez przecięcie różnych pocisków. Miejsce wiązania peptydu sygnałowego zmapowano przy użyciu trzech różnych lokalizacji na SecA i SecYEG oraz czterech różnych lokalizacji na peptydzie sygnałowym.Eksperymenty FRET między różnymi regionami prebiałka i trzema różnymi lokalizacjami na białkach SecA i SecYEG mapują miejsce wiązania i orientację przed białkiem. Karne miejsce wiązania peptydu sygnałowego zostało wcześniej zidentyfikowane jako palec dwuhelisowy, a ogon C-końcowy SecA sugerował orientację równoległą do palca dwuhelisowego. Uzyskano widma FRET w stanie ustalonym pomiędzy SecA37 a PhoA2 i PhoA22.Zmniejszenie intensywności dawcy wskazywało, że większa energia przenoszona z PhoA22. W stosunku do stanowiska PhoA2, które znajduje się dalej od SecA37. Widma rozpadów fluorescencji rozdzielczonej w czasie wykazały, że kompleks donor-akceptor ma krótszy jednorodny rozpad zgodny z transferem energii związanym z jedną odległością.Powłoki dystansowe FRET zbudowane między resztą SecA PhoA2 a miejscami triangulowanymi wykazały, że każda powłoka przecina się z palcem dwuhelisowym, zakładanym miejscem wiązania, które jest pokazane na zielono. Przecięty obszar jest mniejszy niż każda powłoka FRET i zawiera duży wkład rusztowania spiralnego. Powłoki odległości FRET wyznaczone między resztą PhoA2 a oznaczonymi miejscami opisują mniejszy obszar położony bliżej czubka palca dwuspiralnego i ujścia kanału SecYEG.Ten przecięty obszar znajduje się na przeciwległym końcu palca dwuhelisowego od PhoA2. Ważne rzeczy, które należy wziąć pod uwagę, obejmują właściwy wybór miejsc etykietowania w celu triangulacji obszaru zainteresowania, zmierzenia wydajności kwantowej dla każdego miejsca i usunięcia całego wolnego barwnika. Metoda ta jest zgodna z informacjami strukturalnymi uzyskanymi za pomocą metod takich jak NMR lub krystalografia rentgenowska.Gdy wyniki FRET zostaną umieszczone w kontekście strukturalnym, mogą wzbogacić istniejące informacje.

frster-resonance-energy-transfer-mapping-new-methodology-to-elucidate

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Do generowania koherentnego rozpraszania antystokesowskiego Ramana (CARS) oraz dwukrotnie rezonansowego CARS (DR-CARS) wykorzystuje się kombinację trzech krótkopulsowych laserów o pojedynczej długości fali. Różnica między tymi sygnałami zapewnia zwiększoną czułość w przypadku sygnałów koherentnego rozpraszania Ramana, które w przeciwnym razie byłyby trudne do wykrycia, co umożliwia obrazowanie słabych rozpraszaczy ramanowskich.

Obrazowanie różnicowe struktur biologicznych z wykorzystaniem dwustrojonego koherentnego antystokesowego rozpraszania Ramanowskiego (CARS)

Opisujemy tutaj ulepszoną metodę transferu energii rezonansu luminescencji (LRET), w której wprowadzamy miejsce rozszczepienia proteazy między miejscem fluoroforu dawcy i akceptora. Modyfikacja ta pozwala na uzyskanie specyficznych sygnałów LRET pochodzących z interesujących nas białek błonowych, co pozwala na badanie białek błonowych bez oczyszczania białek.

Transfer energii rezonansu luminescencyjnego w celu zbadania zmian konformacyjnych w białkach błonowych ulegających ekspresji w komórkach ssaków

Przedstawiamy konfigurację i eksperymentalną procedurę uzyskiwania danych smFRET z dużych sieci donor-akceptor za pomocą mikroskopu TIRF. Analiza tych pomiarów krok po kroku za pomocą oprogramowania do wnioskowania bayesowskiego Fast-NPS pozwala uzyskać informacje strukturalne o wysokiej rozdzielczości dzięki zastosowaniu dostosowanych modeli barwników.

Informacje strukturalne z eksperymentów z pojedynczymi cząsteczkami FRET przy użyciu systemu szybkiego nanopozycjonowania

Protokół dla wysoce precyzyjnych eksperymentów FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki jest przedstawiony tutaj. Ponadto metodologia ta może być wykorzystana do identyfikacji trzech stanów konformacyjnych w domenie wiążącej ligand receptora N-metylo-D-asparaginianu (NMDA). Wyznaczanie precyzyjnych odległości jest pierwszym krokiem w kierunku budowy modeli konstrukcyjnych w oparciu o eksperymenty FRET.

Wysoka precyzja FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki do określania struktury biomolekuły

Struktury supramolekularnych zespołów białkowych w rozdzielczości atomowej mają duże znaczenie ze względu na ich kluczowe role w różnych zjawiskach biologicznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół do wykonywania wysokorozdzielczych badań strukturalnych nierozpuszczalnych i niekrystalicznych zespołów białek wielkocząsteczkowych za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w stanie stałym z wirowaniem pod magicznym kątem (MAS SSNMR).

Badania strukturalne układów makromolekularnych w skali atomowej za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w ciele stałym

Ten artykuł opisuje protokół do tworzenia trójwymiarowych map chemicznych łączących obrazowanie z filtrem energii i tomografię elektronową. Zbadano rozkład chemiczny dwóch nośników katalizatora utworzonych przez pierwiastki trudne do odróżnienia za pomocą innych technik obrazowania. Każda aplikacja polega na mapowaniu nakładających się na siebie pierwiastków chemicznych - odpowiednio rozstawionych krawędzi jonizacji.

Uzyskiwanie map chemicznych 3D za pomocą tomografii tomografii mikroskopii elektronowej z filtrowaną transmisją energii

Prezentowany tutaj jest protokół do wykonywania transferu energii rezonansu Förstera dla pojedynczej cząsteczki w celu zbadania rozdzielczości HJ. Dwukolorowe wzbudzenie przemienne służy do wyznaczania stałych dysocjacji. Jednokolorowy smFRET poklatkowy jest następnie stosowany w testach rozszczepienia w czasie rzeczywistym w celu uzyskania rozkładu czasu przebywania przed rozdzielczością HJ.

Metody transferu energii rezonansu Förstera w pojedynczych cząsteczkach do badania w czasie rzeczywistym rozdzielczości złącza Hollidaya przez GEN1

Ten artykuł przedstawia metodę analizy czasoprzestrzennej mobilnych, jednocząsteczkowych sond opartych na transferze energii rezonansu Förstera (smFRET) przy użyciu szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej. Nowo opracowany zestaw narzędzi programowych umożliwia wyznaczanie śladów czasowych smFRET poruszających się sond, w tym prawidłowej wydajności FRET i pozycji molekularnych, jako funkcji czasu.

Zautomatyzowana dwuwymiarowa analiza czasoprzestrzenna mobilnych jednocząsteczkowych sond FRET

Elektroniczne obrazowanie rozpraszania Ramana stymulowanego przed rezonansem (epr-SRS) tęczowych barwników Ramana to nowa platforma do wysoce multipleksowanego obrazowania białek opartych na epitopach. W tym miejscu przedstawiamy praktyczny przewodnik obejmujący przygotowanie przeciwciał, barwienie próbki tkanki, montaż mikroskopu SRS i obrazowanie tkanek epr-SRS.

Wysoce zmultipleksowane obrazowanie tkanek za pomocą barwników Ramana

Przedstawiamy protokół do pozyskiwania obrazów chemicznych za pomocą mikroskopii SRS (ang. broadband stimulated Raman scattering). Opierając się na mikroskopie SRS, który działa z różnicową detekcją wielokanałową typu lock-in, protokół opisuje przygotowanie próbki, regulację aparatury SRS i chemometrię w celu rozplątania różnych składników chemicznie niejednorodnych próbek.

Multipleksowe obrazowanie chemiczne oparte na szerokopasmowej mikroskopii rozpraszania Ramana stymulowanego

Protokół zawiera instrukcję modyfikacji RNA za pomocą siarczanu dimetylu do eksperymentów z profilowaniem mutacji. Obejmuje ona sondowanie in vitro i in vivo z dwiema alternatywnymi metodami przygotowania biblioteki.

Sondowanie struktury RNA za pomocą siarczanu dimetylu Profilowanie mutacyjne z sekwencjonowaniem in vitro i w komórkach

Poznaj metodologię mapowania FRET do identyfikacji miejsc wiązania ligandów i zmian konformacyjnych białek. Technika ta pozwala badać dynamikę molekularną w roztworze z zachowaniem swobody ruchu cząsteczek.

Mapowanie transferu energii rezonansu Förster: nowa metodologia wyjaśniająca globalne cechy strukturalne

Przeglądaj więcej filmów