Name: Elektrofizjologiczne metody pomiaru poziomu fotopigmentu w fotoreceptorach Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T12:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Poznaj elektrofizjologiczną metodę pomiaru poziomu fotopigmentu w fotoreceptorach Drosophila. Technika ta umożliwia wykrywanie subtelnych nieprawidłowości w fototransdukcji i jest przydatna w genetycznym przesiewaniu wad wzroku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty z Izraelskiej Fundacji Naukowej (ISF) oraz Amerykańsko-Izraelskiej Dwunarodowej Fundacji Naukowej (BSF). Dziękujemy Panu Anatolijowi Szapochnikowowi za konstrukcję podgrzewacza z żarnika woskowego.

1. Pomiar zależności między intensywnością reakcji, przedłużonym depolaryzacyjnym potencjałem (PDA) i wczesnym potencjałem receptorowym (ERP) za pomocą elektroretinogramu
<ol>
	<li>Odpowiednie warunki chowu dla preparatu D. melanogaster
	<ol>
		<li>Muchy hodowlane D. melanogaster w butelkach zawierających standardową żółtą kukurydzę zawierającą pokarm w inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 24 °C i w 12-godzinnym cyklu ciemnym/jasnym</li>
		<li>Butelki z muchami należy przechowywać w ciemności co najmniej 24 godziny przed eksperymentem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja ogólna
	<ol>
		<li>Przygotuj pipety rejestrujące, pociągając za kapilary ze szkła borokrzemianowego o wymiarach 1 mm x 0,58 mm (OD x ID) wypełnione włóknami (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 6L, O). Rezystancja pipet powinna wynosić 5-10 MΩ; Można użyć dowolnego odpowiedniego ściągacza.</li>
		<li>Pokryj dwa srebrne przewody AgCl2, wkładając srebrny drut 0,25 mm do roztworu 3 M KCl podłączonego do niestandardowego zasilacza 5 V.</li>
		<li>Włóż każdy powlekany srebrny drut do uchwytów elektrod (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 6N).</li>
		<li>Napełnij szklaną kapilarnę przefiltrowanym roztworem Ringera (patrz Tabela 1) za pomocą strzykawki z wydłużoną końcówką (<silna klasa = "xfig">Rysunek 6M).</li>
		<li>Włóż drut elektrodowy do szklanej kapilary. Upewnij się, że roztwór w kapilarze styka się ze srebrnym drutem.</li>
		<li>Włóż uchwyty elektrod (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 7P, N) do dwóch mikromanipulatorów elektrod (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 7G).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procedura przygotowania muchy do nagrań elektrycznych 
	UWAGA: Aby utrzymać muchę w warunkach przystosowanych do ciemności, podczas wykonywania poniższych czynności używaj tylko słabego oświetlenia światłem czerwonym.
	<ol>
		<li>Znieczulić muchy w butelce gazem CO2 za pomocą systemu do podkładów (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 6A, B) i wlać je do pojemnika do podkładu.</li>
		<li>Wybierz jedną muchę i ostrożnie trzymaj ją za skrzydło za pomocą ostrej pęsety. Przykryj resztę much szalką Petriego.</li>
		<li>Umieść muchę na uchwycie muchy we właściwej orientacji - leżąc na boku, tyłem do dłoni (<silna klasa="xfig">Rysunek 6P).</li>
		<li>Włącz zasilanie lutownicy. Ustaw prąd na ~2,25 A. Prąd ten powinien podgrzać żarnik platynowo-irydowy o średnicy 0,25 mm do ~55-56 °C (patrz plik uzupełniający).</li>
		<li>Umieść kroplę wosku o niskiej temperaturze topnienia (~55-56 °C) na lutownicy (<silna klasa="xfig">Rysunek 6F).</li>
		<li>Za pomocą pęsety podnieś muchę ze skrzydeł i przymocuj jej skrzydła do uchwytu na muchy (<silna klasa="xfig">Rysunek 6I) za pomocą lutownicy.</li>
		<li>Za pomocą lutownicy połącz tył muchy z powierzchnią stojaka za pomocą wosku (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 6P).</li>
		<li>Opuść końcówkę lutownicy na punkt łączenia nóg i rozpuść wosk, aby pokryć wszystkie nogi razem (<silna klasa = "xfig">Rysunek 6P).</li>
		<li>Umieść małą kroplę wosku między głową a plecami w okolicy szyi (<silna klasa="xfig">Rysunek 6P). 
		UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność, aby uniknąć przegrzania głowicy muchy. Upewnij się, że mucha jest prawidłowo zamocowana i nie jest w stanie się poruszać podczas eksperymentu; Drobne ruchy mogą powodować powstawanie artefaktów w nagraniach. Upewnij się, że otwory tchawicy (wloty oddechowe) w klatce piersiowej i jamie brzusznej nie są pokryte woskiem.</li>
		<li>Umieść uchwyt na muchy (<silna klasa="xfig">Rysunek 7Q) w ciemnej klatce Faradaya na bloku magnetycznym (<silna klasa="xfig">Rysunek 7I) i upewnij się, że mucha znajduje się ~5 mm od końca światłowodu (<silna klasa="xfig">Rysunek 7L).</li>
		<li>Umieść elektrodę rejestrującą (<silna klasa="xfig">Rysunek 7P) nad okiem muchy, a elektrodę uziemiającą (<silna klasa="xfig">Rysunek 7N) nad górną częścią pleców muchy za pomocą mikromanipulatorów.</li>
		<li>Włóż elektrodę uziemiającą do tylnej części muchy za pomocą mikromanipulatorów.</li>
		<li>Włożyć elektrodę rejestrującą w zewnętrzny brzeg oka muchy, najlepiej za pomocą mikromanipulatorów. 
		UWAGA: Po włożeniu elektrody do oka zaobserwuje się małe wgłębienie; Pociągnij elektrodę do góry, nie wyjmując jej z oka, aż wgłębienie zniknie. Elektrody można również zanurzać w małych kropelkach galaretki elektrodowej nakładanej na tułów i oko.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Protokół intensywność-odpowiedź
	<ol>
		<li>Umieść pomarańczowy filtr (filtr krawędziowy 590) przed wysokociśnieniową lampą ksenonową. Należy użyć dużego (sześć rzędów wielkości) tłumiącego filtra o neutralnej gęstości (ND).</li>
		<li>Odczekaj 60 s w ciemności i daj 5-sekundowy impuls świetlny.</li>
		<li>Wymień filtr ND na filtr ND o mniejszym tłumieniu w krokach co jeden rząd wielkości.</li>
		<li>Odczekaj 60 s w ciemności i daj drugi 5-sekundowy impuls świetlny</li>.
		<li>Powtórz kroki 1.4.1.-1.4.4, stopniowo zwiększając natężenie światła przy użyciu mniej tłumiących filtrów ND (ostatni impuls powinien być generowany bez żadnego filtra ND). Upewnij się, że używasz serii filtrów ND we właściwym kierunku, zaczynając od dużego tłumienia i osiągając niskie tłumienie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Protokół PDA (ten protokół może być wykonywany tylko na muchach białookich)
	<ol>
		<li>Daj 5-sekundowy impuls świetlny o maksymalnym natężeniu za pomocą pomarańczowego filtra (filtr krawędziowy 590, aby przekształcić maksymalny fotopigment w stan R).</li>
		<li>Wymień pomarańczowy filtr na szerokopasmowy niebieski filtr (BP450/40 nm) i daj trzy 5-sekundowe impulsy świetlne o maksymalnej intensywności. 
		UWAGA: Możliwe jest również podanie długiego, ciągłego impulsu światła niebieskiego o maksymalnej intensywności, aż do osiągnięcia napięcia w stanie ustalonym.</li>
		<li>Odczekaj 60 s w ciemności, wymień niebieski filtr na poprzedni pomarańczowy filtr i daj dwa 5-sekundowe impulsy świetlne w odstępach 60 s.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Protokół ERP/M-potencjał do pomiaru widma fotorównowagi M (ten protokół może być wykonywany tylko na muchach białooki10,25)
	<ol>
		<li>Daj ciągły niebieski impuls świetlny (pasmowoprzepustowy (BP) 450/40 nm) aż do osiągnięcia odpowiedzi napięciowej w stanie ustalonym, która przekształca maksymalną ilość fotopigmentu ze stanu R do stanu M komórek R1-6.</li>
		<li>Daj krótki (<3 ms) intensywny błysk światła o długości fali między 350-700 nm (znane widmo absorpcyjne fotopigmentu komórek R1-6) przy użyciu wąskich (~20 nm) filtrów pasmowoprzepustowych i zmierz szczytową amplitudę fazy M1 odpowiedzi potencjału M (która odzwierciedla absorpcję metarodopsyny przy tej określonej długości fali w fotorównowadze10,25). 
UWAGA: Do synchronicznej aktywacji dużej puli cząsteczek fotopigmentu wymagany jest krótki, intensywny błysk światła, aby zawartość fotonów została upakowana w krótkim czasie. Potencjał M składa się z dwóch składników: M1 (ujemna faza rogówki), która odzwierciedla przemieszczenie ładunku metarodopsyny w fotoreceptorze, oraz M2 (dodatnia faza rogówki11,33), który odzwierciedla wzmocnioną odpowiedź M1 fotoreceptorów w blaszce9,10,11. Każdy z tych elementów można zidentyfikować i zmierzyć. Jednak lepiej jest mierzyć potencjał M1, ponieważ jest to bezpośrednia liniowa manifestacja poziomów M. Jeśli używany jest M2, upewnij się, że jego amplituda mieści się w zakresie liniowym, używając łagodnej deprywacji karotenoidów24,25.</li>
		<li>Ponownie daj ciągły niebieski impuls świetlny (BP450/40 nm), po którym następuje krótki (<1 ms) intensywny błysk światła o innej długości fali.</li>
		<li>Powtarzaj ten protokół, aż całe widmo absorpcyjne M w stanie równowagi foto zostanie pokryte.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Protokół ERC do pomiaru spektrum działania stanów R i M komórek R1-6 przy użyciu zapisów cęgowych napięcia całego ogniwa
UWAGA: Szczegółowy protokół korzystania z nagrań cęgowych całego ogniwa można znaleźć w Katz et al.34. Potencjał M wykorzystuje ERG do pomiaru aktywacji stanu M tylko dlatego, że wkład stanu R jest tłumiony przez pojemność membrany. W przeciwieństwie do tego, ERC mierzy aktywację zarówno stanów R (dodatni ERC), jak i M (ujemny ERC), ponieważ zapisy napięcia cęgowego usuwają efekt pojemności membrany (patrz wprowadzenie).
<ol>
	<li>Przekształć fotopigment do żądanego stanu (R lub M). W przypadku konwersji R na M, najpierw dostosuj muchy za pomocą krótkiego (<1 ms) adaptacyjnego niebieskiego (BP450/40 nm) błysku. W przypadku konwersji M na R daj krótki adaptacyjny pomarańczowy błysk (filtr krawędziowy OG590).</li>
	<li>Daj krótki błysk świetlny (<1 ms) o długości fali od 350 do 700 nm i zmierz maksymalną ujemną lub dodatnią amplitudę odpowiedzi ERBN, która odzwierciedla absorpcję M/R przy tej określonej długości fali. 
	UWAGA: Do synchronicznej aktywacji dużej puli cząsteczek fotopigmentu wymagany jest krótki, intensywny błysk światła, aby upakować zawartość fotonów w krótkim czasie. Maksymalna konwersja fotopigmentu z R do M przez niebieski błysk może osiągnąć ~ 80% całkowitych cząsteczek fotopigmentu ze względu na nakładanie się widma absorpcji R i M (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3A). Dlatego przy długościach fal poniżej ~550 nm ERC ma dwa składniki: fazę ujemną, która odzwierciedla odpowiedź metarodopsyny, oraz fazę dodatnią, która odzwierciedla odpowiedź pozostałej rodopsyny. ERC zależy liniowo od natężenia światła (<silna klasa="xfig">Rysunek 5D). W związku z tym, aby wyprowadzić czułość spektralną stanów R i M, każda faza ERC musi być znormalizowana na różnych długościach fal dla równej energii29.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.1.-2.2., używając błysków o różnych długościach fal.</li>
	<li>Wykreśl znormalizowane dodatnie i ujemne ERC w funkcji długości fali. 
	UWAGA: Silny błysk światła indukuje ogromny prąd przez kanały wrażliwe na światło, prowadząc do stresu metabolicznego w fotoreceptorze, co z kolei powoduje otwarcie kanału niezależnego od światła. Na ten konstytutywny prąd nakłada się ERBN.</li>
</ol>

<ol><li>Vogt, K., Kirschfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+identity+of+the+chromophores+of+fly+visual+pigment%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Chemical identity of the chromophores of fly visual pigment.</a> Naturwissenschaften. 77, 211-213 (1984).</li>
<li>Hillman, P., Hochstein, S., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+in+invertebrate+photoreceptors%3A+role+of+pigment+bistability%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Transduction in invertebrate photoreceptors: role of pigment bistability.</a> Physiological Reviews. 63 (2), 668(1983).</li>
<li>Hamdorf, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHamdorf%2C+K+%22Handbook+of+Sensory+Physiology.+Comparative+Physiology+and+Evolution+of+Vision+in+Invertebrates%22">Handbook of Sensory Physiology. Comparative Physiology and Evolution of Vision in Invertebrates</a>. Autrum, H. 7, Springer-Verlag. 145-224 (1979).</li>
<li>Gagné, S., Roebroek, J. G., Stavenga, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enigma+of+early+receptor+potential+in+fly+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Enigma of early receptor potential in fly eyes.</a> Vision Research. 29 (12), 1663-1670 (1989).</li>
<li>Pak, W. L., Shino, S., Leung, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDA+%28prolonged+depolarizing+afterpotential%29-defective+mutants%3A+the+story+of+nina%27s+and+ina%27s--pinta+and+santa+maria%2C+too%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">PDA (prolonged depolarizing afterpotential)-defective mutants: the story of nina's and ina's--pinta and santa maria, too.</a> Journal of Neurogenetics. 26 (2), 216-237 (2012).</li>
<li>Wang, X., Wang, T., Jiao, Y., von, L. J., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+an+enzymatic+visual+cycle+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Requirement for an enzymatic visual cycle in Drosophila.</a> Current Biology. 20 (2), 93-102 (2010).</li>
<li>Pak, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+in+vision+research.+The+Friedenwald+lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Drosophila in vision research. The Friedenwald lecture.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (12), 2340-2357 (1995).</li>
<li>Pak, W. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPak%2C+WL+%22Neurogenetics%2C+Genetic+Approaches+to+the+Nervous+System%22">Neurogenetics, Genetic Approaches to the Nervous System</a>. Breakfield, X. , Elsevier, North-Holland. 67-99 (1979).</li>
<li>Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+reduction+in+excitation+efficiency+in+the+trp+mutant+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Light-induced reduction in excitation efficiency in the trp mutant of Drosophila.</a> The Journal of General Physiology. 79, 361-385 (1982).</li>
<li>Minke, B., Kirschfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+electrical+potentials+arising+from+activation+of+metarhodopsin+in+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fast electrical potentials arising from activation of metarhodopsin in the fly.</a> The Journal of General Physiology. 75 (4), 381-402 (1980).</li>
<li>Stephenson, R. S., Pak, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogenic+components+of+a+fast+electrical+potential+in+Drosophila+compound+eye+and+their+relation+to+visual+pigment+photoconversion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Heterogenic components of a fast electrical potential in Drosophila compound eye and their relation to visual pigment photoconversion.</a> The Journal of General Physiology. 75 (4), 353-379 (1980).</li>
<li>Agam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+stress+reversibly+activates+the+Drosophila+light-sensitive+channels+TRP+and+TRPL+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (15), 5748-5755 (2000).</li>
<li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trp+gene+is+essential+for+a+light-activated+Ca2%2B+channel+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 8, 643-651 (1992).</li>
<li>Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+light-activated+conductance+is+composed+of+the+two+channels+TRP+and+TRPL%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL.</a> Cell. 85 (5), 651-659 (1996).</li>
<li>Phillips, A. M., Bull, A., Kelly, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Drosophila+gene+encoding+a+calmodulin-binding+protein+with+homology+to+the+trp+phototransduction+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Identification of a Drosophila gene encoding a calmodulin-binding protein with homology to the trp phototransduction gene.</a> Neuron. 8, 631-642 (1992).</li>
<li>Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+light-induced+response+of+the+central+retinular+cells+from+the+electroretinogram+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Isolation of light-induced response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila.</a> Journal of Comparative Physiology. 98, 345-355 (1975).</li>
<li>Selinger, Z., Doza, Y. N., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+genetics+of+photoreceptors+desensitization+in+Drosophila+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and genetics of photoreceptors desensitization in Drosophila flies.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1179, 283-299 (1993).</li>
<li>Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+of+the+prolonged+depolarizing+afterpotential+%28PDA%29+and+its+role+in+genetic+dissection+of+Drosophila+phototransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">The history of the prolonged depolarizing afterpotential (PDA) and its role in genetic dissection of Drosophila phototransduction.</a> Journal of Neurogenetics. 26 (2), 106-117 (2012).</li>
<li>Satoh, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin+translocation+is+stoichiometric+to+rhodopsin+isomerization+and+accelerated+by+phototransduction+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Arrestin translocation is stoichiometric to rhodopsin isomerization and accelerated by phototransduction in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 67 (6), 997-1008 (2010).</li>
<li>Byk, T., Bar Yaacov, M., Doza, Y. N., Minke, B., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+arrestin+cycle+secures+the+fidelity+and+maintenance+of+the+fly+photoreceptor+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Regulatory arrestin cycle secures the fidelity and maintenance of the fly photoreceptor cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 1907-1911 (1993).</li>
<li>Dolph, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin+function+in+inactivation+of+G+protein-coupled+receptor+rhodopsin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Arrestin function in inactivation of G protein-coupled receptor rhodopsin in vivo.</a> Science. 260, 1910-1916 (1993).</li>
<li>Belusic, G., Pirih, P., Stavenga, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+responses+of+fruitflies+with+normal+and+reduced+arrestin+content+studied+by+simultaneous+measurements+of+visual+pigment+fluorescence+and+ERG%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology.+A%2C+Neuroethology%2C+Sensory%2C+Neural%2C+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor responses of fruitflies with normal and reduced arrestin content studied by simultaneous measurements of visual pigment fluorescence and ERG.</a> Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 196 (1), 23-35 (2010).</li>
<li>Stavenga, D. G., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metarhodopsin+control+by+arrestin%2C+light-filtering+screening+pigments%2C+and+visual+pigment+turnover+in+invertebrate+microvillar+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology.+A%2C+Neuroethology%2C+Sensory%2C+Neural%2C+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Metarhodopsin control by arrestin, light-filtering screening pigments, and visual pigment turnover in invertebrate microvillar photoreceptors.</a> Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 197 (3), 227-241 (2011).</li>
<li>Stark, W. S., Zitzmann, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+adaptation+mechanisms+and+photopigment+spectra+by+vitamin+A+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Isolation of adaptation mechanisms and photopigment spectra by vitamin A deprivation.</a> Journal of Comparative Physiology. 105, 15-27 (1976).</li>
<li>Minke, B., Kirschfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+a+sensitizing+pigment+to+the+photosensitivity+spectra+of+fly+rhodopsin+and+metarhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">The contribution of a sensitizing pigment to the photosensitivity spectra of fly rhodopsin and metarhodopsin.</a> The Journal of General Physiology. 73, 517-540 (1979).</li>
<li>Cone, R. A., Cobbs, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+cycle+in+the+living+eye+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin cycle in the living eye of the rat.</a> Nature. 221 (5183), 820-822 (1969).</li>
<li>Murakami, M., Pak, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellularly+recorded+early+receptor+potential+of+the+vertebrate+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Intracellularly recorded early receptor potential of the vertebrate photoreceptors.</a> Vision Research. 10 (10), 965-975 (1970).</li>
<li>Hodgkin, A. L., Obryan, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+recording+of+the+early+receptor+potential+in+turtle+cones%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Internal recording of the early receptor potential in turtle cones.</a> The Journal of Physiology. 267 (3), 737-766 (1977).</li>
<li>Yasin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+mouse+melanopsin+in+Drosophila+photoreceptors+reveals+fast+response+kinetics+and+persistent+dark+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of mouse melanopsin in Drosophila photoreceptors reveals fast response kinetics and persistent dark excitation.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3624-3636 (2017).</li>
<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolysis+of+caged+Ca+2%2B+facilitates+and+inactivates+but+does+not+directly+excite+light-sensitive+channels+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Photolysis of caged Ca 2+ facilitates and inactivates but does not directly excite light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 15, 889-902 (1995).</li>
<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+recordings+of+the+light+induced+current+in+dissociated+Drosophila+photoreceptors%3A+evidence+for+feedback+by+calcium+permeating+the+light-sensitive+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Containing+Papers+of+a+Biological+Character.+Royal+Society+%28Great+Britain%29%22%5BJournal%5D)">Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing Papers of a Biological Character. Royal Society (Great Britain). 245, 203-210 (1991).</li>
<li>Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+mutant+defective+in+extracellular+calcium-dependent+photoreceptor+deactivation+and+rapid+desensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Drosophila mutant defective in extracellular calcium-dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization.</a> Nature. 354, 230-232 (1991).</li>
<li>Pak, W. L., Lidington, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+electrical+potential+from+a+long-lived%2C+long-wavelength+photoproduct+of+fly+visual+pigment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fast electrical potential from a long-lived, long-wavelength photoproduct of fly visual pigment.</a> The Journal of General Physiology. 63 (6), 740-756 (1974).</li>
<li>Katz, B., Gutorov, R., Rhodes-Mordov, E., Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+method+for+whole-cell+voltage+clamp+recordings+from+drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55627(2017).</li>
<li>Selinger, Z., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+lipid+cascade+of+vision+studied+in+mutant+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">Inositol lipid cascade of vision studied in mutant flies.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 53, 333-341 (1988).</li>
<li>Minke, B., Kirschfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microspectrophotometric+evidence+for+two+photoconvertible+states+of+visual+pigments+in+the+barnacle+lateral+eye%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Microspectrophotometric evidence for two photoconvertible states of visual pigments in the barnacle lateral eye.</a> The Journal of General Physiology. 71, 37-45 (1978).</li>
<li>Ranganathan, R., Harris, W. A., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+genetics+of+invertebrate+phototransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The molecular genetics of invertebrate phototransduction.</a> Trends in Neurosciences. 14, 486-493 (1991).</li>
<li>Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+photon+responses+in+Drosophila+photoreceptors+and+their+regulation+by+Ca+2%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2.</a> The Journal of Physiology. 524, 179-194 (2000).</li>
<li>Dimitracos, S. A., Tsacopoulos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recovery+from+a+transient+inhibition+of+the+oxidative+metabolism+of+the+photoreceptors+of+the+drone+%28Apis+mellifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The recovery from a transient inhibition of the oxidative metabolism of the photoreceptors of the drone (Apis mellifera).</a> Journal of Experimental Biology. 119, 165-181 (1985).</li>
<li>Agam, K., Frechter, S., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Drosophila+TRP+and+TRPL+channels+requires+both+Ca+2%2B+and+protein+dephosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca 2+ and protein dephosphorylation.</a> Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Główną zaletą stosowania preparatu fotoreceptorów Drosophila jest jego dostępność, łatwość i dokładność stymulacji światłem, a przede wszystkim możliwość zastosowania mocy genetyki molekularnej7. Szeroko zakrojone badania genetyczne ustaliły, że Drosophila jest niezwykle użytecznym systemem modelowym do genetycznej analizy złożonych procesów biologicznych7. Stosunkowo prosta struktura genomu Drosophila (składającego się tylko z czterech chromosomó...

Aktywowana światłem rodopsyna (R), która jest receptorem sprzężonym z białkiem G (GPCR), składa się z 7 białek transbłonowych (opsyna) i chromoforu. U Drosophila melanogaster (muszka owocowa) absorpcja fotonów indukuje izomeryzację chromoforu 11-cis-3-OH-siatkówki do all-trans-3-OH-retinal1, promując konformacyjną zmianę rodopsyny na metarodopsynę (M, <silna klasa="xfig">Rysunek 1A). W przeciwieństwie do rodopsyny kręgowców, dominująca frakcja chromoforu bezkręgowców nie dysocjuje od opsyny, co skutkuje fizjologicznie aktywnym, ciemnostabilnym stanem pigmentowym M. Z kolei dodatkowa absorpcja fotonów przez chromofor all-trans-3-OH-retinalowy indukuje izomeryzację chromoforu2,3, generując stan pigmentu R za pomocą chromoforu 11-cis-3-OH-retinal. Stan R to ciemny, stabilny i fizjologicznie nieaktywny fotopigment. Oprócz niezwykle szybkiej drogi regeneracji fotonów chromoforu4, podobnie jak w przypadku fotopigmentów kręgowców, u bezkręgowców istnieje alternatywna enzymatyczna powolna droga regeneracji chromoforów, w której niektóre etapy są wykonywane w komórkach siatkówki otaczających komórki fotoreceptorów5,6.
Drosophila ma ogromne zalety jako organizm modelowy do badania fotoreceptorów bezkręgowców. W szczególności dostępność preparatu i możliwość zastosowania genetyki molekularnej sprawiły, że Drosophila stała się potężnym systemem modelowym7. W związku z tym ustanowiono kilka eksperymentalnych metod in vivo i ex vivo do badania fototransdukcji w ogóle, a w szczególności poziomów fotopigmentu. Najprostsza metoda in-vivo wykorzystuje stosunkowo dużą pozakomórkowo zarejestrowaną odpowiedź napięciową na światło oka Drosophila. W związku z tym stymulacja światłem wywołuje elektryczną odpowiedź napięciową w całym oku, którą można zmierzyć za pomocą zapisu elektroretinogramu zewnątrzkomórkowego (ERG), który jest ~ 3 rzędy wielkości większy niż odpowiedź ERG na światło oczu kręgowców8,9. Odpowiedź Drosophila ERG jest solidna i łatwa do uzyskania, co czyni ją wygodną metodą identyfikacji nieprawidłowości w odpowiedzi na światło spowodowane mutacjami. Reakcja ERG na światło wynika głównie z fotoreceptorów, komórek barwnikowych (glejowych) i wtórnych neuronów blaszki (patrz <silna klasa="xfig">Ryc. 1B). Głównymi składnikami ERG są (i) zewnątrzkomórkowa odpowiedź napięciowa fotoreceptorów, (ii) stany przejściowe "włączone" i "wyłączone" na początku i na końcu bodźca świetlnego, które powstają z neuronów blaszki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A, wstawka, ON, OFF), (iii) powolna odpowiedź komórek glejowych (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A, wstawka, strzałki) oraz (iv) krótka i przejściowa odpowiedź, wynikająca z przemieszczenia ładunku podczas aktywacji fotopigmentu, która poprzedza ON transient10 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C [wstawka], D, E). Ta krótka odpowiedź składa się z dwóch faz (M1 i M2, <silna klasa="xfig">Rysunek 2C [wstawka]) i może być wywołana tylko przez niezwykle silną stymulację światłem, która aktywuje jednocześnie miliony cząsteczek fotopigmentu. Nie obserwuje się go ani pod niebieską stymulacją (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D, niebieski ślad), ani u mutantów o wysoce obniżonym poziomie fotopigmentu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E, czerwony ślad), ale jego amplituda jest nieznacznie zwiększona w mutancie, który znosi aktywność PLC (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E, pomarańczowy ślad). Faza M1 jest typowym ERP muchy powstającym w wyniku aktywacji M w fotoreceptorach. Faza M1, która ma dodatnią polaryzację (wewnątrzkomórkowo), uwalnia neuroprzekaźnik w normalny sposób w synapsie odwracającej znaki i aktywuje neurony blaszki, które reagują na depolaryzację fotoreceptorów, generując synaptycznie amplifikowaną fazę M2. Tak więc zarówno faza M1, jak i M2 odzwierciedlają aktywację M10,11.
Depolaryzacja fotoreceptora generuje stan przejściowy "on" dodatni dla rogówki, wynikający z synapsy odwracającej znak między aksonem fotoreceptora a neuronami monopolarnymi blaszki10,11 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Powolny wzrost i zanik ERG wynika z depolaryzacji komórek pigmentowych (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A, wstawka, strzałki) głównie z powodu wypływu K+ z komórek fotoreceptorowych12 przez kanały przejściowego potencjału receptora (TRP) i TRP podobne (TRPL)13,14,15. Te powolne komponenty kinetyczne w dużej mierze maskują i zniekształcają przebieg odpowiedzi fotoreceptora w porównaniu z wewnątrzkomórkowymi lub całokomórkowymi zapisami odpowiedzi fotoreceptora na światło9,10. Dodatkowo, przy bardzo silnym oświetleniu, można zaobserwować dodatkową reakcję przejściową, która poprzedza i częściowo łączy się z fazą przejściową "włączoną" (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C [wstawka],D,E). Sygnał ten pochodzi bezpośrednio z masywnej aktywacji fotopigmentu10.
Kilka protokołów reżimu świetlnego wykorzystujących neutralną gęstość (ND) i filtry kolorów, a także silne błyski rozświetlające, zostały opracowane w celu ogólnego zbadania oka, a kaskady fototransdukcji w szczególności. Protokoły te zostały również wykorzystane do zbadania właściwości fotopigmentu.
Protokół intensity-response mierzy szczytową amplitudę napięcia ERG całego oka na rosnące natężenie światła (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A,B). Protokół ten pomaga w wykrywaniu zmian we wrażliwości komórek fotoreceptorów na światło9.
Protokół przedłużonego depolaryzacji potencjału (PDA) wykorzystuje różnice w widmach absorpcji rodopsyny i metarodopsyny, co pozwala u Drosophila na masową konwersję fotopigmentu R do fizjologicznie aktywnego i ciemnego stabilnego pośredniego stanu M2. W odpowiedzi napięciowej ERG podawany jest stosunkowo krótki impuls nasyconego światła, a wynikowa odpowiedź napięciowa jest rejestrowana. W tym stanie pułap (potencjał odwrócenia) jest osiągany przez sygnał depolaryzacji, ponieważ aktywacja ułamka procenta ogromnej ilości cząsteczek rodopsyny (~1 x 108) jest wystarczająca, aby osiągnąć sufit. Obecność składników fototransdukcji w dużych ilościach zapewnia, że pułap ten zostanie osiągnięty nawet u mutantów ze znacznym spadkiem stężenia lub subtelnym nieprawidłowym funkcjonowaniem komponentów fototransdukcji. Sytuacja ta wyklucza izolację tych mutantów. Pak i in. wprowadzili PDA screening7 poszukując wiarygodnego i odkrywczego testu do izolacji wizualnych mutantów. U Drosophila odpowiedź PDA jest wywoływana przez genetyczne usunięcie czerwonego pigmentu przesiewowego, który umożliwia konwersję fotopigmentu, oraz zastosowanie niebieskiego światła, które jest preferencyjnie absorbowane przez rodopsynę (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3A), a zatem powoduje dużą konwersję netto R do stanu fotopigmentu M. Zakończenie fototransdukcji jest zakłócone na poziomie fotopigmentu przez dużą konwersję netto R do M, co z kolei skutkuje trwałym wzbudzeniem długo po wyłączeniu światła (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C, <silna klasa="xfig">Rysunek 4A [góra]). W okresie PDA fotoreceptory są mniej wrażliwe na kolejne światła testowe i są częściowo odczulone (dezaktywowane). PDA wykrywa nawet drobne defekty w biogenezie rodopsyny i testuje maksymalną zdolność komórki fotoreceptorowej do utrzymania pobudzenia przez dłuższy czas. Ponieważ jest ściśle zależny od obecności wysokich stężeń rodopsyny, łatwo ocenia niedostateczne uzupełnianie składników fototransdukcji. Co ciekawe, ekran PDA przyniósł wiele nowych i bardzo ważnych mutantów wizualnych (recenzowane w Pak et al.7). Tak więc mutanty PDA wyizolowane przez Pak et al.7 są nadal niezwykle przydatne do analizy układu wzrokowego Drosophila.
PDA jest indukowane u Drosophila przez nasycenie niebieskiego światła, co skutkuje ciągłą depolaryzacją długo po przesunięciu światła (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A [góra]). Po nasyceniu niebieskiego światła indukującego PDA, fotoreceptory obwodowe (R1-6) pozostają stale aktywne w ciemności ze swoją maksymalną wydajnością, osiągając nasycenie. Dodatkowe nasycone niebieskie światła podczas PDA nie wywołują żadnej dodatkowej odpowiedzi w komórkach R1-6 przez wiele sekund, ale indukują odpowiedź w komórkach R7-8, która jest nakładana na PDA. Nałożone na siebie odpowiedzi są wyjaśnione przez różne widma absorpcyjne fotopigmentów wyrażonych w tych komórkach (R7-8)16. PDA może być stłumiony przez fotokonwersję M z powrotem do R z nasycającym pomarańczowym światłem (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A [góra]). Zdolność PDA do doprowadzenia komórek fotoreceptorów do ich maksymalnej zdolności aktywnej, czego nie można osiągnąć za pomocą intensywnego białego światła, wyjaśnia, dlaczego jest to główne narzędzie do badań przesiewowych w kierunku wizualnych mutantów Drosophila. Dzieje się tak dlatego, że pozwala na wykrycie nawet drobnych defektów w białkach biorących udział w biogenezie prawidłowych poziomów fotopigmentu17,18. Wyizolowano dwie grupy mutantów z wadami PDA: mutanty ani mutanty inaktywacyjne, ani popotencjałowe (nina) oraz mutanty inaktywowane, ale nie popotencjałowe (ina). Fenotypem tego pierwszego jest brak PDA i związana z tym inaktywacja wynikająca z dużego obniżenia poziomu fotopigmentu (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A [środek]). Fenotyp tego ostatniego wykazuje inaktywację, ale nie ma ciemnej depolaryzacji po niebieskim świetle z powodu wciąż nieznanego mechanizmu w mutancie z normalnym poziomem rodopsyny, ale pozbawionym białek oddziałujących z kanałami TRP (<silna klasa = "xfig" >Figura 4A [na dole]).
PDA wynika z różnicy w ilości fotopigmentu w stosunku do aresztyny (ARR2), która wiąże i kończy aktywność M19,20,21 (Rysunek 1A). W fotoreceptorach Drosophila ilość fotopigmentu jest około pięciokrotnie większa niż ilość ARR219. Tak więc poziomy ARR2 są niewystarczające do dezaktywacji wszystkich cząsteczek M generowanych przez dużą fotokonwersję netto R do M, pozostawiając nadmiar M stale aktywny w ciemności17,19,20,22,23. Mechanizm ten wyjaśnia eliminację odpowiedzi PDA przez mutacje lub deprywację karotenoidów24,25, powodując obniżenie poziomu fotopigmentu, ale nie wpływa na poziom aresztyny. Co więcej, wyjaśnienie to uwzględnia również fenotypy zmutowanego allelu mutanta ARR2 (arr23) mutant allelu21, w którym PDA można osiągnąć przy ~10-krotnym ściemnianiu niebieskiego światła19,20,21 (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B,C). PDA nie jest unikalną cechą fotoreceptorów much i pojawia się u każdego badanego gatunku, który ma ciemne stabilne M o widmie absorpcyjnym innym niż w stanie R, co pozwala na wystarczającą fotokonwersję fotopigmentu ze stanu R do stanu M. Dokładnie zbadanym gatunkiem, u którego odkryto fenomenologię PDA, jest fotoreceptor pąkli (Balanus), w którym widmo absorpcyjne stanu R jest na większej długości fali niż stan M2 (<silna klasa="xfig">Ryc. 3B). W związku z tym, w przeciwieństwie do sytuacji w muchy, w pąkli pomarańczowo-czerwone światło indukuje PDA, podczas gdy niebieskie światło tłumi PDA2.
Protokół wczesnego potencjału receptorowego (ERP) wykorzystuje przemieszczenie ładunku występujące podczas aktywacji R lub M. Pigment wizualny jest integralną częścią błony powierzchniowej przedziału sygnalizacyjnego zarówno błon kręgowców, jak i bezkręgowców3. W związku z tym procesowi aktywacji, w którym cząsteczki fotopigmentu przechodzą z jednego stanu pośredniego w drugi, towarzyszy przemieszczenie ładunku4,26. Ponieważ cząsteczki fotopigmentu są elektrycznie wyrównane równolegle z pojemnością błony4, szybka zsynchronizowana zmiana konformacyjna generuje szybką zmianę polaryzacji błony powierzchniowej, która u much zachodzi w przedziale sygnalizacyjnym złożonym ze stosu ~ 30 000-50 000 mikrokosmków zwanych rabdomere. Ta polaryzacja następnie rozładowuje się pasywnie przez pojemność błony ciała komórki, aż błona komórkowa zostanie równomiernie spolaryzowana. ERP to zewnątrzkomórkowy zapis przemieszczenia ładunku. Wewnątrzkomórkowy zapis ERP manifestuje zewnątrzkomórkowy ERP zintegrowany przez stałą czasową błony komórkowej4,27,28. Prąd aktywowany przez wizualne przemieszczenie ładunku pigmentu można również zmierzyć w nagraniach cęgów napięcia całego ogniwa29,30 (<silna klasa="xfig">Rysunek 5A-D), z główną zaletą (we wczesnych zapisach prądu receptora (ERC)) minimalizacją wpływu pojemności membrany na kinetykę sygnału.
Sekcja protokołu opisuje, jak wykonywać pomiary ERG z Drosophila eye9 oraz pomiary ERC na podstawie zapisów całokomórkowych z izolowanej ommatidii Drosophila31,32. Opisujemy również konkretne protokoły, które są używane do badania fototransdukcji w ogóle, a fotopigmentów w szczególności.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka 1 ml z wydłużoną końcówką</td><td></td><td></td><td>Rysunek 6M</td></tr><tr><td>1 szorstka pęseta</td><td></td><td>Dumont #5, Standard</td><td>0,1 mm x 0,06 mm, długość 110 mm, Inox (Rysunek 6H)</td></tr><tr><td>2 soczewki kondensatora</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przetwornik A/D</td><td>Urządzenie molekularne</td><td>Digidata 1200</td><td>Możliwa zamiana: dowolne dane cyfrowe z urządzeń molekularnych (np. 1440A) -Rysunek 7C</td></tr><tr><td>Wzmacniacz</td><td>Prawie idealna elektronika</td><td></td><td>Możliwa wymiana: instrumenty Warner - IE251A lub IE-210 (w zestawie ze sceną główną) - Rysunek 7D</td></tr><tr><td>Stół antywibracyjny</td><td>Newport</td><td>VW-3036-OPT-01</td><td>Rysunek 7H</td></tr><tr><td>Kapilary</td><td>Harvard Aparat</td><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>1 mm x 0,58 mm (Rysunek 6O)</td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td>urządzenia</td><td></td> molekularnego <td>Clampex</td></tr><tr><td>CO2 </ zbiornik sub></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Źródło zimnego światła</td><td>Schott</td><td>KL1500 LCD</td><td>Rysunek 6C</td></tr><tr><td>Delikatne wycieraczki</td><td>Kimtech Kimwipes</td><td></td><td>(Rysunek 6K)</td></tr><tr><td>Uchwyt</td><td></td><td></td> elektrody <td>Nadaje się do kapilarnej średnicy zewnętrznej 1 mm (Rysunek 6N, Rysunek 7N i Rysunek 7P)</td></tr> <tr><td>Klatka Faradaya</td><td>Domowa robota</td><td></td><td>Elektromagnetyczna osłona przeciwhałasowa i kurtyna przednia (Rysunek 7K)</td></tr><tr><td>Filtr (kolor)</td><td>Schott</td><td>OG590, filtr krawędziowy</td><td>Rysunek 7S</td></tr><tr><td>Filtr (kolor)</td><td>Schott</td><td>BP450/40 nm</td><td>Rysunek 7S</td></tr><tr><td>Filtr (kolor)</td><td>Blazers</td><td>550 nm</td><td>Rysunek 7S Filtr</td></tr><tr><td>(kolor) dla źródła zimnego światła</td><td>Schott</td><td>RG630</td><td>Rysunek 6C</td></tr><tr><td>Filtr (ciepło)</td><td>Schott</td><td>KG3</td><td>Rysunek 7S Filtry</td></tr><tr><td>(neutralne filtr gęstości)</td> <td>Chroma</td><td>6,5,4,3,2,1,0,5,0,3</td><td>Rysunek 7S</td></tr><tr><td>System lamp błyskowych</td><td>Honeywell</td><td></td><td>Rysunek 7U</td></tr><tr><td>System podkładów muchowych z wtryskiwaczem</td><td>Inject + matic</td><td></td><td>Rysunek 6A-B</td></tr><tr><td>Zasilacz lampy</td><td>PTI</td><td>LPS-220</td><td>Rysunek 7W</td></tr><tr><td>Detektor światła</td><td>Fototranzystor domowej roboty</td><td></td><td>(rysunek 7O)</td></tr><tr><td>Światłowód</td><td></td><td></td><td>Średnica 3 mm, długość 1,3 m (Rysunek 7L,M)</td></tr><tr><td>Źródło</td><td></td><td></td> światła <td>Wysokociśnieniowa, wolna od ozonu lampa ksenonowa o mocy 75 W (działająca na 50 W), możliwa wymiana: Badania Cairn - OptoLED (Rysunek 7R)</td></tr> <tr><td>Wosk topliwy w niskiej temperaturze</td><td>Domowej roboty</td><td></td><td>Składa się z mieszaniny wosku pszczelego (Tm&asymp; 62 &stopnie; C) i parafina w stosunku ~3:1, aby osiągnąć temperaturę topnienia ~55&ndash; 56 &stopni; C (Rysunek 6J)</td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny na muchy</td><td>Domowej roboty</td><td></td><td>Rysunek 6I i Rysunek 7Q</td></tr> System <tr><td>przedwzmacniacza mikroelektrodowego ze stopniem czołowym</td><td>Prawie doskonała elektronika</td><td></td><td>Tester impedancji (rysunek 7G)</td></tr><tr><td>Mikromanipulator (mechaniczny zgrubny)</td><td>Tritech Research, Narishige</td><td>M-2</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator (mechaniczny drobny)</td><td>Leitz Microsystems</td><td>Leitz Mikromanipulator mechaniczny</td><td>Rysunek 7F</td></tr><tr><td>pCLAMP</td><td>Oprogramowanie</td>urządzenia <td></td><td>molekularnego</td></tr><tr><td>szalka</td><td></td><td></td> Petriego <td>60 mm</td></tr><tr><td>Generator impulsów</td><td>AMPI</td><td>Master 8</td><td>Rysunek 7A</td></tr><tr><td>Krem Redux do elektrokardiografii</td><td>Parker Laboratories</td><td>Redux Elektrolit Cr&egrave; me</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik migawki</td><td>Uniblitz, Vincent Associates</td><td>VCM-D1 Jednokanałowy Uni-stabilny</td><td>Rysunek 7V</td></tr><tr><td>System żaluzji</td><td>Uniblitz, Vincent Associates</td><td>LS2 2 mm Niestabilne żaluzje</td><td>Rysunek 7V</td></tr><tr><td>Srebrny drut</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td>0.25&ndash; Średnica 1 mm, musi być chlorowana</td></tr><tr><td>Lutownica złożona z włókna</td><td></td><td></td> platynowo-irydowego o <td>średnicy 0,25 mm (Rysunek 6F)</td></tr> <tr><td>Mikroskop stereoskopowy z zoomem</td><td>Nikon</td><td>SMZ-2B</td><td>Rysunek 6D</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Wild</td><td>Wild M5</td><td>Z ustawieniami powiększenia 6, 12, 25 i 50 (Rysunek 7E)</td></tr> <tr><td>Filtry strzykawkowe</td><td>Millex</td><td></td><td>22 i mikro; m Filtr PVDF</td></tr><tr><td>Pionowy ściągacz do pipet</td><td>Sutter / Narishige</td><td>Model P-97 / PP-830</td><td>Użyj ściągacza pionowego lub poziomego, w zależności od preferencji (Rysunek 6L)</td></tr> <tr><td>Podgrzewacz filamentu woskowego</td><td>Domowej roboty</td><td></td><td>Zobacz rysunek S1 (Rysunek 6E-G)</td></tr> <tr><td>System ksenonowej lampy błyskowej</td><td>Dr. Rapp OptoElectronic</td><td>JML-C2</td><td>Rysunek 7X</td></tr></tbody></table>

elektrofizjologiczne metody pomiaru poziomu fotopigmentu w fotoreceptorach drosophila

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

Fotopigment rodopsyna (R) sprzężony z białkiem G Drosophila składa się z białka (opsyny) i chromoforu. Proces aktywacji rodopsyny jest inicjowany przez indukującą absorpcję fotonów izomeryzację chromoforu, promującą zmiany konformacyjne opsyny i powodującą drugi ciemny stabilny stan fotopigmentu (metarodopsyna, M). Badanie tego bistabilnego fotopigmentu za pomocą mutagenezy losowej wymaga prostych i solidnych metod badań przesiewowych zmutowanych much. W związku z tym opracowano kilka metod pomiaru obniżenia funkcjonalnych poziomów fotopigmentu. Jedna z takich metod wykorzystuje przemieszczenia ładunku w fotopigmentach po absorpcji fotonów oraz ogromne ilości cząsteczek fotopigmentu ulegających ekspresji w fotoreceptorach. Ten sygnał elektryczny, nazwany wczesnym potencjałem receptora (lub wczesnym prądem receptora), jest mierzony za pomocą różnych metod elektrofizjologicznych (np. elektroretinogramu i zapisów całej komórki) i jest liniowo proporcjonalny do funkcjonalnych poziomów fotopigmentu. Zaletami tej metody są wysoki stosunek sygnału do szumu, bezpośredni liniowy pomiar poziomu fotopigmentu oraz niezależność mechanizmów fototransdukcji od aktywacji rodopsyny lub metarodopsyny. Dodatkowa metoda elektrofizjologiczna, zwana przedłużonym depolaryzującym potencjałem wtórnym (PDA), wykorzystuje bistabilność fotopigmentu Drosophila oraz absorpcyjno-spektralne różnice stanów pigmentowych R i M much. PDA jest indukowany przez intensywne niebieskie światło, przekształcając nasycone ilości rodopsyny w metarodopsynę, co powoduje niepowodzenie zakończenia odpowiedzi na światło przez dłuższy czas w ciemności, ale może zostać zakończone przez konwersję metarodopsyny do rodopsyny przy użyciu intensywnego pomarańczowego światła. Ponieważ PDA jest silnym sygnałem, który wymaga masowej konwersji fotopigmentu, nawet niewielkie defekty w biogenezie fotopigmentu prowadzą do łatwego wykrycia nieprawidłowego PDA. Rzeczywiście, wadliwe mutanty PDA doprowadziły do zidentyfikowania nowych białek sygnałowych ważnych dla fototransdukcji.

Rycina 2 obrazuje niezawodność i łatwość stosowania techniki ERG. Jest ona niezawodna, ponieważ pomiary są rejestrowane u praktycznie nienaruszonej muchy za pomocą prostej metody pozakomórkowych pomiarów napięcia, która wymaga jedynie podstawowego zestawu elektrofizjologicznego. Niezawodność ta przejawia się w uzyskiwaniu zapisów odpowiedzi na światło o stosunkowo dużych amplitudach (w zakresie miliwoltów), nawet gdy mutacje silnie redukują lub zniekształcają tę odpowiedź. Dzięki temu nawet ...

Przedstawiamy protokół do elektrofizjologicznego charakterystyki bistabilnych fotopigmentów: (i) wykorzystanie przemieszczeń ładunku w cząsteczkach fotopigmentu po absorpcji fotonów i ich ogromnej ilości w fotoreceptorach, oraz (ii) wykorzystanie różnic w widmach absorpcyjnych rodopsyny i metarodopsyny. Protokoły te są przydatne do badań przesiewowych pod kątem mutacji wpływających na bistabilne systemy fotopigmentowe.

Elektrofizjologiczne metody pomiaru poziomu fotopigmentu w fotoreceptorach Drosophila

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is ...

Protokół ten jest szczególnie przydatny w przypadku genetycznych badań przesiewowych wad wzroku mutantów Drosophila. Dzieje się tak, ponieważ pozwalają one na wykrycie nawet niewielkich nieprawidłowości w fototransdukcji Drosophila, szczególnie w zakresie poziomów fotopigmentu i funkcji związanych z rówieśnikami. Technika ta jest dogłębna in vivo, łatwa do wykonania i wysoce wytrzymała, umożliwiając wykrycie niewielkich zmian w aktywności białek fototransdukcji.Moim zdaniem naprawianie much przy jednoczesnym zachowaniu żywotności jest prawdopodobnie krytyczną częścią tej metody. Włącz komputer i otwórz oprogramowanie Clampex. Włącz wzmacniacz i generator impulsów Master-8, a następnie włącz lampę ksenonową i kontroler migawki.Włącz ściągacz i umieść szklaną kapilarnę w ściągaczu i pociągnij ją. Wyjmij szklaną kapilarnę ze ściągacza. Napełnij szklaną kapilarnę przefiltrowanym roztworem dzwonka za pomocą strzykawki z wydłużoną końcówką.Włóż drut elektrodowy do szklanej kapilary. Upewnij się, że roztwór w kapilarze styka się ze srebrnym drutem. Włóż uchwyty elektrod do dwóch mikromanipulatorów elektrod.Włącz zasilanie lutownicy. Ustaw prąd na około 2,25 amper. Prąd ten powinien podgrzać 0,25-milimetrowe włókno platynowo-irydowe do około 55 do 56 stopni Celsjusza.Umieść kroplę wosku o niskiej temperaturze topnienia na lutownicy. Znieczulij muchy w butelce. Wlej znieczulone muchy do pojemnika do podkładu, wybierz jedną muchę i przykryj resztę much szalką Petriego.Ostrożnie chwyć muchę za skrzydła za pomocą ostrej pęsety i umieść ją na uchwycie na muchę. Na uchwycie na muchy połóż muchę leżącą na boku tyłem do dłoni. Za pomocą pęsety podnieś muchę ze skrzydeł i przymocuj jej skrzydła do uchwytu na muchy za pomocą lutownicy.Podłącz tył muchy do powierzchni stojaka za pomocą wosku za pomocą lutownicy. Opuść końcówkę lutownicy do punktu łączenia nóg, a następnie rozpuść wosk, aby pokryć wszystkie nogi razem. Umieść niewielką kroplę wosku między głową a szyją w okolicy szyi.Umieść uchwyt na muchy w ciemnej klatce Faradaya na bloku magnetycznym i upewnij się, że mucha znajduje się około pięciu milimetrów od końca światłowodu. Umieść elektrodę rejestrującą nad okiem muchy, a elektrodę masową nad górną częścią pleców muchy za pomocą mikromanipulatorów. Następnie włóż elektrodę uziemiającą do tylnej części muchy za pomocą mikromanipulatorów.Włóż elektrodę rejestrującą na zewnętrzny obwód oka muchy, najlepiej za pomocą mikromanipulatorów. Zamknij klatkę Faradaya i wyłącz światła w pomieszczeniu, aby umożliwić adaptację do ciemności na pięć minut. Wprowadź parametry, zaczynając od czasu trwania impulsu 500 metrów na sekundę, interwału impulsów 60 sekund i liczby impulsów ustawionej na sześć.Do pomiaru PDA należy ustawić generator impulsów Master-8 w trybie TRAIN, a następnie podać pięciosekundowy impuls świetlny o maksymalnym natężeniu za pomocą pomarańczowego filtra. Sprawdź odpowiedź napięciową. Wymień pomarańczowy filtr na szerokopasmowy niebieski filtr i daj trzy 5-sekundowe impulsy świetlne o maksymalnej intensywności.Sprawdź odpowiedź napięciową. Odczekaj co najmniej 60 sekund w ciemności. Zastąp niebieski filtr poprzednim pomarańczowym filtrem.Następnie podaj dwa 5-sekundowe impulsy świetlne w 60-sekundowych odstępach. Sprawdź odpowiedź napięciową. W celu pomiaru potencjału M ERP należy podać ciągły impuls światła niebieskiego, aż do osiągnięcia odpowiedzi napięciowej w stanie ustalonym.Daj krótki, intensywny błysk światła o długości fali od 350 do 700 nanometrów przy użyciu 20-nanometrowego filtra pasmowo-przepustowego. Następnie zmierz szczytową amplitudę fazy M1 odpowiedzi potencjału M, która odzwierciedla absorpcję metarodopsyny przy tej określonej długości fali w stanie równowagi w stanie równowagi. Odpowiedzi PDA oceniano dla różnych zmutowanych much.Muchy typu dzikiego wykazywały nasyconą depolaryzację w ciemności, która wyglądała jak przedłużony ERG rogówkowy ujemny, po intensywnej stymulacji światłem niebieskim. Następujące niebieskie światła powodowały małe reakcje nałożone na PDA, pozbawione stanów nieustalonych włączania i wyłączania. U zmutowanych muszek z nieprawidłową biogenezą fotopigmentu, taką jak ninaE, odpowiedź napięciowa powróciła do wartości wyjściowej po intensywnej stymulacji światłem niebieskim, a odpowiedź na dodatkowe niebieskie światło nie została stłumiona i wykazywała normalne stany przejściowe włączania i wyłączania.ERP muchy typu dzikiego jest uzyskiwany za pomocą tego samego protokołu, ale podczas PDA stosowany jest intensywny zielony błysk. Ten zielony błysk uruchamia ERP i tłumi PDA. Potencjał M został uzyskany przez zielony błysk po niebieskim oświetleniu, ale nie przez niebieski błysk po niebieskim oświetleniu u muchy typu dzikiego.Protokół ten powtórzono w typie dzikim, u mutanta hipomorficznego fotopigmentu ninaE oraz u mutanta z niedoborem fototransdukcji z normalnym poziomem fotopigmentu norpA. Względne widma absorpcyjne rodopsyny muchowej i metarodopsyny obliczono na podstawie pomiarów fotometrycznych różnego widma i widma fotorównowagowego. Dla przetrwania much ważne jest, aby zwracać uwagę na lepkość wosku, powstrzymując się od przegrzania.Procedura ta jest odpowiednia do badań genetycznych i przesiewowych wadliwych mutantów wzrokowych. Metody, które losowo izolują i identyfikują mutacje wzrokowe, mogą ułatwić odkrycie nowych białek i mechanizmów zaangażowanych w fototransdukcję Drosophila. Protokół PDA umożliwił wyodrębnienie ważnych i nowatorskich mechanizmów wizualnych.W przeciwnym razie prawdopodobnie nie zostałby odkryty ani nawet przewidziany.

electrophysiological-methods-for-measuring-photopigment-levels

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film przedstawia protokół elektrofizjologicznego zapisu aktywności fotoreceptorów w oku unieruchomionej Drosophila, umożliwiając precyzyjny pomiar zmian napięcia w odpowiedzi na bodźce świetlne.

Elektrofizjologiczny zapis napięciowych odpowiedzi fotoreceptorów siatkówki Drosophila na bodźce świetlne

Film demonstruje rejestrowanie aktywności elektrycznej w neuronach fotoreceptorowych ommatidium Drosophila poprzez ustanowienie konfiguracji całej komórki. Podkreśla on aktywację przejściowych kanałów potencjału receptora przez impulsy świetlne, co skutkuje mierzalnymi wstrząsami kwantowymi.

Zapisy cęgów napięcia całej komórki z fotoreceptorów Drosophila

Ten film demonstruje eksperymentalny protokół badania przedłużonego depolaryzującego potencjału (PDA) u białookich Drosophila. Oko muchy jest wystawione na intensywne impulsy niebieskiego światła w celu przekształcenia fotopigmentu rodopsyny w metarodopsynę, inicjując kaskadę sygnalizacyjną, która otwiera kanały jonów dodatnich i powoduje depolaryzację błony. Ponieważ niebieskie światło zapobiega rekonwersji metarodopsyny do rodopsyny, ciągły napływ jonów dodatnich powoduje trwałą...

Badanie przedłużonego depolaryzacyjnego potencjału wtórnego (PDA) w fotoreceptorach Drosophila

Źródło: Wagner, K.  i inni., Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila przy użyciu białek znakowanych eGFP. J. Vis. Exp. (2022). Ten film przedstawia wizualizację transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorów Drosophila przy użyciu białek TRPL znakowanych eGFP. Szczegółowo opisano w nim przygotowanie transgenicznych muszek do obrazowania, przechwytywanie obrazów fluorescencyjnych komórek fotoreceptorowych oraz ilościowe określenie transportu TRPL...

Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila

Elektrofizjologiczna technika zapisu wewnątrzkomórkowego jest demonstrowana i używana do określania wrażliwości spektralnej pojedynczych komórek fotoreceptorowych w złożonym oku motyla.

Wyznaczanie czułości spektralnej komórek fotoreceptorowych w modelu owadów na podstawie nagrań wewnątrzkomórkowych in vivo

Ostre mikroelektrody umożliwiają dokładną elektrofizjologiczną charakterystykę fotoreceptorów i wizualnych interneuronów u żyjących Drosophila. Tutaj pokazujemy, jak wykorzystać tę metodę do rejestrowania wysokiej jakości odpowiedzi napięciowych poszczególnych komórek na kontrolowaną stymulację światłem. Ta metoda jest idealna do badania przetwarzania informacji neuronalnych w oczach złożonych owadów.

Elektrofizjologiczna metoda rejestracji wewnątrzkomórkowych odpowiedzi napięciowych fotoreceptorów i interneuronów Drosophila na bodźce świetlne in vivo

Tutaj pokazujemy, jak określić ilościowo liczbę i rozkład przestrzenny aktywnych stref synaptycznych w fotoreceptorach Drosophila melanogaster, wyróżnionych genetycznie zakodowanym markerem molekularnym, oraz ich modulację po długotrwałej ekspozycji na światło.

Analiza modulacji synaptycznej fotoreceptorów Drosophila melanogaster po ekspozycji na przedłużone światło

Zapisy całokomórkowe z fotoreceptorów Drosophila melanogaster umożliwiają pomiar spontanicznych ciemnych guzków, wybrzuszeń kwantowych, makroskopowych reakcji na światło i zależności prąd-napięcie w różnych warunkach. W połączeniu z narzędziami manipulacji genetycznej D. melanogaster, metoda ta umożliwia badanie wszechobecnego szlaku sygnałowego inozytol-lipid i jego celu, czyli kanału TRP.

Metoda elektrofizjologiczna dla zapisów cęgów napięcia w całej komórce z fotoreceptorów Drosophila

Ta praca przedstawia metodę szybkiego i precyzyjnego ilościowego określenia pigmentacji brzucha Drosophila melanogaster za pomocą cyfrowej analizy obrazu. Metoda ta usprawnia procedury między akwizycją fenotypu a analizą danych i obejmuje montowanie próbek, akwizycję obrazu, ekstrakcję wartości pikseli i pomiar cech.

Kwantyfikacja pigmentacji jamy brzusznej u Drosophila melanogaster

Tutaj opisano nieinwazyjne metody lokalizacji białek błony fotoreceptorowej i oceny zwyrodnienia siatkówki w oku złożonym Drosophila za pomocą fluorescencji eGFP.

Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila przy użyciu białek znakowanych eGFP

Poznaj elektrofizjologiczną metodę pomiaru poziomu fotopigmentu w fotoreceptorach Drosophila. Technika ta umożliwia wykrywanie subtelnych nieprawidłowości w fototransdukcji i jest przydatna w genetycznym przesiewaniu wad wzroku.

Elektrofizjologiczne metody pomiaru poziomu fotopigmentu w fotoreceptorach Drosophila

Przeglądaj więcej filmów