Name: Standaryzacja i utrzymanie 3D kultur organoidowych wątroby i jelit psów do wykorzystania w badaniach biomedycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Poznaj metody izolacji i utrzymania 3D organoidów wątroby i jelit psów do badań biomedycznych. Protokoły te umożliwiają biobankowanie i standaryzację kultur komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną wyrazić wdzięczność pracownikom Weterynaryjnego Laboratorium Diagnostycznego Uniwersytetu Stanowego Iowa, a mianowicie Haley M. Lambert, Emily Rahe, Rosalyn M. Branaman, Victorii J. Green i Jennifer M. Groeltz-Thrush, za terminowe przetworzenie dostarczonych próbek. Autorzy pragną podziękować za wsparcie ze strony Faculty Startup, ISU VPR Miller Award, ISU VPR Miller Award oraz podnagrody NSF SBIR dla ISU # 1912948.

<ol><li>Hickman, D. L., Johnson, J., Vemulapalli, T. H., Crisler, J. R., Shepherd, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commonly+used+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Principles+of+Animal+Research+for+Graduate+and+Undergraduate+Students%22%5BJournal%5D)">Commonly used animal models.</a> Principles of Animal Research for Graduate and Undergraduate Students. , 117-175 (2017).</li>
<li>De Jong, M., Maina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+and+humans%3A+Are+they+the+same%3F+-+Implications+in+cancer+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Of mice and humans: Are they the same? - Implications in cancer translational research.</a> Journal of Nuclear Medicine. 51 (4), 501-504 (2010).</li>
<li>Cannarozzi, G., Schneider, A., Gonnet, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phylogenomic+study+of+human%2C+dog%2C+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">A phylogenomic study of human, dog, and mouse.</a> PLoS Computational Biology. 3 (1), 0009-0014 (2007).</li>
<li>Jacob, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Researchers+turn+to+canine+clinical+trials+to+advance+cancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+-+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Researchers turn to canine clinical trials to advance cancer therapies.</a> JAMA - Journal of the American Medical Association. 315 (15), 1550-1552 (2016).</li>
<li>Ziegler, A., Gonzalez, L., Blikslager, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+animal+models%3A+The+key+to+translational+discovery+in+digestive+disease+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (6), 716-724 (2016).</li>
<li>Swanson, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+and+gene-centric+metagenomics+of+the+canine+intestinal+microbiome+reveals+similarities+with+humans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic and gene-centric metagenomics of the canine intestinal microbiome reveals similarities with humans and mice.</a> ISME Journal. 5 (4), 639-649 (2011).</li>
<li>Coelho, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarity+of+the+dog+and+human+gut+microbiomes+in+gene+content+and+response+to+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Similarity of the dog and human gut microbiomes in gene content and response to diet.</a> Microbiome. 6 (1), 72(2018).</li>
<li>Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+informative+is+the+mouse+for+human+gut+microbiota+research%5BTitle%5D)+AND+%22DMM+Disease+Models+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">How informative is the mouse for human gut microbiota research.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).</li>
<li>Bontempo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrition+and+health+of+dogs+and+cats%3A+Evolution+of+petfood%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Nutrition and health of dogs and cats: Evolution of petfood.</a> Veterinary Research Communications. 29, 45-50 (2005).</li>
<li>Allenspach, K., Gaschen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canine+chronic+enteropathies%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Schweizer+Archiv+fur+Tierheilkunde%22%5BJournal%5D)">Canine chronic enteropathies: A review.</a> Schweizer Archiv fur Tierheilkunde. 145 (5), 209-222 (2003).</li>
<li>Tribuddharatana, T., Kongpiromchean, Y., Sribhen, K., Sribhen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+alterations+and+their+relationships+with+the+metabolic+syndrome+components+in+canine+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Kasetsart+Journal+-+Natural+Science%22%5BJournal%5D)">Biochemical alterations and their relationships with the metabolic syndrome components in canine obesity.</a> Kasetsart Journal - Natural Science. 45 (4), 622-628 (2011).</li>
<li>Chandra, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+adult+canine+intestinal+organoids+for+translational+research+in+gastroenterology%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Derivation of adult canine intestinal organoids for translational research in gastroenterology.</a> BMC Biology. 17 (1), 33(2019).</li>
<li>Schaefer, K., Rensing, S., Hillen, H., Burkhardt, J. E., Germann, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+Science+the+only+driver+in+species+selection%3F+An+internal+study+to+evaluate+compound+requirements+in+the+minipig+compared+to+the+dog+in+preclinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Is Science the only driver in species selection? An internal study to evaluate compound requirements in the minipig compared to the dog in preclinical studies.</a> Toxicologic Pathology. 44 (3), 474-479 (2016).</li>
<li>MacArthur Clark, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+3Rs+in+research%3A+A+contemporary+approach+to+replacement%2C+reduction+and+refinement%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">The 3Rs in research: A contemporary approach to replacement, reduction and refinement.</a> British Journal of Nutrition. 120, 1-7 (2018).</li>
<li>Schneider, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+reverse+translation+between+veterinary+and+human+medicine%3A+The+one+health+initiative%5BTitle%5D)+AND+%22CPT%3A+Pharmacometrics+and+Systems+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Model-based reverse translation between veterinary and human medicine: The one health initiative.</a> CPT: Pharmacometrics and Systems Pharmacology. 7 (2), 65-68 (2018).</li>
<li>Lehmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+organoids%3A+A+new+dimension+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Human organoids: A new dimension in cell biology.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1129-1137 (2019).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+organoids%3A+model+systems+for+human+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human organoids: model systems for human biology and medicine.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).</li>
<li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33(2020).</li>
<li>Ho, B. X., Pek, N. M. Q., Soh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modeling+using+3D+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Disease modeling using 3D organoids derived from human induced pluripotent stem cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 936(2018).</li>
<li>Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microphysiological+systems+and+organoids+as+in+vitro+models+for+toxicological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Human microphysiological systems and organoids as in vitro models for toxicological studies.</a> Frontiers in Public Health. 6, 185(2018).</li>
<li>Caipa Garcia, A. L., Arlt, V. M., Phillips, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+for+toxicology+and+genetic+toxicology%3A+applications+with+drugs+and+prospects+for+environmental+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Organoids for toxicology and genetic toxicology: applications with drugs and prospects for environmental carcinogenesis.</a> Mutagenesis. , (2021).</li>
<li>Augustyniak, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+are+promising+tools+for+species-specific+in+vitro+toxicological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Organoids are promising tools for species-specific in vitro toxicological studies.</a> Journal of Applied Toxicology. 39 (12), 1610-1622 (2019).</li>
<li>Zietek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+to+study+intestinal+nutrient+transport%2C+drug+uptake+and+metabolism+-+Update+to+the+human+model+and+expansion+of+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Organoids to study intestinal nutrient transport, drug uptake and metabolism - Update to the human model and expansion of applications.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 577656(2020).</li>
<li>Zietek, T., Rath, E., Haller, D., Daniel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoids+for+assessing+nutrient+transport%2C+sensing+and+incretin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoids for assessing nutrient transport, sensing and incretin secretion.</a> Scientific Reports. 5 (1), 1-10 (2015).</li>
<li>Kar, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%3A+a+promising+new+in+vitro+platform+in+livestock+and+veterinary+research%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Organoids: a promising new in vitro platform in livestock and veterinary research.</a> Veterinary Research. 52 (1), 1-17 (2021).</li>
<li>Borcherding, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sa1976+polyphenols+reverse+the+pathologic+effects+of+palmitic+acid+and+high+fat+diet+in+canine+enteroids%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Sa1976 polyphenols reverse the pathologic effects of palmitic acid and high fat diet in canine enteroids.</a> Gastroenterology. 158 (6), 486(2020).</li>
<li>Ambrosini, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulation+of+the+accessible+interface+of+biopsy-derived+canine+intestinal+organoids+to+study+epithelial-luminal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions.</a> PLoS ONE. 15 (4), 0231423(2020).</li>
<li>Zdyrski, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Su124+homology+directed+repair+in+canine+duodenal+enteroids+to+mimic+the+wild-type+P-glycoprotein+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Su124 homology directed repair in canine duodenal enteroids to mimic the wild-type P-glycoprotein mutation.</a> Gastroenterology. 160 (6), 625(2021).</li>
<li>Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+based+personalized+medicine%3A+from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Organoid based personalized medicine: from bench to bedside.</a> Cell Regeneration. 9 (1), 21(2020).</li>
<li>Kurr, L. A., Allenspach, K., Jergens, A., Mochel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+biology+of+intestinal+organoids+to+accelerate+drug+discovery+in+inflammatory+bowel+disease%3A+A+one+health+approach%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Harnessing the biology of intestinal organoids to accelerate drug discovery in inflammatory bowel disease: A one health approach.</a> The FASEB Journal. 34, 1(2020).</li>
<li>Nantasanti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modeling+and+gene+therapy+of+copper+storage+disease+in+canine+hepatic+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Disease modeling and gene therapy of copper storage disease in canine hepatic organoids.</a> Stem Cell Reports. 5 (5), 895-907 (2015).</li>
<li>Favier, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COMMD1-Deficient+dogs+accumulate+copper+in+hepatocytes+and+provide+a+good+model+for+chronic+hepatitis+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">COMMD1-Deficient dogs accumulate copper in hepatocytes and provide a good model for chronic hepatitis and fibrosis.</a> PLoS ONE. 7 (8), 42158(2012).</li>
<li>Kruitwagen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+survival+of+transplanted+autologous+canine+liver+organoids+in+a+COMMD1-deficient+dog+model+of+metabolic+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Long-term survival of transplanted autologous canine liver organoids in a COMMD1-deficient dog model of metabolic liver disease.</a> Cells. 9 (2), 410(2020).</li>
<li>Vilgelm, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-needle+aspiration-based+patient-derived+cancer+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Fine-needle aspiration-based patient-derived cancer organoids.</a> iScience. 23 (8), 101408(2020).</li>
<li>Saxena, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intestinal+enteroids%3A+A+new+model+to+study+human+rotavirus+infection%2C+host+restriction%2C+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Human intestinal enteroids: A new model to study human rotavirus infection, host restriction, and pathophysiology.</a> Journal of Virology. 90 (1), 43-56 (2016).</li>
<li>VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-WRN+conditioned+medium+for+gastrointestinal+epithelial+stem+cell+culture+shows+replicable+batch-to-batch+activity+levels+across+multiple+research+teams%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams.</a> Stem Cell Research. 37, 101430(2019).</li>
<li>Powell, R. H., Behnke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WRN+conditioned+media+is+sufficient+for+in+vitro+propagation+of+intestinal+organoids+from+large+farm+and+small+companion+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals.</a> Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).</li>
<li>Mackenzie, J. S., Jeggo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+one+health+approach-why+is+it+so+important%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+Medicine+and+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">The one health approach-why is it so important.</a> Tropical Medicine and Infectious Disease. 4 (2), 88(2019).</li>
<li>Artegiani, B., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+and+application+of+3D-organoid+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Use and application of 3D-organoid technology.</a> Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).</li>
</ol>

K. Allenspach jest współzałożycielem LifEngine Animal Health i 3D Health Solutions. Pełni funkcję konsultanta w Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics i Mars. J. P. Mochel jest współzałożycielem LifEngine Animal Health i 3D Health Solutions. Dr Mochel pełni funkcję konsultanta w Ceva Animal Health i Ethos Animal Health. Pozostali autorzy nie mają do zadeklarowania żadnego konfliktu interesów.

Obecnie brakuje znormalizowanych protokołów izolacji i utrzymania organoidów wątrobowych i jelitowych psów. Ustanowienie standardowych procedur operacyjnych dla kultur organoidowych jest uzasadnione, aby model ten mógł być stosowany w różnych warunkach laboratoryjnych. W szczególności zapewnienie ustandaryzowanych protokołów operacyjnych dla hodowli tych modeli organoidów psów jest kluczem do scharakteryzowania normalnego wzrostu organoidów podczas hodowli i pasażowania w celu wyznaczenia optymalnych punktów czasowych dla ekspansji i konserwacji. Organoidy jelitowe psów hodowane przy użyciu protokołu zostały wcześniej scharakteryzowane przez Chandra i wsp.12.
Jednym z najbardziej krytycznych etapów protokołu jest pasażowanie organoidów. Optymalny czas na pierwsze pasaże sferoid wątrobowych określono na 7 dzień po izolacji na podstawie pomiarów sferoidów wątrobowych. Maksymalną objętość sferoid osiągnięto w 7 dniu, a jednocześnie sferoidy zaczęły pączkować i tworzyć organoidy wątrobowe. Wzrost ogólnej objętości organoidów od 2 do 7 dnia po izolacji był ponad 365 razy, co sugeruje, że optymalny czas pasażu jest dłuższy niż w przypadku hodowli organoidów jelitowych psów. Po 7 dniach w hodowli nie zaobserwowano żadnych poważnych oznak apoptozy komórkowej w sferoidalnym wątrobie, nawet bez czyszczenia lub pasażowania (ryc. 7). Pasażowanie organoidów jelitowych i wątrobowych może być trudne, ponieważ procedura może prowadzić do utraty komórek i zmiany żywotności. Wyniki wskazują, że długotrwała inkubacja organoidów wątrobowych z proteazą podobną do trypsyny (do 12 min) nie wpływa negatywnie na subkulturę. Inkubacja organoidów w proteazie podobnej do trypsyny przez okres dłuższy niż 24 minuty może być szkodliwa dla późniejszej subkultury organoidów.
W przypadku nieoptymalnego pękania w skupiskach komórek z pasażem organoidowym, dysocjacja mechaniczna zamiast długotrwałej inkubacji z proteazą podobną do trypsyny może być bardziej korzystna. W przypadku napotkania problemów z prawidłową dysocjacją organoidów, można podjąć próbę krótkiego wirowania próbek w celu zwiększenia wydajności przejścia. Z drugiej strony, wirowanie może zrujnować kulturę i uszkodzić komórki, dlatego powinno być stosowane tylko wtedy, gdy inne procedury wielokrotnie zawodziły. Rozbijanie organoidów wątrobowych na pojedyncze komórki obniża tempo wzrostu organoidów, podczas gdy rozbijanie ich na skupiska komórek może znacznie poprawić ich żywotność. Jako czas inkubacji dla protokołu organoidowego wybrano dziesięć minut. 12-minutowy punkt czasowy inkubacji został uznany za niecytotoksyczny w porównaniu z 24-minutową inkubacją w eksperymencie z proteazą podobną do trypsyny.
Eksperyment przeżywalności potwierdził, że organoidy wątrobowe psów mogą przetrwać do 19,5 dnia w niesprzyjających warunkach (wyczerpanie strukturalne i żywieniowe). Organoidy, które przetrwały te warunki najdłużej, były hodowane za pomocą pożywek CMGF+. Obserwacja ta mogła być spowodowana wolniejszym wzrostem organoidów wątrobowych w pożywkach nieuzupełnionych inhibitorem Rock i GSK3β. Hodowle organoidów z CMGF+ R/G rosły szybciej i mogły szybciej wyczerpywać swoje zasoby. Eksperyment ten otwiera możliwości miniaturyzacji hodowli organoidów psów w celu osiągnięcia wysokoprzepustowej konwersji systemu. Taka technologia może ułatwić odkrywanie leków lub prowadzenie badań toksykologicznych przy znacznie obniżonych kosztach.
Niektóre typowe problemy napotykane podczas utrzymywania hodowli organoidów psów to niewłaściwe krzepnięcie próbki podczas posiewu, zanieczyszczenie hodowli oraz ustalenie odpowiedniej gęstości i wielkości organoidów. Jeśli rozpuszczony ECM przedwcześnie zestala się podczas powlekania, natychmiast umieść go na lodzie na 10 minut. Jeśli rozpuszczony ECM nie tworzy struktur przypominających kopułę, jest prawdopodobne, że z próbki nie usunięto wystarczającej ilości pożywki. W takim przypadku należy rozcieńczyć próbkę bardziej rozpuszczonym ECM, aż do powstania kopułek.
W przypadku stwierdzenia zanieczyszczenia grzybiczego lub bakteryjnego na całej płytce (patrz rysunek 4), najlepszym rozwiązaniem jest wyrzucenie płytki. Można próbować leczenia lekami przeciwgrzybiczymi lub antybiotykami, ale powodzenie takiej próby jest bardzo niskie. Jeśli pojedynczy studzienka jest zanieczyszczona w płycie, żywotne i nienaruszone studzienki można oczyścić (wykonaj kroki od 4.1 do 4.5) do nowej płytki i ściśle monitorować. Jeśli próbka została już zamrożona w trybie awaryjnym, zaleca się wyrzucenie całej próbki, ponieważ rozmrożenie próbki naraża inkubator na dodatkowe ryzyko zanieczyszczenia.
Zdrowa hodowla organoidów powinna należeć co najmniej do kategorii średniej wielkości i średniej gęstości lub większej. Optymalna gęstość ma kluczowe znaczenie dla wzrostu kultur organoidowych. Niższą gęstość należy skorygować poprzez oczyszczenie organoidów do średniej gęstości. Jeśli wystąpi sytuacja ekstremalnego zagęszczenia (przeludnienie), organoidy należy rozszerzyć na więcej studni. Poważne oznaki apoptozy komórkowej często towarzyszą zarówno przeludnieniu, jak i niskiej gęstości hodowli organoidów. Jeśli te problemy nie zostaną naprawione na czas, cała kultura organoidów przejdzie w apoptozę w ciągu kilku dni. Jeśli organoidy osiągają bardzo duże rozmiary lub bardzo dużą gęstość, kulturę należy wykorzystać do eksperymentu, zamrażania lub utrwalania.
Pożywka organoidowa zawiera obecnie 17 składników, a dodanie czynników wzrostu potrzebnych do utrzymania i ekspansji organoidów może być kosztowne. Problem ten można rozwiązać, hodując hodowle komórkowe 2D, które syntetyzują czynniki wzrostu w celu wytworzenia kondycjonowanego CMGF+. Hodowla komórkowa L-WRN wytwarza czynniki wzrostu Wnt-3a, R-Spondin-3 i Noggin37. Kolonia komórkowa wykorzystuje 90% pożywek hodowlanych DMEM/F12 i 10% FBS. Gdy kultura osiągnie 90-procentową konfluencję, pożywka jest zbierana codziennie przez 1 tydzień. Zebrane podłoże jest następnie mieszane z 2x CMGF+ (bez tych czynników wzrostu). Podczas gdy kultury 2D mogą wytworzyć potrzebne czynniki wzrostu za ułamek kosztów, należy spodziewać się dodatkowego czasu i przygotowań do produkcji pożywki. Stężenia czynników wzrostu między partiami kondycjonowanych pożywek mogą się również różnić37,38.
Hodowle organoidów pochodzących z dorosłych psów z komórek macierzystych są unikalnym modelem biomedycznym, który może pomóc w osiągnięciu celów Inicjatywy "Jedno Zdrowie"39. Technologia organoidów może być stosowana w wielu podstawowych i biomedycznych obszarach badań, począwszy od biologii rozwojowej, patofizjologii, odkrywania i testowania leków, toksykologii po badania chorób zakaźnychi medycyny regeneracyjnej. Badania translacyjne i odwrotne translacyjne to obszary, w których organoidy psów mają zastosowanie15. Psy były wykorzystywane od wieków w translacyjnych warunkach eksperymentalnych, a ich status zwierzęcia towarzyszącego ułatwił im również pozycję jednego z najbardziej zbadanych gatunków w medycynie weterynaryjnej.
Podsumowując, manuskrypt ten zawiera ustandaryzowane protokoły operacyjne dotyczące izolacji, utrzymania, zbierania i biobankowania organoidów wątrobowych i jelitowych psów, aby ułatwić zastosowanie tego modelu w różnych dziedzinach biomedycznych. Model ten jest wyjątkowo odpowiedni do promowania badań translacyjnych jako narzędzia inicjatywy "Jedno zdrowie" w celu promowania inter- i intradyscyplinarnego dzielenia się wiedzą.

Gryzonie są najczęściej wykorzystywanym modelem zwierzęcym do badań biomedycznych i translacyjnych1. Są one wyjątkowo przydatne do badania podstawowej molekularnej patogenezy chorób, chociaż ich kliniczne znaczenie dla przewlekłych chorób wieloczynnikowych zostało ostatnio zakwestionowane2. Model psa ma kilka zalet w porównaniu z gryzoniami3,4. Psy i ludzie mają podobieństwa w metabolomice i mikrobiomie jelitowym, które rozwinęły się w wyniku spożywania diety człowieka w różnych okresach ich udomowienia5,6,7. Podobieństwa między anatomią i fizjologią przewodu pokarmowego psów i ludzi to kolejny z przykładów8.
Dodatkowo, psy często dzielą podobne środowisko i styl życia ze swoimi właścicielami9. Dłuższa długość życia psów w porównaniu z gryzoniami pozwala na naturalny rozwój wielu chorób przewlekłych10. Nieswoiste zapalenie jelit lub zespół metaboliczny to przykłady wieloczynnikowych chorób przewlekłych, które mają istotne podobieństwa między ludźmi a psami11,12. Badania przedkliniczne psów z udziałem psów z naturalnie występującymi chorobami mogą generować bardziej wiarygodne dane niż te uzyskane z modeli gryzoni13. Jednakże, aby zminimalizować wykorzystanie badań na żywych zwierzętach i zachować zgodność z zasadami 3R (Reduce, Refine, Replace)14, pojawiły się alternatywy dla badań in vivo z wykorzystaniem organoidów 3D in vitro psów15.
Organoidy to samoorganizujące się struktury 3D pochodzące z komórek macierzystych, które podsumowują fizjologię i mikroanatomię swoich oryginalnych organów16,17. Technologia ta została po raz pierwszy opisana przez Sato i in. w 2009 roku17 i pozwoliła na bardziej translacyjne badania in vitro na liniach komórek nabłonkowych, niż było to wcześniej możliwe przy użyciu hodowli komórek nowotworowych 2D18,19,20. Organoidy są przydatne w modelach in vitro w wielu dyscyplinach biomedycznych, takich jak przedkliniczne badania toksykologiczne21,22,23, absorpcja lub metabolizm24,25,26,27,28, a także w spersonalizowanych podejściach medycznych29,30,31. Udana hodowla organoidów jelitowych psów została opisana po raz pierwszy w 201912, podczas gdy organoidy wątrobowe pochodzące od psa zostały po raz pierwszy opisane przez Nantasanti i in. w 201532. Od tego czasu organoidy psów są z powodzeniem stosowane w badaniach nad przewlekłymi enteropatiami psów, guzami podścieliskowymi przewodu pokarmowego, gruczolakorakiem jelita grubego12 i chorobą Wilsona33,34.
Podczas gdy dorosłe komórki macierzyste mogą być pozyskiwane metodą sekcji zwłok, technologia organoidów nie zawsze wymaga poświęcania zwierząt. Biopsje endoskopowe i laparoskopowe, a nawet aspiraty cienkoigłowe narządów35, są realnym źródłem dorosłych komórek macierzystych do izolacji organoidów nabłonkowych12. Powszechne stosowanie takich nieinwazyjnych technik w praktyce weterynaryjnej ułatwia opcje badań translacyjnych odwrotnych (translacja informacji z weterynaryjnej praktyki klinicznej na praktykę kliniczną u ludzi i odwrotnie)15. Dalszy postęp technologii organoidów można zapewnić poprzez standaryzację metod hodowli organoidów i konserwacji. Przedstawiony tutaj protokół organoidowy jest częściowo oparty na wcześniej opublikowanej pracy Saxeny i wsp. z 201536, a metody zostały dostosowane do specyfiki hodowli organoidów jelitowych i wątrobowych psów. Ogólny przebieg procesów protokołów organoidowych psów jest przedstawiony na Rysunek 1.
Protokół Izolacji Organoidów Psów wprowadza metody pobierania próbek z biopsji endoskopowych, laparoskopowych i chirurgicznych, a także sekcji zwłok. Przedstawiono w nim wstępną obróbkę próbek tkanek oraz metodologie stosowane do transportu do laboratorium. Materiały i odczynniki potrzebne do izolacji organoidów podsumowano w sekcji "Przygotowanie do izolacji". Szczegółowo opisano proces izolacji dorosłych komórek macierzystych z próbek tkanek. Na koniec omówiono proces posiewania organoidów w struktury przypominające kopułę przy użyciu rozpuszczonej macierzy błony zewnątrzkomórkowej.
Drugi protokół, Protokół Utrzymania Organoidów Psów, opisuje metody dokumentowania i hodowli organoidów. Zmiany w mediach i ich częstotliwość są omówione w tej sekcji. Ponadto opisano procedury laboratoryjne, takie jak pasażowanie i czyszczenie kultur komórkowych, które są niezbędne do zapewnienia pomyślnego utrzymania organoidów 3D psów. Odpowiednie pasażowanie jest krytycznym krokiem protokołu, a możliwe korekty i rozwiązywanie problemów związanych z tym krokiem omówiono w dalszej części manuskryptu.
Ostatnim protokołem jest Protokół Zbierania Organoidów Psów i Biobankowania zawierający metody przygotowania w pełni rozwiniętych organoidów do zatapiania parafiny i konserwacji RNA. Opisano tu również metody biobankowania próbek organoidów w magazynie ciekłego azotu. Na koniec omówiono sposoby rozmrażania zamrożonych próbek i wspomagania ich wzrostu.
Podsumowując, ten artykuł ma na celu zapewnienie spójnych procedur hodowli organoidów u psów poprzez standaryzację protokołów międzylaboratoryjnych. W ten sposób manuskrypt ma na celu ułatwienie odtwarzalności danych pochodzących z modeli organoidów psów w celu zwiększenia ich znaczenia w translacyjnych badaniach biomedycznych.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63515/63515fig01.jpg"> 
Rysunek 1: Przebieg pracy protokołów organoidowych u psów. Protokół izolacji organoidów psów opisuje przygotowanie materiałów potrzebnych do izolacji organoidów, pobranie próbki tkanki (za pomocą sekcji zwłok, biopsji endoskopowych, laparoskopowych i chirurgicznych) oraz wytyczne dotyczące dysocjacji i posiewu komórek populacji komórkowej. Protokół konserwacji organoidów u psów omawia czyszczenie i pasażowanie kultur organoidów. Protokół Pozyskiwania i Biobankowania Organoidów omawia przygotowanie próbek organoidów do zatapiania w parafinie i dalszą charakterystykę organoidów. Omówiono również metody biobankowania kultur organoidów i ich przywracania z przechowywania w ciekłym azocie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63515/63515fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Roztwór chelatujący</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP439-500</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Promega</td><td>V3151</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655-100G</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4-2H2O</td><td>Sigma</td><td>S5136-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher Chemical</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>Organoid podłoża</td><td></td><td></td><td></td>[</tr><tr><td>Leu15]-Gastrin I człowiek</td><td>Sigma</td><td>G9145-.5MG</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>PeproTech</td><td>9094360</td><td></td></tr><tr><td>Zaawansowany DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>suplement Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR Life Science</td><td>J848-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Human R-Spondin-1</td><td>PeproTech</td><td>120-38-500UG</td><td></td></tr><tr><td>Murine EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Murine Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38-250UG</td><td></td></tr><tr><td>Murine Wnt-3a</td><td>PeproTech</td><td>315-20-10UG</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>suplement Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylo-L-cysteina</td><td>Sigma</td><td>A9165-25G</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>ROCK inhibitor (Y-27632)</td><td>EMD Millipore Corp.</td><td>SCM 075</td><td></td></tr><tr><td>SB202190 (inhibitor P38)</td><td>Sigma</td><td>S7067-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Stemolecule CHIR99021 (GSK3&beta;)</td><td>Reprocell</td><td>04-0004-base</td><td></td></tr><tr><td>Trimethoprim</td><td>Sigma</td><td>T7883-5G</td><td></td></tr><tr><td>Sulfametoksazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7507-10G</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid, Glacial</td><td>Fisher Chemical</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Fisher Chemicals</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, pH 8,0, 0,5 M</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd (37%)</td><td>Fisher Chemical</td><td>F79P-4</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór aldehydu glutarowego</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix do hodowli organoidów</td><td>Corning</td><td>356255</td><td>Macierz błony zewnątrzkomórkowej</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, 97%</td><td>Alfa</td><td>Aesar A11313</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1X (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1X (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>RNApóźniej Soln.</td><td>Invitrogen</td><td>AM7021</td><td>Odczynnik do przechowywania RNA</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td>Proteaza trypsyna podobna</td></tr> <tr><td>< silna>Inne< / silna></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 Płytka do hodowli komórkowych Well</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>ACD Hybez II System hybrydyzacji</td><td>ACD marki biotechne</td><td>321710</td><td></td></tr><tr><td>Probówka wirówkowa, 15 ml</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell LX</td><td>Fiolki</td> kriogeniczne Corning <td>BCS-405MC</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa probówka wirówkowa</td><td></td> Corning 430488 <td></td> (50 ml)Fisherbrand 05-539-13 <td></td></tr><tr><td>Żyroskop Mini Mikser nutacyjny (rocker)</td><td>Labnet</td><td>S0500-230V-EU</td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia cieplna</td><td>Lab-Line Instruments</td><td>3000</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik do zamrażania Mr. Frosty</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>ThermoFisher Scientific ND2000CLAPTOP</td><td></td><td>Spektrofotometr Analiza</td></tr><tr><td>Inkubator Panasonic</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170ML-PA</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M Folia do pakowania</td><td>Bemis Company Inc</td><td>PM996 / EMD</td><td>Laboratoryjna elastyczna taśma foliowa</td></tr><tr><td>chroniona jednorazowa Skalpele</td><td>Bard-Parker</td><td>239844</td><td></td></tr><tr><td>Test RNAscope 2.5 HD &ndash; RED</td><td>ACD to biotechne marki</td><td>322350</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope H2O2 & Odczynniki Protease Plus</td><td>ACD marka biotechne</td><td>322330</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope Target Retrieval Repleeval Reagents</td><td>ACD marka biotechne</td><td>322000</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope Wash Buffer Reagents</td><td>ACD marka biotechne</td><td>310091</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Dish</td><td>Dot Scientific</td><td>6676621</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Plate 24 dołki</td><td>Fisherbrand</td><td>FB012929</td><td></td></tr></tbody></table>

standaryzacja i utrzymanie 3d kultur organoidowych wątroby i jelit psów do wykorzystania w badaniach biomedycznych

Standardization and Maintenance of 3D Canine Hepatic and Intestinal Organoid Cultures for Use in Biomedical Research

Psy rozwijają złożone, wieloczynnikowe choroby analogiczne do ludzkich, w tym choroby zapalne, choroby metaboliczne i raka. W związku z tym reprezentują one odpowiednie duże modele zwierzęce o potencjale translacyjnym dla medycyny ludzkiej. Organoidy to trójwymiarowe (3D), samoorganizujące się struktury pochodzące z komórek macierzystych, które naśladują mikroanatomię i fizjologię narządu, z którego pochodzą. Te translacyjne modele in vitro mogą być wykorzystywane do zastosowań związanych z przepuszczalnością i odkrywaniem leków, oceną toksykologiczną oraz do zapewnienia mechanistycznego zrozumienia patofizjologii wieloczynnikowych chorób przewlekłych. Co więcej, organoidy psów mogą poprawić jakość życia psów towarzyszących, dostarczając informacji w różnych obszarach badań weterynaryjnych i ułatwiając spersonalizowane zastosowania lecznicze w medycynie weterynaryjnej. Niewielka grupa dawców może stworzyć biobank próbek organoidów, zmniejszając potrzebę ciągłego pobierania tkanek, ponieważ linie komórek organoidowych mogą być hodowane w nieskończoność. W niniejszym artykule przedstawiono trzy protokoły, które koncentrują się na hodowli organoidów jelitowych i wątrobowych psów pochodzących z dorosłych komórek macierzystych. Protokół izolacji organoidów psów określa metody przetwarzania tkanek i osadzania izolatu komórkowego w macierzy podporowej (rozpuszczona macierz błony zewnątrzkomórkowej). Protokół konserwacji organoidów u psów opisuje wzrost i konserwację organoidów, w tym czyszczenie i pasażowanie wraz z odpowiednim czasem na ekspansję. Protokół Organoid Harvesting and Biobanking Protocol opisuje sposoby ekstrakcji, zamrażania i przechowywania organoidów do dalszej analizy.

Opisano eksperymentalne metody pobierania dorosłych komórek macierzystych z tkanek jelitowych i wątrobowych psów w celu stworzenia kultur organoidowych 3D. Ponadto omówiono techniki laboratoryjne zapewniające stały wzrost i standardowe procedury operacyjne w celu zbioru, biobanku i ożywienia kultur organoidów jelitowych i wątrobowych psów.

Standaryzacja i utrzymanie 3D kultur organoidowych wątroby i jelit psów do wykorzystania w badaniach biomedycznych

Dogs develop complex multifactorial diseases analogous to humans, including inflammatory diseases, metabolic diseases, and cancer. Therefore, they ...

Protokoły hodowli organoidów wątrobowych i jelitowych psów są ważne dla standaryzacji tej nowatorskiej technologii. Technika ta pozwala na wiarygodne i powtarzalne ustanowienie hodowli organoidów psów, w tym izolację organoidów, konserwację, zbieranie i późniejsze biobankowanie próbek. Organoidy psów mogą stanowić doskonały model do wielu zastosowań obejmujących biologię, rozwój chorób zakaźnych, testowanie i odkrywanie leków, a także medycynę transmisyjną.Na początek przygotuj pięć 15-mililitrowych probówek wirówkowych z pięcioma mililitrami 1X kompletnego roztworu chelatującego, jedną probówkę z trzema mililitrami 1X kompletnego roztworu chelatującego, jedną pustą probówkę i jedną probówkę z pięcioma mililitrami 1X kompletnego roztworu chelatującego i dwoma mililitrami płodowej surowicy bydlęcej. W dniu izolacji umieść sterylną szalkę Petriego, skalpel, wiadro z lodem i zimną zaawansowaną mieszankę składników odżywczych DMEM F12 w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Umieścić wymaganą liczbę 24-dołkowych płytek do hodowli komórkowych w inkubatorze dwutlenku węgla w celu wstępnego ogrzania.Umieść rozpuszczoną macierz błony zewnątrzkomórkowej na lodzie w celu rozmrożenia. Wstępnie schłodzić wirówkę do czterech stopni Celsjusza. Przenieś całe media z czynnikami wzrostu z zamrażarki do łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, unikając bezpośredniego naświetlenia.Potrząsaj próbkami tkanek w probówce transportowej przez 30 sekund. Usunąć nadmiar supernatantu bez wyrzucania jakiejkolwiek tkanki, powoli pipetując w pobliżu powierzchni płynu, aż w probówce pozostanie 0,5 mililitra. Przenieść tkankę i pozostały supernatant na sterylną szalkę Petriego.Za pomocą jednorazowego skalpela pokrój i zmiel tkankę na mniejsze kawałki przypominające konsystencję zacieru przez około pięć minut. Odpipetować tkankę mieloną płynem z szalki Petriego do pierwszej kompletnej probówki z roztworem chelatującym, a następnie dodać dwa mililitry zaawansowanej mieszanki składników odżywczych DMEM F12 do szalki Petriego. Przepłukać pozostałą tkankę i przenieść do pierwszej kompletnej probówki z roztworem chelatującym.Wirować 1X kompletną probówkę z roztworem chelatującym około pięć razy przez pięć sekund. Pozostawić biopsje na dnie probówki na jedną minutę i usunąć supernatant, aż pozostanie pięć mililitrów. Przenieść 1X kompletny roztwór chelatujący z nowej probówki do probówki z próbką.Powtórz poprzedni krok dla następujących dwóch probówek. A podczas ostatnich dwóch prań usuń supernatant do trzech mililitrów pozostałych w probówce. Przenieś biopsje i 1X kompletny roztwór chelatujący z probówki z próbką do jednego dołka na płytce sześciodołkowej.Dodaj trzy mililitry 1X kompletnego roztworu chelatującego do probówki z próbką. Delikatnie zamieszaj, aby zebrać pozostałą tkankę i przenieść do tego samego dołka płytki. Dodaj 150 mikrolitrów 0,5-molowego kwasu etylenodiaminotetraoctowego do studzienki i umieść sześciodołkową płytkę na bujaczku o temperaturze 20 stopni i prędkości obrotowej 24 obr./min w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Próbki wątroby należy inkubować przez 10 minut, a próbki jelitowe przez godzinę na ruchomym kołysce. Przetransportować sześciodołkową płytkę z powrotem do komory bezpieczeństwa biologicznego i przenieść zmieloną tkankę i płyn do probówki zawierającej 1X kompletny roztwór chelatujący z płodową surowicą bydlęcą. Pozwól tkankom się uspokoić i przetransportuj supernatant z 0,2 mililitra górnej części tkanki do pustej probówki.Wirować probówkę zawierającą próbkę o temperaturze 700 XG przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Komórki macierzyste są teraz granulowane wraz z tkanką mieloną. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant, aby nie naruszyć osadu.Ponownie zawiesić pellet w zaawansowanym DMEM F12. Ponownie zakręć probówką i odessać supernatant bez naruszania osadu. Dodaj obliczoną objętość rozpuszczonej macierzy błony zewnątrzkomórkowej do probówki z próbką.Zachowaj ostrożność podczas wyjmowania pożywki, aby nie stracić osadu komórkowego. Podczas dodawania macierzy błony zewnątrzkomórkowej należy powoli pipetować, aby nie tworzyć nadmiernych pęcherzyków w zawiesinie organoidów. Trzymaj próbkę z rozpuszczoną macierzą błony zewnątrzkomórkowej na lodzie i zasiej zawiesinę w środku studzienek, tak aby rozpuszczona macierz błony zewnątrzkomórkowej utworzyła strukturę przypominającą kopułę.Przetransportować płytkę do inkubatora i odczekać, aż rozpuszczona macierz błony zewnątrzkomórkowej zestali się przez 30 minut. Wymieszaj inhibitor ROCK i GSK3 beta w kompletnych pożywkach z czynnikami wzrostu i dodaj 500 mikrolitrów tego roztworu do każdej studzienki. Umieścić płytkę w inkubatorze.Protokół organoidów psów zazwyczaj generuje około 50 000 do 150 000 komórek jelitowych lub wątrobowych na studzienkę. Po izolacji komórek macierzystych organoidy wątrobowe psów rozpoczynają swój cykl życiowy jako rozszerzające się sferoidy, a po siedmiu dniach przekształcają się w pączkujące i różnicujące się organoidy. Obliczono objętość, pole powierzchni, pole elipsy 2D i obwód sferoid.Obszar i obwód elipsy 2D wykorzystano do oceny stanu zdrowia kultury organoidów. Ocena ekspresji markerów w sposób półilościowy wykazała, że sferoidy preferencyjnie wyrażały marker cholangiocytów KRT7 w zakresie od 1 do 26%Ekspresja markera komórek macierzystych LGR5 wahała się od 0,17 do 0,78%, podczas gdy markery hepatocytów były wyrażane w mniejszym stopniu i wynosiły od 0,05 do 0,34% dla pudełka Forkhead 1A i od 0,03 do 0,28% dla cytochromu-P450. 12-minutowa inkubacja z proteazą podobną do trypsyny nie zahamowała wzrostu organoidów.Jednak 24-minutowa inkubacja miała negatywny wpływ na wzrost organoidów. Przeanalizowano przeżywalność organoidów wątrobowych psów w niekorzystnym środowisku w celu określenia objętości pożywki organoidowej i macierzy podstawnej potrzebnej do pomyślnego wzrostu i przeżycia organoidów wątrobowych. Wskaźnik przeżycia organoidów wahał się od 12,9 dnia do 18 dni.Podstawowe techniki hodowli komórkowych i podejścia aseptyczne są niezbędnymi warunkami wstępnymi prawidłowej izolacji i konserwacji organoidów.

standardization-maintenance-3d-canine-hepatic-intestinal-organoid

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten protokół opisuje produkcję mysiego pozawątrobowego przewodu żółciowego 3-wymiarowego systemu organoidowego. Te organoidy żółciowe można utrzymywać w kulturze w celu badania biologii cholangiocytów. Organoidy żółciowe wyrażają markery zarówno komórek progenitorowych, jak i żółciowych i składają się ze spolaryzowanych komórek nabłonka.

Wytwarzanie organoidów z pozawątrobowych dróg żółciowych myszy

Trójwymiarowe hodowle próbek BMPC pacjentów i ksenoprzeszczepów raka prostaty z przerzutami do kości utrzymują funkcjonalną heterogeniczność swoich pierwotnych guzów, co prowadzi do powstawania torbieli, sferoid i złożonych, podobnych do guzów organoidów. Niniejszy manuskrypt zawiera strategię i protokół optymalizacji hodowli 3D heterogenicznych próbek pobranych od pacjentów i ich analizy przy użyciu IFC.

Ustanowienie i analiza trójwymiarowych (3D) organoidów pochodzących z próbek przerzutów do kości raka prostaty u pacjentów i ich ksenoprzeszczepów

Cała struktura 3D i zawartość komórkowa organoidów, jak również ich fenotypowe podobieństwo do oryginalnej tkanki, mogą być uchwycone za pomocą opisanego tutaj protokołu obrazowania 3D o rozdzielczości pojedynczej komórki. Protokół ten może być stosowany do szerokiej gamy organoidów różniących się pochodzeniem, rozmiarem i kształtem.

Trójwymiarowe obrazowanie nienaruszonych organoidów w rozdzielczości pojedynczej komórki

Tutaj prezentujemy protokół opisujący hodowlę organoidów jelitowych psów w dwukomorowym, przepuszczalnym systemie wsparcia. Opisano wysiewanie organoidów w przepuszczalnych podporach, utrzymanie monowarstwy i późniejsze eksperymenty z przepuszczalnością leków.

Organoidy jelitowe psów w dwukomorowym przepuszczalnym systemie nośnym

Tutaj opisujemy metodę generowania organoidów glejaka (GBM) z pierwotnych próbek pacjentów lub hodowli komórkowych pochodzących od pacjentów i utrzymywania ich do dojrzałości. Te organoidy GBM zawierają fenotypowo zróżnicowane populacje komórek i odtwarzają mikrośrodowiska guza ex vivo.

Utrzymanie różnorodności komórkowej ludzkiego glejaka wielopostaciowego ex vivo przy użyciu trójwymiarowej hodowli organoidów

Integracja organoidów jelitowych psów i systemu mikroprzepływowego Gut-on-a-Chip oferuje odpowiednie modele translacyjne dla chorób jelit u ludzi. Przedstawione protokoły pozwalają na morfogenezę 3D i dynamiczne modelowanie jelit in vitro, pomagając w opracowaniu skutecznych metod leczenia chorób jelit u psów i ludzi z One Health.

Trójwymiarowa morfogeneza w psich jelitach na chipie przy użyciu organoidów jelitowych pochodzących od pacjentów z nieswoistymi zapaleniami jelit

Enteroidy pojawiają się jako nowy model do badania fizjologii i patofizjologii tkanek, opracowywania leków i medycyny regeneracyjnej. W tym miejscu opisujemy system hodowli 2D enteroidów pochodzących z komórek pierwotnych bydła, który umożliwia kohodowlę z odpowiednimi typami komórek tkankowych. Model ten oferuje przewagę translacyjną w modelowaniu badań żołądkowo-jelitowych.

Opracowanie dwuwymiarowego systemu hodowli jednowarstwowej bydła pochodzącego z enteroidów pierwotnych do zastosowań w translacyjnych badaniach biomedycznych

Ten protokół przedstawia zoptymalizowaną dwuetapową technikę perfuzji wątroby kolagenazy w modelu szczurzym i pokazuje użycie izolowanych hepatocytów do długoterminowej hodowli organoidów 3D in vitro.

Perfuzja wątroby szczura i izolacja pierwotnych hepatocytów: stara procedura kluczowa dla najnowocześniejszej hodowli organoidów 3D

To badanie przedstawia protokół generowania monowarstw 2D organoidów wieprzowych pochodzących z jelita cienkiego i grubego. Wzrost tych monowarstw charakteryzuje się rosnącymi wartościami TEER, co wskazuje na solidną integralność nabłonka. Dodatkowo, te monowarstwy wykazują fizjologiczne reakcje wydzielnicze w eksperymentach w komorze Ussing po zastosowaniu forskoliny.

Dwuwymiarowe organoidy jelitowe świń odzwierciedlające fizjologiczne właściwości rodzimego jelita

Opisujemy małoinwazyjną i bezbolesną metodę pomiaru siły mięśni kończyn tylnych u psów oraz reakcji mięśni na powtarzające się skurcze ekscentryczne.

Test funkcji mięśni psów in vivo

Poznaj metody izolacji i utrzymania 3D organoidów wątroby i jelit psów do badań biomedycznych. Protokoły te umożliwiają biobankowanie i standaryzację kultur komórkowych.

Standaryzacja i utrzymanie 3D kultur organoidowych wątroby i jelit psów do wykorzystania w badaniach biomedycznych

Przeglądaj więcej filmów