Name: Przeszczepienie indukowanego przez człowieka pluripotencjalnego mikrogleju pochodzącego z komórek macierzystych w mózgu myszy immunokompetentnych drogą przeznosową (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Poznaj nieinwazyjną metodę przeszczepiania ludzkich mikroglejów iPS w mózg myszy immunokompetentnych drogą przez nos. Technika ta umożliwia badanie funkcji mikroglejów in vivo bez uszkodzenia mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Sponsorzy grantu: To badanie było wspierane przez JSPS KAKENHI 17K14961 (PB), 20K15899 (PB), JP18K06481 (YS), JP20KK0366 (YS), 20H05902 (SK), 20H05060 (SK), 19H04746 (SK), 21H04786 (SK), 21K19309 (SK), AMED-CREST (SK), CREST (SK), Mitsubishi Science Foundation (SK), Takeda Science Foundation (SK) oraz Frontier Brain Science Grant z University of Yamanashi (SK).

Wszystkie zwierzęta użyte w tym badaniu zostały uzyskane, trzymane, opiekowane i używane zgodnie z "Zasadami przewodnimi w opiece i użytkowaniu zwierząt w dziedzinie nauk fizjologicznych" opublikowanym przez Japońskie Towarzystwo Fizjologiczne20, oraz za uprzednią zgodą Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Yamanashi (Yamanashi, Japonia).
1. Przygotowanie pożywki komórkowej, pożywki transplantacyjnej i mieszaniny anestezjologicznej
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę komórkową, dodając 10% płodowej surowicy bydlęcej i 0,1% penicyliny/streptomycyny do DMEM.</li>
	<li>Przygotować pożywkę do przeszczepu, dodając hCSF1 (250 ng/ml) i hTGF-β1 (100 ng/ml) do pożywki komórkowej.</li>
	<li>Przygotuj mieszaninę znieczulającą do wstrzyknięcia dootrzewnowego, mieszając 0,45 ml chlorowodorku medetomidyny, 1,2 ml midazolamu i 1,5 ml winianu butorfanolu w 11,8 ml zwykłej soli fizjologicznej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie iPSMG
UWAGA: Zamrożone iPSMG (Tabela Materiałów) były przechowywane w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
<ol>
	<li>Zamrożone komórki szybko rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Mieszaj próbki, aż stopi się cały widoczny lód.</li>
	<li>Dodać rozmrożony iPSMG do pożywki hodowlanej ogrzanej do 37 °C. Dodać 1 ml rozmrożonych komórek zawierających pożywkę (1 ×10 6 komórek) do 10 ml pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad komórek.</li>
	<li>Po odwirowaniu usunąć cały supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Całkowite usunięcie supernatantu jest pożądane w celu zmniejszenia rozcieńczenia stężenia cytokin w pożywce transplantacyjnej.</li>
	<li>Dodać pożywkę do przeszczepu, aby uzyskać stężenie komórek 1 x 105 komórek/μl.</li>
	<li>Umieść iPSMG na lodzie i natychmiast przystąp do przeszczepu. 
	UWAGA: Przygotowanie iPSMG do przeszczepu odbywa się na czystej stole, aby uniknąć zanieczyszczenia.</li>
</ol>
3. Przygotowanie myszy do przeszczepu przeznosowego (Tsn)
<ol>
	<li>Karmić samce myszy typu dzikiego (C57BL/6J, 8 tygodni) dietą zawierającą PLX5622 przez 7 dni.</li>
	<li>Pod koniec 7 dnia należy przerwać dietę PLX i karmić myszy normalną dietą do końca badania. 
	UWAGA: Dietę zawierającą PLX5622 przygotowuje się poprzez dodanie 1,2 g PLX5622 w 1 kg AIN-93G (Tabela Materiałów).</li>
</ol>
4. Przeznosowe przeszczepienie komórek
<ol>
	<li>24 godziny po zaprzestaniu karmienia PLX zważyć myszy i znieczulić je za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia mieszanki znieczulającej (0,2 ml/20 g).</li>
	<li>Po całkowitym znieczuleniu myszy ocenianym na podstawie braku reakcji na odruch wycofania pedału (mocne uszczypnięcie palca), należy podać 2,5 μl hialuronidazy w PBS (100 U/ml) na 1 godzinę przed Tsn iPSMG do każdego nozdrza dwa razy za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 μl, aby zwiększyć przepuszczalność błony śluzowej nosa.</li>
	<li>Po zastosowaniu hialuronidazy należy ułożyć myszy w pozycji leżącej.</li>
	<li>Powtórz krok 4.2 10 minut przed przeznosowym przeszczepieniem iPSMG.</li>
	<li>Nanieść 2,5 μl zawiesiny komórek do jednego nozdrza myszy za pomocą końcówki do pipety o pojemności 10 μl.</li>
	<li>Umieść mysz w pozycji leżącej na plecach na 5 minut przed podaniem zawiesiny komórkowej do drugiego nozdrza.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 4.5 i 4.6 cztery razy, nakładając całkowitą objętość 20 μl na zwierzę.</li>
	<li>Umieść mysz w pozycji leżącej na poduszce grzewczej o temperaturze 37 °C do czasu wyleczenia ze znieczulenia.</li>
	<li>Po 48 godzinach od zaprzestania karmienia PLX powtórz kroki 4.1-4.7 na tych samych myszach jeszcze raz. 
	UWAGA: Należy zauważyć, że iPSMG umieszcza się na lodzie podczas przeszczepu.</li>
</ol>
5. Zastosowanie cytokin
<ol>
	<li>Znieczulenie myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie mieszaniny znieczulającej (0,2 ml/20 g).</li>
	<li>Nanieść 2,5 μl pożywki transplantacyjnej do jednego nozdrza myszy za pomocą końcówki do pipety o pojemności 10 μl.</li>
	<li>Umieść mysz w pozycji leżącej na plecach na 5 minut przed podaniem pożywki do przeszczepu do drugiego nozdrza.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 5.2 i 5.3 cztery razy, nakładając całkowitą objętość 20 μl na zwierzę. 
	UWAGA: Należy zauważyć, że donosowe podawanie pożywki transplantacyjnej (cytokin ludzkich) jest wymagane co 12 godzin dla żywotności przeszczepionego iPSMG do końca badania.</li>
</ol>

<ol><li>Hanisch, U. K., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+active+sensor+and+versatile+effector+cells+in+the+normal+and+pathologic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain.</a> Nature Neuroscience. 10 (11), 1387-1394 (2007).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li>
<li>Smith, A. M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+side+of+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The human side of microglia.</a> Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).</li>
<li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li>
<li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li>
<li>Abud, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSC-derived+human+microglia-like+cells+to+study+neurological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases.</a> Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).</li>
<li>Brownjohn, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+studies+of+missense+TREM2+mutations+in+human+stem+cell-derived+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).</li>
<li>Douvaras, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to microglia.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1516-1524 (2017).</li>
<li>Haenseler, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+human+pluripotent+stem+cell+microglia+model+displays+a+neuronal-co-culture-specific+expression+profile+and+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response.</a> Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).</li>
<li>Hasselmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+chimeric+model+to+study+and+manipulate+human+microglia+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development of a chimeric model to study and manipulate human microglia in vivo.</a> Neuron. 103 (6), 1016-1033 (2019).</li>
<li>Mancuso, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-derived+human+microglia+transplanted+in+mouse+brain+to+study+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-derived human microglia transplanted in mouse brain to study human disease.</a> Nature Neuroscience. 22 (12), 2111-2116 (2019).</li>
<li>Muffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+derivation+of+microglia-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).</li>
<li>Pandya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+and+murine+induced+pluripotent+stem+cells+to+microglia-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human and murine induced pluripotent stem cells to microglia-like cells.</a> Nature Neuroscience. 20 (5), 753-759 (2017).</li>
<li>Schetters, S. T. T., Gomez-Nicola, D., Garcia-Vallejo, J. J., Van Kooyk, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation%3A+Microglia+and+T+cells+get+ready+to+tango%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation: Microglia and T cells get ready to tango.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1905(2017).</li>
<li>Sulzer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+from+patients+with+Parkinson%27s+disease+recognize+alpha-synuclein+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T cells from patients with Parkinson's disease recognize alpha-synuclein peptides.</a> Nature. 546 (7660), 656-661 (2017).</li>
<li>Togo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+T+cells+in+the+brain+of+Alzheimer%27s+disease+and+other+neurological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunology%22%5BJournal%5D)">Occurrence of T cells in the brain of Alzheimer's disease and other neurological diseases.</a> Journal of Neuroimmunology. 124 (1), 83-92 (2002).</li>
<li>Parajuli, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transnasal+transplantation+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+microglia+to+the+brain+of+immunocompetent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Transnasal transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived microglia to the brain of immunocompetent mice.</a> Glia. 69 (10), 2332-2348 (2021).</li>
<li>Elmore, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colony-stimulating+factor+1+receptor+signaling+is+necessary+for+microglia+viability%2C+unmasking+a+microglia+progenitor+cell+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Colony-stimulating factor 1 receptor signaling is necessary for microglia viability, unmasking a microglia progenitor cell in the adult brain.</a> Neuron. 82 (2), 380-397 (2014).</li>
<li>Zasshi, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guiding+principles+for+the+care+and+use+of+animals+in+the+field+of+physiological+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Physiologic+Society+of+Japan%22%5BJournal%5D)">Guiding principles for the care and use of animals in the field of physiological sciences.</a> Journal of the Physiologic Society of Japan. 64 (7-8), 143-146 (2002).</li>
<li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+requirements+for+microglial+survival%2C+specification%2C+and+function+revealed+by+defined-medium+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Diverse requirements for microglial survival, specification, and function revealed by defined-medium cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li>
<li>Butovsky, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+unique+TGF-beta-dependent+molecular+and+functional+signature+in+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of a unique TGF-beta-dependent molecular and functional signature in microglia.</a> Nature Neuroscience. 17 (1), 131-143 (2014).</li>
<li>Regateiro, F. S., Howie, D., Cobbold, S. P., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+in+transplantation+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">TGF-beta in transplantation tolerance.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (5), 660-669 (2011).</li>
<li>Yoshimura, A., Muto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+function+in+immune+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">TGF-beta function in immune suppression.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 350, 127-147 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niniejszy protokół opisuje nieinwazyjne przeszczepienie iPSMG do mózgu myszy. Wyjątkowość obecnego protokołu polega na tym, że łącząc farmakologiczne metody PLX ON/OFF i przeszczep donosowy, iPSMG może być nieinwazyjnie przeszczepiony do immunokompetentnego mózgu myszy. Przeszczepiony iPSMG utworzył większość mikrogleju w hipokampie i móżdżku, zajmując wolną niszę przez okres do 60 dni, ale nie w korze.
Punktami krytycznymi dla skutecznego Tsn iPSMG są: (i) skuteczność zubożenia endogennego mikrogleju myszy, (ii) podawanie ludzkich cytokin co 12 godzin. Mikroglej utrzymuje swoje własne terytorium w mózgu. Skuteczne zubożenie mikrogleju myszy jest konieczne, aby zapewnić niszę do wszczepienia przeszczepionego iPSMG. Gdy zubożenie endogennego mikrogleju myszy jest niewystarczające, nie obserwuje się kolonizacji hipokampa i móżdżku myszy przez iPSMG. Żywotność mikrogleju zależy od sygnalizacji CSF1R i TGFBR 19,21,22. Doniesiono, że hCSF1 selektywnie zwiększa żywotność ludzkiego mikrogleju, a hTGF-β1 jest wymagany do żywotności mikrogleju, a także tłumi stan zapalny, gdy jest podawany co 12 godzin 21,23,24. W przypadku braku egzogennych cytokin ludzkich, iPSMG nie są obserwowane w mózgu myszy. Ponadto należy zachować ostrożność, aby nie aktywować mechanicznie iPSMG poprzez nadmierne pipetowanie lub w jakikolwiek inny sposób przed zastosowaniem Tsn, ponieważ nieodwracalnie zmienia to charakterystykę iPSMG, jak również skuteczność przeszczepu. Jeżeli nie zaobserwuje się zadowalającego Tsn iPSMG, należy określić żywotność iPSMG przed przeszczepieniem, jak również zmniejszenie endogennego mikrogleju. Jeśli zubożenie endogennego mikrogleju myszy nie przekracza 90%, PLX5622 czas karmienia można zmodyfikować w celu zwiększenia zubożenia.
W porównaniu z konwencjonalną metodą przeszczepu chirurgicznego, która jest inwazyjna i wymaga dodatkowego sprzętu i szkolenia, Tsn umożliwia przeszczep w nieinwazyjny, prosty, stabilny i łatwy sposób. Ponadto metoda ta umożliwia przeszczepienie iPSMG do immunokompetentnych mózgów myszy; w ten sposób immunokompetentne myszy modelowe choroby można wykorzystać do badania odpowiedzi na iPSMG.
Największą wadą obecnej metody jest regionalna niejednorodność w ingrafpcji iPSMG. Jeśli wymagany jest przeszczep iPSMG specyficzny dla regionu mózgu, obecny protokół nie jest odpowiedni, ponieważ przeszczepiony iPSMG pozostaje wszczepiony przez 60 dni tylko w hipokampie i móżdżku, ale nie w korze. Co więcej, konieczność podawania egzogennych cytokin ludzkich donosowo co 12 godzin jest również ograniczeniem obecnego protokołu, ponieważ wymaga dużego nakładu pracy i jest kosztowna.
Podsumowując, przedstawiono szczegółowy protokół Tsn iPSMG do mózgów myszy immunokompetentnych. W połączeniu z farmakologicznym włączaniem/wyłączaniem mysiego mikrogleju przez PLX5622, protokół ten umożliwia pomyślne wszczepienie iPSMG. Ponieważ przeszczepione komórki można obserwować w hipokampie i móżdżku przez dłuższy czas, gdy stosowane są cytokiny egzogenne, obecna metoda może być cenna dla oceny roli ludzkiego mikrogleju zarówno w stanach fizjologicznych, jak i patologicznych w tych regionach.

Mikroglej to wyspecjalizowana populacja komórek podobnych do makrofagów w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) i odgrywają istotną rolę w kontrolowaniu różnych funkcji mózgu, takich jak rozwój obwodów nerwowych, modulowanie neurotransmisji i utrzymywanie homeostazy mózgu1,2,3. Chociaż mysi mikroglej ma wiele funkcji wspólnych z ludzkimi, wykazują różnice specyficzne dla gatunku. W związku z tym reakcja mikrogleju myszy na różne bodźce nie zawsze musi reprezentować reakcję ludzkiego mikrogleju4,5,6. Chociaż w wielu badaniach analizowano ludzki mikroglej, eksperymenty te ograniczają się do badań in vitro. Mikroglej ludzki hodowany in vitro wykazuje cechy morfologiczne i ekspresję genów, które znacznie różnią się od tych uprawianych in vivo. W związku z tym eksperymenty in vitro nie zawsze mogą podważyć cechy in vivo ludzkiego mikrogleju. Dlatego potrzebny jest eksperymentalny system do badania ludzkiego mikrogleju in vivo.
Ostatnio, w celu zbadania in vivo cech ludzkiego mikrogleju, indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) - lub embrionalne komórki macierzyste pochodzące z ludzkich komórek macierzystych są chirurgicznie przeszczepiane do mózgu myszy7,8,9,10,11,12,13,14. Korzystając z tego podejścia, scharakteryzowano różne cechy ludzkiego mikrogleju in vivo. Jednak powszechne stosowanie tej metody jest ograniczone z dwóch powodów. Pierwszym z nich jest zapotrzebowanie na myszy z niedoborem odporności. Tak więc, aby zbadać rolę ludzkiego mikrogleju w różnych chorobach neurodegeneracyjnych, myszy przenoszące mutacje choroby muszą zostać skrzyżowane z myszami z niedoborem odporności, co wymaga znacznego czasu i wysiłku. Ponadto w różnych zaburzeniach neurologicznych obwodowe komórki odpornościowe, takie jak limfocyty T, mogą modulować funkcje mikrogleju15,16,17. W związku z tym eksperymenty przeprowadzone na myszach z niedoborem odporności mogą nie reprezentować prawdziwych cech ludzkiego mikrogleju in vivo. Po drugie, inwazyjne operacje przeszczepu mikrogleju wymagają dodatkowego sprzętu i szkolenia. Co więcej, uszkodzenie mózgu podczas inwazyjnego przeszczepu może zmienić fenotypy mikrogleju.
W tym protokole opisano nieinwazyjny przeznosowy przeszczep (Tsn) iPSMG immunokompetentnym myszom dzikiego typu18. Łącząc farmakologiczne włączanie/wyłączanie antagonisty CSF1R PLX5622 który zubaża endogenny mikroglej myszy 19 i Tsn, iPSMG można nieinwazyjnie przeszczepić do mózgu myszy. Ponadto, po zastosowaniu egzogennej ludzkiej cytokiny, przeszczepiony iPSMG pozostaje żywotny przez 60 dni w sposób specyficzny dla regionu bez żadnych leków immunosupresyjnych.

<table><tbody><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM) firmy</td> <td>DulbeccoThermo Fisher Scientific</td><td>10566</td><td></td></tr><tr><td>AIN 93G</td><td>Drożdże orientalne Co</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Iba1</td><td>FUJIFILM</td><td>019&ndash; 19741</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-STEM121</td><td>Takara Bioscience</td><td>Y40410</td><td></td></tr><tr><td>Winian butorfanolu</td><td>Kyoritsu Seiyaku</td><td>8019</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Olympus</td><td>FV1200</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Mrożone iPSMG</td><td>Shionogi & Co., Ltd</td><td></td><td>Laboratorium dla Odkrywanie leków i badania nad chorobami</td></tr><tr><td>Ludzki czynnik stymulujący tworzenie kolonii 1 (hCSF1)</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3506</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek medetomidyny</td><td>Meiji Seika</td><td>VETLI5</td><td></td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>Astellas</td><td>18005A2</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>162-16065</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3120000011</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka do pipety</td><td>Eppendorf</td><td>30076028</td><td></td></tr><tr><td>PLX5622</td><td>Amadis Chemical</td><td>A930097</td><td></td></tr><tr><td>Transformujący czynnik wzrostu-&beta; 1 (Tgf-b1)</td><td>PeproTech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>VECTA SHIELD Hard Set Medium montażowe</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1400-10</td><td>antifade</td></tr></tbody></table>

przeszczepienie indukowanego przez człowieka pluripotencjalnego mikrogleju pochodzącego z komórek macierzystych w mózgu myszy immunokompetentnych drogą przeznosową

Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Microglia in Immunocompetent Mice Brain via Non-Invasive Transnasal Route

Mikroglej to wyspecjalizowana populacja komórek mózgu podobnych do makrofagów. Odgrywają istotną rolę zarówno w fizjologicznych, jak i patologicznych funkcjach mózgu. Większość naszej obecnej wiedzy na temat mikrogleju opiera się na eksperymentach przeprowadzonych na myszach. Mikroglej ludzki różni się od mikrogleju myszy, a zatem reakcja i charakterystyka mikrogleju myszy nie zawsze muszą być takie same jak mikrogleju ludzkiego. Ponadto, ze względu na trudności etyczne i techniczne, badania nad ludzkim mikroglejem są ograniczone do systemu hodowli in vitro, który nie kapituluje in vivo charakterystyki mikrogleju. Aby przezwyciężyć te problemy, opracowano uproszczoną metodę nieinwazyjnego przeszczepiania indukowanego pluripotencjalnego ludzkiego mikrogleju pochodzącego z ludzkich komórek macierzystych (iPSMG) do mózgu immunokompetentnych myszy drogą przeznosową w połączeniu z farmakologicznym zubożeniem endogennego mikrogleju przy użyciu antagonisty receptora czynnika stymulującego tworzenie kolonii 1 (CSF1R). Protokół ten umożliwia nieinwazyjne przeszczepianie komórek do mózgu myszy i dlatego może być cenny dla oceny roli ludzkiego mikrogleju w fizjologicznych i patologicznych funkcjach mózgu in vivo.

Technika ta pozwala badaczowi na nieinwazyjne przeszczepienie iPSMG do hipokampa i móżdżku, ale nie do kory mózgu myszy. Po zakończeniu badania znieczulone myszy poddano perfuzji transkardialnej lodowatym PBS(−), a następnie lodowatym 4% (w/v) paraformaldehydem w PBS. Mózgi wyizolowano, poddano postfixacji przez noc w 4% (w/v) paraformaldehydzie oraz krioprotekcji w PBS zawierającym 30% (w/v) sacharozy. Następnie mózgi zamrożono w związku do zatapiania i pocięto (przekroje czołowe o grubości 20 µm) na kriostacie. Przekroje przemyto trzykrotnie w PBS(−) (po 10 min każdy), a następnie poddano permeabilizacji i blokowaniu za pomocą 0,5% (v/v) Triton X-100 w 10% normalnym surowicy koziej przez 1 h. Następnie przekroje inkubowano przez 5 dni z markerem cytoplazmatycznym specyficznym dla ludzi, STEM121 (1:100), oraz przeciwciałem anty-Iba1 (1:1000). W dalszej kolejności przekroje przemyto trzy razy PBS(−) po 10 min każdy i inkubowano przez 2 h w temperaturze pokojowej z przeciwciałami wtórnymi: mysimi lub króliczymi IgG sprzężonymi z Alexa Fluor 488 lub 546 (1:1000). Po trzykrotnym przemyciu PBS(−), przekroje zamontowano na szkiełkach za pomocą medium montażowego przeciw wyblaknięciu. Do pozyskania obrazów fluorescencyjnych użyto mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw 40x. Żywotność iPSMG 2 miesiące po przeszczepieniu do hipokampa i kory przedstawiono na Rysunku 1. Liczbę przeszczepionych komórek można określić poprzez zliczenie komórek wykazujących pozytywny wynik zarówno dla przeciwciał specyficznych dla ludzi, jak i markerów pan-mikroglejowych/monocytarnych, podczas gdy endogenna mikroglej mysia jest pozytywna tylko dla markera pan-mikroglejowego/monocytarnego, zgodnie z wcześniejszym opisem18. Przeszczepione iPSMG zastępują mikroglej mysi, wykazują morfologię rozgałęzioną w hipokampie i nie są wykrywane w korze18.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna Iba1 i STEM121 w hipokampie i korze, analiza rozkładu komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63574/63574fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Żywotność iPSMG w korze i hipokampie 2 miesiące po Tsn. Panel lewy przedstawia immunobarwienie z użyciem pan-mikroglejowego/monocytowego markera Iba1 (zielony). Panel środkowy przedstawia immunobarwienie z użyciem specyficznego dla ludzi markera cytoplazmatycznego STEM121 (czerwony). Panel prawy przedstawia obraz złączony immunobarwień Iba1 i STEM121. (A) U myszy kontrolnych w korze i hipokampie wykryto wyłącznie mikroglej mysi (Iba1+/STEM121-). (B) U myszy z przeszczepionymi iPSMG w korze wykryto wyłącznie mikroglej mysi (Iba1+/STEM121-), natomiast w hipokampie wykryto iPSMG (Iba1+/STEM121+). Strzałki na obrazie wskazują mikroglej mysi, natomiast groty strzałek wskazują iPSMG. Do akwizycji obrazów fluorescencyjnych użyto mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw 40x. Maksymalny rozmiar obrazu: 1024 x 1024 pikseli. Współczynnik powiększenia: 2. Paski skali = 50 µm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63574/63574fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Przedstawiony tutaj protokół pozwala na przeszczepienie indukowanego pluripotencjalnego ludzkiego mikrogleju pochodzącego z komórek macierzystych (iPSMG) do mózgu drogą przeznosową u myszy immunokompetentnych. Przedstawiono metodę przygotowania i przeznosowego przeszczepienia komórek oraz podawania mieszaniny cytokin w celu utrzymania iPSMG.

Przeszczepienie indukowanego przez człowieka pluripotencjalnego mikrogleju pochodzącego z komórek macierzystych w mózgu myszy immunokompetentnych drogą przeznosową

Microglia are the specialized population of macrophage-like cells of the brain. They play essential roles in both physiological and pathological brain ...

Protokół ten umożliwia nieinwazyjne przeszczepienie iPSMG do immunokompetentnego mózgu myszy poprzez połączenie farmakologicznego włączania/wyłączania PLX5622 antagonisty receptora CSF1 z przeszczepem przeznosowym. Główną zaletą tej techniki jest to, że iPSMG można przeszczepić bez wywoływania uszkodzenia mózgu, nawet u myszy immunokompetentnych. Przeszczep mikrogleju może w przyszłości służyć jako potencjalna terapia mająca na celu wymianę dysfunkcyjnego mikrogleju na funkcjonalny w różnych chorobach neurodegeneracyjnych.Procedurę zademonstruje Bijay Parajuli, badaczka z mojego laboratorium. Zacznij od szybkiego rozmrożenia zamrożonych, indukowanych pluripotencjalnych ludzkich komórek mikrogleju pochodzących z ludzkich komórek macierzystych w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Mieszaj próbki, aż stopi się cały widoczny lód.Dodaj rozmrożony iPSMG do pożywki hodowlanej, podgrzanej do 37 stopni Celsjusza. Dodaj jeden mililitr komórek do 10 mililitrów pożywki hodowlanej. Odwirować komórki 300 razy g przez pięć minut, aby uzyskać osad komórkowy.Usunąć supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Dodaj pożywkę do przeszczepu, aby uzyskać stężenie komórek od 10 do piątych komórek na mikrolitr. Umieść iPSMG na lodzie i natychmiast przystąp do przeszczepu.Aby przygotować myszy do przeszczepu przeznosowego, należy karmić samce myszy dietą zawierającą PLX przez siedem dni. Pod koniec siódmego dnia przerwij dietę PLX i nakarm myszy normalną dietą. Na godzinę przed przeznosowym przeszczepieniem iPSMG należy dwukrotnie podać 2,5 mikrolitra hialuronidazy w PBS do każdego nozdrza za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów, aby zwiększyć przepuszczalność błony śluzowej nosa.Po zastosowaniu hialuronidazy umieść myszy w pozycji leżącej. Podawać 2,5 mikrolitra hialuronidazy dziesięć minut przed przeznosowym przeszczepieniem iPSMG. Nałóż 2,5 mikrolitra zawiesiny komórkowej do jednego nozdrza myszy za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów.Umieść mysz w pozycji leżącej na plecach na pięć minut przed podaniem zawiesiny komórek do drugiego nozdrza. Podawać zawiesinę komórkową czterokrotnie, stosując łączną objętość 20 mikrolitrów na zwierzę. 48 godzin po zaprzestaniu karmienia PLX powtórz podawanie hialuronidazy i zawiesiny komórkowej tym samym myszom.W celu podania cytokin należy nałożyć 2,5 mikrolitra pożywki transplantacyjnej do jednego nozdrza myszy za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów. Po dwóch miesiącach od przeszczepienia przeznosowego liczbę przeszczepionych komórek można określić, licząc komórki, które są dodatnie zarówno pod kątem markerów specyficznych dla człowieka, jak i markerów panmikrogleju. Endogenny mikroglej myszy jest dodatni tylko dla markera pan-mikrogleju.U myszy kontrolnych wykryto tylko mikroglej myszy zarówno w korze, jak i hipokampie. W korze myszy przeszczepionych iPSMG wykryto tylko mikroglej myszy, podczas gdy w hipokampie wykryto iPSMG. Podczas próby zastosowania tego protokołu konieczne jest całkowite usunięcie supernatantu, aby zapobiec rozcieńczeniu cytokin.Bardzo ważne jest, aby stosować cytokinę co 12 godzin dla żywotności przeszczepionych komórek. Do przeszczepienia iPSMG wymagane jest zubożenie endogennego mikrogleju myszy. Procedura ta umożliwia przeszczepienie iPSMG do normalnego lub chorego mózgu myszy.W ten sposób można określić charakterystykę iPSMG, a także odpowiedź na chorobę. Technika ta jest odpowiednia do określenia in vivo charakterystyki iPSMG w mózgu myszy. W związku z tym przeszczepienie iPSMG myszom modelowym choroby pomoże nam zrozumieć odpowiedź i może utorować drogę do nowego celu terapeutycznego.

transplantation-human-induced-pluripotent-stem-cell-derived-microglia

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Szczegółowo opisano transplantację mysich komórek macierzystych neuronów (NSCs) do rdzenia kręgowego myszy z utrwaloną demielinizacją. Przedstawiono przygotowanie NSCs, laminektomię dziewiątego kręgu piersiowego (T9) oraz transplantację NSCs, wraz z opieką przed- i pooperacyjną nad myszami.

Chirurgiczna transplantacja neuralnych komórek macierzystych myszy do rdzeni kręgowych myszy zainfekowanych neurotropowym wirusem zapalenia wątroby myszy

Źródło: Weber, R. Z., et al. Przeszczep domózgowy i śledzenie bioluminescencji in vivo ludzkich nerwowych komórek progenitorowych w mózgu myszy. J. Vis. Exp. (2022)Ten film demonstruje stereotaktyczny przeszczep genetycznie zmodyfikowanych ludzkich nerwowych komórek progenitorowych (NPC) do mózgu myszy. Naukowcy wstrzykują NPC eksprymujące lucyferazy i białka fluorescencyjne, umożliwiając obrazowanie bioluminescencyjne in vivo i pośmiertną mikroskopię fluorescencyjną w celu zbadania przeżycia,...

Przeszczep ludzkich nerwowych komórek progenitorowych w mózgu myszy

Źródło: Furmanski, O., et al. Kontrolowany model wpływu kory mózgowej uszkodzenia mózgu myszy z terapeutycznym przeszczepem ludzkich pluripotencjalnych komórek nerwowych pochodzących z komórek macierzystych. J. Vis. Exp. (2019 rok)W tym filmie indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki nerwowe pochodzące z komórek macierzystych są stereotaktycznie wstrzykiwane do granicy istoty szarej i istoty białej kory głębokiej w mysim modelu urazowego uszkodzenia mózgu. Przeszczepione komórki...

Stereotaktyczny przeszczep zawiesiny komórek nerwowych myszy z urazowym uszkodzeniem mózgu

Ten film demonstruje donosowe dostarczanie terapeutycznych nerwowych komórek macierzystych załadowanych wirusem onkolitycznym do mysiego modelu z guzem mózgu. Nieinwazyjne donosowe podawanie komórek macierzystych omija barierę krew-mózg, ułatwiając ich dostarczenie do miejsca guza w mózgu w celu zastosowania terapeutycznego.

Donosowe dostarczanie terapeutycznych nerwowych komórek macierzystych (NSC) w modelu mysim: procedura ukierunkowanego na nowotwór dostarczania NSC załadowanych wirusem onkolitycznym do mysiego modelu zawierającego guz mózgu

Źródło: Parajuli, B., et.al. Przeszczepienie indukowanego przez człowieka pluripotencjalnego mikrogleju pochodzącego z komórek macierzystych w mózgu myszy immunokompetentnych drogą przeznosową. J. Vis. Exp. (2022).Ten film pokazuje przeznosowe przeszczepienie indukowanych pluripotencjalnych komórek ludzkiego mikrogleju pochodzących z ludzkich komórek macierzystych (iPSMG) do mózgu myszy. Hialuronidazę nakłada się na nozdrza myszy zubożonej w mikroglej w celu zwiększenia przepuszczalności.

Przeznosowe przeszczepienie indukowanych pluripotencjalnych ludzkich komórek mikrogleju pochodzących z ludzkich komórek gleju do mózgu myszy

Komórki macierzyste są obiecującymi nośnikami terapeutycznymi w leczeniu guzów mózgu ze względu na ich wewnętrzny tropizm nowotworowy. Nieinwazyjne donosowe podawanie komórek macierzystych omija barierę krew-mózg i wykazuje duży potencjał w zakresie translacji klinicznej. W artykule podsumowano podstawowe zasady podawania donosowych komórek macierzystych w mysim modelu glejaka.

Donosowe podawanie terapeutycznych komórek macierzystych do glejaka w modelu mysim

Ten protokół demonstruje metodologie dla mysiego modelu urazowego mózgu z otwartą czaszką i przeszczepu hodowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do miejsca urazu. W skrócie opisano również testy behawioralne i histologiczne wyników tych procedur.

Kontrolowany model wpływu kory mózgowej uszkodzenia mózgu myszy z terapeutycznym przeszczepem ludzkich pluripotencjalnych komórek nerwowych pochodzących z komórek macierzystych

Opisujemy intraparenchymalne przeszczepienie ludzkich nerwowych komórek progenitorowych transdukowanych podwójnym wektorem reporterowym wyrażającym lucyferazy-zielone białko fluorescencyjne (GFP) w mózgu myszy. Po przeszczepie sygnał lucyferazy jest wielokrotnie mierzony za pomocą bioluminescencji in vivo i przeszczepionych komórek wykazujących ekspresję GFP, identyfikowanych w sekcjach mózgu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Przeszczep domózgowy i śledzenie bioluminescencji in vivo ludzkich nerwowych komórek progenitorowych w mózgu myszy

Przeszczepienie ludzkich pluripotencjalnych neuronów GABA-ergicznych pochodzących z komórek macierzystych, generowanych przez programowanie neuronalne, może być potencjalnym podejściem do leczenia zaburzeń neurorozwojowych. Protokół ten opisuje wytwarzanie i przeszczepianie prekursorów neuronów GABA-ergicznych pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do mózgów nowonarodzonych myszy, umożliwiając długoterminowe badanie przeszczepionych neuronów i ocenę ich potencjału terapeutycznego.

Przeszczep ludzkich neuronów GABA-ergicznych pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do wczesnopourodzeniowego hipokampa myszy w celu złagodzenia zaburzeń neurorozwojowych

To badanie przedstawia nowatorskie podejście do tworzenia ludzkich komórek mikrogleju (iMG) pochodzących z monocytów, które umożliwiają pośrednią ocenę stanu zapalnego mózgu. Przedstawia to model komórkowy, który może być korzystny dla badań koncentrujących się na potencjalnym zapaleniu mózgu i związanych z nim zaburzeniach neuropsychiatrycznych.

Inżynieria komórek mikrogleju indukowanych ludzką krwią do badań mózgu z odwrotną translacją

Poznaj nieinwazyjną metodę przeszczepiania ludzkich mikroglejów iPS w mózg myszy immunokompetentnych drogą przez nos. Technika ta umożliwia badanie funkcji mikroglejów in vivo bez uszkodzenia mózgu.

Przeszczepienie indukowanego przez człowieka pluripotencjalnego mikrogleju pochodzącego z komórek macierzystych w mózgu myszy immunokompetentnych drogą przeznosową (Wideo) | JoVE Journal

Przeszczepienie indukowanego przez człowieka pluripotencjalnego mikrogleju pochodzącego z komórek macierzystych w mózgu myszy immunokompetentnych drogą przeznosową

Przeglądaj więcej filmów