Przeszczepienie indukowanego przez człowieka pluripotencjalnego mikrogleju pochodzącego z komórek macierzystych w mózgu myszy immunokompetentnych drogą przeznosową
31 maja 2022
Przedstawiony tutaj protokół pozwala na przeszczepienie indukowanego pluripotencjalnego ludzkiego mikrogleju pochodzącego z komórek macierzystych (iPSMG) do mózgu drogą przeznosową u myszy immunokompetentnych. Przedstawiono metodę przygotowania i przeznosowego przeszczepienia komórek oraz podawania mieszaniny cytokin w celu utrzymania iPSMG.
Protokół ten umożliwia nieinwazyjne przeszczepienie iPSMG do immunokompetentnego mózgu myszy poprzez połączenie farmakologicznego włączania/wyłączania PLX5622 antagonisty receptora CSF1 z przeszczepem przeznosowym. Główną zaletą tej techniki jest to, że iPSMG można przeszczepić bez wywoływania uszkodzenia mózgu, nawet u myszy immunokompetentnych. Przeszczep mikrogleju może w przyszłości służyć jako potencjalna terapia mająca na celu wymianę dysfunkcyjnego mikrogleju na funkcjonalny w różnych chorobach neurodegeneracyjnych.
Procedurę zademonstruje Bijay Parajuli, badaczka z mojego laboratorium. Zacznij od szybkiego rozmrożenia zamrożonych, indukowanych pluripotencjalnych ludzkich komórek mikrogleju pochodzących z ludzkich komórek macierzystych w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Mieszaj próbki, aż stopi się cały widoczny lód.
Dodaj rozmrożony iPSMG do pożywki hodowlanej, podgrzanej do 37 stopni Celsjusza. Dodaj jeden mililitr komórek do 10 mililitrów pożywki hodowlanej. Odwirować komórki 300 razy g przez pięć minut, aby uzyskać osad komórkowy.
Usunąć supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Dodaj pożywkę do przeszczepu, aby uzyskać stężenie komórek od 10 do piątych komórek na mikrolitr. Umieść iPSMG na lodzie i natychmiast przystąp do przeszczepu.
Aby przygotować myszy do przeszczepu przeznosowego, należy karmić samce myszy dietą zawierającą PLX przez siedem dni. Pod koniec siódmego dnia przerwij dietę PLX i nakarm myszy normalną dietą. Na godzinę przed przeznosowym przeszczepieniem iPSMG należy dwukrotnie podać 2,5 mikrolitra hialuronidazy w PBS do każdego nozdrza za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów, aby zwiększyć przepuszczalność błony śluzowej nosa.
Po zastosowaniu hialuronidazy umieść myszy w pozycji leżącej. Podawać 2,5 mikrolitra hialuronidazy dziesięć minut przed przeznosowym przeszczepieniem iPSMG. Nałóż 2,5 mikrolitra zawiesiny komórkowej do jednego nozdrza myszy za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów.
Umieść mysz w pozycji leżącej na plecach na pięć minut przed podaniem zawiesiny komórek do drugiego nozdrza. Podawać zawiesinę komórkową czterokrotnie, stosując łączną objętość 20 mikrolitrów na zwierzę. 48 godzin po zaprzestaniu karmienia PLX powtórz podawanie hialuronidazy i zawiesiny komórkowej tym samym myszom.
W celu podania cytokin należy nałożyć 2,5 mikrolitra pożywki transplantacyjnej do jednego nozdrza myszy za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów. Po dwóch miesiącach od przeszczepienia przeznosowego liczbę przeszczepionych komórek można określić, licząc komórki, które są dodatnie zarówno pod kątem markerów specyficznych dla człowieka, jak i markerów panmikrogleju. Endogenny mikroglej myszy jest dodatni tylko dla markera pan-mikrogleju.
U myszy kontrolnych wykryto tylko mikroglej myszy zarówno w korze, jak i hipokampie. W korze myszy przeszczepionych iPSMG wykryto tylko mikroglej myszy, podczas gdy w hipokampie wykryto iPSMG. Podczas próby zastosowania tego protokołu konieczne jest całkowite usunięcie supernatantu, aby zapobiec rozcieńczeniu cytokin.
Bardzo ważne jest, aby stosować cytokinę co 12 godzin dla żywotności przeszczepionych komórek. Do przeszczepienia iPSMG wymagane jest zubożenie endogennego mikrogleju myszy. Procedura ta umożliwia przeszczepienie iPSMG do normalnego lub chorego mózgu myszy.
W ten sposób można określić charakterystykę iPSMG, a także odpowiedź na chorobę. Technika ta jest odpowiednia do określenia in vivo charakterystyki iPSMG w mózgu myszy. W związku z tym przeszczepienie iPSMG myszom modelowym choroby pomoże nam zrozumieć odpowiedź i może utorować drogę do nowego celu terapeutycznego.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia nieinwazyjną metodę transplantacji ludzkiej mikroglei pochodzącej z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSMG) do mózgu immunokompetentnych myszy drogą transnasalną. Protokół wykorzystuje podawanie cytokin oraz usuwanie endogennej mikroglei, aby umożliwić skuteczną integrację iPSMG, co może utorować drogę do opracowania metod terapeutycznych w chorobach neurodegeneracyjnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- badania nad komórkami macierzystymi
- biologia mikrogleju
Wstęp
- Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste mogą być różnicowane w funkcjonalną mikrogleję.
- Dysfunkcja mikroglei jest zaangażowana w różne choroby neurodegeneracyjne.
- Podawanie przez nos stanowi nowatorskie podejście do transplantacji komórek.
- Podawanie cytokin jest kluczowe dla przeżywalności komórek po transplantacji.
Cel badania
- Opracowanie metody nieinwazyjnej transplantacji mikrogleju.
- Ocena wykonalności podawania przez nos w kontekście utrzymania prawidłowych funkcji mózgu.
- Ocena potencjału iPSMG w zastępowaniu dysfunkcyjnego mikrogleju.
Zastosowane metody
- Podstawowa platforma obejmuje transnasalną transplantację iPSMG u myszy immunokompetentnych.
- Samce myszy poddano wstępnemu leczeniu antagonistą receptora CSF1 PLX5622 oraz roztworem hialuronidazy w celu zwiększenia przepuszczalności nosa.
- Zawiesiny komórkowe podawano w wielu dawkach w określonych ramach czasowych, aby zapewnić prawidłową integrację.
- Monitorowanie po transplantacji polegało na ocenie obecności i żywotności przeszczepionych komórek.
Główne wyniki
- Przeszczepione iPSMG zostały pomyślnie zintegrowane z hipokampem myszy bez uszkadzania endogennej mikroglejii.
- Podawanie cytokin co 12 godzin było kluczowe dla utrzymania żywotności komórek po transplantacji.
- Metoda ta umożliwia badanie odpowiedzi iPSMG zarówno w modelach zdrowych, jak i chorobowych.
Wnioski
- Niniejszy protokół ułatwia badanie iPSMG in vivo, co może dostarczyć informacji przydatnych dla przyszłych terapii genowych w chorobach neurodegeneracyjnych.
- Zrozumienie zachowania przeszczepionej mikroglei może pomóc w określeniu jej roli w utrzymaniu zdrowia mózgu.
- Podejście to może otworzyć nowe możliwości w poszukiwaniu celów terapeutycznych w leczeniu patologii związanych z mikrogleją.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Nieinwazyjna transplantacja mikrogleju pochodzącego z ludzkich iPSC do mózgów immunokompetentnych myszy umożliwia bezpośrednie badanie in vivo funkcji ludzkiego mikrogleju i jego odpowiedzi w przebiegu chorób. Podejście to niweluje luki translacyjne między mikroglejem gryzoni a ludzkim, wspierając tworzenie bardziej predykcyjnych modeli przedklinicznych w badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi. Protokół ten usprawnia walidację celów oraz minimalizację ryzyka mechanistycznego na wczesnych etapach odkrywania leków i w punktach zwrotnych badań przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie biologii ludzkiej mikrogleju in vivo w środowisku mózgu ssaka.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez rozróżnienie odpowiedzi swoistych dla ludzkiego mikrogleju od modeli mysich.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów terapeutycznych w szlakach neurozapalnych i neurodegeneracyjnych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowany system oceny integracji i żywotności ludzkiej mikroglei in vivo.
- Umożliwia powtarzalną kwantyfikację mikroglei przeszczepionej w stosunku do endogennej przy użyciu specyficznych markerów.
- Wspiera dalsze badania przesiewowe związków ukierunkowanych na funkcje ludzkiej mikroglei w kontekście fizjologicznym.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dostosowanie modeli przedklinicznych do charakterystyki ludzkich schorzeń poprzez wprowadzenie ludzkiej mikroglei do mózgów myszy.
- Pozwala na ocenę odpowiedzi ludzkiej mikroglei zarówno u myszy zdrowych, jak i w modelach chorobowych.
- Zwiększa wiarygodność przewidywań w zakresie odkrywania translacyjnych biomarkerów oraz testowania hipotez terapeutycznych.
Integracja potoku i procesu roboczego
Niniejszy protokół łączy wczesną fazę odkrywania z badaniami przedklinicznymi, umożliwiając funkcjonalne badania ludzkiej mikroglej w warunkach in vivo, co wspiera identyfikację związków wiodących oraz ciągłość translacyjną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących roli ludzkiej mikroglei w fizjologii i patologii mózgu.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych odczytów integracji i żywotności komórek po transplantacji.
- Analityka: Umożliwia rozróżnienie między ludzką a mysią mikrogleą na podstawie markerów w celu przeprowadzenia rzetelnej analizy danych.
- Badania translacyjne: Ułatwia modelowanie istotne dla chorób poprzez transplantację iPSMG do mysich modeli chorobowych.
- Zastosowania szerokie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny funkcji ludzkiej mikroglei w wielu kontekstach chorobowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność specyficzną dla gatunku w badaniach nad neurozapaleniem.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje nieinwazyjne przepływy pracy w zakresie dostarczania i ilościowego oznaczania komórek w celu zapewnienia powtarzalności między badaniami.
- Wartość strategiczna: Umożliwia lepsze podejmowanie decyzji typu go/no-go w przypadku terapii celowanych w mikroglej dzięki dostarczeniu danych istotnych dla człowieka.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację programów chorób neurodegeneracyjnych z uwzględnieniem ryzyka poprzez poprawę wierności modelu.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza ekspercka w zakresie hodowli iPSC, różnicowania mikrogleju oraz technik transplantacji in vivo.
- Niezbędny jest dostęp do środków farmakologicznych służących do deplecji endogennej mikroglei oraz wsparcia cytokinowego.
- Wymagane są zestandaryzowane protokoły przygotowania komórek, transplantacji oraz analizy powydatłukowej.
- Adaptacja do innych systemów modelowych może wymagać optymalizacji parametrów dostarczania komórek i deplecji.
- Zgodnie z protokołem, ciągłe podawanie cytokin jest kluczowe dla przeżywalności przeszczepionych komórek.
