Name: Mikroskopia subkomórkowa przyżyciowych gruczołu sutkowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 14 s
Description: Poznaj technikę obrazowania subkomórkowego gruczołu sutkowego myszy w czasie laktacji przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej. Metoda umożliwia wizualizację dynamiki kropli lipidów w komórkach nabłonkowych in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują Sherry Rausch i Samri Gebre (National Cancer Institute, NIH) za zarządzanie i opiekę nad zwierzętami oraz Jamesowi Matherowi za pomoc w produkcji szeregu plastikowych przekładek. Badania te były wspierane [częściowo] przez Intramural Research Program NIH.

Wszystkie procedury dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Centrum Badań nad Rakiem, Narodowego Instytutu Raka, Narodowych Instytutów Zdrowia zgodnie z Przewodnikiem Amerykańskiej Narodowej Rady ds. Badań Naukowych dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, Polityką Służby Zdrowia Publicznego USA dotyczącą humanitarnej opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, oraz Przewodnik dotyczący opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich wykorzystywania. Na potrzeby tej pracy gruczoły numer 4 samic pierworódek myszy (w wieku 4-5 miesięcy, 10 dzień laktacji) zostały chirurgicznie przygotowane w pozycji leżącej po prawej stronie (<silna klasa="xfig">Ryc. 1A).
1. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Zważ mysz na wadze ładowanej od góry, aby obliczyć wymaganą ilość środka znieczulającego.</li>
	<li>W trakcie i po zastosowaniu środków znieczulających utrzymuj temperaturę ciała, umieszczając mysz na podkładce rozgrzewającej.</li>
	<li>Znieczulić mysz przez krótką ekspozycję na izofluran (3,0%-3,5%) w komorze oddechowej nasyconej tlenem (patrz tabela materiałów) przez 1-2 minuty, a następnie wstrzyknąć dootrzewnowo mieszaninę 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny.</li>
	<li>Utrzymuj zwierzęta w głębokim znieczuleniu zarówno podczas operacji, jak i obrazowania, stosując dalsze miareczkowane dawki ksylazyny i ketaminy (od połowy do jednej czwartej dawki początkowej opisanej w kroku 1.3) przez cewnik na stałe (patrz krok 3.4) co około 45 minut, zgodnie z wymaganiami. 
	UWAGA: Optymalna płaszczyzna znieczulenia jest najłatwiejsza do utrzymania, sprawdzając odruchy szczypania powiek i palców u nóg co 10-20 minut. Temperatura przytomnych myszy wynosi 36,5-38 °C, która w znieczuleniu spada do 34,5 °C.</li>
	<li>Krzyżuj się z pups22 jeśli dostępne są myszy dawcy na podobnym etapie laktacji; w przeciwnym razie należy poddać miot eutanazji. 
	UWAGA: Szczenięta w wieku <10 dni powinny zostać poddane eutanazji poprzez wystawienie na działanie 3,0% izofluranu, a następnie ścięcie. Szczenięta w wieku ≥10 dni powinny zostać poddane eutanazji poprzez wdychanie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy.</li>
</ol>
2. Zabieg chirurgiczny
<ol>
	<li>Utrzymuj mysz w cieple przez cały czas operacji na podkładce rozgrzewającej. Ogol sierść ze skóry otaczającej gruczoły sutkowe numer 4 i 5 (leżące, prawa strona) za pomocą ręcznej elektrycznej maszynki do golenia. Oczyść ogolony obszar trzema naprzemiennymi peelingami betadynowymi i alkoholowymi.</li>
	<li>Przetrzyj wszystkie narzędzia chirurgiczne 70% alkoholem. Wykonaj nacięcie w linii środkowej ~1 cm w pobliżu czwartego sutka, szczypiąc skórę pęsetą i przecinając uniesioną skórę ostrymi nożyczkami. Wykonaj okrągłe nacięcia wokół gruczołu zarówno w kierunku czaszkowym, jak i ogonowym i ostrożnie oderwij skórę od brzucha. Utrzymuj odsłoniętą skórę wilgotną solą fizjologiczną.</li>
	<li>Aby zminimalizować utratę krwi, przed ich przecięciem należy uszczelnić wszelkie widoczne naczynia krwionośne ręcznym kauteryzatorem (patrz Tabela materiałów). Wszelka egzogenna krew powinna być natychmiast usunięta za pomocą soli fizjologicznej, aby uniknąć późniejszej utraty rozdzielczości optycznej.</li>
	<li>Usuń powierzchowną tkankę łączną i tłuszczową, delikatnie drażniąc warstwę powierzchniową drobnymi kleszkami.</li>
	<li>Utrzymuj odsłonięty gruczoł wilgotny solą fizjologiczną i chroń ścianę brzucha żelem i półprzezroczystą, elastyczną, termoplastyczną folią (patrz Tabela Materiałów). 
	UWAGA: Kroki 2.2-2.5 tworzą płat skóry z częścią gruczołu i związanym z nim naczyniem oddzielonym od ściany brzucha (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1Bi-iv).</li>
	<li>W razie potrzeby należy potraktować gruczoł środkami egzogennymi, np. środkami farmakologicznymi lub barwnikami specyficznymi dla organelli, kąpiąc odsłonięty gruczoł podczas zabiegu. 
	UWAGA: W podanych przykładach, LD u myszy EGFPcyto lub EGFPmembr (mG) znakowano 1,0 ml boru-dipyrrometenu (BODIPY) 665/676 (10 mM roztworu podstawowego w dimetylosulfotlenku rozcieńczonym 1 do 1000 razy w soli fizjologicznej i stosowanym przez <1 h) oraz w myszy tdTomatomembr (mT) lub EGFPmembr (mG), z 0,5 ml monodansylpentanu23 (0,1 M roztwór podstawowy w dimetylosulfotlenku rozcieńczony 1 do 1000 razy w soli fizjologicznej i stosowany przez 5 min).</li>
</ol>
3. Przygotowanie do obrazowania
<ol>
	<li>Ostrożnie ustaw mysz brzuszkiem do dołu na podgrzewanym (37 °C) odwróconym stoliku mikroskopowym, tak aby płat skóry wystawał na środkową szklaną pokrywę (30 mm) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1Biv). Zabezpiecz odsłonięte miejsca cienką warstwą żelu.</li>
	<li>Ustabilizuj płat skóry za pomocą specjalnie wykonanych przekładek, aby zamortyzować gruczoł przed artefaktami ruchu spowodowanymi oddychaniem i biciem serca. Aby to osiągnąć, umieść karbowaną przekładkę wykonaną z trzech przyklejonych bawełnianych patyczków (<silna klasa="xfig">Rysunek 1Ci) między klapą skóry a ścianą ciała i przyklej tylną nogę i ogon do sceny za przekładką (<silna klasa="xfig">Rysunek 1Bv).</li>
	<li>Zapobiegaj przesuwaniu się płata skóry podczas obrazowania, bezpiecznie przyklejając plastikową osłonę (<silna klasa="xfig">Rysunek 1Cii) na obu końcach otworu stolika (<silna klasa="xfig">Rysunek 1Bv).</li>
	<li>Wprowadzić podskórny cewnik umieszczony na stałe pod skórą grzbietową przymocowany do rurki, strzykawki i pompy (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Potwierdź, że płat skóry jest stabilny z odpowiednim przepływem krwi za pomocą konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1Bvi).</li>
	<li>Przykryj mysz gazą gąbczastą (patrz Tabela materiałów), aby utrzymać ciepło podczas obrazowania, 
	UWAGA: Kroki 3.1-3.5 są najbardziej krytyczne w zapewnieniu pozyskiwania filmów w wysokiej rozdzielczości odpowiednich do analizy ilościowej. Nie ma sensu wychodzić poza ten etap, chyba że stabilność tkanek została potwierdzona.</li>
</ol>
4. Mikroskopia
<ol>
	<li>Do konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej myszy EGFPcyto lubEGFP membr (mG) oznaczonej BODIPY665/676 (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2, Wideo 1 i Wideo 2), należy użyć mikroskopu odwróconego wyposażonego w wstępnie nagrzany 60-krotny obiektyw zanurzeniowy w olejku, utrzymywany w temperaturze 37 °C (patrz Tabela Materiałów).
	<ol>
		<li>Oddzielnie wykrywaj EGFP i BODIPY665/676 za pomocą laserów 488 i 633; dla EGFP wzbudzenie 488 nm i emisję 560 nm, z filtrem pasmowo-przepustowym BA 505-605; dla BODIPY665/676, wzbudzenie 633 nm i emisję 668 nm, z filtrem pasmowo-przepustowym BA 655-755.</li>
		<li>Zbieraj obrazy według skanowania liniowego z prędkością 4 lub 8 μs/piksel (512 x 512 pikseli; 12 bitów na piksel) co 5 s lub 10 s przez 1-2 godziny i przechowuj je jako pliki TIFF. Ręcznie utrzymuj zeskanowane obszary w kadrze, korygując odchylenie x/y w całym cyklu obrazowania. Twórz obrazy 3D ze skanów z użyciem oprogramowania powiązanego z mikroskopem (patrz Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do mikroskopii dwufotonowej myszyEGFP membr (mG) znakowanej monodansylpentanem (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 3, Wideo 3) należy użyć mikroskopu odwróconego wyposażonego w przestrajalny laser i obiektyw o temperaturze 30x nagrzany w temperaturze 37 °C (patrz Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Wzbudzić gruczoł przy 910 nm i wykryć monodansylpentan i EGFP za pomocą dwóch detektorów GaAs, używając filtrów pasmowo-przepustowych 410-460 nm i 495-540 nm odpowiednio dla emisji niebieskiej i zielonej.</li>
		<li>Zbieraj obrazy według skanowania liniowego z prędkością 2 μs/piksel (320 x 320 pikseli; 16 bitów na piksel) i przechowuj je jako pliki OIR. Ręcznie utrzymuj zeskanowane obszary w kadrze, korygując dryf x/y w całym cyklu obrazowania. Twórz obrazy 3D ze skanów z użyciem oprogramowania powiązanego z mikroskopem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do mikroskopii dwufotonowej myszy tdTomatomembr (mT) oznaczonej monodansylpentanem (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4, Wideo 4), użyj mikroskopu odwróconego z przestrajalnymi laserami i wstępnie nagrzanego obiektywu 63x w temperaturze 37 °C (patrz Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Wzbudzić próbki przy 800 nm i 1060 nm jednocześnie i wykryć monodansylpentan za pomocą hybrydowego detektora HyD ustawionego na emisję 418-471 nm, a TdTomato za pomocą innego hybrydowego detektora HyD ustawionego na emisję 595-667 nm.</li>
		<li>Zbierz obrazy według skanowania liniowego z czterema liniami o średniej częstotliwości 200 Hz (512 x 512 pikseli; 12 bitów na piksel) i przechowuj je jako pliki LIF. Ręcznie utrzymuj zeskanowane obszary w kadrze, korygując dryf x/y w całym cyklu obrazowania. Twórz obrazy 3D ze skanów za pomocą oprogramowania powiązanego z mikroskopem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Eutanazja
<ol>
	<li>Poddać myszy eutanazji pod koniec obrazowania poprzez wdychanie CO2 zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami.</li>
</ol>
6. Tworzenie filmów w czasie rzeczywistym
<ol>
	<li>Konwertuj sekwencje czasowe na pliki TIFF, a następnie na filmy za pomocą odpowiedniego oprogramowania (patrz Spis materiałów). 
	UWAGA: Analiza ilościowa konkretnych filmów wykracza poza zakres tego artykułu i będzie wymagała określonych metod rozwiązywania określonych problemów. Na przykład zobacz Ebrahim et al.24 dla roli kompleksów promieniowców w egzocytozie śliny z gruczołu ślinowego, Meyer et al.25 dla dynamiki wydzielania żółci z wątroby oraz Masedunskas et al.9 dla analizy wydzielania LD z komórek nabłonka sutka.</li>
</ol>

<ol><li>Scheele, C. L. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identity+and+dynamics+of+mammary+stem+cells+during+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identity and dynamics of mammary stem cells during branching morphogenesis.</a> Nature. 542 (7641), 313-317 (2017).</li>
<li>Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+dynamic+single-cell+behavior+in+mouse+mammary+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue.</a> Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).</li>
<li>Kedrin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+metastatic+behavior+through+a+mammary+imaging+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window.</a> Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic%2C+long-term+in+vivo+imaging+of+tumor-stroma+interactions+in+mouse+models+of+breast+cancer+using+spinning-disk+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2011).</li>
<li>Ellenbroek, S. I. J., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+hallmarks+of+cancer+in+living+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Imaging hallmarks of cancer in living mice.</a> Nature Reviews Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).</li>
<li>Dawson, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+ductal+macrophages+survey+the+mammary+epithelium+and+facilitate+tissue+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident ductal macrophages survey the mammary epithelium and facilitate tissue remodelling.</a> Nature Cell Biology. 22 (5), 546-558 (2020).</li>
<li>Ebrahim, S., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+in+mammalian+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy in mammalian multicellular organisms.</a> Current Opinion in Cell Biology. 59, 97-103 (2019).</li>
<li>Masedunskas, A., Weigert, R., Mather, I. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMasedunskas%2C+A+%22Advances+in+Intravital+Microscopy%22">Advances in Intravital Microscopy</a>. Weigert, R. , Weigert) Springer-Verlag. Netherlands. 187-204 (2014).</li>
<li>Masedunskas, A., Chen, Y., Stussman, R., Weigert, R., Mather, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+milk+lipid+droplet+transport%2C+growth%2C+and+secretion+revealed+by+intravital+imaging%3A+lipid+droplet+release+is+intermittently+stimulated+by+oxytocin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Kinetics of milk lipid droplet transport, growth, and secretion revealed by intravital imaging: lipid droplet release is intermittently stimulated by oxytocin.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 935-946 (2017).</li>
<li>Stevenson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+imaging+of+basal+cell+dynamics+in+the+functionally-mature+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally-mature mammary gland.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).</li>
<li>Shan, S., Sorg, B., Dewhirst, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+rodent+mammary+window+of+orthotopic+breast+cancer+for+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">A novel rodent mammary window of orthotopic breast cancer for intravital microscopy.</a> Microvascular Research. 65 (2), 109-117 (2003).</li>
<li>Zomer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+report%3A+Intravital+imaging+of+cancer+stem+cell+plasticity+in+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Brief report: Intravital imaging of cancer stem cell plasticity in mammary tumors.</a> Stem Cells. 31 (3), 602-606 (2013).</li>
<li>Harper, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+early+dissemination+and+metastasis+in+Her2%2B+mammary+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2+ mammary cancer.</a> Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).</li>
<li>Burgoyne, R. D., Duncan, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+of+milk+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Secretion of milk proteins.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 3 (3), 275-286 (1998).</li>
<li>Monks, J., Neville, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Albumin+transcytosis+across+the+epithelium+of+the+lactating+mouse+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology+London%22%5BJournal%5D)">Albumin transcytosis across the epithelium of the lactating mouse mammary gland.</a> Journal of Physiology London. 560, 267-280 (2004).</li>
<li>Boisgard, R., Chanat, E., Lavialle, F., Pauloin, A., Ollivier-Bousquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roads+taken+by+milk+proteins+in+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Livestock+Production+Science%22%5BJournal%5D)">Roads taken by milk proteins in mammary epithelial cells.</a> Livestock Production Science. 70 (1-2), 49-61 (2001).</li>
<li>Green, K. A., Lund, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECM+degrading+proteases+and+tissue+remodelling+in+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">ECM degrading proteases and tissue remodelling in the mammary gland.</a> Bioessays. 27 (9), 894-903 (2005).</li>
<li>Lund, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+phases+of+apoptosis+in+mammary+gland+involution%3A+proteinase-independent+and+-dependent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Two distinct phases of apoptosis in mammary gland involution: proteinase-independent and -dependent pathways.</a> Development. 122 (1), 181-193 (1996).</li>
<li>Abe, T., Fujimori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporter+mouse+lines+for+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Develoment+Growth+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Reporter mouse lines for fluorescence imaging.</a> Develoment Growth and Differentiation. 55 (4), 390-405 (2013).</li>
<li>Hadjantonakis, A. K., Gertsenstein, M., Ikawa, M., Okabe, M., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+green+fluorescent+mice+by+germline+transmission+of+green+fluorescent+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Generating green fluorescent mice by germline transmission of green fluorescent ES cells.</a> Mechanisms of Development. 76 (1-2), 79-90 (1998).</li>
<li>Mazumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li>
<li>Fostering litters. The Jackson Laboratory. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.jax.org/jax-mice-and-services/customer-support/technical-support/breeding-and-husbandry-support/general-husbandry-tips#">https://www.jax.org/jax-mice-and-services/customer-support/technical-support/breeding-and-husbandry-support/general-husbandry-tips#</a> (2022).</li>
<li>Yang, H. -J., Hsu, C. -L., Yang, J. -Y., Yang, W. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monodansylpentane+as+a+blue-fluorescent+lipid-droplet+marker+for+multi-color+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Monodansylpentane as a blue-fluorescent lipid-droplet marker for multi-color live-cell imaging.</a> PloS One. 7 (3), 32693(2012).</li>
<li>Ebrahim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+polyhedral+actomyosin+lattices+remodel+micron-scale+curved+membranes+during+exocytosis+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic polyhedral actomyosin lattices remodel micron-scale curved membranes during exocytosis in live mice.</a> Nature Cell Biology. 21 (8), 933-939 (2019).</li>
<li>Meyer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+predictive+3D+multi-scale+model+of+biliary+fluid+dynamics+in+the+liver+lobule%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">A predictive 3D multi-scale model of biliary fluid dynamics in the liver lobule.</a> Cell Systems. 4 (3), 277-290 (2017).</li>
<li>Macias, H., Hinck, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mammary gland development.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).</li>
<li>Mather, I. H., Masedunskas, A., Chen, Y., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symposium+review%3A+Intravital+imaging+of+the+lactating+mammary+gland+in+live+mice+reveals+novel+aspects+of+milk-lipid+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Symposium review: Intravital imaging of the lactating mammary gland in live mice reveals novel aspects of milk-lipid secretion.</a> Journal of Dairy Science. 102 (3), 2760-2782 (2019).</li>
<li>Caspi, A., Granek, R., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+diffusion+in+active+intracellular+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Enhanced diffusion in active intracellular transport.</a> Physical Review Letters. 85, 5655-5658 (2000).</li>
<li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+magic%3A+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).</li>
<li>Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cell+biology+in+live+animals%3A+Ready+for+prime+time%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging cell biology in live animals: Ready for prime time.</a> Journal of Cell Biology. 201 (7), 969-979 (2013).</li>
<li>So, P. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+fluorescence+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Two-photon fluorescence light microscopy.</a> Encyclopedia of Life Sciences. , 1-5 (2002).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563(2011).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mice+for+long-term+intravital+imaging+of+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562(2011).</li>
<li>Nishinakagawa, H., Mochizuki, K., Nishida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+blood+supply+to+the+mammary+glands+of+the+mouse%2C+rat%2C+hamster+and+guinea-pig%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Zoological+Science%22%5BJournal%5D)">On the blood supply to the mammary glands of the mouse, rat, hamster and guinea-pig.</a> Japanese Journal of Zoological Science. 39 (7), 283-291 (1968).</li>
<li>Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+drift+correction+following+4D+confocal+time-lapse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e51086(2014).</li>
<li>Palade, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+aspects+of+the+process+of+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intracellular aspects of the process of protein synthesis.</a> Science. 189 (4200), 347-358 (1975).</li>
<li>Heald, C. W., Saacke, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytological+comparison+of+milk+protein+synthesis+of+rat+mammary+tissue+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Cytological comparison of milk protein synthesis of rat mammary tissue in vivo and in vitro.</a> Journal of Dairy Science. 55 (5), 621-628 (1972).</li>
<li>Hunziker, W., Kraehenbuhl, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+transcytosis+of+immunoglobulins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Epithelial transcytosis of immunoglobulins.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 3 (3), 287-302 (1998).</li>
<li>Messal, H. A., van Rheenen, J., Scheele, C. L. G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intravital+microscopy+toolbox+to+study+mammary+gland+dynamics+from+cellular+level+to+organ+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">An intravital microscopy toolbox to study mammary gland dynamics from cellular level to organ scale.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 26 (1), 9-27 (2021).</li>
<li>Teter, B. B., Sampugna, J., Keeney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milk+fat+depression+in+C57Bl%2F6J+mice+consuming+partially+hydrogenated+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Milk fat depression in C57Bl/6J mice consuming partially hydrogenated fat.</a> Journal of Nutrition. 120 (8), 818-824 (1990).</li>
<li>Russell, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+of+the+mammary+epithelium+with+adenovirus+vectors+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Transduction of the mammary epithelium with adenovirus vectors in vivo.</a> Journal of Virology. 77 (10), 5801-5809 (2003).</li>
</ol>

Żaden z autorów nie ma sprzecznych interesów, które mógłby zadeklarować.

To, czy użyć mikroskopu jedno- czy wielofotonowego, zależy od zadawanych pytań, charakteru i lokalizacji tkanki, która ma być obrazowana, oraz wymaganej rozdzielczości. Mikroskopy wielofotonowe opierają się na generowaniu dwóch lub więcej niskoenergetycznych fotonów w bliskiej podczerwieni, które mogą penetrować tkanki na większą głębokość przy mniejszej fototoksyczności niż mikroskopy jednofotonowe29,30. Ponadto fluorofor jest wzbudzany tylko w punkcie ogniskowy...

Mikroskopia przyżyciowa gruczołu sutkowego myszy przyciąga coraz większą uwagę jako skuteczna metoda analizy całego szeregu zjawisk biologicznych, w tym pochodzenia i różnicowania komórek macierzystych1,2, progresja nowotworów przerzutowych3,4,5oraz rola makrofagów przewodowych w rozwoju i inwolucji sutka6. Dzięki rozwojowi Intravital Subcellular Microscopy (ISMic)7, badania zostały rozszerzone na ruch błonowy i mechanizmy wydzielnicze podczas laktacji8,9, oraz skurcz komórek mioepitelialnych za pośrednictwem oksytocyny9,10. Opracowano dwie główne metody, które wykorzystują dostępność gruczołu między skórą a ścianą ciała.
W pierwszym podejściu, akrylowe lub szklane okno jest wkładane do skóry i zabezpieczane metalowym pierścieniem ustalającym1,3,11. Myszy dobrze znoszą operację, a różne zjawiska mogą być analizowane okresowo u tego samego zwierzęcia przez kilka tygodni. Ta metoda okazała się szczególnie przydatna do śledzenia linii1,12 oraz monitorowania inwazji i progresji guzów sutka in situ3,11. Jednak rozdzielczość poniżej poziomu całej komórki okazała się trudna, ponieważ gruczoł jest nadal przyczepiony do ściany ciała, a zatem podlega artefaktom ruchowym spowodowanym oddychaniem i biciem serca.
W drugim podejściu, gruczoł jest chirurgicznie odsłonięty na płatku skóry z nienaruszonym unaczynieniem i ustabilizowany na stoliku mikroskopu za pomocą przekładek4,9,13. W ten sposób część gruczołu jest skutecznie oddzielona od ściany brzucha, a artefakty ruchowe są zminimalizowane. W większości przypadków odsłonięty miąższ umieszcza się bezpośrednio na szkiełku nakrywkowym myszą brzuszną stroną do dołu pod odwróconym mikroskopem. W niedawnej modyfikacji mysz umieszczono na wznak na pionowym mikroskopie, a odsłonięty gruczoł zabezpieczono w komórce wypełnionej płynem, uszczelnionej szkiełkiem nakrywkowym2. Ta ostatnia konfiguracja umożliwia dostęp do powierzchni miąższowej w celu eksperymentalnej manipulacji podczas obrazowania. Rozdzielczość do <1 μm, w obu przypadkach, pozwala na analizę procesów wewnątrzkomórkowych, czego przykładem jest śledzenie kropelek lipidów (LD) w komórkach nabłonka sutka9.
Obecny protokół szczegółowo opisuje łatwą metodę obrazowania komórek nabłonka sutka w trybie przyżyciowym na poziomie subkomórkowym, na przykładzie biogenezy, transportu i wydzielania LD podczas laktacji. Podejście to ma szerokie zastosowanie w wielu innych procesach, w tym w transporcie i wydzielaniu białek mleka14, transcytozie białek od strony surowiczej nabłonka do światła pęcherzyka płucnego15,16, oraz przebudowa gruczołu podczas inwolucji17,18.
Myszy wykazujące ekspresję białka fluorescencyjnego są preferowane w większości eksperymentów przyżyciowych, aby ułatwić wybór odpowiednich obszarów do obrazowania i jako morfologiczny marker odniesienia. Dostępna jest szeroka gama odpowiednich myszy transgenicznych i knock-in, które wyrażają fluorescencyjne markery białkowe w przedziałach komórkowych, elementach cytoszkieletu, błonach i organellach19. W podanych przykładach użyto myszy EGFPcyto FvB, w której wzmocnione białko zielonej fluorescencji (EGFP) jest ukierunkowane na cytoplazmę w większości komórek20 (oznaczone EGFPcyto) oraz C57BL/6J Tomato (mT/mG) mouse21, który jest podwójnie fluorescencyjną linią Cre kodującą geny tdTomato i EGFP. Ekspresja EGFP jest możliwa dzięki wycinaniu genu tdTomato za pośrednictwem Cre. Każdy z fluoroforów jest kierowany do błony plazmatycznej w większości komórek za pomocą cekonu pochodzącego z białka MARCKS 21. W tej pracy myszy wykazujące ekspresję czerwonego fluoroforu tdTomato są oznaczone jako tdTomatomembr (mT), a myszy z ekspresją EGFP, po wycięciu genu tdTomato są oznaczone jakoEGFP membr (mG).
Myszy mają pięć par gruczołów sutkowych po obu stronach brzusznej linii środkowej, trzy w okolicy piersiowej (ponumerowane 1-3) i dwie w okolicy pachwinowej (ponumerowane 4-5) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). W przypadku ISMic gruczoły pachwinowe są najbardziej dostępne i najłatwiejsze do ustabilizowania, ponieważ znajdują się najdalej od globalnych ruchów związanych z oddychaniem i biciem serca w klatce piersiowej.

<table><tbody><tr><td>488 laser</td><td>Melles-Griot-CW</td><td></td><td>&nbsp; laser 50 mW</td></tr><tr><td>60x PLAPON obiektyw zanurzeniowy olejek (NA 1.42)</td><td>Olympus</td><td>1-U2B933</td><td>Soczewka Mikroskop konfokalny</td></tr><tr><td>633 laser</td><td>Melles-Griot-CW</td><td></td> <td>He-Ne laser 12 mW</td></tr><tr><td>Obiektyw 63x (NA 1.40, HC PL APO CS2)</td><td>Obiektyw Leica</td><td>11506350</td><td>Mikroskop dwufotonowy</td></tr><tr><td>BA 410-460 nm</td><td>Chroma</td><td>-</td><td>Filtr pasmowo-przepustowy</td></tr><tr><td>BA 495-540 nm</td> <td>Filtr pasmowo-przepustowy</td><td></td> <td>Chroma-Band-pass</td></tr> <tr><td>BA 505-605 nm</td> Filtr pasmowo-przepustowy <td></td><td></td><td>Chroma-Band-pass</td></tr><tr><td>BA 655-755 nm</td><td>Filtr</td> <td>pasmowo-borowo-dipirometanowy</td><td></td></tr> <tr><td>(BODIPY) 665/676</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B3932</td><td>Czujnik peroksyjacji lipidów</td></tr><tr><td>Carbomer-940</td><td>Farma zasp śnieżnych</td><td>739601480651</td><td>Cewnik żelowy</td></tr><tr><td></td><td>Terumo</td><td>SV27EL</td><td>Zestawy infuzyjne ze skrzydłami&nbsp;</td></tr><tr><td>Kauteryzator&nbsp;</td><td>Braintree Scientific, Inc</td><td>GEM 5917</td><td>System kauteryzacji</td></tr><tr><td>Mysz CMV-Cre&nbsp;</td><td>Jackson lab</td><td>006054</td><td>Linia myszy</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>Bioptechs-Średnica</td><td></td> <td>30 mm warga nakrywkowa do mikroskopu odwróconego</td></tr><tr><td>Curity 4x4 calowa uniwersalna gaza gąbkowa</td><td>Covidien</td><td>9024</td><td>Gąbka</td></tr><tr><td>EGFPcyto mysz</td><td>Jackson lab</td><td>003291</td><td>Linia myszy</td></tr><tr><td>Fidżi / ImageJ Oprogramowanie</td><td>Open source-Darmowe</td><td></td> <td>narzędzie programowe</td></tr><tr><td>Kleszcze precyzyjne</td><td>Braintree Scientific, Inc</td><td>FC003 8</td><td>Kleszczyki do tkanek</td></tr><tr><td>Mikroskop Fluoview 1000</td><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td></tr><tr><td>Oprogramowanie FluoView</td><td></td> <td>Mikroskop konfokalny Olympus i mikroskop dwufotonowy</td><td></td></tr> <tr><td>Ręczna elektryczna maszynka do golenia</td><td>Braintree Scientific, Inc</td><td>CLP-8786-451A</td><td>Bezprzewodowa maszynka do strzyżenia</td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>Braintree Scientific, Inc</td><td>DPIP</td><td>Poduszka termiczna dla zwierząt</td></tr><tr><td>Detektory HyD Detektor</td> <td>spektralny Leica-Leica 4Tune</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Oprogramowanie Imaris</td><td>Instrumenty Bitplane / Oxford</td> - <td></td><td>Komercyjne narzędzie programowe</td></tr><tr><td>Przestrajalny laser Ingisht X3 Przestrajalny laser</td> impulsowy <td>Spectra Physics</td><td>Insight X3</td><td>Przestrajalny laser pulsacyjny</td></tr><tr><td>VetOne</td><td></td><td>13985-046-40</td><td>Ketamina znieczulająca</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>VetOne</td><td>13985-702-10</td><td>Znieczulenie</td></tr><tr><td>LAS X Oprogramowanie</td><td>Leica-Dwufotonowy</td><td></td><td></td></tr> mikroskop <tr><td>przestrajalny Przestrajalny laser Mai-Tai</td><td>Fizyka widm</td><td>Mai-Tai</td><td>Laser</td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>Molecular</td> <td>Devices-Komercyjne</td> <td>narzędzie programowe</td></tr><tr><td>Monodansylpentan AUTODOT</td><td>Abcepta</td><td>Sm1000a</td><td>Barwnik kropelkowy lipidów</td></tr><tr><td>MPE-RS mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX70</td><td>Mikroskop dwufotonowy</td></tr><tr><td>mysz mT/mG</td><td>Linia 007676 laboratoryjna Jacksona</td><td></td><td>Linia myszy</td></tr><tr><td>Grzałka obiektywu</td><td>Bioptechs</td><td>150819</td><td>Grzałka obiektywu do mikroskopów konfokalnych i dwufotonowych</td></tr><tr><td>Komora oddechowa nasycona tlenem</td><td>Patterson Scientific</td><td>78933385, SAS3 i EVAC4</td><td>System anestezjologii i ewakuacji gazu&nbsp;</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Heathrow Scientific</td><td>HS234526B</td><td>Półprzezroczysty, elastyczny detektor PMT z folii termoplastycznej</td></tr> <tr><td></td><td></td><td>Olympus-Descanned</td><td>&nbsp; &nbsp; detektory</td></tr><tr><td>Detektor PMT</td><td>Technologia LSM</td><td>Niestandardowe</td><td>detektory bez skanowania</td></tr><tr><td>Pompa</td><td>Aparatura Harvarda</td><td>703602, 704402</td><td>Wtryskiwacz i kontroler nanomitów</td></tr><tr>Jakość<td>soli fizjologicznej</td><td>Biologiczne</td><td>114-055-721EA</td><td>Sól fizjologiczna</td></tr><tr><td>Zwykłe nożyczki Ostre nożyczki z końcami</td><td>Braintree Scientific, Inc</td><td>SCT-S 508</td><td>Nożyczki</td></tr> <tr><td>chirurgiczneStrzykawka</td><td>Covidien</td><td>22-257-150</td><td>Strzykawka tuberkulinowa 1 ml</td></tr><tr><td>TCS SP8 Nurkowanie Mikroskop spektralny</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>Mikroskop dwufotonowy</td></tr><tr><td>Pęseta&nbsp;</td><td>Braintree Scientific, Inc</td><td>FC032</td><td>Kleszczyki do tkanek</td></tr><tr><td>Ksylazyna&nbsp;</td><td>VetOne</td><td>13985-704-10</td><td>Środek znieczulający</td></tr></tbody></table>

mikroskopia subkomórkowa przyżyciowych gruczołu sutkowego

Intravital Subcellular Microscopy of the Mammary Gland

Gruczoł sutkowy stanowi model par excellence do badania funkcji nabłonka, w tym przebudowy tkanek, polaryzacji komórek i mechanizmów wydzielniczych. W czasie ciąży gruczoł rozszerza się z prymitywnego drzewa przewodowego osadzonego w poduszce tłuszczowej do silnie rozgałęzionej sieci pęcherzyków płucnych przygotowanej do tworzenia i wydzielania siary i mleka. Po porodzie gruczoł dostarcza wszystkie składniki odżywcze niezbędne do przeżycia noworodka, w tym kropelki lipidów pokryte błoną (LD), białka, węglowodany, jony i wodę. Różne składniki mleka, w tym laktoza, micele kazeinowe i białka mleka odtłuszczonego, są syntetyzowane w komórkach pęcherzyków płucnych i wydzielane z pęcherzyków przez egzocytozę na powierzchni wierzchołkowej. LD są transportowane z miejsc syntezy w szorstkiej retikulum endoplazmatycznym do wierzchołka komórki, pokryte błonami komórkowymi i wydzielane przez unikalny mechanizm apokrynowy. Inne wstępnie uformowane składniki, w tym przeciwciała i hormony, są transportowane z surowiczej strony nabłonka do mleka przez transcytozę. Procesy te są podatne na mikroskopię przyżyciową, ponieważ gruczoł sutkowy jest gruczołem skórnym, a zatem jest bezpośrednio dostępny do manipulacji eksperymentalnej. W tym artykule opisano łatwą procedurę badania kinetyki wydzielania LD in situ, w czasie rzeczywistym, u żywych znieczulonych myszy. Bor-dipyrrometen (BODIPY) 665/676 lub monodansylpentan są używane do znakowania neutralnej frakcji lipidowej myszy transgenicznych, które albo wyrażają rozpuszczalny EGFP (wzmocnione białko zielonej fluorescencji) w cytoplazmie, albo peptyd ukierunkowany na błonę połączony z EGFP lub tdTomato. Białka fuzyjne znakowane błoną służą jako markery powierzchni komórek, a barwniki lipidowe rozwiązują LD ≥ 0,7 μm. Obrazy poklatkowe można rejestrować za pomocą standardowej laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej do głębokości 15-25 μm lub za pomocą mikroskopii wielofotonowej w celu obrazowania głębiej w tkance. Gruczoł sutkowy może być kąpany w środkach farmakologicznych lub barwnikach fluorescencyjnych przez cały czas trwania operacji, zapewniając platformę do ostrych manipulacji eksperymentalnych w razie potrzeby.

Mleko jest wydzielane przez spolaryzowane komórki nabłonka pęcherzyków mlecznych, które różnicują się podczas ciąży z pąków rozległego drzewa przewodowego26 (Rycyna 2A). Prekursory do syntezy mleka są przyswajane przez błony podstawne/boczne, a gotowe produkty są wydzielane przez powierzchnię apikalną do centralnej „przestrzeni mlecznej”. Strona podstawna każdego pęcherzyka jest pokryta gwieździstym układem komórek mioepitelialnych (Rycyna 2A</str...

Niniejszy protokół opisuje łatwą technikę obrazowania gruczołu sutkowego myszy w okresie laktacji za pomocą skaningu laserowego, mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej.

Mikroskopia subkomórkowa przyżyciowych gruczołu sutkowego

The mammary gland constitutes a model par excellence for investigating epithelial functions, including tissue remodeling, cell polarity, and secretory ...

Na początek umieść ogoloną, znieczuloną mysz na podkładce rozgrzewającej. Ściśnij skórę pęsetą w pobliżu czwartego sutka i przetnij uniesioną skórę ostrymi nożyczkami, aby wykonać nacięcie w linii środkowej o długości około jednego centymetra. Wykonaj okrągłe nacięcia wokół gruczołu zarówno w kierunku czaszkowym, jak i ogonowym i ostrożnie oderwij skórę od brzucha.Natychmiast usuń egzogenną krew za pomocą soli fizjologicznej, aby uniknąć późniejszej utraty rozdzielczości optycznej. Aby zminimalizować utratę krwi, uszczelnij wszelkie widoczne naczynia krwionośne ręcznym kauteryzatorem. Następnie delikatnie przetrzyj warstwę powierzchniową cienkimi kleszkami, aby usunąć powierzchowną tkankę łączną i tłuszczową.Utrzymuj odsłonięty gruczoł w wilgoci z solą fizjologiczną. W razie potrzeby należy potraktować gruczoł środkami egzogennymi, na przykład środkami farmakologicznymi lub barwnikami specyficznymi dla organelli, kąpiąc odsłonięte gruczoły podczas operacji. Chroń ścianę brzucha półprzezroczystą, elastyczną folią termoplastyczną.Ostrożnie ustaw mysz brzuszkiem do dołu na odwróconym stoliku mikroskopu, tak aby płat skóry wystawał na środkową szybę nakrywkową. Zabezpiecz odsłonięte mi

intravital-subcellular-microscopy-of-the-mammary-gland

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie poklatkowe służy do oceny zachowania pierwotnych komórek nabłonka sutka preneoplastycznego pochodzących z genetycznie modyfikowanych mysich modeli ryzyka raka piersi w celu określenia, czy istnieją korelacje między określonymi parametrami behawioralnymi a odrębnymi zmianami genetycznymi.

Obrazowanie poklatkowe pierwotnych przednowotworowych komórek nabłonka sutka pochodzących z genetycznie zmodyfikowanych mysich modeli raka piersi

Mikroskopia przyżyciowe to potężne narzędzie, które umożliwia obrazowanie różnych procesów biologicznych u żywych zwierząt. W tym artykule przedstawiamy szczegółową metodę obrazowania dynamiki struktur subkomórkowych, takich jak ziarnistości wydzielnicze, w gruczołach ślinowych żywych myszy.

Mikroskopia przyżyteczna do obrazowania struktur subkomórkowych u żywych myszy wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych

Opisano protokół nieinwazyjnego wewnątrzprzewodowego dostarczania wodnych odczynników do gruczołu sutkowego myszy. Metoda wykorzystuje miejscowe wstrzyknięcie do sutków gruczołów sutkowych, celując konkretnie w przewody sutkowe. Technika ta można dostosować do różnych związków, w tym siRNA, chemioterapeutyków i małych cząsteczek.

Wstrzyknięcie doprzewodowe w celu miejscowego dostarczania leku do mysiego gruczołu sutkowego

Protokół immunofluorescencji pośredniej opisany w tym artykule pozwala na wykrywanie i lokalizację białek w gruczole sutkowym myszy. Podano kompletną metodę przygotowania próbek gruczołu mlecznego, przeprowadzenia immunohistochemii, obrazowania skrawków tkanek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz rekonstrukcji obrazów.

Immunofluorescencja pośrednia na zamrożonych odcinkach mysiego gruczołu sutkowego

Ten protokół opisuje użycie mikroskopii wielofotonowej do wykonywania rozszerzonego obrazowania poklatkowego interakcji wielokomórkowych w czasie rzeczywistym, in vivo w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Rozszerzone poklatkowe obrazowanie przyżyciowe dynamiki wielokomórkowej w czasie rzeczywistym w mikrośrodowisku guza

Tutaj opisujemy technikę miejscowego dostarczania odczynników do gruczołu sutkowego królika poprzez wstrzyknięcie doprzewodowe. Dodatkowo opisujemy protokół wizualizacji i potwierdzenia porodu za pomocą wysokorozdzielczego obrazowania ultrasonograficznego środków kontrastowych.

Dostarczanie wewnątrzprzewodowe do gruczołu sutkowego królika

Tutaj prezentujemy protokół izolacji całych, nienaruszonych gruczołów sutkowych myszy w celu zbadania ekspresji macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i morfologii przewodowej. Gruczoły brzuszne myszy #4 wyekstrahowano od 8-10 tygodniowych samic myszy nieródek, utrwalono w neutralnej buforowanej formalinie, pocięto i wybarwiono przy użyciu immunohistochemii białek ECM.

Izolacja nienaruszonych, całych gruczołów sutkowych myszy w celu analizy ekspresji macierzy zewnątrzkomórkowej i morfologii gruczołów

Przedstawiono tutaj podejście do długoterminowego obrazowania przyżyciowego za pomocą optycznie przezroczystych, silikonowych okienek, które można przykleić bezpośrednio do tkanki/organu zainteresowania i skóry. Te okna są tańsze i bardziej wszechstronne niż inne obecnie używane w terenie, a chirurgiczne wprowadzenie powoduje ograniczone stany zapalne i stres u zwierząt.

Podłużne obrazowanie przyżyciowe przez przezroczyste okienka silikonowe

Ten protokół opisuje nowatorskie okno obrazowania sutka z wymienną pokrywą (R.MIW). Mikroskopia przyżyciowa po wszczepieniu R.MIW pozwala na podłużne i wielodniowe obrazowanie zdrowego i chorego gruczołu sutkowego z rozdzielczością komórkową na różnych etapach rozwoju.

Podłużna mikroskopia przyżyciowa z wykorzystaniem okienka do obrazowania sutkowego z wymienną pokrywą

Opisana tutaj metoda obrazowania intravital wykorzystuje generowanie drugiej harmonii kolagenu i endogenną fluorescencję z metabolicznego kofaktora NAD(P)H do nieinwazyjnej segmentacji nieoznaczonego mikrośrodowiska guza na przedziały guza, zrębu i naczyń krwionośnych w celu dogłębnej analizy obrazów 4D intravital.

Bezznacznikowe podejście do segmentacji w obrazowaniu przyżyciowym mikrośrodowiska guza sutka

Obecny protokół opisuje doprzewodową iniekcję wektorów wirusowych przez smoczek w celu dostarczenia interesujących genów do komórek nabłonka sutka.

In vivo (in vivo) Dostarczanie genów do komórek nabłonka sutka myszy poprzez wstrzyknięcie doprzewodowe sutka

Poznaj technikę obrazowania subkomórkowego gruczołu sutkowego myszy w czasie laktacji przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej. Metoda umożliwia wizualizację dynamiki kropli lipidów w komórkach nabłonkowych in vivo.

Mikroskopia subkomórkowa przyżyciowych gruczołu sutkowego

Przeglądaj więcej filmów