Name: Zewnątrzkomórkowy zubożenie glukozy jako pośrednia miara wychwytu glukozy w komórkach i tkankach ex vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Poznaj metodę zewnątrzkomórkowego pomiaru pobierania glukozy w komórkach 3T3-L1 i tkankach ex vivo. Technika ta umożliwia badanie kinetyki metabolicznej w odpowiedzi na składniki odżywcze i leki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Projekt był wspierany przez Ralph and Marian Falk Medical Research Catalyst Award oraz Kathleen Kelly Award. Inne wsparcie obejmowało Narodowe Centrum Zasobów Badawczych UL1RR025755 i NCI P30CA16058 (OSUCCC), Mapę drogową NIH dla badań medycznych. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie reprezentują one oficjalnych poglądów Narodowego Centrum Zasobów Badawczych ani NIH.

Badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Stanowego Ohio (OSU, protokół 2007A0262-R4).
UWAGA: Wszystkie procedury muszą być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II, przy włączonej dmuchawie i zgaszonym świetle.
1. Przygotowanie materiałów
UWAGA: Wszystkie materiały są wymienione w Tabeli Materiałów.
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę 1, pożywkę wirującą 2 oraz roztwory do przechowywania i robocze fluorescencyjnego 2-deoksy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoksadiazol-4-ylo)amino]-D-glukozy (2-NBDG lub FD-glukozy) zgodnie z tabelą 1 w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II. Chroń FD-glucose przed światłem przez cały czas trwania eksperymentu, wyłączając wszystkie światła pod maską.</li>
	<li>Używaj gotowych do użycia odczynników do hodowli komórkowych: Trypsyna-EDTA, sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) oraz bezglukozowa i pozbawiona czerwieni fenolowej pożywka Dulbecco's Modified Eagle Medium (zwana dalej DMEM bez glukozy).</li>
	<li>Użyj 20 ml buforu do lizy testu radioimmunoprecypitacji (RIPA). 
	UWAGA: W poniższych sekcjach porównano zubożenie zewnątrzkomórkowe i wewnątrzkomórkowy wychwyt różnych dawek FD-glukozy w fibroblastach 3T3-L1 ze stymulacją insuliny i bez niej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2).</li>
</ol>
2. Hodowla i utrzymanie komórek 3T3-L1
<ol>
	<li>Hodowla mysich fibroblastów 3T3-L1 przez posiew 1 x 106 komórek rozcieńczonych w 20 ml pożywki 1 na dwóch 96-dołkowych płytkach. Na dołek należy podać 100 μl zawiesiny komórek, zapewniając utrzymanie jednorodności tej zawiesiny przez mieszanie. Hoduj komórki przez 48 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C (5%CO2 i 95% wilgotności) bez zmiany pożywki do około 70%-80% zgryzu.</li>
	<li>Utrzymuj komórki zlewające się i na czczo, hodując je w tym samym podłożu przez 48 godzin. Zmieniaj czas inkubacji od 24 do 72 godzin w zależności od pożądanego stanu katabolicznego na czczo.</li>
</ol>
3. Głód komórek 3T3-L1
<ol>
	<li>Dekantacja pożywki z komórek w płytkach 96-dołkowych. Wchłonąć pozostały płyn za pomocą sterylnych ręczników papierowych.</li>
	<li>Opłucz 96-dołkową płytkę 100 μl PBS na studzienkę i wchłonij pozostały płyn sterylnymi ręcznikami papierowymi.</li>
	<li>Dodać 100 μl bezglukozowego DMEM do dołka i inkubować przez 40 minut. Dostosuj czas inkubacji w zależności od typu komórki, bodźców i pożądanego poziomu postu. 
	UWAGA: Czas inkubacji może wymagać optymalizacji w zależności od pory roku.</li>
</ol>
4. Przygotowanie roztworów FD-glucose o różnych stężeniach
UWAGA: Eksperyment w Rysunek 2 bada pożywki zewnątrzkomórkowe i międzykomórkowe ze stymulacją insuliną i bez niej.
<ol>
	<li>Użyć ośmiu powtórzeń (jeden rząd na płytce 96-dołkowej) dla każdego warunku stymulacji. W związku z tym należy przygotować 1 ml dla każdego warunku stymulacji (określonego w Tabeli 2 i poniżej).</li>
	<li>Użyj ośmiu warunków stymulacji bez insuliny: FD-glukoza 2,5 μg/ml, 1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 0,2 μg/ml, 0,1 μg/mL, 0,05 μg/ml i 0 μg/ml (kontrola bez FD-glukozy) na jednej 96-dołkowej płytce.</li>
	<li>Użyj ośmiu warunków stymulacji insuliną (10 μg/ml, stężenie końcowe): FD-glukoza 2,5 μg/mL, 1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 0,2 μg/mL, 0,1 μg/mL, 0,05 μg/ml i 0 μg/ml (kontrola bez FD-glukozy) na innej 96-dołkowej płytce.</li>
	<li>Aby przygotować warunki stymulacji, rozcieńczyć 1 μl roztworu roboczego FD-glukozy o stężeniu 5 mg/ml (Tabela 1) w 999 μl DMEM bez glukozy, aby otrzymać 1 ml roboczego roztworu podstawowego (rozcieńczenie 1:1000 lub 5 μg/ml).
	<ol>
		<li>Korzystając z tego roboczego roztworu podstawowego, przygotuj 1:2000, 1:5000, 1:10 000, 1:25 000, 1:50 000 i 1:100 000 rozcieńczenia FD-glukozy w celu uzyskania 2,5 μg / ml, 1 μg / ml, 0,5 μg / ml, 0,2 μg / mL, 0,1 μg / ml i 0,05 μg / ml (Tabela 2) w probówkach o pojemności 2 ml bezpośrednio przed eksperymentami w komorze bezpieczeństwa biologicznego bez świateł.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórzyć krok 4.4 i dodać 1 μl insuliny (10 mg/ml, stężenie końcowe) do każdego z warunków określonych powyżej. 
	UWAGA: Końcowe stężenie insuliny w tych próbkach wynosi 10 μg/ml = 1,7 nmol/ml. Aby uzyskać homogenizację, dodaj insulinę do probówek przed dodaniem innych roztworów.</li>
</ol>
5. Leczenie wygłodzonych komórek 3T3-L1
<ol>
	<li>Po 40 minutach inkubacji zdekantować wolny od glukozy DMEM z każdej studzienki na 96-dołkowe płytki i wchłonąć pozostały płyn sterylnymi ręcznikami papierowymi.</li>
	<li>Dodać po 100 μl (na studzienkę) z różnych warunków uzdatniania opisanych powyżej do studzienek wzdłuż jednej kolumny i 100 μl (na studzienkę) z tego samego stanu uzdatniania do studzienek wzdłuż rzędu (osiem powtórzeń) w obu płytkach 96-dołkowych. Oznacz płytki, na których wykorzystano warunki, z insuliną i bez insuliny. Dodać sam DMEM bez glukozy do studzienek kontrolnych (n = 8).</li>
	<li>Inkubować płytkę przez 40 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 i 95% wilgotności) w ciemności.</li>
</ol>
6. Pomiary zewnątrzkomórkowe i międzykomórkowe dla stymulowanych komórek 3T3-L1
<ol>
	<li>Po stymulacji komórek przez 40 minut, przenieś pożywkę stymulacyjną z obu płytek na nowe 96-dołkowe płytki, zachowując ten sam układ eksperymentalny.</li>
	<li>Zdekantować pozostały roztwór z oryginalnie stymulowanych 96-dołkowych płytek z komórkami na sterylnych ręcznikach papierowych.</li>
	<li>Opcjonalnie umyj komórki PBS. Usuń PBS i zdekantuj pozostały roztwór na sterylnych ręcznikach papierowych.</li>
	<li>Dodać 100 μl buforu do lizy RIPA do każdej studzienki. Opcjonalnie dodaj inhibitor proteazy do buforu RIPA w celu ochrony białek. Umieść płytki zawierające RIPA w shakerze na 30 minut.</li>
	<li>Za pomocą czytnika mikropłytek (tabela materiałów) zmierz fluorescencję przy długościach fal wzbudzenia (Ex) i emisji (Em) odpowiednio 485 i 535 nm, najpierw w pożywce zawierającej zewnątrzkomórkową FD-glukozę, a następnie na płytce z komórkami zmielonymi lizą RIPA pod koniec 30-minutowej inkubacji (patrz krok 6.4).</li>
</ol>
7. Wewnątrzkomórkowy wychwyt glukozy oparty na białku
UWAGA: Wewnątrzkomórkowy wychwyt glukozy FD zależy od liczby komórek. Poziomy białka w lizatach komórkowych są proporcjonalne do liczby komórek, które pozwalają na normalizację wewnątrzkomórkowego poziomu glukozy FD do liczby komórek w każdym dołku.
<ol>
	<li>Wykonaj test białka BCA zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów). Określić ilościowo stężenia białka w każdym studzience zawierającej komórki poddane lizie RIPA.</li>
	<li>Użyj 10 μl homogenatu RIPA i zmierz stężenia białka w trzech powtórzeniach, aby zwiększyć dokładność pomiarów na płytkach 96-dołkowych.</li>
	<li>Określ ilościowo białko na podstawie wzorców białka (0, 10, 20, 30, 40, 50 i 60 μg/ml białka) analizowanych razem z próbkami na każdej 96-dołkowej płytce.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję przy długości fali 562 nm i określić ilościowo stężenia białka w każdej próbce na podstawie wzoru na regresję liniową otrzymanego dla wzorca białka.</li>
	<li>Normalizuj poziomy wewnątrzkomórkowej FD-glukozy, używając wartości fluorescencyjnej/stężenia białka w każdym dołku. Zewnątrzkomórkowy ubytek glukozy FD nie wymaga normalizacji.</li>
	<li>Opcjonalnie należy użyć średnich wartości wyjściowych w próbkach kontrolnych w celu dodatkowej normalizacji (100%).</li>
</ol>
8. Pomiar ex vivo zewnątrzkomórkowego wyczerpania glukozy FD w narządach
<ol>
	<li>Wstępnie potraktuj myszy związkami stymulującymi metabolizm glukozy przed rozwarstwieniem narządu, w następujący sposób.</li>
	<li>Użyj dziewięciotygodniowych samców myszy Lepob (n = 11). Przed eksperymentem nakarm wszystkie myszy regularną dietą żywieniową.</li>
	<li>Losowo przypisz myszy do trzech grup do wstrzyknięć dootrzewnowych (i.p.).
	<ol>
		<li>Myszy z grupy kontrolnej Lepob należy wstrzyknąć 0,1 ml sterylnego PBS (n = 4).</li>
		<li>Myszom z grupy insuliny Lepob wstrzyknąć 0,1 ml sterylnego PBS, zawierającego 12 j.m. insuliny ludzkiej na gram masy ciała (BW) (n = 3).</li>
		<li>Wstrzyknąć myszom z grupy AAC2 Lepob 0,1 ml sterylnego PBS, zawierającego 0,1 nmol AAC2 na gram masy ciała (BW) (n = 4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po 15 minutach poddaj myszy inhalacji 5% izofluranu i krwi wykrwawiającej przez nakłucie serca od znieczulonych zwierząt26.</li>
	<li>Wypreparuj trzewną, nakdydimalną białą tkankę tłuszczową (200 mg), wątrobę (200 mg) i cały mózg każdego zwierzęcia. Do obchodzenia się z tkankami należy używać kaptura bezpieczeństwa biologicznego klasy II.</li>
	<li>Przygotować roztwór roboczy FD-glucose (0,29 mM) w bezglukozowym DMEM w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II bez światła.</li>
	<li>Zmierzyć fluorescencję roztworu roboczego FD-glukozy (0,29 mM) przy długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 485 i 535 nm za pomocą czytnika mikropłytek.</li>
	<li>Inkubować pobrane tkanki/narządy na 6-dołkowej płytce zawierającej PBS przez 1 minutę. Każdą tkankę lub narząd należy umieścić w oddzielnym dołku.</li>
	<li>Po 1 minucie umieść każdą chusteczkę na sterylnym ręczniku papierowym, aby wchłonął PBS. Przenieś tkanki/narządy na oddzielną 6-dołkową płytkę zawierającą 4 000 μl bezglukozowego DMEM i inkubuj przez 2 minuty.</li>
	<li>Po 2 minutach wyjąć i przenieść tkanki do studzienek 6-dołkowej płytki zawierającej 0,29 mM roztworu roboczego FD-glukozy (1 ml / dołek). Inkubować 6-dołkowe płytki zawierające tkanki w roztworze roboczym FD-glukozy w temperaturze 37 °C (5% CO2 i 95% wilgotności).</li>
	<li>Zebrać 100 μl roztworu roboczego FD-glukozy z każdego dołka po 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 i 120 minutach inkubacji, aby przeanalizować kinetykę zewnątrzkomórkowego wyczerpania glukozy FD. Wstrząsnąć przed i po pobraniu.</li>
	<li>Przenieść 100 μl roztworu roboczego FD-glukozy do 96-dołkowych płytek w celu zmierzenia fluorescencji przy długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 485 i 535 nm, za pomocą czytnika mikropłytek.</li>
	<li>Znormalizuj fluorescencję do wartości 0 min (100%) dla każdego narządu u każdego zwierzęcia (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
</ol>

<ol><li>Kyrtata, N., Emsley, H. C. A., Sparasci, O., Parkes, L. M., Dickie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+review+of+glucose+transport+alterations+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A systematic review of glucose transport alterations in Alzheimer's disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 568(2021).</li>
<li>Garcia-Carbonell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+glucose+metabolism+in+rheumatoid+arthritis+fibroblast-like+synoviocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Critical role of glucose metabolism in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes.</a> Arthritis Rheumatology. 68 (7), 1614-1626 (2016).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+diabetes+mellitus+associated+with+mortality+and+severity+of+COVID-19%3F+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+%26+Metabolic+Syndrome%3A+Clinical+Research+%26+Review%22%5BJournal%5D)">Is diabetes mellitus associated with mortality and severity of COVID-19? A meta-analysis.</a> Diabetes & Metabolic Syndrome: Clinical Research & Review. 14 (4), 535-545 (2020).</li>
<li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+prognostic+impact+of+glucose+uptake+in+visceral+adipose+tissue+according+to+sex+in+patients+with+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Different prognostic impact of glucose uptake in visceral adipose tissue according to sex in patients with colorectal cancer.</a> Scientific Reports. 11 (1), 21556(2021).</li>
<li>Miner, M. W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of%3A+%282S%2C4R%29-4-%5B%2818%29F%5DFluoroglutamine%2C+%5B%2811%29C%5DMethionine%2C+and+2-Deoxy-2-%5B%2818%29F%5DFluoro-D-Glucose+and+two+small-animal+PET%2FCT+systems+imaging+rat+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Comparison of: (2S,4R)-4-[(18)F]Fluoroglutamine, [(11)C]Methionine, and 2-Deoxy-2-[(18)F]Fluoro-D-Glucose and two small-animal PET/CT systems imaging rat gliomas.</a> Frontiers in Oncology. 11 (18), 730358(2021).</li>
<li>Gumbiner, B., Thorburn, A. W., Ditzler, T. M., Bulacan, F., Henry, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+impaired+intracellular+glucose+metabolism+in+the+insulin+resistance+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Role of impaired intracellular glucose metabolism in the insulin resistance of aging.</a> Metabolism. 41 (10), 1115-1121 (1992).</li>
<li>Ebrahimi, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+cell+identity+changes+with+mild+hyperglycemia%3A+Implications+for+function%2C+growth%2C+and+vulnerability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Beta cell identity changes with mild hyperglycemia: Implications for function, growth, and vulnerability.</a> Molecular Metabolism. 35, 100959(2020).</li>
<li>Ruberto, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KLF10+integrates+circadian+timing+and+sugar+signaling+to+coordinate+hepatic+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">KLF10 integrates circadian timing and sugar signaling to coordinate hepatic metabolism.</a> Elife. 10, 65574(2021).</li>
<li>Stocks, B., Zierath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications%3A+The+signals+at+the+intersection+of+exercise%2C+glucose+uptake%2C+and+insulin+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications: The signals at the intersection of exercise, glucose uptake, and insulin sensitivity.</a> Endocrinology Reviews. , (2021).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+report+on+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Global report on diabetes.</a> World Health Organization. , (2016).</li>
<li>Kolb, H., Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental%2Flifestyle+factors+in+the+pathogenesis+and+prevention+of+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medicine%22%5BJournal%5D)">Environmental/lifestyle factors in the pathogenesis and prevention of type 2 diabetes.</a> BMC Medicine. 15 (1), 131(2017).</li>
<li>Galicia-Garcia, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of type 2 diabetes mellitus.</a> International Journal of Molecular Science. 21 (17), 6275(2020).</li>
<li>Petrov, M. S., Basina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIAGNOSIS+OF+ENDOCRINE+DISEASE%3A+Diagnosing+and+classifying+diabetes+in+diseases+of+the+exocrine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">DIAGNOSIS OF ENDOCRINE DISEASE: Diagnosing and classifying diabetes in diseases of the exocrine pancreas.</a> European Journal of Endocrinology. 184 (4), 151-163 (2021).</li>
<li>Sirdah, M. M., Reading, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+predisposition+in+type+2+diabetes%3A+A+promising+approach+toward+a+personalized+management+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic predisposition in type 2 diabetes: A promising approach toward a personalized management of diabetes.</a> Clinical Genetics. 98 (6), 525-547 (2020).</li>
<li>Ramos-Lopez, O., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Martinez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+signatures+underlying+inflammation%3A+an+interplay+of+nutrition%2C+physical+activity%2C+metabolic+diseases%2C+and+environmental+factors+for+personalized+nutrition%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">Epigenetic signatures underlying inflammation: an interplay of nutrition, physical activity, metabolic diseases, and environmental factors for personalized nutrition.</a> Inflammation Research. 70 (1), 29-49 (2021).</li>
<li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+glucose+uptake+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Measurement of glucose uptake in cultured cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. 71 (1), 12-14 (2015).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+and+simple+HPLC-FLD-based+method+for+the+measurement+of+intracellular+glucose+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A sensitive and simple HPLC-FLD-based method for the measurement of intracellular glucose uptake.</a> Food Chemistry. 372, 131218(2021).</li>
<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid-based+compound+activates+atypical+PKC+and+leptin+receptor+pathways+to+improve+glycemia+and+anxiety+like+behavior+in+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Amino acid-based compound activates atypical PKC and leptin receptor pathways to improve glycemia and anxiety like behavior in diabetic mice.</a> Biomaterials. 239, 119839(2020).</li>
<li>Shukla, S. K., Mulder, S. E., Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-mediated+in+vivo+tumor+glucose+uptake+measurement+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-mediated in vivo tumor glucose uptake measurement and analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1742, 107-113 (2018).</li>
<li>Jakson, I., Ujvari, D., Brusell Gidlof, S., Linden Hirschberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+regulation+of+solute+carrier+family+2+member+1+%28glucose+transporter+1%29+expression+and+glucose+uptake+in+decidualizing+human+endometrial+stromal+cells%3A+an+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biology+and+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Insulin regulation of solute carrier family 2 member 1 (glucose transporter 1) expression and glucose uptake in decidualizing human endometrial stromal cells: an in vitro study.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 18 (1), 117(2020).</li>
<li>Saparbaev, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+quantification+of+any+isoforms+of+carbohydrates+by+2D+UV-MS+fingerprinting+of+cold+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification and quantification of any isoforms of carbohydrates by 2D UV-MS fingerprinting of cold ions.</a> Analytical Chemistry. 92 (21), 14624-14632 (2020).</li>
<li>Schulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+metabolomics+of+pellicle+and+saliva+in+children+with+different+caries+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Targeted metabolomics of pellicle and saliva in children with different caries activity.</a> Scientific Reports. 10 (1), 697(2020).</li>
<li>Shulman, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+studies+of+glucose+metabolism+in+non-insulin-dependent+diabetes+mellitus+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance studies of glucose metabolism in non-insulin-dependent diabetes mellitus subjects.</a> Molecular Medicine. 2 (5), 533-540 (1996).</li>
<li>Cochran, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+PET+imaging+with+%5B%2818%29F%5DFDG+to+explain+improved+glucose+uptake+in+an+apolipoprotein+A-I+treated+mouse+model+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">In vivo PET imaging with [(18)F]FDG to explain improved glucose uptake in an apolipoprotein A-I treated mouse model of diabetes.</a> Diabetologia. 59 (18), 1977-1984 (2016).</li>
<li>Lloyd, P. G., Hardin, C. D., Sturek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+glucose+transport+in+single+vascular+smooth+muscle+cells+with+a+fluorescent+glucose+analog%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Research%22%5BJournal%5D)">Examining glucose transport in single vascular smooth muscle cells with a fluorescent glucose analog.</a> Physiological Research. 48 (6), 401-410 (1999).</li>
<li>Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drawing+blood+from+rats+through+the+saphenous+vein+and+by+cardiac+puncture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Drawing blood from rats through the saphenous vein and by cardiac puncture.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e266(2007).</li>
<li>DiSilvestro, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+production+by+encapsulated+adipocytes+increases+brown+fat%2C+decreases+resistin%2C+and+improves+glucose+intolerance+in+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Leptin production by encapsulated adipocytes increases brown fat, decreases resistin, and improves glucose intolerance in obese mice.</a> PLoS One. 11 (4), 0153198(2016).</li>
<li>Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptin+and+the+endocrine+control+of+energy+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Leptin and the endocrine control of energy balance.</a> Nature Metabolism. 1 (8), 754-764 (2019).</li>
<li>Guillam, M. T., Burcelin, R., Thorens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+hepatic+glucose+production+in+the+absence+of+GLUT2+reveals+an+alternative+pathway+for+glucose+release+from+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Normal hepatic glucose production in the absence of GLUT2 reveals an alternative pathway for glucose release from hepatocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (21), USA. 12317-12321 (1998).</li>
<li>Guillam, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+diabetes+and+abnormal+postnatal+pancreatic+islet+development+in+mice+lacking+Glut-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Early diabetes and abnormal postnatal pancreatic islet development in mice lacking Glut-2.</a> Nature Genetics. 17 (3), 327-330 (1997).</li>
<li>Barros, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+validation+of+6-NBDG+as+a+probe+for+the+glucose+transporter+GLUT1+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetic validation of 6-NBDG as a probe for the glucose transporter GLUT1 in astrocytes.</a> Journal of Neurochemistry. 109, 94-100 (2009).</li>
<li>Sprinz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+blood+glucose+level+on+18F-FDG+uptake+for+PET%2FCT+in+normal+organs%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effects of blood glucose level on 18F-FDG uptake for PET/CT in normal organs: A systematic review.</a> PLoS One. 13 (2), 0193140(2018).</li>
<li>Johnson, T. V., Martin, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+an+adult+retinal+explant+organotypic+tissue+culture+system+as+an+in+vitro+intraocular+stem+cell+transplantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (8), 3503-3512 (2008).</li>
<li>de Urquiza, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Docosahexaenoic+acid%2C+a+ligand+for+the+retinoid+X+receptor+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Docosahexaenoic acid, a ligand for the retinoid X receptor in mouse brain.</a> Science. 290 (5499), 2140-2144 (2000).</li>
<li>Olson, A. L., Pessin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function%2C+and+regulation+of+the+mammalian+facilitative+glucose+transporter+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Structure, function, and regulation of the mammalian facilitative glucose transporter gene family.</a> Annual Review of Nutrition. 16 (1), 235-256 (1996).</li>
<li>Muhanna, D., Arnipalli, S. R., Kumar, S. B., Ziouzenkova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmotic+adaptation+by+Na%28%2B%29-dependent+transporters+and+ACE2%3A+correlation+with+hemostatic+crisis+in+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Osmotic adaptation by Na(+)-dependent transporters and ACE2: correlation with hemostatic crisis in COVID-19.</a> Biomedicines. 8 (11), 460(2020).</li>
<li>Ligasova, A., Koberna, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+dyes-highly+sensitive+reporters+of+cell+quantification%3A+comparison+with+other+cell+quantification+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">DNA dyes-highly sensitive reporters of cell quantification: comparison with other cell quantification methods.</a> Molecules. 26 (18), 5515(2021).</li>
<li>DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+clamp+technique%3A+a+method+for+quantifying+insulin+secretion+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance.</a> American Journal of Physiology. 237 (3), 214-223 (1979).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych problemów do ujawnienia i nie mają konfliktu interesów.

Bezpośrednie porównanie zewnątrzkomórkowego wyczerpania glukozy FD ze znormalizowanym wewnątrzkomórkowym wychwytem glukozy w hodowli komórkowej wykazało wysoką korelację, co sugeruje, że zewnątrzkomórkowe wyczerpanie glukozy może być zastępczym pomiarem do oceny wychwytu glukozy. Pomiar zewnątrzkomórkowej FD-glukozy może wykorzystywać szeroki zakres stężeń glukozy FD, również 0,5-2,5 μg FD-glukozy/ml wydaje się zapewniać optymalny zakres. Zewnątrzkomórkowa FD-glukoza nie wymaga normalizacji liczby komórek lub stężeń biał...

Zapotrzebowanie na pomiar wychwytu glukozy rośnie wraz z krytyczną potrzebą rozwiązania problemu epidemicznego wzrostu wielu chorób zależnych od metabolizmu glukozy. Mechanizmy leżące u podstaw zwyrodnieniowych chorób metabolicznych, zaburzeń neurologicznych i poznawczych1, zapalne2 i choroby zakaźne3, cancer4,5, a także aging6, zależą od metabolizmu glukozy w celu uzyskania energii i jej magazynowania, procesów anabolicznych, modyfikacji białek i genów, sygnalizacji, regulacji genów i syntezy kwasów nukleinowych oraz replication7,8,9. Cukrzyca (DM) jest bezpośrednio związana z nieprawidłową regulacją wychwytu glukozy. Cukrzyca to spektrum chorób przewlekłych, takich jak cukrzyca typu 1, -2 i -3, cukrzyca ciążowa, cukrzyca wieku dojrzałego u dzieci i inne rodzaje tej choroby wywołane czynnikami środowiskowymi i/lub genetycznymi. W 2016 r. pierwszy globalny raport WHO na temat cukrzycy wykazał, że liczba dorosłych żyjących z najbardziej rozpowszechnioną cukrzycą wzrosła prawie czterokrotnie od 1980 r. do 422 milionów dorosłych10, a liczba pacjentów z cukrzycą rośnie wykładniczo w ciągu ostatnich kilku dekad. Szacuje się, że tylko w 2019 roku 1,5 miliona zgonów było bezpośrednio spowodowanych przez DM10. Ten dramatyczny wzrost jest spowodowany wzrostem cukrzycy typu 2 i warunkami, które go napędzają, w tym nadwagą i otyłością10. Pandemia COVID-19 ujawniła dwukrotny wzrost śmiertelności u pacjentów z cukrzycą w porównaniu z populacją ogólną, co sugeruje głęboką, ale słabo poznaną rolę metabolizmu glukozy w obronie immunologicznej3. Profilaktyka, wczesna diagnoza i leczenie cukrzycy, otyłości i innych chorób wymagają optymalizacji pomiarów wychwytu glukozy przez różne tkanki oraz identyfikacji czynników środowiskowych11, nutritional12, endocrine13, genetic14 oraz epigenetic15 czynników wpływających na wychwyt glukozy.
W badaniach, wewnątrzkomórkowy i/lub tkankowy wychwyt glukozy jest zwykle mierzony za pomocą fluorescencyjnie znakowanej glukozy (FD-glukozy) in vitro16,17,18 i in vivo19. FD-glucose stała się preferowaną metodą w porównaniu z bardziej precyzyjnymi metodami wykorzystującymi radioaktywnie znakowaną glukozę20, analityczna spektroskopia mas analysis21, metabolomics22, metody magnetycznego rezonansu jądrowego23, oraz pozytonowa tomografia emisyjna/tomografia komputerowa (PET/CT)5,24. W przeciwieństwie do wychwytu glukozy FD, metody analityczne wymagające większej ilości materiału biologicznego mogą obejmować wieloetapowe przygotowanie próbki, drogie instrumenty i złożoną analizę danych. Skuteczne i niedrogie pomiary wychwytu glukozy FD-glucose w hodowlach komórkowych zostały wykorzystane w eksperymentach potwierdzających słuszność koncepcji i mogą wymagać walidacji innymi metodami.
Podstawą zastosowania FD-glucose do badań nad absorpcją glukozy jest zmniejszony metabolizm glukozy FD w porównaniu do glukozy endogennej 25. Niemniej jednak zarówno endogenna glukoza, jak i FD-glukoza są dynamicznie dystrybuowane we wszystkich przedziałach komórkowych do stosowania w procesach anabolicznych, katabolicznych i sygnalizacyjnych. Podział na przedziały i przetwarzanie zależne od czasu25 FD-glucose zakłócają pomiary fluorescencji i stanowią główne czynniki ograniczające zastosowanie tego testu w wysokoprzepustowych eksperymentach przesiewowych, analizie kinetycznej, hodowli komórkowych 3D, kokulturach i eksperymentach z eksplantatami tkanek. W tym miejscu przedstawiamy dane wykazujące wysoką korelację między zewnątrzkomórkowym zubożeniem FD-glukozy a jej wewnątrzkomórkowym wychwytem, co sugeruje zewnątrzkomórkowe wyczerpanie FD-glukozy jako zastępczy pomiar wewnątrzkomórkowego wychwytu glukozy. Pomiar zewnątrzkomórkowego wyczerpania glukozy zastosowano w celu walidacji specyficznych dla tkanek różnic w wychwytywaniu glukozy u myszy leczonych insuliną i eksperymentalnym lekiem18, aby zapewnić dowód słuszności tej metody.
Obecny protokół opisuje wewnątrzkomórkowe i zewnątrzkomórkowe (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) pomiary wychwytu glukozy FD w komórkach 3T3-L1. Sekcje 1-7 protokołu wyjaśniają hodowlę i wzrost komórek przez 48 godzin; głód komórek, stymulacja i wyjściowe pomiary zewnątrzkomórkowe; oraz pomiary po stymulacji zewnątrzkomórkowej FD-glukozy i wewnątrzkomórkowe pomiary FD-glukozy i białka. Sekcja 8 protokołu opisuje pomiar ex vivo zewnątrzkomórkowego wychwytu FD-glukozy w tkankach wypreparowanych od myszy ob / ob w obecności i bez insuliny i związku aminokwasowego 2 (AAC2) opisanego w innym miejscu18.

<table><tbody><tr><td>Mysie fibroblasty 3T3-L1 ATCC</td><td></td><td>CL-173</td><td>Linia komórkowa</td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki</td><td>Falcon</td><td>353227</td><td>Wyroby z tworzywa sztucznego</td></tr><tr><td>B6. Samce myszy V-Lepob/J Numer</td><td>magazynowy</td><td></td><td>Jackson Laboratory</td> 000632</tr><tr><td>Myszy Modułowy wielomodowy czytnik mikropłytek BioTek Synergy H1 (Fisher Scientific, USA)</td><td>Fisher Scientific, US</td><td>&nbsp; Urządzenie B-SHT</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>Gibco/ThermoFisher</td><td>161790-060</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Surowica cielęca</td><td>Gibco/ThermoFisher</td><td>26010-066</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Inkubator komórkowy</td><td>Forma</td><td>Series II Urządzenie z kurtką wodną</td><td></td></tr><tr><td>Dieta (dieta myszy/szczurów, napromieniowana)</td><td>Envigo</td><td>Teklad LM-485</td><td>Dieta</td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma LifeScience</td><td>D2650-100mL</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco/ThermoFisher</td><td>&nbsp; 11965-092</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-500mL</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Fluorescencyjny 2-deoksy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoksadiazol-4-ylo)amino]-D-glukoza)</td><td>Sigma</td><td>72987-1MG</td><td>Test</td></tr><tr><td>Bez glukozy i bez czerwieni fenolowej DMEM</td><td>Gibco/ThermoFisher</td><td>A14430-01</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Insulina ludzka 10 mg/ml</td><td>MilliporeSigma, Cat N 91077C</td><td>Cat N 91077C</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Izofluran, 5%</td> <td>Henry Schein</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td>Penicylina anestetyczna</td></tr><tr><td>/ streptomycyna (P / S)</td> <td>Gibco / ThermoFisher</td><td>15140-122</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Roztwór buforowany fosforanami</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DA537-500 ml</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Test białka kwasu bicynowego pierce'a (BCA)</td><td>Test ThermoFisher</td><td>Cat N23225</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy do testów radioimmunoimmunoprecypitacyjnych</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-24948</td><td>Test</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,05%)</td><td>Gibco/ThermoFisher</td><td>&nbsp; 25300-054</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr></tbody></table>

zewnątrzkomórkowy zubożenie glukozy jako pośrednia miara wychwytu glukozy w komórkach i tkankach ex vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Trwająca na całym świecie epidemia cukrzycy zwiększa zapotrzebowanie na identyfikację czynników środowiskowych, żywieniowych, endokrynologicznych, genetycznych i epigenetycznych wpływających na wychwyt glukozy. Pomiar fluorescencji wewnątrzkomórkowej jest szeroko stosowaną metodą badania wychwytu glukozy znakowanej fluorescencyjnie (FD-glukozy) w komórkach in vitro lub do obrazowania tkanek zużywających glukozę in vivo. Ten test ocenia wychwyt glukozy w wybranym punkcie czasowym. Analiza wewnątrzkomórkowa zakłada, że metabolizm FD-glukozy jest wolniejszy niż endogennej glukozy, która uczestniczy w reakcjach katabolicznych i anabolicznych oraz sygnalizacji. Jednak dynamiczny metabolizm glukozy zmienia również mechanizmy wychwytu, co wymagałoby pomiarów kinetycznych wychwytu glukozy w odpowiedzi na różne czynniki. W artykule opisano metodę pomiaru zewnątrzkomórkowego wyczerpania glukozy FD-glucose i potwierdzono jej korelację z wewnątrzkomórkowym wychwytem FD-glukozy w komórkach i tkankach ex vivo. Zewnątrzkomórkowe wyczerpanie glukozy może być potencjalnie przydatne w wysokoprzepustowych badaniach kinetycznych i zależnych od dawki, a także w identyfikacji związków o aktywności glikemicznej i ich swoistym dla tkanek działaniu.

Wewnątrzkomórkowy pobór i zewnątrzkomórkowe wyczerpanie glukozy zmierzono w preadipocytach 3T3-L1 w odpowiedzi na różne stężenia FD-glucose (Rysunek 2) z i bez stymulacji insuliną. Rysunek 2A wykazuje zależny od dawki wzrost wewnątrzkomórkowego poboru FD-glucose, który był znacząco zwiększony w obecności insuliny. Towarzyszący temu spadek poziomu zewnątrzkomórkowej FD-glucose w tych samych komórkach przedstawiono na Rysunku 2B, gdzi...

Zewnątrzkomórkowe wyczerpanie fluorescencyjnie znakowanej glukozy koreluje z wychwytem glukozy i może być wykorzystane do wysokoprzepustowych badań przesiewowych wychwytu glukozy w wyciętych organach i hodowlach komórkowych.

Zewnątrzkomórkowy zubożenie glukozy jako pośrednia miara wychwytu glukozy w komórkach i tkankach ex vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...

Wychwyt glukozy jest kluczem do zrozumienia zdrowia i choroby. Ponieważ glukoza odgrywa kluczową rolę w wymaganiach metabolicznych i strukturalnych w organizmie człowieka, a także odgrywa istotną rolę w regulacji. Zewnątrzkomórkowy pomiar glukozy pozwala na opracowanie wysokoprzepustowych testów kinetyki wychwytu glukozy w komórkach, tkankach i narządach o różnym tle genetycznym w odpowiedzi na składniki odżywcze lub leki.Test ten byłby cennym narzędziem do odkrycia terapii i żywienia w cukrzycy, raku, chorobach zwyrodnieniowych ośrodkowego układu nerwowego, otyłości i wszystkich chorobach glukozy i metabolizmu. Test wymaga dostosowania czasu głodu i stymulacji, które powinny być oparte na specyfice metabolicznej dla różnych tkanek i kultur komórkowych. Hodowla mysich fibroblastów 3T3-L1 przez posiew od 10 do 6 komórek, rozcieńczonych w 20 mililitrach pożywki 1 na 296 dołków.Płytkę 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na studzienkę, zapewniając utrzymanie jednorodności tej zawiesiny przez mieszanie. Hoduj komórki przez 48 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza bez zmiany podłoża, aż do około 70 do 80% zgryzu. Utrzymuj komórki zlewające się i na czczo, hodując je w

extracellular-glucose-depletion-as-an-indirect-measure-glucose-uptake

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film demonstruje test in vitro do pośredniego pomiaru wewnątrzkomórkowego wychwytu glukozy. Test wykorzystuje znakowany fluorescencyjnie analog glukozy w celu ustalenia korelacji między zewnątrzkomórkowym zubożeniem glukozy a wewnątrzkomórkowym wychwytem glukozy.

Test zubożenia glukozy in vitro: oparta na fluorescencji metoda ilościowego określania wychwytu glukozy w komórkach za pomocą zewnątrzkomórkowego pomiaru wyczerpania glukozy

W tym filmie demonstrujemy technikę ex vivo do pomiaru wyczerpania zewnątrzkomórkowego analogu glukozy w pobranych narządach myszy. Polega na inkubacji tkanki myszy w roztworze zawierającym znakowaną fluorescencyjnie deoksyglukozę, która jest pobierana przez komórki. Wychwyt analogu glukozy można pośrednio określić, mierząc fluorescencję inkubowanej pożywki.

Pomiar zubożenia analogu glukozy we fluorescencji zewnątrzkomórkowej: zastępcza technika pomiarowa do oceny wychwytu glukozy w narządach myszy ex vivo

Opisujemy tutaj dokładną, powtarzalną i wygodną biochemiczną metodę miareczkowania glikogenu in vitro. Technika ta wykorzystuje zestaw do oznaczania glikogenu Abcam i opiera się na sukcesywnej hydrolizie glikogenu do glukozy i miareczkowaniu glukozy przez fluorescencję.

Miareczkowanie biochemiczne glikogenu in vitro

Monocyty są integralnymi składnikami ludzkiego wrodzonego układu odpornościowego, który polega na metabolizmie glikolitycznym po aktywacji. Opisujemy protokół cytometrii przepływowej do pomiaru ekspresji transportera glukozy i wychwytu glukozy przez całkowite monocyty i subpopulacje monocytów w świeżej krwi pełnej.

Prosta metoda cytometrii przepływowej do pomiaru wychwytu glukozy i ekspresji transportera glukozy dla subpopulacji monocytów we krwi pełnej

To badanie opisuje protokół, który wykorzystuje obrazowanie 18F-FDG i pozytonowej tomografii emisyjnej/tomografii komputerowej (PET/CT), wraz z modelowaniem kinetycznym, do ilościowego określenia in vivo, w czasie rzeczywistym wychwytu 18F-FDG do tkanek.

Określanie kinetyki metabolizmu glukozy za pomocą 18F-FDG Micro-PET/CT

W tej metodzie, ludzkie pierwotne komórki mięśniowe są hodowane in vitro w celu uzyskania zróżnicowanych miotub, a wskaźniki wychwytu glukozy są mierzone. Zapewniamy szczegółowy protokół do ilościowego określania wskaźników w stanach podstawowych i stymulowanych insuliną przy użyciu znakowanej radioaktywnie [3H] 2-deoksy-D-glukozy.

Pomiar wychwytu glukozy i odpowiedź na stymulację insuliną w ludzkich pierwotnych miotubach in vitro

Ta technika opisuje rejestrowanie w czasie rzeczywistym zużycia tlenu i wskaźników zakwaszenia zewnątrzkomórkowego w eksplantowanych tkankach siatkówki myszy za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.

Pomiar metabolizmu energetycznego w eksplantowanej tkance siatkówki za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego

Nienaruszona regulacja wychwytu glukozy w mięśniach jest ważna dla utrzymania homeostazy glukozy w całym organizmie. Protokół ten przedstawia ocenę wychwytu glukozy stymulowanego insuliną i skurczem w izolowanych i inkubowanych dojrzałych mięśniach szkieletowych przy jednoczesnym określeniu wpływu różnych interwencji fizjologicznych na metabolizm glukozy w całym organizmie.

Pomiar wychwytu glukozy stymulowanego insuliną i skurczem w izolowanych i inkubowanych dojrzałych mięśniach szkieletowych myszy

Wychwyt glukozy jest zwiększony w neuronach ruchowych Drosophila dotkniętych proteinopatią białka wiążącego DNA TAR (TDP-43), na co wskazuje genetycznie kodowany czujnik glukozy oparty na FRET.

Pomiar wychwytu glukozy w modelach proteinopatii TDP-43 u drosophila

Lipoliza triglicerydowa w adipocytach jest ważnym procesem metabolicznym, w wyniku którego uwalniane są wolne kwasy tłuszczowe i glicerol. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół pomiaru podstawowej i stymulowanej lipolizy w adipocytach i tkance tłuszczowej ex vivo od myszy.

Pomiar częstości lipolizy w mysiej tkance tłuszczowej ex vivo i pierwotnych preadipocytach zróżnicowanych in vitro

Wiele typów komórek w siatkówce, w tym komórki śródbłonka, neurony i komórki glejowe, wyrażają transportery glukozy (GLUT), aby umożliwić wychwyt glukozy do komórek. Korzystając z mysiej siatkówki nerwowej ex vivo i fluorescencyjnego analogu glukozy 6-NBDG, opisujemy stosunkowo szybką i niedrogą metodę pomiaru wychwytu glukozy w całej siatkówce myszy.

Pomiar wychwytu analogu glukozy, 6-(N-(7-nitrobenz-2-oksa-1,3-diazol-4-ylo)amino)-6-deoksyglukozy, w nienaruszonej mysiej siatkówce nerwowej

Poznaj metodę zewnątrzkomórkowego pomiaru pobierania glukozy w komórkach 3T3-L1 i tkankach ex vivo. Technika ta umożliwia badanie kinetyki metabolicznej w odpowiedzi na składniki odżywcze i leki.

Zewnątrzkomórkowy zubożenie glukozy jako pośrednia miara wychwytu glukozy w komórkach i tkankach ex vivo

Przeglądaj więcej filmów