Name: In Situ Hybrydyzacja połączona z immunohistochemią w kriosekcji zarodków danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Naucz się metody hybrydyzacji in situ połączonej z immunohistochemią w kriosekcji zarodków Danio rerio. Technika umożliwia jednoczesną detekcję mRNA i białek w badaniach neurobiologii rozwojowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Nantong Science and Technology Foundation of China (MS12019011), Nantong Science and Technology Foundation of China (JC2021058) oraz Natural Science Foundation of the Jiangsu Higher Education Institutions (21KJB180009).

Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Nantong (nr S20191210-402).
1. Kolekcja zarodków danio pręgowanego
<ol>
	<li>Ustaw parę danio pręgowanego w zbiornikach hodowlanych w noc przed zebraniem jaj, jedną transgeniczną danio pręgowany, a drugą zebry AB typu dzikiego (Tg (foxP2:egfp-caax) X AB typu dzikiego lub Tg (hb9:egfp) X AB typu dzikiego) (patrz Tabela materiałów). Użyj ukośnej plastikowej przegrody, aby oddzielić mężczyznę i kobietę, aby uniemożliwić fizyczny dostęp. Następnego dnia zamontuj górną część zbiornika hodowlanego w czystej dolnej części wypełnionej świeżą wodą i wyjmij przegrodę zbiornika hodowlanego. Pozwól rybie łączyć się w pary przez 10-20 minut i zbierz jaja po opadnięciu na dno zbiornika hodowlanego.</li>
	<li>Wyhodować zarodki w pożywce dla zarodków E3 (patrz tabela materiałów) zawierającej błękit metylenowy (1 ml 0,05% błękitu metylenowego w 1 litrze pożywki dla zarodków E3) w temperaturze 28,5 °C.</li>
	<li>Po 24 godzinach od zapłodnienia (hpf) należy potraktować zarodki fenylotiomocznikiem (PTU, patrz tabela materiałów), aby zapobiec tworzeniu się pigmentu. 
	UWAGA: W eksperymentach wykorzystuje się zwierzęta obu płci.</li>
</ol>
2. Hybrydyzacja in situ
UWAGA: Woda użyta w krokach 2.1-2.11 to woda uzdatniona pirowęglanem dietylu (DEPC) (zobacz Tabelę Materiałów).
<ol>
	<li>Utrwal ~10 zarodków za pomocą 0,5-1 ml świeżego 4% paraformaldehydu (PFA, patrz tabela materiałów) w probówce do mikrofugi o pojemności 1,5 ml w temperaturze 4 °C przez noc przez 12-14 godzin 
	UWAGA: Protokół hybrydyzacji in situ jest nieznacznie zmodyfikowany w stosunku do wcześniej opublikowanej literatury12. PFA musi być świeżo przygotowany i przechowywany w temperaturze 4 °C w ciągu jednego tygodnia od użycia lub przez jeden miesiąc w temperaturze -20 °C. Wszystkie poniższe etapy hybrydyzacji in situ przeprowadzono przy użyciu probówek do mikrofuge o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Użyj pęsety, aby usunąć skórę tylko z zarodków starszych niż 48 hpf. 
	UWAGA: Skóra jest usuwana w celu ułatwienia penetracji sond RNA do obszaru tułowia zarodków starszych niż 48 hpf. </li>
	<li>Stopniowo odwadniaj zarodki, przemłukując 25%, 50% i 75% metanolem w 1x buforowanym fosforanem soli fizjologicznej zawierającej 0,1% Tween-20 kolejno (PBST, patrz Tabela Materiałów) przez 5 minut każdy w temperaturze pokojowej. Następnie myj zarodki przez 5 minut w 100% metanolu w temperaturze pokojowej. Inkubować zarodki w 100% metanolu w temperaturze -20 °C przez co najmniej noc przez 12-14 godzin 
	UWAGA: Odwodnione zarodki można przechowywać w 100% metanolu w temperaturze -20 °C przez 6 miesięcy.</li>
	<li>Stopniowo nawadniaj zarodki, przemłukując je 75%, 50% i 25% metanolem w PBST kolejno przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Umyj zarodek trzy razy PBST przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Trawić zarodki za pomocą 10 μg/ml proteinazy K (patrz tabela materiałów) w PBST w temperaturze pokojowej (patrz tabela 1).</li>
	<li>Myj zarodki PBST przez 5 minut. Wykonaj ten etap mycia trzy razy.</li>
	<li>Ponownie utrwal umyte zarodki w 4% PFA przez 15 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Ten etap zatrzymuje trawienie, ponieważ PFA dezaktywuje proteinazę K. Upewnij się, że próbka jest delikatnie wymieszana, aby wystawić wszystkie zarodki na działanie PFA; Probówki można umieścić na bokach, aby równomiernie rozprowadzić zarodki w roztworze. Ten PFA nie musi być świeży (można go przechowywać w lodówce do 2 tygodni).</li>
	<li>Umyj zarodek trzy razy PBST, inkubując przez 5 minut podczas każdego płukania.</li>
	<li>Przeprowadzić prehybrydyzację zarodków przez inkubację z roztworem prehybrydyzacyjnym (preHYB, patrz tabela materiałów) w temperaturze 65 °C przez 5 minut. Zastąp preHYB roztworem hybrydyzacyjnym (HYB, patrz tabela materiałów) i poddaj prehybrydyzacji przez co najmniej 4 godziny w HYB. 
	UWAGA: Przed przystąpieniem do wstępnej hybrydyzacji należy podgrzać roztwory do temperatury 65 °C. Formamid (patrz Tabela Materiałów) służy do utrzymania kształtu i struktury tkanki. Formamid zapobiega również wiązaniu się niehomologicznych fragmentów w niskich temperaturach.</li>
	<li>Podgrzewać sondę (Insm1a lub 5-HT2C) w HYB przez 5 minut w temperaturze 95 °C przed dodaniem do zarodków. Użyj sondy o stężeniu 1 μg/ml HYB. Usuń jak najwięcej preHYB, nie dopuszczając do kontaktu zarodków z powietrzem, i dodaj podgrzaną sondę w HYB do probówki zawierającej zarodki. 
	UWAGA: Znakowana sonda RNA może być użyta do hybrydyzacji z docelową sekwencją mRNA w zarodkach. Dlatego sonda może być używana do wykrywania ekspresji interesującego genu i lokalizacji mRNA.</li>
	<li>Pozostawić sondę do hybrydyzacji przez noc (12-14 godzin) w temperaturze 50-70 °C. 
	UWAGA: Temperatura hybrydyzacji różni się dla różnych sond.</li>
	<li>Następnego dnia należy odessać roztwór sondy za pomocą pipety i przechowywać go w probówce w temperaturze -20 °C, aby mógł być wielokrotnie używany.</li>
	<li>Umyj zarodki w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Myć zarodki przez 15 minut 100% HYB w temperaturze 65 °C.</li>
		<li>Płucz zarodki kolejno 75%, 50% i 25% HYB w 2x standardowym roztworze soli fizjologicznej zawierającym 0,1% Tween-20 (SSCT, patrz tabela materiałów) przez 15 minut każdy w temperaturze 65 °C.</li>
		<li>Myć zarodki przez 15 minut w 2x SSCT w temperaturze 65 °C.</li>
		<li>Myć zarodki przez 15 minut w 0,2x SSCT w temperaturze 65 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj zarodki dwa razy przez 10 minut w buforze kwasu maleinowego zawierającym 0,02% Tween-20 (MABT, patrz Tabela Materiałów) w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zablokuj zhybrydyzowane i umyte zarodki przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej za pomocą 2% roztworu blokującego-1 (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Zastąpić roztwór blokujący-1 antydigoksygeniną AP (rozcieńczenie 1:4 000, patrz Tabela Materiałów) w świeżym 2% roztworze blokującym-1 i wstrząsać przez noc przez 12-14 godzin w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyj zarodki cztery razy przez 30 minut w MABT w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Wyjmij BM fioletowy (patrz Tabela Materiałów) z lodówki podczas trzeciego prania i potrząśnij nim od czasu do czasu podczas kolejnych prań.</li>
	<li>Umyj zarodki dwa razy przez 10 minut w NTMT (0,1 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 1% Tween-20, patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Użyj pipety, aby usunąć jak najwięcej NTMT z zarodków. Zastąp fioletowym substratem BM AP i zabarwij zarodki w temperaturze pokojowej w ciemności. Monitoruj zmiany koloru co 30 minut, aby kontrolować stopień zabarwienia. 
	UWAGA: Konkretny czas barwienia jest inny i należy go dostosować do każdej sondy. Inkubacja zarodków w temperaturze 37 °C może przyspieszyć reakcję. Inkubacja zarodków w temperaturze 4 °C może wydłużyć czas reakcji i może być przeprowadzona przez noc.</li>
	<li>Gdy rozwinie się do pożądanego stopnia, zatrzymaj reakcję, dwukrotnie krótko spłukując NTMT. Po hybrydyzacji in situ przepłukać zarodki trzykrotnie PBST przez 20 minut.</li>
</ol>
3. Osadzanie
<ol>
	<li>Zanurzyć zarodki w 5% sacharozie w 1x PBS (patrz Tabela Materiałów) na noc na 12-14 godzin w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zmienić roztwór pokrywający zarodki na 15% sacharozy w 1x PBS i inkubować przez noc przez 12-16 godzin w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zmienić roztwór pokrywający zarodki na 30% sacharozy w 1x PBS i inkubować przez 1-2 dni w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Inkubować w tym roztworze, aż zarodki opadną na dno probówki.</li>
	<li>Napełnij kriomoldę medium o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) (patrz Tabela materiałów). Przenieś zarodki w 30% sacharozie do kriomoldu za pomocą pożywki OCT. Wymieszaj je, aby usunąć sacharozę z zarodków.</li>
	<li>Przenieś zarodki do nowego kriomoldu na tkankę i delikatnie wypełnij je pożywką OCT, unikając tworzenia się pęcherzyków.</li>
	<li>Zanurz każdy zarodek, popychając go na dno krioformy i umieść każdy zarodek w pożądanej orientacji (grzbietowo-brzusznej lub bocznej). Utrzymuj zarodki w linii prostej. 
	UWAGA: Zdecydowanie zaleca się umieszczanie tylko jednego zarodka w każdym kriomoldu (patrz Tabela Materiałów).</li>
	<li>Umieść osadzone zarodki w krioformach w kąpieli etanolowej z suchym lodem.</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze -80 °C co najmniej przez noc przez 12-14 h. 
	UWAGA: Krioformy można przechowywać w temperaturze -80 °C przez co najmniej jeden miesiąc.</li>
</ol>
4. Kriosekcja
<ol>
	<li>Ustawić kriosekcje za pomocą kriostatu na -20 °C.</li>
	<li>Wyjmij blok próbki z kriomoldu i umieść go w kriostacie. Umieść pożywkę OCT na podstawie schłodzonego uchwytu i umieść blok na górze.</li>
	<li>Upewnij się, że blok próbki jest równoległy do żyletki. Ostrożnie odetnij nadmiar pożywki OCT wokół próbki.</li>
	<li>Pociąć na odcinki o grubości 12-20 μm za pomocą kriostatu. Szybko przenieś sekcje na szkiełka podstawowe, tak aby każda szkiełko miało 3-4 sekcje. Pozostawić próbki do osiągnięcia temperatury pokojowej i przechowywać skrawki w szczelnie zamkniętym pudełku na suwaki w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.</li>
</ol>
5. Barwienie immunologiczne
UWAGA: Barwienie GFP jest wykonywane na sekcjach.
<ol>
	<li>Myć szkiełka zawierające sekcje PBS przez 5 minut.</li>
	<li>Podgrzej bufor cytrynianowy do wrzenia w kuchence mikrofalowej.</li>
	<li>Umieść szkiełka w buforze i kontynuuj podgrzewanie, aby roztwór był bliski wrzenia przez około 20 minut. 
	UWAGA: Ten krok pomaga w odzyskiwaniu antygenu. Tkanka pozostaje nienaruszona nawet w wysokich temperaturach, co poprawia jakość barwienia, zapobiegając fałdowaniu, uszkodzeniu lub oderwaniu tkanek.</li>
	<li>Pozwól próbkom powoli ostygnąć do temperatury pokojowej przed następnym krokiem. Odcedź nadmiar roztworu, ostrożnie osusz obszar wokół każdej sekcji kawałkiem chusteczki i narysuj okrąg wokół sekcji za pomocą wodoodpornego pisaka (patrz Tabela materiałów), aby utworzyć hydrofobową barierę. Uważaj, aby nie wysuszyć skrawków tkanki.</li>
	<li>Umyj szkiełka dwa razy PBS, inkubując przez 10 minut podczas każdego mycia.</li>
	<li>Blokować przez 2 godziny w roztworze blokującym-2 (patrz tabela materiałów) w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odpipetować roztwór przeciwciał pierwotnych (mysi monoklonalny α-GFP, 1:250, patrz Tabela Materiałów) na szkiełko podstawowe i inkubować szkiełka w mokrym pojemniku immunohistochemicznym w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Umyj szkiełka trzykrotnie PBS, inkubując przez 10 minut podczas każdego mycia.</li>
	<li>Odcedź nadmiar PBS. Inkubować szkiełka z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym (1:400, patrz Tabela Materiałów) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w PBS.</li>
	<li>Umyj szkiełka trzykrotnie PBS, inkubując przez 10 minut podczas każdego mycia.</li>
	<li>Spuść nadmiar PBS, odpipetuj pożywkę mocującą na szkiełko podstawowe i zamontuj za pomocą szkiełka nakrywkowego.</li>
</ol>

<ol><li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+%28Brachydanio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).</li>
<li>Chen, E., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+genomics+research+model%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a genomics research model.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).</li>
<li>Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li>
<li>Torres, E. The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it">https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it</a> (2018).</li>
<li>Akam, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+location+of+ultrabithorax+transcripts+in+Drosophila+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections.</a> EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).</li>
<li>Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+in+situ+hybridization+method+for+the+detection+of+cellular+RNAs+in+Drosophila+tissue+sections+and+its+application+for+localizing+transcripts+of+the+homeotic+Antennapedia+gene+complex%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex.</a> EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).</li>
<li>Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryos+and+young+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae.</a> Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).</li>
<li>Clay, H., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish+embryos+using+tyramide+signal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification.</a> Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).</li>
<li>Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+genetic+tools+for+studying+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development.</a> Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).</li>
<li>Cunningham, R. L., Monk, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+in+situ+hybridization+and+immunohistochemistry+for+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae.</a> Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li>
<li>Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+5-HT%282C%29+receptors+regulate+anxiety-like+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Brain%2C+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior.</a> Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).</li>
<li>Ferguson, J. L., Shive, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+immunofluorescence+and+immunohistochemistry+on+cryosectioned+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344(2019).</li>
<li>Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+immunohistochemistry+in+zebrafish+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575(2020).</li>
<li>Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+whole-mount+immunohistochemistry+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+embryos+and+larvae+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).</li>
<li>O'Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Garbage+in%2C+garbage+out%3A+a+critical+evaluation+of+strategies+used+for+validation+of+immunohistochemical+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers.</a> Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Protokół ten proponuje połączenie hybrydyzacji in situ i immunohistochemii, co jest ważnym krokiem w eksperymentach kolokalizacyjnych na zarodkach danio pręgowanego. Metoda ta służy jako łatwy i skuteczny sposób jednoczesnej analizy jednego mRNA i jednego białka. Hybrydyzację in situ i barwienie przeciwciałami przeprowadzono na zarodkach danio pręgowanego. W przeciwieństwie do kilku opublikowanych wcześniej protokołów 14,15,16, immunofluorescencja i immunohistochemia zostały wykorzystane do zbadania eks...

Danio pręgowany jest potężnym modelem kręgowców do badań nad rozwojem i genetyką1,2. Danio pręgowany i ludzi łączy wysoka homologia genetyczna (70% genów jest wspólnych z ludzkim genomem), co pozwala na wykorzystanie go jako modelu chorób ludzkich3. U danio pręgowanego dość często wykrywa się wzorce ekspresji dwóch genów i ich związek przestrzenny. Immunohistochemia została po raz pierwszy użyta w 1941 roku do wykrywania patogenów w zakażonych tkankach poprzez zastosowanie przeciwciał znakowanych FITC4. Białko docelowe w sekcji tkanki jest najpierw znakowane przeciwciałem pierwszorzędowym, a następnie fragment jest znakowany przeciwciałem drugorzędowym przeciwko immunoglobulinie gatunku żywiciela przeciwciała pierwotnego. Barwienie przeciwciał jest solidnym podejściem do wykrywania lokalizacji białek, które zapewnia wysoką rozdzielczość optyczną na poziomie wewnątrzkomórkowym. Jednak liczba dostępnych przeciwciał u danio pręgowanego jest bardzo ograniczona. Niedawne badanie pokazuje, że około 112 000 przeciwciał jest dostępnych na rynku dla myszy; Wykazano jednak, że bardzo niewiele przeciwciał jest wiarygodnych u danio pręgowanego5.
Zamiast tego, u danio pręgowanego, hybrydyzacja in situ była szeroko stosowana do analizy wzorców ekspresji genów. Metoda ta została po raz pierwszy użyta do oceny ekspresji genów w zarodkach Drosophila w latach 80. XX wieku6,7 i od tego czasu technologia ta jest stale rozwijana i ulepszana. Początkowo do wykrywania transkryptów mRNA używano znakowanych radioaktywnie sond DNA; Jednak rozdzielczość przestrzenna była stosunkowo niska, a radioaktywność powodowała potencjalne zagrożenia dla zdrowia. Następnie hybrydyzacja in situ opiera się na sondach RNA znakowanych digoksygeniną (DIG) lub fluoresceiną (Fluo), które są sprzężone z fosfatazą alkaliczną (AP) lub wykrywane przez fluorescencyjne wzmocnienie sygnału tyramidowego (TSA)8,9. Chociaż TSA została wykorzystana do wykrycia dwóch lub trzech genów, znakowanie DIG sond RNA i przeciwciało sprzężone z antyDIG AP są nadal wysoce czułymi, stabilnymi i szeroko stosowanymi metodami hybrydyzacji in situ. Dlatego skomercjalizowane przeciwciała w połączeniu z sondami in situ znakowanymi DIG są przydatne do uzyskania wglądu w lokalizację białka i ekspresję jednego genu.
Embriony z pełnym wierzchowcem nie mogą ujawnić przestrzennego związku między genami ze względu na niską rozdzielczość optyczną, mimo że zarodki danio pręgowanego są małe i przezroczyste10. W związku z tym sekcje są niezbędne do analizy wzorców ekspresji genów na poziomie wewnątrzkomórkowym. Kriosekcja jest szeroko stosowana u danio pręgowanego, ponieważ jest łatwa do wykonania i może skutecznie zachować antygen. Dlatego hybrydyzacja in situ w połączeniu z immunohistochemią w kriosekcjach danio pręgowanego oferuje potężny sposób analizy wzorców ekspresji dwóch genów. Kombinacja hybrydyzacji in situ i immunohistochemii została zastosowana do danio pręgowanego11. Jednak leczenie proteinazą K zastosowano w celu zwiększenia penetracji sondy kosztem integralności antygenu. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, protokół ten wykorzystuje ogrzewanie do indukcji pobierania antygenu. Protokół ten ma zastosowanie nie tylko do zarodków w różnych stadiach rozwoju i skrawków tkanek o różnej grubości (14 μm skrawków głowy i 20 μm odcinków rdzenia kręgowego), ale został również zweryfikowany przy użyciu genów ulegających ekspresji w dwóch narządach, w tym w głowie i rdzeniu kręgowym.
Ten artykuł opisuje, jak połączyć hybrydyzację in situ i barwienie przeciwciał w zarodkach danio pręgowanego w kriosekcjach. Wszechstronność tego protokołu została zademonstrowana poprzez zastosowanie szeregu kombinacji hybrydyzacji i immunohistochemii in situ, w tym sond hybrydyzacji in situ dla dwóch różnych neuronów. Metoda ta nadaje się do wykrywania mRNA i białka w różnych regionach i zarodkach w różnym wieku, a także wzorców ekspresji dwóch genów.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało drugorzędowe Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td></td></tr><tr><td>Anty-Digoxigenina AP Fragmenty Fab</td> Roche <td></td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-GFP</td><td>Odczynnik blokujący Millipore</td><td>MAB3580</td><td></td></tr><tr><td>Roche</td><td></td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Rozwiązanie blokujące-1</td><td>wyprodukowane w laboratorium</td><td>Nie dotyczy</td><td>Rozpuścić odczynnik blokujący w 1X MAB do końcowego stężenia 10% (wag./obj.). Autoklaw i przechowywanie w temperaturze -20 &#176; C przed użyciem.</td></tr><tr><td>Roztwór blokujący-2</td><td>wyprodukowany w laboratorium</td><td>Nie dotyczy</td><td>0,1% Triton X-100, 3% BSA, 10% kozia surowica w 1x PBS</td></tr><tr><td>BM fioletowy</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>B2064</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Bufor cytrynianowy</td><td>Leagene</td><td>IH0305</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Sigma</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold do tkanek, 15 mm x 15 mm x 5 mm</td><td>Głowica Biotechnology</td><td>H4566</td><td></td></tr><tr><td>Woda uzdatniona DEPC</td><td>Sangon Biotech B501005</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aparat cyfrowy, mikroskop fluorescencyjny</td><td>Pożywka</td> zarodkowa <td>Nikon NI-SSR 931479</td><td></td></tr><tr><td>E3</td><td>wykonana w laboratorium</td><td>N/A</td><td>5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Invitrogen</td><td>AM9342</td><td></td></tr><tr><td>Serum kozie</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa heparyny</td><td>J& K Scientific</td><td>542858</td><td></td></tr><tr><td>HYB</td><td>wykonane w laboratorium</td><td>N/A</td><td>preHYB plus 50 &micro; g/ml soli sodowej heparyny, 100 i mikro; g/ml kwasu rybonukleinowego, sól dietyloaminoetanolowa</td></tr><tr><td>Immunohistochemiczne pudełko mokre</td><td>Mkbio</td><td>MH10002</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Niskoprofilowe ostrza Leica Leica</td><td></td><td>819</td><td></td></tr><tr><td>MABT (1x)</td> <td>wykonane w laboratorium</td><td>N/A</td><td>0,1 M kwas maleinowy, 0,15 M NaCl, 0,02% Tween-20, pH 7,5</td></tr><tr><td>Kwas maleinowy</td><td>Sigma</td><td>M0375</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>J& K Scientific</td><td>116481</td><td></td></tr><tr><td>Błękit metylenowy</td><td>Macklin</td><td>M859248</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NTMT</td><td>wyprodukowany w laboratorium</td><td>N/A</td><td>0,1M Tris-HCl, 0,1M NaCl, 1% Tween-20</td></tr><tr><td>OCT medium</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Enzo Nauki biologiczne</td><td>ADI-950-233</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, 4%</td><td>Abbexa</td><td>abx082483</td><td>wyprodukowano w laboratorium w 1x PBS</td></tr><tr><td>PBST (1x)</td><td>wyprodukowano w laboratorium</td><td>Nie dotyczy</td><td>1x PBS plus 0,1% Tween-20</td></tr><tr><td>Fenylotiomocznik</td><td>Merck</td><td>103-85-5</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10x)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>preHYB</td><td>wyprodukowany w laboratorium</td><td>Nie dotyczy</td><td>50% formamid, 5x SSC, 9,2 mM kwas cytrynowy (pH 6,0), 0,1%</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Roche</td><td>1092766</td><td></td></tr><tr><td>Kwas rybonukleinowy Sól dietyloaminoetanolowa</td><td>Sigma</td><td>R3629</td><td></td></tr> bez <tr><td>RNaz 1,5 ml</td><td>Ambion</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>SSC (20x)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9770</td><td></td></tr><tr><td>SSCT (0,2x)</td><td>wyprodukowane w laboratorium</td><td>N/A</td><td>0,2x SSC plus 0,1% Tween-20</td></tr><tr><td>SSCT (1x)</td> <td>wyprodukowane w laboratorium</td><td>Nie dotyczy</td><td>1x SSC plus 0,1% Tween-20</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Invitrogen</td><td>15503022</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Laboratorium Zebry</td><td>Centrum Zwierząt Uniwersytetu Nantong</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ hybrydyzacja połączona z immunohistochemią w kriosekcji zarodków danio pręgowanego

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

Jako kręgowiec, danio pręgowany był szeroko stosowany w badaniach biologicznych. Danio pręgowany i ludzie mają wspólną wysoką homologię genetyczną, co pozwala na wykorzystanie jej jako modelu chorób ludzkich. Badanie funkcji genów opiera się na wykrywaniu wzorców ekspresji genów. Chociaż immunohistochemia oferuje skuteczny sposób oznaczania ekspresji białek, ograniczona liczba komercyjnie dostępnych przeciwciał u danio pręgowanego ogranicza stosowanie barwienia. Hybrydyzacja in situ jest szeroko stosowana w zarodkach danio pręgowanego do wykrywania ekspresji mRNA. Protokół ten opisuje, w jaki sposób uzyskać obrazy poprzez połączenie hybrydyzacji in situ i immunohistochemii dla skrawków zarodków danio pręgowanego. Przed kriosekcją przeprowadzono hybrydyzację in situ, a następnie barwienie przeciwciałami. Immunohistochemię i obrazowanie pojedynczej kriosekcji przeprowadzono po hybrydyzacji in situ. Protokół jest pomocny w rozwikłaniu wzorca ekspresji dwóch genów, najpierw poprzez wykrywanie transkryptu in situ, a następnie przez immunohistochemię białka w tej samej sekcji.

Niniejszy protokół może być wykorzystany do jednoczesnego badania wzorca ekspresji jednego mRNA oraz jednego białka. Rysunek 1 przedstawia schemat postępowania eksperymentalnego. Receptor 5-HT2C jest podtypem receptora 5-HT wiążącego neuroprzekaźnik serotoninę (5-hydroksytryptaminę, 5-HT). Jest on szeroko rozpowszechniony w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) i może w znacznym stopniu regulować szereg funkcji mózgu, w tym apetyt, nastrój, lęk oraz zachowania rozrodcze13</sup...

Ten protokół opisuje, jak uzyskać obrazy poprzez połączenie hybrydyzacji in situ i immunohistochemii odcinków embrionalnych danio pręgowanego. Przed kriosekcją przeprowadzono hybrydyzację in situ, a następnie barwienie przeciwciałami. Przydatne jest wykrycie wzorców ekspresji dwóch genów u danio pręgowanego, jeśli występuje niedobór przeciwciał.

In Situ Hybrydyzacja połączona z immunohistochemią w kriosekcji zarodków danio pręgowanego

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a ...

Protokół ten wykorzystuje połączenie hybrydyzacji in situ i immunohistochemii i służy jako łatwy i skuteczny sposób jednoczesnej analizy jednego mRNA i jednego białka. Protokół ten ma zastosowanie do zarodków w różnych stadiach, skrawków tkanek o różnej grubości i różnych narządów. Na początek utrwal około 10 zarodków za pomocą 0,5 do 1 mililitra świeżego 4% paraformaldehydu w 1,5-mililitrowej probówce do mikrofugi w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc przez 12 do 14 godzin.Stopniowo odwadniaj zarodki, przemłukując je 25, 50 i 75% metanolem w PBST kolejno przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie myj zarodki w 100% metanolu przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Inkubuj zarodki w 100% metanolu w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez co najmniej noc, przez 12 do 14 godzin.Stopniowo nawadniaj zarodki, przemłukując je kolejno 75, 50 i 25% metanolem w PBST przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Ponownie przemyj zarodek trzykrotnie PBST przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Trawić zarodki za pomocą 10 mikrogramów na mililitr proteinazy K w PBST w temperaturze pokojowej i myć zarodki trzykrotnie PBST przez pięć minut.Następnie ponownie utrwal umyte zarodki w 4% paraformaldehydzie przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie przemyj zarodek trzykrotnie PBST, inkubując przez pięć minut podczas każdego płukania. W celu wstępnej hybrydyzacji zarodków inkubuj je w roztworze przed hybrydyzacją w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut.Następnie zastąp roztwór przed hybrydyzacją roztworem hybrydyzacyjnym i wstępnie hybrydyzuj przez co najmniej cztery godziny. Podgrzewaj sondę w roztworze hybrydyzacyjnym przez pięć minut w temperaturze 95 stopni Celsjusza przed dodaniem do zarodków. Usuń jak najwięcej roztworu do hybrydyzacji, nie dopuszczając do kontaktu zarodków z powietrzem.Do probówki zawierającej zarodki dodać podgrzaną sondę do roztworu hybrydyzacyjnego i pozostawić sondę do hybrydyzacji przez noc przez 12 do 14 godzin w temperaturze od 50 do 70 stopni Celsjusza. Następnego dnia odessać roztwór sondy pipetą i przechowywać go w probówce w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aby można go było wielokrotnie używać. Umyj zarodki 100% roztworem hybrydyzacyjnym, a następnie sekwencyjnie przemyj 75, 50 i 25% roztworem hybrydyzacyjnym w dwukrotnie stężeniu SSCT przez 15 minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza.Następnie myj zarodki w dwukrotnie i 0,2-krotności stężenia SSCT przez 15 minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Umyj zarodki dwukrotnie przez 10 minut w MABT w temperaturze pokojowej. Zablokuj zhybrydyzowane i umyte zarodki przez co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej, za pomocą 2% roztworu blokującego-1.Zastąp roztwór blokujący-1 alkaliczną fosfatazą antydigoksygeninową w świeżym 2% roztworze blokującym-1 i wstrząsaj przez noc przez 12 do 14 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie umyj zarodki cztery razy w MABT przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie umyj zarodki dwukrotnie w NTMT i usuń jak najwięcej NTMT z zarodków za pomocą pipety.Zastąp fioletowym substratem fosfatazy alkalicznej BM i wybarwij zarodki w temperaturze pokojowej w ciemności. Gdy plama się rozwinie, zatrzymaj reakcję, krótko spłukując dwukrotnie NTMT. Po hybrydyzacji in situ przepłukać zarodki trzykrotnie PBST przez 20 minut.Zanurz zarodki w 5% sacharozie w PBS na noc na 12 do 14 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie zmień roztwór pokrywający zarodki na 15% sacharozy w PBS i inkubuj przez noc przez 12 do 16 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponownie zmień roztwór pokrywający zarodki na 30% sacharozy w PBS i inkubuj przez jeden do dwóch dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Przenieś zarodki do nowego kriomoldu na tkanki i delikatnie wypełnij je pożywką o optymalnej temperaturze cięcia, unikając tworzenia się pęcherzyków. Następnie pokrój próbki na odcinki o grubości od 12 do 20 mikrometrów za pomocą kriostatu i szybko przenieś skrawki na szkiełka podstawowe. Pozwól próbkom osiągnąć temperaturę pokojową i przechowuj skrawki w szczelnie zamkniętym pudełku na szkiełka w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do późniejszego użycia.Myć szkiełka zawierające skrawki PBS przez pięć minut. Następnie umieść szkiełka w buforze i podgrzewaj roztwór przez około 20 minut, aby utrzymać go w temperaturze bliskiej wrzenia. Odcedź nadmiar roztworu i ostrożnie osusz obszar wokół każdej sekcji kawałkiem chusteczki.Następnie narysuj okrąg wokół sekcji za pomocą wodoodpornego pisaka, aby utworzyć hydrofobową barierę i zablokuj sekcję na dwie godziny w roztworze blokującym-2 w temperaturze pokojowej. Pobrać pipetę do roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na szkiełko podstawowe i inkubować szkiełka w immunohistochemicznym mokrym pudełku w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Umyj szkiełka trzy razy PBS podczas inkubacji przez 10 minut podczas każdego mycia i odcedź nadmiar PBS.Następnie inkubować szkiełka z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej w PBS. Ponownie umyj szkiełka trzykrotnie PBS podczas inkubacji przez 10 minut podczas każdego mycia i odcedź nadmiar PBS. Następnie odpipetować podłoże mocujące na szkiełko podstawowe i zamocować za pomocą szkiełka nakrywkowego.Ekspresję receptora 5-HT2C w ośrodkowym układzie nerwowym wykryto w transgenicznej linii foxP2 egfp-caax. Jednoczesną ekspresję 5-HT2C zaobserwowano w linii transgenicznej wraz z neuronami foxP2, które były znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym fluoresceiny. Ekspresję insm1a, czynnika transkrypcyjnego palca cynkowego w rdzeniu kręgowym danio pręgowanego i neuronach ruchowych, wykryto w linii transgenicznej.Jednoczesną ekspresję insm1a zaobserwowano w linii transgenicznej wraz z neuronami hb9, które były znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym fluoresceiny. Danio pręgowany należy utrwalić świeżo przygotowanym paraformaldehydem.

in-situ-hybridization-combined-with-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Hybrydyzacja in situ w preparatach całych jest jedną z najszerzej stosowanych technik w biologii rozwoju. Przedstawiamy tutaj protokół podwójnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości, służący do analizy precyzyjnego wzorca ekspresji pojedynczego genu oraz określania nakładania się domen ekspresji dwóch genów. Włączyliśmy barwienie jąder jodkiem propidyny w celu uwydatnienia organizacji tkanki.

Wysokorozdzielcza podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w całych embrionach ryby danio-ostrobłysku

Opisano szybką metodę immunobarwienia embrionalnego serca danio pręgowanego. W porównaniu z metodą immunobarwienia całych preparatów, metoda ta znacznie zwiększa penetrację przeciwciał, co pozwala na uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości, ujawniających struktury komórkowe i podkomórkowe w sercu przy znacznie krótszym czasie przetwarzania.

Immunobarwienie wypreparowanego serca embrionalnego ryby danio

Danio pręgowany, mała tropikalna ryba, stała się popularnym modelem do badania funkcji genów podczas rozwoju i choroby kręgowców. Czasową i przestrzenną ekspresję genów docelowych można określić za pomocą hybrydyzacji in situ. Nasz ulepszony protokół pozwala na wykrywanie mało obfitych transkryptów z niskim niespecyficznym sygnałem tła.

Hybrydyzacja in situ w pełnej rozdzielczości w zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania ekspresji i funkcji genów

Zarodek danio pręgowanego jest doskonałym modelem do badań nad biologią rozwojową. Podczas embriogenezy danio pręgowany rozwija się z masą żółtka, co stanowi trójwymiarowe wyzwanie dla obserwacji i analizy próbek. Protokół ten opisuje, w jaki sposób tworzyć dwuwymiarowe preparaty do montażu płaskiego całych próbek zarodków danio pręgowanego barwionych metodą montażu in situ (WISH).

Przygotowanie do obserwacji i analizy próbek zarodków danio pręgowanego wybarwionych metodą hybrydyzacji in situ metodą całego wierzchowca

Opisano techniki immunobarwienia fosfo-epitopów w całych zarodkach danio pręgowanego, a następnie przeprowadzania dwukolorowej fluorescencyjnej lokalizacji konfokalnej w strukturach komórkowych tak małych jak pierwotne rzęski. Techniki utrwalania i obrazowania mogą określać lokalizację i kinetykę pojawiania się lub aktywacji określonych białek.

Immunobarwiące fosfo-epitopy w narządach rzęskowych całych zarodków danio pręgowanego

Rozwój rzęsek jest niezbędny do prawidłowego organogenezy. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę oznaczania i wizualizacji komórek rzęskowych danio pręgowanego.

Wizualizacja wielorzęskowych komórek u danio pręgowanego za pomocą połączonego protokołu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i immunofluorescencji całej góry

Ten protokół demonstruje sekwencyjną immunofluorescencję i immunohistochemię na kriosekcjach z wczesnych stadiów zarodków danio pręgowanego, umożliwiając precyzyjne analizy kolokalizacji w określonych populacjach komórek.

Sekwencyjna immunofluorescencja i immunohistochemia na kriowyciętych zarodkach danio pręgowanego

Technologie edycji genów umożliwiły badaczom generowanie mutantów danio pręgowanego w celu zbadania funkcji genów ze względną łatwością. W tym miejscu przedstawiamy przewodnik do przeprowadzania równoległego genotypowania zarodków i kwantyfikacji sygnałów hybrydyzacji in situ u danio pręgowanego. To bezstronne podejście zapewnia większą dokładność analiz fenotypowych opartych na hybrydyzacji in situ.

Genotypowanie i kwantyfikacja barwienia hybrydyzacji in situ u danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania białek za pośrednictwem przeciwciał fluorescencyjnych w całych preparatach zarodków i larw danio pręgowanego.

Immunohistochemia całego wierzchowca w zarodkach i larwach danio pręgowanego

Danio pręgowany jest ważnym modelem do zrozumienia rozwoju nerek. W tym przypadku protokół hybrydyzacji in situ jest zoptymalizowany pod kątem wykrywania ekspresji genów u larw danio pręgowanego i osobników młodocianych podczas rozwoju mesonephros.

In Situ Hybrydyzacja u larw danio pręgowanego i osobników młodocianych podczas rozwoju Mesonephros

Naucz się metody hybrydyzacji in situ połączonej z immunohistochemią w kriosekcji zarodków Danio rerio. Technika umożliwia jednoczesną detekcję mRNA i białek w badaniach neurobiologii rozwojowej.

In Situ Hybrydyzacja połączona z immunohistochemią w kriosekcji zarodków danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów