Name: Wytwarzanie rekombinowanego wirusa rzekomego pomoru drobiu o wysokim mianie z płynu omoczniowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania rekombinowanego wirusa rzekomego pomoru drobiu o wysokim mianie z płynu omoczniowego. Protokół obejmuje filtrację przepływową, ultrawirówkę w gradiencie jodoksanolu oraz kontrolę jakości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J.G.E.Y otrzymał stypendium doktoranckie Ontario Veterinary College oraz stypendium dla absolwentów Ontario. Praca ta została sfinansowana przez Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grants dla SKW (grant #304737) i LS (grant #401127).

<ol><li>Kim, S. H., Samal, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+as+a+vaccine+vector+for+development+of+human+and+veterinary+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus as a vaccine vector for development of human and veterinary vaccines.</a> Viruses. 8 (7), (2016).</li>
<li>Kortekaas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+immunity+provided+by+a+paramyxovirus+vaccine+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus immunity provided by a paramyxovirus vaccine vector.</a> Vaccine. 28 (27), 4394-4401 (2010).</li>
<li>Matveeva, O. V., Kochneva, G. V., Zainutdinov, S. S., Ilyinskaya, G. V., Chumakov, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+paramyxoviruses%3A+mechanism+of+action%2C+preclinical+and+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Molekuliarnaia+Biologiia%22%5BJournal%5D)">Oncolytic paramyxoviruses: mechanism of action, preclinical and clinical studies.</a> Molekuliarnaia Biologiia. 52 (3), 360-379 (2018).</li>
<li>Sinkovics, J. G., Horvath, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+%28NDV%29%3A+brief+history+of+its+oncolytic+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus (NDV): brief history of its oncolytic strains.</a> Journal of Clinical Virology. 16 (1), 1-15 (2000).</li>
<li>Matuszewska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+vascular+normalization+with+an+oncolytic+virus+enhances+immunotherapy+in+a+preclinical+model+of+advanced-stage+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Combining vascular normalization with an oncolytic virus enhances immunotherapy in a preclinical model of advanced-stage ovarian cancer.</a> Clinical Cancer Research. 25 (5), 1624-1638 (2019).</li>
<li>McAusland, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+vanadyl+sulfate+with+Newcastle+disease+virus+potentiates+rapid+innate+immune-mediated+regression+with+curative+potential+in+murine+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Combining vanadyl sulfate with Newcastle disease virus potentiates rapid innate immune-mediated regression with curative potential in murine cancer models.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 20, 306-324 (2021).</li>
<li>Warner, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+vaccination+with+a+Newcastle+disease+virus-vectored+vaccine+protects+hamsters+from+SARS-CoV-2+infection+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Intranasal vaccination with a Newcastle disease virus-vectored vaccine protects hamsters from SARS-CoV-2 infection and disease.</a> iScience. 24 (11), 103219(2021).</li>
<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+%28NDV%29+expressing+the+spike+protein+of+SARS-CoV-2+as+a+live+virus+vaccine+candidate%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus (NDV) expressing the spike protein of SARS-CoV-2 as a live virus vaccine candidate.</a> EBioMedicine. 62, (2020).</li>
<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Newcastle+disease+virus+%28NDV%29+expressing+a+membrane-anchored+spike+as+a+cost-effective+inactivated+SARS-CoV-2+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">A Newcastle disease virus (NDV) expressing a membrane-anchored spike as a cost-effective inactivated SARS-CoV-2 vaccine.</a> Vaccines. 8 (4), 1-14 (2020).</li>
<li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Newcastle+disease+virus+mediated+dendritic+cell+activation+and+cross-priming+tumor-specific+immune+responses+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Newcastle disease virus mediated dendritic cell activation and cross-priming tumor-specific immune responses ex vivo.</a> International Journal of Cancer. 146 (2), 531-541 (2020).</li>
<li>Burman, B., Pesci, G., Zamarin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease+virus+at+the+forefront+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease virus at the forefront of cancer immunotherapy.</a> Cancers. 12 (12), 1-15 (2020).</li>
<li>Ricca, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-existing+immunity+to+oncolytic+virus+potentiates+its+immunotherapeutic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Pre-existing immunity to oncolytic virus potentiates its immunotherapeutic efficacy.</a> Molecular Therapy. 26 (4), 1008-1019 (2018).</li>
<li>Zamarin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+oncolytic+virotherapy+overcomes+systemic+tumor+resistance+to+immune+checkpoint+blockade+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Localized oncolytic virotherapy overcomes systemic tumor resistance to immune checkpoint blockade immunotherapy.</a> Science Translational Medicine. 6 (226), (2014).</li>
<li>Schirrmacher, V., van Gool, S., Stuecker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+therapy+resistance%3A+an+update+on+oncolytic+Newcastle+disease+virus+for+improvements+of+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Breaking therapy resistance: an update on oncolytic Newcastle disease virus for improvements of cancer therapy.</a> Biomedicines. 7 (3), (2019).</li>
<li>Santry, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+high-titer+Newcastle+disease+virus+for+use+in+preclinical+mouse+models+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Methods+and+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Production and purification of high-titer Newcastle disease virus for use in preclinical mouse models of cancer.</a> Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 9, 181-191 (2018).</li>
<li>Cassel, W. A., Murray, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ten-year+follow-up+on+stage+II+malignant+melanoma+patients+treated+postsurgically+with+Newcastle+disease+virus+oncolysate%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Oncology+and+Tumor+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">A ten-year follow-up on stage II malignant melanoma patients treated postsurgically with Newcastle disease virus oncolysate.</a> Medical Oncology and Tumor Pharmacotherapy. 9 (4), 169-171 (1992).</li>
<li>Plitt, T., Zamarin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+therapy+with+Newcastle+disease+virus%3A+rationale+for+new+immunotherapeutic+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Investigations%22%5BJournal%5D)">Cancer therapy with Newcastle disease virus: rationale for new immunotherapeutic combinations.</a> Clinical Investigations. 5 (1), 75-87 (2015).</li>
<li>Arifin, M. A., Mel, M., Abdul Karim, M. I., Ideris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Newcastle+disease+virus+by+Vero+cells+grown+on+cytodex+1+microcarriers+in+a+2-litre+stirred+tank+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+%26+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Production of Newcastle disease virus by Vero cells grown on cytodex 1 microcarriers in a 2-litre stirred tank bioreactor.</a> Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, (2010).</li>
<li>Blom, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+chromatographic+reduction+of+ovalbumin+for+egg-based+influenza+virus+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification.</a> Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).</li>
<li>Hegde, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture-based+influenza+vaccines%3A+A+necessary+and+indispensable+investment+for+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+and+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Cell culture-based influenza vaccines: A necessary and indispensable investment for the future.</a> Human Vaccines and Immunotherapeutics. 11 (5), 1223-1234 (2015).</li>
<li>Fulber, J. P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+development+for+Newcastle+disease+virus-vectored+vaccines+in+serum-free+vero+cell+suspension+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Process development for Newcastle disease virus-vectored vaccines in serum-free vero cell suspension cultures.</a> Vaccines. 9 (11), 1335(2021).</li>
<li>Ungerechts, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+oncolytic+viruses+into+the+clinic%3A+clinical-grade+production%2C+purification%2C+and+characterization+of+diverse+oncolytic+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Moving oncolytic viruses into the clinic: clinical-grade production, purification, and characterization of diverse oncolytic viruses.</a> Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16018(2016).</li>
<li>Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+recombinant+Newcastle+disease+virus+from+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+%28Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rescue of recombinant Newcastle disease virus from cDNA.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments. (80), e50830(2013).</li>
<li>Zhao, W., Zhang, Z., Zsak, L., Yu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P+and+M+gene+junction+is+the+optimal+insertion+site+in+Newcastle+disease+virus+vaccine+vector+for+foreign+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">P and M gene junction is the optimal insertion site in Newcastle disease virus vaccine vector for foreign gene expression.</a> The Journal of General Virology. 96, Pt 1 40-45 (2015).</li>
<li>van Vloten, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+high-titer+OrfV+for+preclinical+studies+in+vaccinology+and+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Production and purification of high-titer OrfV for preclinical studies in vaccinology and cancer therapy.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 23, 434-447 (2021).</li>
<li>Ramakrishnan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+50%25+endpoint+titer+using+a+simple+formula%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Determination of 50% endpoint titer using a simple formula.</a> World Journal of Virology. 5 (2), 85(2016).</li>
<li>Yuan, P., Paterson, R. G., Leser, G. P., Lamb, R. A., Jardetzky, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Ulster+strain+Newcastle+disease+virus+hemagglutinin-neuraminidase+reveals+auto-inhibitory+interactions+associated+with+low+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Structure of the Ulster strain Newcastle disease virus hemagglutinin-neuraminidase reveals auto-inhibitory interactions associated with low virulence.</a> PLoS Pathogens. 8 (8), (2012).</li>
<li>Sheets, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opinion+on+adventitious+agents+testing+for+vaccines%3A+Why+do+we+worry+so+much+about+adventitious+agents+in+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Opinion on adventitious agents testing for vaccines: Why do we worry so much about adventitious agents in vaccines.</a> Vaccine. 31 (26), 2791-2795 (2013).</li>
<li>Chung, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccine+allergies%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Vaccine+Research%22%5BJournal%5D)">Vaccine allergies.</a> Clinical and Experimental Vaccine Research. 3 (1), 50(2014).</li>
<li>Schirrmacher, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fifty+years+of+clinical+application+of+Newcastle+disease+virus%3A+time+to+celebrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Fifty years of clinical application of Newcastle disease virus: time to celebrate.</a> Biomedicines. 4 (3), (2016).</li>
<li>Ajamian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL5+persists+in+RSV+stocks+following+sucrose-gradient+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">CCL5 persists in RSV stocks following sucrose-gradient purification.</a> Journal of Leukocyte Biology. 108 (1), 169-176 (2020).</li>
<li>Axis-Shield. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Axis-Shield+OptiPrepTM+The+ideal+density+gradient+medium+for+isolation+of+blood+cells%22">Axis-Shield OptiPrepTM The ideal density gradient medium for isolation of blood cells</a>. , (2020).</li>
<li>Mita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiproinflammatory+effects+of+iodixanol+%28OptiPrep%29-based+density+gradient+purification+on+human+islet+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Antiproinflammatory effects of iodixanol (OptiPrep)-based density gradient purification on human islet preparations.</a> Cell Transplantation. 19 (12), 1537-1546 (2010).</li>
<li>Gias, E., Nielsen, S. U., Morgan, L. A. F., Toms, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+human+respiratory+syncytial+virus+by+ultracentrifugation+in+iodixanol+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of human respiratory syncytial virus by ultracentrifugation in iodixanol density gradient.</a> Journal of Virological Methods. 147 (2), 328-332 (2008).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+purification+of+Citrus+yellow+vein+clearing+virus+by+sucrose+cushion+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient purification of Citrus yellow vein clearing virus by sucrose cushion ultracentrifugation.</a> Journal of Plant Pathology. 98 (1), 159-161 (2016).</li>
<li>Zhao, H., Peeters, B. P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Newcastle+disease+virus+as+a+viral+vector%3A+Effect+of+genomic+location+of+foreign+gene+on+gene+expression+and+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: Effect of genomic location of foreign gene on gene expression and virus replication.</a> Journal of General Virology. 84 (4), 781-788 (2003).</li>
<li>Cheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+of+oncolytic+Newcastle+disease+virus+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genetic modification of oncolytic Newcastle disease virus for cancer therapy.</a> Journal of Virology. 90 (11), 5343-5352 (2016).</li>
<li>Chen, T. -F., Jang, J. -W., Miller, J. A. STABLE AND FILTERABLE ENVELOPED VIRUS FORMULATIONS STABILE UND FILTERBARE EINGEHÜLLTE VIRUSFORMULIERUNGEN FORMULATIONS DE VIRUS ENVELOPPÉS FILTRABLES ET STABLES (84). EUROPEAN PATENT SPECIFICATION. , Designated Contracting States: AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LI LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR 1-14 (2007).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+amino+acid+sequence+diversity+at+the+F+protein+cleavage+site+of+Newcastle+disease+virus+in+fusogenic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of amino acid sequence diversity at the F protein cleavage site of Newcastle disease virus in fusogenic activity.</a> PLOS ONE. 12 (9), 0183923(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Wirusy stosowane jako środki terapeutyczne w badaniach przedklinicznych muszą być wysoce oczyszczone, aby uniknąć toksyczności podczas podawania in vivo15. Jeśli czynniki przypadkowe lub zanieczyszczenia nie zostaną usunięte, może to prowadzić do poważnych działań niepożądanych negujących efekt terapeutyczny czynnika wirusowego28. Ponieważ NDV jest wytwarzany w zarodkach jaj kurzych, istnieje kilka zanieczyszczających białek jaj, takich jak albumina jaja kurzego, k...

Wirus rzekomego pomoru drobiu, znany również jako Ptasi Ortoawelwirus-1, jest otoczkowym paramyksowirusem ptaków, który może być stosowany zarówno jako wirus onkolityczny, jak i szczepionka wektorowa1,2,3,4,5,6,7. Ostatnio NDV zmodyfikowany do ekspresji białka kolca SARS-CoV-2 został scharakteryzowany jako skuteczna szczepionka donosowa w modelach prowokacyjnych myszy i chomików7,8,9. Stosowana jako immunoterapia nowotworów powoduje rekrutację wrodzonych komórek odpornościowych, w szczególności komórek NK naturalnych, produkcję interferonu typu I i wytwarzanie limfocytów T specyficznych dla nowotworu10,11,12,13. Oprócz tych silnych właściwości immunostymulujących, NDV ma silny profil bezpieczeństwa i dobrze ugruntowany system genetyki odwrotnej14,15. Te pożądane cechy skłoniły do oceny NDV w licznych badaniach przedklinicznych i klinicznych na ludziach (NCT04871737, NCT01926028, NCT04764422)16,17. Aby dalej rozwijać ten bardzo obiecujący, immunostymulujący wektor wirusowy, potrzebne są szczegółowe metody wytwarzania i oczyszczania ultraczystego NDV o wysokim mianie, który można bezpiecznie podawać in vivo.
Ponieważ NDV jest ptasim paramyksowirusem, najczęściej namnaża się w zarodkach jaj kurzych. Chociaż istnieją systemy komórkowe do rozmnażania NDV, większość z nich nie była w stanie wytworzyć mian podobnych do tych osiąganych w zarodkach jaj kurzych18. Niemniej jednak istnieją pewne wady produkcji NDV w jajach, w tym fakt, że produkcja na bazie jaj jest długotrwała i niełatwa do skalowania, pozyskiwanie dużych ilości jaj kurzych SPF może być problematyczne i istnieje możliwość zanieczyszczenia alergenami jaj13,18,19,20. Ostatnio jedna grupa wykazała, że komórki Vero hodowane w zawiesinie w pożywce bez surowicy mogą wspierać replikację NDV do mian porównywalnych do tych osiąganych w jajach, przed oczyszczaniem21. Wymagało to jednak seryjnego przenikania wirusa w celu adaptacji wirusa do komórek Vero, a optymalizacja metody oczyszczania NDV z zawiesinowych komórek Vero jest nadal wymagana21.
Jak podkreślono wcześniej, metody używane do oczyszczania wirusa in vivo różnią się w zależności od wirusa, o którym mowa22. Istnieje dobrze ugruntowany system genetyki odwrotnej dostępny do wytwarzania rekombinowanego NDV. Proces ten, obejmujący wykorzystanie klonu cDNA, plazmidów pomocniczych i wirusa pomocniczego eksprymującego polimerazę RNA T7, został wcześniej szczegółowo opisany15,23. Protokół ten może być stosowany zarówno do lentogennego, jak i mezogenicznego NDV. Wirus opisany w tym protokole jest rekombinowanym mezogenicznym NDV kodującym białko zielonej fluorescencji (GFP) z meduzy Aequorea victoria wstawione między geny wirusa P i M jako indywidualna jednostka transkrypcyjna, ponieważ zostało to wcześniej opisane jako optymalne miejsce dla insercji obcego transgenu24.
Zamknięte metody opisują oczyszczanie NDV na podstawie jego rozmiaru, od 100 do 500 nm, oraz jego gęstości15. Pozwoliło to na wytworzenie in vivo stad NDV o wysokim mianie w ciągu około 3 tygodni, począwszy od momentu otrzymania jaj do uzyskania ostatecznego miana. Opisano techniki często stosowane w produkcji wirusów na bazie jaj na dużą skalę, takie jak filtracja z przepływem stycznym, filtracja wgłębna i ultrawirowanie w gradionym gradieniu gęstości, co umożliwia zastosowanie tych metod w produkcji na większą skalę. Poprzednio opisane techniki oczyszczania NDV zostały ulepszone poprzez włączenie buforu stabilizującego wirusa, zastosowanie jodiksanolu podczas ultrawirowania w gradiacji gęstości oraz opis różnych środków kontroli jakości w celu zapewnienia jakości in vivo15. Pozwoliło to na oczyszczenie NDV in vivo, osiągając miana tak wysokie, jak 3 ×10 10 PFU/ml od 0,8 do 1,0 l płynu omoczniowego.

<table><tbody><tr><td>0,25% HyClone Trypsyny</td><td></td><td>SH30042,02</td><td></td></tr><tr><td>1 ml strzykawka z końcówką ślizgową</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 ml strzykawka Luer-Lok</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>10% roztwór jodu powidonu</td><td>LORIS</td><td>109-08</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówki stożkowe</td><td>Thermo-Fisher</td><td>14955240</td><td></td></tr><tr><td>18G x 1 1/2 cala igła do napełniania</td><td>BD</td><td>305180</td><td></td></tr><tr><td>18G x 1 1/2 cala Igła do precyzyjnego ślizgu</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Igła 25 G x 5/8 cala</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Thermo-Fisher</td><td>03446I-100</td><td></td></tr><tr><td>30% akrylamid/roztwór bis 37,5:1</td><td>BioRad</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyd-PBS</td><td>Thermo-Fisher</td><td>J19943-K2</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Luer-Lok Strzykawka</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>96 dołków Płytka do hodowli tkankowych - Płaskie dno</td><td>Greiner Bio One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy, lodowaty</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Froggabio</td><td>A87-500G</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 488 Kozia Anty-Mysz</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Allegra X-14</td><td>Beckman Redlica</td><td>B08861</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>BioRad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Wybielacz (5%)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>36-102-0599</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze szeroko, nieząbkowane</td><td>Thermo-Fisher</td><td>09-753-50</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114405-25G</td><td></td></tr><tr><td>Centramate Uchwyt kasety</td><td>PALL</td><td>CM018V</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc XRS+</td><td>BioRad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2 </td><td>Thermo-Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-259</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP101-50</td><td></td></tr><tr><td>DF1 Cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-12203</td><td></td></tr><tr><td>Żel dietetyczny do odzyskiwania</td><td>ClearH2O, INC</td><td>72-01-1062</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy inkubator jaj Sportsman 1502</td><td>Berry Hill</td><td>1502W</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125-500G</td><td></td></tr><tr><td>Świecznik do jaj</td><td>Berry Hill</td><td>A46</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (70%)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP82031GAL</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), pH 8,0, 0,5 M w H2O</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>Trójnik z gwintem wewnętrznym, nylon, 1/8 cala NPT(F)</td><td>Cole-Parmer</td><td>06349-50</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td> precyzyjne <td>Fine Point Thermo-Fisher</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>ZEISS AXIO</td><td></td><td>Niekonieczne, jeśli nie wykonuje IFA lub jeśli NDV nie koduje białka fluorescencyjnego</td></tr><tr><td>System liofilizacji Freezone 4.5</td><td>LABCONCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GiBOX Gel Imager</td><td>Obrazowanie syngenetyczne</td><td></td><td>żeli agarozowych</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Thermo-Fisher</td><td>G33-1</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw odwrotnej transkryptazy cDNA o dużej pojemności</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowana pożywka eteryczna Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy</td><td></td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw wilgotności</td><td>Berry Hill</td><td>3030</td><td></td></tr><tr><td>Jodixanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>60% (w/v) roztwór jodiksanolu w wodzie (sterylny)</td></tr> <tr><td>Monochlorowodorek L-lizyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62929-100G-F</td><td></td></tr><tr><td>Męski i żeński Luer-Lok 1/8 cala krajowy gwint rurowy, NPT</td><td>Cole-Parmer</td><td>41507-44</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Cyfrowy napęd</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-07522-20</td><td>Pompa perystaltyczna z wyświetlaczem cyfrowym</td></tr><tr><td>Masterflex L/S Łatwe ładowanie Głowica pompy do przewodów precyzyjnych</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-07514-10</td><td></td></tr><tr><td>Rurka silikonowa Masterflex (platynowa) L/S 16</td><td>Cole-Parmer</td><td>96420-16</td><td>BioPharm Silikon utwardzany platyną</td></tr><tr><td>MC Pro 5 Termocykler</td><td>Eppendorf</td><td>EP950040025</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean Tetra Cell</td><td>BioRad</td><td>1658000EDU</td><td>SDS-PAGE cast i działający appartus</td></tr><tr><td>Mouse-Anti-NDV</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-11633</td><td>Klon 6H12</td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Abcam</td><td>AB7481</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Thermo-Fisher</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>Kaseta centramate z membraną Omega LV, 100K</td><td>PALL</td><td>OS100T02</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 Ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>OWL Easycast B1A Mini żelowy system elektroforetyczny</td><td>Thermo-Fisher</td><td>B1A</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10X Roztwór</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP399-20</td><td></td></tr><tr><td>Poli(glikol etylenowy) Średnia Mn 20 000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81300-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PowePac 300</td><td>BioRad</td><td></td><td>Model 1655050 - do elektroforezy w żelu agarozowym</td></tr><tr><td>Q5 High Fidelity 2X Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492S</td><td></td></tr><tr><td>QIA Amp Viral RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>52904</td><td></td></tr><tr><td>RedSafe</td><td>Thermo-Fisher</td><td>50999562</td><td></td></tr><tr><td>Kaseta do dializy Slide-a-lyzer (dodatkowa moc), 10 000 MWCO 0,5-3 ml</td><td>Thermo-Fisher</td><td>66380</td><td></td></tr><tr><td>Dodecyl siarczan sodu</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (granulki)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>S318-10</td><td></td></tr><tr><td>Jaja wolne od specyficznych patogenów</td><td>Dostawca CFIA</td><td>NA</td><td>będzie się różnić w zależności od lokalizacji</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Thermo-Fisher</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>Supracap 50 Filtr wgłębny</td><td>PALL</td><td>SC050V100P</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td> <td>chirurgiczneThermo-Fisher</td><td>08-951-5</td><td></td></tr><tr><td>Sw41Ti Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td>Używany w kroku protokołu 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7</td></tr><tr><td>SX4750 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>369702</td><td></td></tr><tr><td>SxX4750 Adapter do rur z konspiracyjnym dnem</td><td>Beckman Coulter</td><td>359472</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Invitrogen</td><td>15524-010</td><td></td></tr><tr><td>Cienkościenne probówki wirówkowe Ultraclear ( 9/16 cala x 3 1/2 cala)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Zacisk śrubowy do rurek</td><td>PALL</td><td>88216</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379-1L</td><td></td></tr><tr><td>Manometry uniwersalne</td><td>Cole-Parmer</td><td>68355-06</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie rekombinowanego wirusa rzekomego pomoru drobiu o wysokim mianie z płynu omoczniowego

Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid

Wirus rzekomego pomoru drobiu (NDV), znany również jako serotyp 1 ptasiego ortoawulawirusa, jest jednoniciowym wirusem RNA o negatywnym znaczeniu, który został opracowany zarówno jako wirus onkolityczny, jak i szczepionka wektorowa. NDV jest atrakcyjnym środkiem terapeutycznym i profilaktycznym ze względu na dobrze ugruntowany system genetyki odwrotnej, silne właściwości immunostymulujące i doskonały profil bezpieczeństwa. Podawany jako wirus onkolityczny lub szczepionka z wektorem wirusowym, NDV wywołuje silną odpowiedź immunologiczną swoistą przeciwnowotworowo lub antygenowo, aktywując zarówno wrodzone, jak i adaptacyjne ramię układu odpornościowego. 
Biorąc pod uwagę te pożądane cechy, NDV został oceniony w licznych badaniach klinicznych i jest jednym z najlepiej przebadanych wirusów onkolitycznych. Obecnie zarejestrowane są dwa badania kliniczne z udziałem NDV: jedno oceniające rekombinowaną szczepionkę wektorową NDV przeciwko SARS-CoV-2 (NCT04871737), a drugie oceniające rekombinowaną NDV kodującą interleukinę-12 w połączeniu z Durvalumabem, przeciwciałem antyPD-L1 (NCT04613492). Aby ułatwić dalszy rozwój tego wysoce obiecującego wektora wirusowego, potrzebne są uproszczone metody generowania rekombinowanego NDV (rNDV) o wysokim mianie in vivo. 
Ten artykuł opisuje szczegółową procedurę amplifikacji rNDV w zarodkach jaj kurzych wolnych od określonych patogenów (SPF) oraz oczyszczania rNDV z płynu omoczniowego, z ulepszeniami w celu zmniejszenia strat podczas oczyszczania. Dołączono również opisy zalecanych testów kontroli jakości, które należy przeprowadzić w celu potwierdzenia braku zanieczyszczeń i integralności wirusa. Ogólnie rzecz biorąc, ta szczegółowa procedura umożliwia syntezę, oczyszczanie i przechowywanie NDV o wysokim mianie, in vivo, rekombinowanego, lentogennego i mezogenicznego NDV do wykorzystania w badaniach przedklinicznych.

Pozyskiwanie płynu alantoicznego 
Płyn alantoiczny pozyskiwany z zarodkowych jaj kurzych powinien być klarowny i przezroczysty. Jeśli płyn jest mętny i żółty, wskazuje to na obecność zanieczyszczeń. Włączenie takiego płynu alantoicznego do procesu oczyszczania utrudni tę procedurę, ponieważ ciśnienie szybko wzrośnie i przekroczy 10 psi, co doprowadzi do ścinania wirusa i utraty jego zakaźności. Płyn alantoiczny o krwawym wyglądzie sugeruje, że jaja zostały inokulowane zbyt dużą liczbą PFU wirusa. Wy...

Tutaj przedstawiamy szczegółową procedurę produkcji, oczyszczania i kwantyfikacji rekombinowanego wirusa rzekomego pomoru drobiu o wysokim mianie. Protokół ten konsekwentnie daje > 6 × 109 jednostek tworzących blaszki miażdżycowe/ml, zapewniając ilości wirusa odpowiednie do badań in vivo na zwierzętach. Opisano dodatkowe testy kontroli jakości w celu zapewnienia bezpieczeństwa in vivo.

Wytwarzanie rekombinowanego wirusa rzekomego pomoru drobiu o wysokim mianie z płynu omoczniowego

Newcastle disease virus (NDV), also known as avian orthoavulavirus serotype-1, is a negative sense, single-stranded RNA virus that has been developed both ...

Protokół ten określa techniki stosowane do produkcji wirusa rzekomego pomoru drobiu, tak aby można go było bezpiecznie podawać myszom i innym zwierzętom, takim jak chomiki i owce. Zastosowanie filtracji z przepływem stycznym pozwala na bardziej efektywne przetwarzanie dużych objętości początkowych w porównaniu z istniejącymi procedurami, które wykorzystują tylko procesy wirowania. Jest to długa procedura składająca się z kilku skomplikowanych kroków, co oznacza, że zarządzanie czasem może stanowić problem.Zalecałbym zidentyfikowanie wszystkich potencjalnych kroków pauzy, aby technika mogła być odpowiednio podzielona, minimalizując stres. Tę procedurę zademonstruje Alex, asystent naukowy z mojego laboratorium. W celu oczyszczenia z wirusa rzekomego pomoru drobiu lub NDV, najpierw należy zagruntować wcześniej ustawiony system eksperymentalny, przepuszczając przez niego 50 mililitrów PBS.Zatrzymaj pompę, gdy w rurce pozostanie około pięciu mililitrów PBS. Następnie podłącz do rurki filtr wgłębny o współczynniku retencji od jednego do trzech mikromolowych. Aby odpowietrzyć filtr, zdejmij drugą nasadkę po epickiej stronie filtra wgłębnego, a następnie zacznij przepuszczać przez system dodatkowe 50 mililitrów PBS.Gdy PBS zacznie przepływać przez otwór wentylacyjny w górnej części filtra, zamknij port i kontynuuj przepływ PBS przez przewody. Następnie wymień naczynie na odpady na nowe sterylne naczynie zbiorcze i zacznij przepuszczać płyn omoczniowy przez filtr wgłębny. Następnie skonfiguruj system filtracji o przepływie stycznym lub TFF w otwartym potwierdzeniu i uruchom zgodnie z opisem w manuskrypcie.Gdy w zbiorniku pozostało około pięciu mililitrów płynu, wstrzymaj pompę i dodaj do zbiornika przefiltrowany płyn omocznikowy. Następnie wznów przepływ pompy. Aby zapobiec ścinaniu wirusa, ważne jest, aby upewnić się, że ciśnienie w systemie nie przekracza 10 funtów siły na cal kwadratowy.Aby zwiększyć złudzenie, należy zastosować kombinację prędkości pompy perystaltycznej i zacisku C. W zbiorniku pozostawia się od 150 do 100 mililitrów płynu omoczniowego, wstrzymać pompę i wymienić bufor, dodając od 150 do 200 mililitrów buforu ML. Ponownie wstrzymaj pompę, gdy w zbiorniku pozostanie od pięciu do 10 mililitrów płynu, a następnie za pomocą dwóch zacisków C zamknij linię talii.Odłącz retencyjną linię zasilającą zbiornik i włóż ją do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Następnie wznów przepływ i zatrzymaj się, gdy w zbiorniku pozostało kilka kropel płynu. Następnie usuń zaciski C z przewodów odpływowych i ponownie podłącz zatrzymany przewód zasilający do zbiornika zbiornika.Tymczasem, aby przygotować się do ultrawirowania w gradionym spadku gęstości jodiksanolu, najpierw dodaj 0,5 mililitra 40% jodiksanolu do 13,2 mililitra cienkościennej ultra wirówki o pojemności 13,2 mililitra. Następnie przygotuj kolumnę, dodając kolejno 2,5 mililitra 20% jodiksanolu i 2,5 mililitra 10% jodiksanolu. Przed ultrawirowaniem ostrożnie dodaj od sześciu do 6,5 mililitra roztworu wirusa naniesionego z systemu TFF do kolumny jodiksanolu, nie naruszając gradientu.Po ultraodwirowaniu wyjmij probówki za pomocą sterylnych kleszczy. Pasma docelowe powinno być dużym pasmem między nachyleniami od 10 do 20%. Następnie zawieś rurkę na wierzchu zlewki za pomocą stojaka na retortę.Następnie przymocuj igłę 1,5 cala o rozmiarze 18 do pięciomililitrowej strzykawki, a następnie nakłuj igłą bok probówki ultrawirówki i usuń opaskę docelową, powoli wysuwając tłok. Po usunięciu jodiksanolu z roztworu wirusa, jak opisano w manuskrypcie, należy użyć strzykawki, aby ostrożnie wstrzyknąć wirusa do kasety dializacyjnej. Aby zagęścić roztwór wirusa, należy wyjąć kasetę dializacyjną z buforu do dializy i umieścić ją w małej, zamykanej plastikowej torbie.Następnie dodaj 15 do 25 mililitrów 40% glikolu polietylenowego do worka, tak aby kaseta dializy była całkowicie zanurzona. Po dializie krótko przepłukać kasetę dializacyjną PBS. Następnie napełnić strzykawkę wyposażoną w igłę o średnicy 1,5 cala o rozmiarze 18 rano, włożyć strzykawkę do kasety dializacyjnej i nacisnąć tłok.Obróć aparat do usuwania wirusa bez usuwania wprowadzanego powietrza. Aby usunąć resztki wirusa przylegające do membrany, ostrożnie masuj membranę palcami w rękawiczkach, nie uszkadzając jej. Aby ułatwić proces usuwania powietrza, należy usunąć część nadmiaru powietrza z kasety do dializy.W przypadku testów kontroli jakości, najpierw rozcieńcz roztwór wirusa 100 razy, dodając 10 mikrolitrów do 990 mikrolitrów PBS w probówce o pojemności 1,5 mililitra. Następnie kontynuuj seryjne rozcieńczanie, dodając 100 mikrolitrów poprzedniego rozcieńczenia do 900 mikrolitrów PBS. W przypadku testów infekcji dodaj 20 mikrolitrów każdego złudzenia do każdej studzienki na 96-dołkowej płytce.Przed zbadaniem cytopatycznego działania białka zielonej fluorescencji lub wykonaniem pośredniego testu immunofluorescencyjnego, należy inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez co najmniej 48 godzin. Dzięki zastosowaniu tego protokołu uzyskano wysoce oczyszczony NDV, co wykazano za pomocą elektroforezy białek wirusa w żelu poliakrylamidowym siarczanu sodu. Zakaźność wirusa oczyszczonego tą metodą zweryfikowano również za pomocą 50% dawki zakażenia kulturą tkankową lub testu TCID50 wykonanego na płytkach 96-dołkowych.TCID50 określono na podstawie liczby dołków dodatnich dla każdego rozcieńczenia za pomocą kalkulatora Spearmana-Karbera. Test infekcji ujawnił różnicę między cytopatycznym wpływem lentogennego i mezogennego NDV na komórki DF one w różnych warunkach po 10 i 24 godzinach inkubacji. Test immunoflorencyjny okazał się również skuteczny w badaniu zakażenia komórek Vero przez lentogenny NDV.Podczas zalewania systemu doświadczalnego należy upewnić się, że linie są skutecznie zalane, ponieważ wszelkie pozostałości wodorotlenku sodu dezaktywują wirusa. Ważne jest również, aby zachować integralność błony, ponieważ jej naruszenie znacznie pogorszy oczyszczanie i wydajność wirusa.

production-high-titer-recombinant-newcastle-disease-virus-from

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Odzyskiwanie wirusów grypy typu A z plazmidowego DNA jest podstawową i niezbędną techniką eksperymentalną, która pozwala badaczom grypy na generowanie wirusów rekombinowanych w celu badania wielu aspektów biologii wirusa grypy, a także do wykorzystania ich jako potencjalnych wektorów lub szczepionek.

Generowanie rekombinowanego wirusa grypy z plazmidowego DNA

W niniejszym artykule opisujemy identyfikację serotypu 3 wirusa towarzyszącego adenowirusom (AAV3) jako najskuteczniejszego wektora do celowania w ludzkie komórki raka wątroby.<br...

Wysokoefektywna transdukcja komórek raka wątroby za pomocą wektorów rekombinowanego wirusa adeno-zależnego serotypu 3

Wektory rekombinowanego wirusa towarzyszącego adenowirusom (rAAVs) stają się coraz bardziej cenne w badaniach in vivo na zwierzętach. Opisujemy, w jaki sposób rAAVs mogą być produkowane w laboratorium oraz jak można oznaczać miano tych wektorów, aby uzyskać dokładny odczyt liczby wyprodukowanych cząstek zakaźnych.

Produkcja i miareczkowanie rekombinowanych wektorów wirusowych opartych na wirusie towarzyszącym adenowirusom (AAV)

W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół oparty wyłącznie na infekcji komórek, który zwiększa wydajność produkcji rekombinowanego parwowirusa ponad 100-krotnie w porównaniu z innymi stosowanymi protokołami. Protokół ten opiera się na wykorzystaniu nowego pomocniczego adenowirusa typu 5 zawierającego jednostkę transkrypcyjną VP parwowirusa (Ad-VP).

Wydajna produkcja rekombinowanego parwowirusa z wykorzystaniem systemów pochodnych adenowirusa

Source: Brauer, R. et al., Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the synthesis and harvest of the influenza virus in fertilized chicken eggs. The virus is inoculated into the allantoic cavity, where it replicates in epithelial cells and buds into the allantoic fluid, which is then collected and stored for downstream applications.

Propagation and Harvest of Influenza Virus from a Fertilized Chicken Egg

Ratowanie rekombinowanych arenawirusów ze sklonowanych cDNA, podejście określane jako genetyka odwrotna, pozwala badaczom badać rolę określonych produktów genowych wirusa, a także wkład ich różnych specyficznych domen i reszt, w wielu różnych aspektach biologii arenawirusa. Podobnie, techniki genetyki odwrotnej w zatwierdzonych przez FDA liniach komórkowych (Vero) do opracowywania szczepionek zapewniają nowe możliwości generowania skutecznych i bezpiecznych szczepionek do zwalczania ludzkich...

Generowanie rekombinowanego arenawirusa do opracowania szczepionki w komórkach Vero zatwierdzonych przez FDA

Wirus rzekomego pomoru drobiu (NDV) był intensywnie badany w ciągu ostatnich kilku lat w celu opracowania nowych wektorów do szczepień i terapii, między innymi. Badania te były możliwe dzięki technikom ratowania rekombinowanego wirusa z cDNA, takim jak te, które tutaj opisujemy.

Ratowanie rekombinowanego wirusa rzekomego pomoru drobiu z cDNA

Płodne jaja kurze są powszechnie używane do produkcji dużych ilości ludzkiego wirusa grypy A, ponieważ zapewniają wygodny i opłacalny system do udowodnienia wysokich plonów wirusa.

Namnażanie się wirusa grypy w zarodkach kurzych jaj

Tutaj przedstawiamy szczegółową procedurę produkcji na dużą skalę wektorów AAV klasy badawczej przy użyciu przylegających komórek HEK 293 hodowanych w stosach komórkowych i oczyszczania metodą chromatografii powinowactwa. Protokół ten konsekwentnie daje &gt;1 x 1013 genomów wektorowych/ml, zapewniając ilości wektorów odpowiednie dla badań na dużych zwierzętach.

Produkcja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w stosach komórkowych do badań przedklinicznych na dużych modelach zwierzęcych

Wraz z rozwojem terapii genowej, rośnie zapotrzebowanie na innowacyjne metody, które mogą sprostać tym wyzwaniom. Zaprezentowano tu unikalną metodę, która usprawnia proces generowania wysokowydajnych i czystych wektorów AAV z wykorzystaniem platformy fabryki komórek, spełniającej standardy jakości dla badań in vivo.

Uproszczona i ustandaryzowana procedura generowania wysokiej jakości wektorów wirusowych związanych z adenowirusem o wysokim mianie z wykorzystaniem platformy Cell Factory

Ten artykuł przedstawia uproszczoną metodę przygotowania 4 jednostek hemagglutynacji antygenu do testów serologicznych wirusa rzekomego pomoru drobiu. Dzięki dokładnemu określeniu miana hemaglutynacji antygenu, w połączeniu z bardziej rygorystyczną metodą miareczkowania wstecznego i dobrze zdefiniowanym procesem regulacji, zwiększa wydajność testu, zmniejsza liczbę wyników fałszywie dodatnich i poprawia nadzór nad chorobami u drobiu.

Optymalizacja preparatu antygenowego do oznaczania hamowania hemaglutynacji wirusa rzekomego pomoru drobiu

Poznaj metodę wytwarzania rekombinowanego wirusa rzekomego pomoru drobiu o wysokim mianie z płynu omoczniowego. Protokół obejmuje filtrację przepływową, ultrawirówkę w gradiencie jodoksanolu oraz kontrolę jakości.

Wytwarzanie rekombinowanego wirusa rzekomego pomoru drobiu o wysokim mianie z płynu omoczniowego

Przeglądaj więcej filmów