Analiza morfologii organoidów odbytniczych (ROMA): test diagnostyczny w mukowiscydozie

ROMA może rozróżniać organoidy od osób z mukowiscydozą i bez mukowiscydozy, gdy stwierdzono mniej niż dwie chorobowe mutacje CFTR i gdy fluorek potu jest pośredni. ROMA może być wykonywana w każdym wieku i przy niskim odsetku powikłań. Analiza jest półautomatyczna i standaryzowana, a biopsje mogą być wysyłane do centralnego laboratorium w celu analizy.

Organoidy stosowane w ROMA mogą być również wykorzystywane do uzyskiwania dostępu do skuteczności modulacyjnej CFTR, a ROMA może pomóc w pomiarze stopnia przywrócenia funkcji CFTR. Dzień po posianiu zabarwić organoidy zielenią wapniową. Obróć i lekko przechyl talerz z założoną pokrywką kilka razy, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie zieleni wapniowej w całej studzience.

Ponownie inkubować płytkę przez 15 do 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby zapewnić zabarwienie wszystkich organoidów w studzienkach. Aby ustawić ostrość na organoidach, określ optymalną pozycję X i Y i skup się na organoidach w każdym dołku ręcznie, za pomocą mikroskopu konfokalnego. I zapisz te pozycje w oprogramowaniu do obrazowania.

Następnie, korzystając z ustawień obrazowania żywych komórek, ustaw emisję na 488 nanometrów i wzbudzenie na 515 nanometrów, a obiektyw powiększenia LD na 5X. Aby uzyskać obrazy organoidów, należy wykonywać zdjęcia w sposób jednokierunkowy z rozdzielczością 1024 pikseli na 1024 piksele i głębią 16 bitów za pomocą mikroskopu konfokalnego. Wybierz intensywność lasera i wzmocnienie główne, aby optymalnie zobrazować różnice morfologiczne między organoidami mukowiscydozy i bez mukowiscydozy.

Rozpocznij eksperyment, aby przechwycić obrazy. Następnie zapisz po jednym obrazie dla każdego dołka dla wszystkich 32 dołków w formacie mikroskopu i wyeksportuj je jako pliki TIFF. Najpierw załaduj pliki TIFF do oprogramowania do analizy obrazu, a następnie przeprowadź pierwszą kontrolę jakości na podstawie kryteriów wykluczenia określonych przez operatora.

Wykluczyć zestaw obrazów, jeśli występuje wiele zróżnicowanych lub martwych struktur lub szczątków, gdy gęstość posiewu jest niewystarczająca, gdy obecnych jest zbyt wiele lub zbyt mało organoidów oraz w przypadku nieodpowiedniego rozkładu fluorescencji. Aby przygotować obrazy do analizy, należy utworzyć i otworzyć jeden plik danych sieciowych zawierający wszystkie 32 obrazy dla każdej hodowli organoidów, umożliwiając jednoczesną analizę wszystkich 32 obrazów na obiekt. I ponownie skalibruj obrazy tak, aby jeden piksel odpowiadał 2,5 na 2,5 mikrometra.

Następnie wyznacz struktury, używając dolnego progu intensywności 4 500 i górnego progu 65 535, wyłączając funkcje gładkie i czyste, włączając funkcję wypełniania otworów i umieszczając oddzielną funkcję na 3X. Aby policzyć organoidy, wybierz wszystkie struktury większe lub równe 40 mikrometrów. Następnie kliknij przycisk aktualizacji pomiaru ND, a zliczone organoidy zostaną ponumerowane.

Aby zmierzyć intensywność i kołowość do obliczeń, wybierz wszystkie struktury większe lub równe 60 mikrometrów i policz. Następnie usuń wszystkie struktury stykające się z krawędziami obrazu. Następnie oderwij jeden piksel od granicy każdej struktury o wielkości większej lub równej 60 mikrometrów i zmierz średnią intensywność każdej struktury.

Następnie ponownie zaznacz wszystkie struktury większe lub równe 60 mikrometrów i zeroduj 10 pikseli od granicy każdej struktury o wielkości większej lub równej 60 mikrometrów. Następnie zmierz średnią intensywność każdej zerodowanej struktury i okrągłość każdej struktury. Następnie należy obliczyć współczynnik intensywności, dzieląc pomiar intensywności po erodowaniu 25 mikrometrów od granicy każdej struktury o wielkości większej lub równej 60 mikrometrów przez średnią pomiaru intensywności po erodowaniu 2,5 mikrometra od granicy każdej struktury o wielkości większej lub równej 60 mikrometrów.

Przeprowadź drugą kontrolę jakości w oparciu o kryteria wykluczenia określone przez oprogramowanie zgodnie z opisem w manuskrypcie. Zebrano i zobrazowano organoidy od 212 osób. Po wykluczeniu 23 zestawów zdjęć, przeanalizowano obrazy organoidów od 167 osób z mukowiscydozą i dwiema mutacjami powodującymi chorobę CFTR oraz od 22 osób bez mukowiscydozy, stwierdzono, że średnia liczba organoidów na kulturę wynosi 1 519.

Współczynnik intensywności i wskaźnik cyrkularności określono dla organoidów od osób z mukowiscydozą i bez mukowiscydozy. Korzystając z tych dwóch wskaźników, uzyskano doskonałą dyskryminację między organoidami od osób z mukowiscydozą i bez mukowiscydozy nie tylko przy użyciu danych ze wszystkich 32 dołków, ale także wtedy, gdy osiem dołków wybrano losowo dla każdej hodowli. Uzyskano histogramy dla czterech kultur ilustracyjnych, pokazujące rozkład wartości dla cyrkularności, intensywności centralnej części organoidu oraz intensywności całego organoidu.

Kontrola jakości jest niezbędna, ponieważ do dokładnego obliczenia współczynnika intensywności i wskaźnika cyrkularności wymagane są zdjęcia wysokiej jakości. Hodowle organoidów stworzone dla ROMA mogą być również wykorzystywane jako pomoce fizyczne do testowania efektów leczenia CFTR. RNA, DNA i białko można wyekstrahować w celu dalszej charakterystyki wariantów CFTR.