Przygotowanie nerwu kulszowego szczura do neurofizjologii ex vivo

Protokół ten umożliwia obserwację wielu zjawisk neurofizjologicznych, które nie są dobrze poznane, takich jak przenoszenie blokady nerwowej po wstrzyknięciu prądu o wysokiej częstotliwości/wysokiej amplitudzie, jednocześnie zapobiegając zakłóceniom wynikającym z innych procesów zachodzących w żywym ciele. Technika ta daje wysoce powtarzalne, wiarygodne wyniki i jest bardziej praktyczna niż elektrofizjologia in vivo, ponieważ złożone zmienne, takie jak głębokość znieczulenia, nie muszą być kontrolowane, a zatem nie mogą wpływać na pomiary. Po zabiegu eutanazji w znieczuleniu umieść samicę szczura na stole sekcyjnym, mocno przytrzymaj kostkę między kciukiem, palcem wskazującym i palcem środkowym i przetnij ścięgno piętowe za pomocą 12-centymetrowych prostych nożyczek.

Za pomocą cienkich kleszczy i nożyczek wykonaj ostrożne nacięcia przez warstwy mięśni w pobliżu środka tylnej części nogi, aż nerw kulszowy zostanie odsłonięty. Gdy nerw jest widoczny, nawilż jamę za pomocą lodowatego zmodyfikowanego buforu Krebs-Henseleit lub MKHB, aby zapobiec wysuszeniu nerwu. Za pomocą hemostatów pociągnij płaty skóry z każdej strony i utrzymuj nacięcie otwarte, aby uzyskać dokładniejsze rozwarstwienie.

Zaczynając od miejsca nacięcia ścięgna kości piętowej, za pomocą cienkich nożyczek przerwij mięsień po przyśrodkowej stronie nogi, aby uwolnić nerw. Kontynuuj utrzymywanie poziomu wilgoci w okolicy za pomocą lodowatego MKHB. Gdy nerw jest odsłonięty podczas poruszania się w górę nogi, wypreparuj leżącą nad nim tkankę mięśniową.

Uwolnij nerw bliżej kręgosłupa z tkanek łącznych, aż dotrze do szczeliny kręgosłupa, w którym to momencie dochodzi do załamania nerwu. Nie czyść jeszcze nerwu, ponieważ na tym etapie niezbędna jest szybkość. Aby ułatwić preparację, za pomocą kleszczy delikatnie pociągnij koniec nerwu w pobliżu kostki.

Następnie za pomocą cienkich nożyczek podrażnij nerw w pobliżu kręgosłupa. Umieść wypreparowany nerw w 15-mililitrowej probówce wirówkowej wypełnionej MKHB i umieść probówkę z powrotem na lodzie do rozpoczęcia procedury czyszczenia. Napełnij powlekaną szalkę Petriego do połowy schłodzonym natlenionym MKHB, a następnie umieść jeden wycięty nerw kulszowy w naczyniu i przypnij oba końce nerwu do naczynia tak, aby nerw był prosty bez załamań, skrętów lub skrętów.

Używając jedwabnych szwów 6-0 lub cienkiej nici, zawiąż podwójny węzeł wokół każdego końca nerwu, aby zapobiec wyciekowi cytozolu do buforu. Umieść węzły tuż obok szpilek owadów po stronie bliżej środka nerwu, aby zapobiec wyciekowi z tkanki nerwowej do bufora. Pod mikroskopem, za pomocą dwumilimetrowych skośnych nożyczek sprężynowych i cienkich kleszczy, usuń tłuszcz, naczynia krwionośne i tkankę mięśniową z nerwu.

Przycinaj wszystkie gałęzie nerwowe, które nie będą używane w stymulacji i nagrywaniu. Po każdych pięciu minutach czyszczenia należy wymienić bufor na świeży, schłodzony, natleniony MKHB. Po oczyszczeniu umieść nerw z powrotem w rurze transportowej wypełnionej buforem i oprzyj rurkę na lodzie.

Przygotuj czystą, dwukomorową kąpiel nerwową. Używając standardowych głowic i chwytaków laboratoryjnych, umieść kąpiel nerwową poniżej poziomu dwulitrowej butelki umieszczonej na mieszadle grzewczym. Podłączyć odpływ wanny do wlotu pompy perystaltycznej.

Podłączyć wylot pompy perystaltycznej do rurki prowadzącej z powrotem do butelki buforowej. Podłącz wlot wanny do rurki z regulowanym zaworem przepływu i włóż rurkę do butelki. Użyj zaworu trójdrogowego ze strzykawką podłączoną do środkowego wylotu, aby pomóc w zalaniu rurki jako syfonu do grawitacyjnego dopływu bufora.

Zalać syfon, wciągając strzykawkę, aż bufor wpłynie do niego. Skonfiguruj zawór tak, aby natężenie przepływu bufora do kąpieli wynosiło od pięciu do sześciu milimetrów na minutę. Natężenie przepływu można początkowo zwiększyć, aby napełnić wannę.

Gdy poziom bufora kąpieli osiągnie odpływ, umieść nerwy w wannie. Za pomocą szpilki przeciw owadom zabezpiecz koniec nerwu w rogu komory kąpielowej wypełnionej buforem. Używając cienkich kleszczy pod kątem 45 stopni i ściskając nerw tylko na końcach, ostrożnie przeciągnij nerw, który ma być stymulowany, przez otwór w przegrodzie między dwiema komorami kąpieli.

Za pomocą szpilki przeciw owadom zabezpiecz drugi koniec nerwu w komorze olejowej wanny, upewniając się, że nerw jest prosty bez rozciągania i jest wolny od załamań i skrętów. Za pomocą smaru silikonowego wykonaj uszczelkę, aby zapobiec wyciekowi bufora z komory buforowej do komory olejowej Napełnij komorę olejową silikonem lub olejem mineralnym. Umieść haki elektrod rejestrujących srebro/chlorek srebra w komorze kąpieli olejowej i zabezpiecz je za pomocą głowic i chwytaków.

Następnie ułóż część nerwu w kąpieli olejowej na haczykach, nie napinając nerwu. Wyreguluj lub napraw uszczelkę smaru silikonowego, jeśli po przesunięciu nerwu zaobserwuje się jakikolwiek wyciek. Podłącz referencyjną elektrodę srebra/chlorku srebra do ampuziemienie wzmacniacza i umieść elektrodę w komorze kąpieli wypełnionej buforem, zabezpieczając ją za pomocą chwytaka laboratoryjnego.

Po przygotowaniu czystej elektrody mankietu nerwowego do stymulacji, umieść elektrodę w komorze kąpieli wypełnionej buforem. Za pomocą kleszczy lub cienkiej pęsety z lub skośnymi końcówkami otwórz elektrodę w wannie, aby zwilżyć wnętrze mankietu. Jeśli pozostaną bąbelki, użyj cienkiej strzykawki, aby pobrać bufor z kąpieli i wypchnąć bąbelki z mankietu.

Za pomocą pęsety delikatnie otwórz mankiet i wsuń go pod nerw. Zamknij mankiet wokół nerwu, unikając załamywania się lub skręcania nerwu. Podłącz elektrodę stymulacyjną i elektrodę powrotną prądu do stymulatora.

Jeśli używasz kwadratowej platynowej blachy jako elektrody powrotnej prądu, umieść arkusz z dala od nerwu w kąpieli. Zabezpiecz oba elektrody taśmą. Podłącz wyjście sygnału TTL stymulatora do kanału czwartego oscyloskopu.

Na ekranie oscyloskopu naciśnij zakładkę Trigger channel (Kanał wyzwalający) i określ kanał czwarty jako kanał wyzwalający. Ustaw poziom spustu na jeden wolt za pomocą pokrętła poziomu. Na oscyloskopie ustaw rozdzielczość czasową na jedną milisekundę na działkę, a rozdzielczość napięcia na 10 miliwoltów na działkę.

Wyśrodkuj odniesienie spustu w czasie i ustaw poziom wyzwalania na jeden wolt. Po podłączeniu stymulatora do komputera należy włączyć stymulator poprzez podłączenie zasilacza bateryjnego do wejścia zasilania. Następnie uruchom oprogramowanie MATLAB na komputerze.

Wykonaj niestandardowy skrypt MATLAB. Następnie otwórz wskazany skrypt MATLAB. Edytuj skrypt i ustaw parametry amplituda impulsu stymulatora na minus 300 mikroamperów, szerokość impulsu stymulatora na 300 mikrosekund, liczba impulsów stymulatora na 10 oraz czas stymulacji między impulsami na jedną sekundę.

Uruchom protokół stymulacji, klikając Uruchom w oprogramowaniu. Złożony potencjał czynnościowy (CAP) miał amplitudę międzyszczytową wynoszącą jeden miliwolt na elektrodzie i 100 miliwoltów po wzmocnieniu. Typowa pobudliwość nerwów dla standardowych platynowych mankietów nerwowych i wykonanych na zamówienie przewodzących elastomerowych mankietów nerwowych jest pokazana tutaj.

CAP uzyskany ex vivo w ciągu jednego dnia eksperymentów z użyciem obu nerwów kulszowych pokazano tutaj. Minimalne zmniejszenie amplitudy CAP zaobserwowano w przypadku prawego nerwu kulszowego. W przeciwieństwie do tego, amplituda CAP lewego nerwu kulszowego na poziomie około trzech miliwoltów była podobna do amplitudy prawego nerwu kulszowego na początku eksperymentu ponad sześć godzin po ekstrakcji nerwu.

Kładź nacisk na precyzję i powtarzalność w technice preparacji, czyszczenia i wdrażania. Zwróć uwagę na to, co dzieje się w wannie. Jeśli sygnał nerwowy zostanie utracony, może to być po prostu spowodowane tym, że elektrody nie są w dobrym kontakcie lub że w przegrodzie z olejkiem do kąpieli znajduje się sól fizjologiczna, a nie to, że nerw jest martwy.

Użytkownicy po raz pierwszy mogą ulec pokusie pośpiechu, zwłaszcza w fazie sekcji. Prawdopodobnie doprowadzi to do błędów i uszkodzenia nerwu. Precyzja i konsekwencja są tutaj kluczowe i doprowadzą do wyższej jakości wyników.

Szczególną uwagę należy również zwrócić na spójność w przygotowaniu buforu.