Name: Przygotowanie nerwu kulszowego szczura do neurofizjologii ex vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Naucz się przygotowywać nerw kulszowy szczura do badań elektrofizjologicznych ex vivo. Ta metoda minimalizuje czynniki zakłócające i zapewnia powtarzalne wyniki w neurofizjologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują Dr. Geraldowi Hunsbergerowi z GlaxoSmithKline Pharmaceuticals, Królowi Prus, PA, USA oraz Galvani Bioelectronics (Stevenage, UK) za podzielenie się z nami swoją oryginalną techniką przygotowania nerwów. Autorzy dziękują Robertowi Tothowi za projekt dwukomorowej kąpieli nerwowej. Autorzy potwierdzają finansowanie z grantu Healthcare Technologies Challenge Awards (HTCA) Rady ds. Badań Inżynieryjnych i Fizycznych (EPSRC). Autorzy dziękują High Performance Embedded and Distributed Systems Centre for Doctoral Training (HiPEDS CDT) z Imperial College London za sfinansowanie projektu Adrien Rapeaux (EP/L016796/1 ). Adrien Rapeaux jest obecnie finansowany przez brytyjski Instytut Badań nad Demencją, Centrum Badań i Technologii Opieki. Autorzy dziękują Zackowi Baileyowi z Imperial College, na Wydziale Bioinżynierii, za pomoc w eksperymentach i dostęp do tkanek zwierzęcych podczas produkcji artykułu wideo JoVE.

Wszystkie procedury związane z opieką nad zwierzętami zostały przeprowadzone na podstawie odpowiednich licencji wydanych przez brytyjskie Ministerstwo Spraw Wewnętrznych na mocy Ustawy o zwierzętach (procedury naukowe) (1986) i zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Dobrostanu Zwierząt i Etyki Imperial College London.
1. Przygotowanie
UWAGA: Ta część protokołu może być przeprowadzona na długo przed resztą protokołu, z wyjątkiem końcowych etapów związanych z przygotowaniem zmodyfikowanego buforu Krebsa-Henseleita (mKHB) o stężeniu 1x.
<ol>
	<li>Przygotować 1 M roztwór podstawowy CaCl2
	<ol>
		<li>Dodać 14,701 g dwuwodzianu CaCl2 do czystej zlewki o pojemności 100 ml. Dodaj ~75 ml wody dejonizowanej i mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia soli.</li>
		<li>Przenieść roztwór do kolby miarowej o pojemności 100 ml i dodawać wodę dejonizowaną, aż do osiągnięcia objętości 100 ml. Przenieść roztwór do butelki i przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 10x skoncentrowany bulion mKHB
	<ol>
		<li>Do zlewki o pojemności 2 l dodać 66,03 g chlorku sodu (NaCl), 3,57 g chlorku potasu (KCl), 1,63 g diwodorofosforanu potasu (KH2PO4) i 1,44 g siarczanu magnezu.</li>
		<li>Dodaj ~ 750 ml wody dejonizowanej do zlewki i mieszaj, aż sole się rozpuszczą (na dnie mogą pozostać małe kryształki soli). Dodać 25 ml 1 M roztworu podstawowego CaCl2 (krok 1.1) i wymieszać; Upewnij się, że jest to ostatnia dodana sól.</li>
		<li>Przenieść roztwór do kolby miarowej o pojemności 1 l i dodać wodę dejonizowaną do uzyskania całkowitej objętości 1 l. Przenieść roztwór do butelki o pojemności 1 l. Przechowywać skoncentrowane 10x mKHB w temperaturze 4 °C w lodówce. 
		UWAGA: Skoncentrowany zapas mKHB można przechowywać przez około 1 miesiąc przed wymianą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować rozwarstwienie szalki Petriego (powlekanie)
	<ol>
		<li>Przygotuj czystą szklaną szalkę Petriego (o średnicy 120 mm) do powlekania, dokładnie myjąc i susząc naczynie.</li>
		<li>Postępując zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi użytkowania i utwardzania konforemnej powłoki alkoksylowej, pokryj dno szalki Petriego powłoką o grubości ~3-5 mm, ostrożnie wlewając mieszaninę powłok ochronnych do naczynia, aż do osiągnięcia pożądanej grubości.</li>
		<li>Powłokę utwardzić w suszarce w temperaturze 60 °C, aż stanie się twarda w dotyku. Szalka Petriego do preparacji jest już gotowa. 
		UWAGA: Delikatne czyszczenie naczynia po każdym użyciu zapewni, że powłoka będzie trwać przez lata, zanim konieczna będzie wymiana. Podczas wymiany powłoki należy upewnić się, że cały materiał powłokowy został usunięty przed nałożeniem nowej powłoki. Należy pamiętać, że konforemna powłoka alkoksylowa (tabela materiałów) zastosowana w tym protokole ma okres trwałości krótszy niż rok.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowania do presekcji
UWAGA: Ten krok rozpoczyna eksperyment. Poniższe kroki należy wykonać tego samego dnia, w tej kolejności.
<ol>
	<li>Przygotuj 1x mKHB
	<ol>
		<li>Przygotować czystą zlewkę o pojemności 2 l na bufor. Przenieść 200 ml bulionu 10x mKHB do zlewki o pojemności 2 l. Dodać 2,1 g węglanu sodu (NaHCO3) i 0,99 g bezwodnej dekstrozy (D-glukozy) do 2 l zlewki.</li>
		<li>Do zlewki dodać około 1 l wody dejonizowanej. Mieszaj, aż sole całkowicie się rozpuszczą. Przenieść roztwór do kolby miarowej o pojemności 2 l i dodać wodę dejonizowaną, aż do uzyskania całkowitej objętości 2 l.</li>
		<li>Przenieść roztwór do szklanej butelki o pojemności 2 litrów umieszczonej na mieszadle grzewczym o temperaturze ustawionej na 37 °C. 
		UWAGA: Mniejsze mieszadło grzewcze często nie będzie w stanie osiągnąć docelowej temperatury 37 °C ze względu na bezwładność cieplną dużych pojemników pełnych wody. Zwiększ temperaturę, aby zawartość butelki osiągnęła 37 °C, mieszając. Monitoruj temperaturę podczas eksperymentu i obniż ustawioną temperaturę w przypadku przeregulowania.</li>
		<li>Umieść termometr w butelce o pojemności 2 litrów, aby monitorować temperaturę, używając chwytaków, aby zapobiec uderzeniu termometru przez mieszającą się pchłę. Napowietrzać bufor karbogenem przez co najmniej 30 minut w celu natlenienia roztworu. To powinno ustawić pH na 7,4. Zmierz pH za pomocą pH-metru, aby upewnić się, że mieści się w zakresie 0,1 jednostki pH 7,4 (w 37 °C). 
		UWAGA: Aby dostosować pH do 7,4, w razie potrzeby użyj kwasu solnego lub wodorotlenku sodu.</li>
		<li>Napełnij dwie probówki wirówkowe o pojemności 15 ml i jedną butelkę o pojemności 100 ml mKHB i umieść je na lodzie do ostygnięcia. 
		UWAGA: Probówki wirówkowe i butelkę można czyścić i ponownie używać po każdym eksperymencie bez autoklawowania.</li>
		<li>W dalszej części eksperymentu należy kontynuować napowietrzanie buforu w 2-litrowej butelce z karbogenem w temperaturze 37 °C, ciągle mieszając. 
		UWAGA: Nienadzorowane stosowanie karbogenu może być niebezpieczne, jeśli nie ma automatycznych systemów odcinających przepływ gazu w przypadku wycieku. Zautomatyzowany czujnik i elektroniczny zawór odcinający mogą temu zapobiec; W przeciwnym razie należy pozostawić osobę do nadzorowania sprzętu, jeśli sekcja odbywa się w innym pomieszczeniu. We wszystkich przypadkach czujnik tlenu powinien być używany w pobliżu instalacji, aby ostrzec operatorów, gdy stężenie tlenu w otoczeniu wzrośnie powyżej 25%. Jeśli to możliwe, korzystaj z pomieszczenia z aktywną wentylacją.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Włącz urządzenie do akwizycji sygnału, przedwzmacniacz o niskim poziomie szumów, filtr szumów liniowych i oscyloskop do nagrywania i stymulacji, aby zapewnić wystarczająco dużo czasu na stabilizację temperatury.</li>
	<li>Upewnij się, że wszystkie elektryczne urządzenia rejestrujące są prawidłowo skonfigurowane
	<ol>
		<li>Ustaw przedwzmacniacz o niskim poziomie szumów na wejście sprzężone z prądem przemiennym z wejściowym filtrem pasmowo-przepustowym ustawionym na 6 dB roll-off na dekadę i częstotliwościami odcięcia ustawionymi odpowiednio na 30 Hz i 3 kHz dla filtrów górnoprzepustowych i dolnoprzepustowych.</li>
		<li>Ustaw wzmocnienie przedwzmacniacza o niskim poziomie szumów na 100.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Znieczulenie zwierząt i eutanazja
UWAGA: Do badań wykorzystano samice szczurów o wadze od 250 do 330 g (Tabela materiałów).
<ol>
	<li>Przygotuj narzędzia chirurgiczne i materiały eksploatacyjne: nożyczki proste 12 cm (); nożyczki sprężynowe kątowe 2 mm; cienkie nożyczki 4 cm, ostre lub półostre; #7 kleszcze Dumonta; kleszcze cienkie pod kątem 45° i jedwab lub nić 6-0 do szycia.</li>
	<li>Umieść szczura w pojemniku lub komorze anestezjologicznej. Podłącz tlen i dyfuzor znieczulający do pojemnika. Ustaw stężenie środka znieczulającego (izofluranu) na 3,5% i odczekaj około 10 minut lub do momentu, gdy zwierzę wykaże oznaki znieczulenia, takie jak utrata odruchu prostowania.</li>
	<li>Po tym, jak szczur wykaże oznaki znieczulenia, potwierdź utratę przytomności za pomocą testu odruchu odruchu odstawienia palca u nogi. Kontynuuj tylko wtedy, gdy nie ma wycofania palca u nogi; W przeciwnym razie sprawdź wszystkie połączenia i poziomy znieczulenia w dyfuzorze i powtórz krok 3.2.</li>
	<li>Wyjmij zwierzę z pojemnika i przystąp do zwichnięcia szyjki macicy, a następnie nacięcia tętnicy udowej w celu potwierdzenia śmierci.</li>
</ol>
4. Protokół sekcji
UWAGA: Połóż zwierzę brzuchem do dołu na stole sekcyjnym. Powtórz następujące kroki dla obu nóg. Zazwyczaj prawa noga jest najpierw preparowana.
<ol>
	<li>Trzymając mocno kostkę między kciukiem, palcem wskazującym i środkowym, przeetnij ścięgno piętowe za pomocą prostych nożyczek o długości 12 cm.</li>
	<li>Drobnymi, ostrymi nożyczkami wykonaj nacięcie skóry od ścięgna piętowego wzdłuż tylnej części nogi aż do podstawy kręgosłupa, uważając, aby nie wypreparować tkanki mięśniowej poniżej.</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczy i cienkich nożyczek wykonaj ostrożne nacięcia przez warstwy mięśni w pobliżu środka tylnej części nogi, aż nerw kulszowy zostanie odsłonięty. Gdy tylko nerw kulszowy będzie widoczny, nawilż jamę za pomocą lodowatego mKHB, aby zapobiec wysuszeniu nerwu.</li>
	<li>Za pomocą hemostatyków rozsuń płaty skóry z każdej strony i utrzymuj nacięcie otwarte, aby uzyskać dokładniejsze prace preparacyjne. Zaczynając od miejsca nacięcia ścięgna kości piętowej, cienkimi nożyczkami przerwij mięsień po przyśrodkowej stronie nogi, aby uwolnić nerw. Kontynuuj utrzymywanie poziomu wilgoci w obszarze za pomocą lodowatego mKHB.</li>
	<li>Gdy nerw jest odsłonięty podczas poruszania się w górę nogi, wypreparuj leżącą nad nim tkankę mięśniową. Uwolnij nerw bliżej kręgosłupa z tkanek łącznych, aż dotrze do szczeliny rdzeniowej, w którym to momencie następuje załamanie nerwu. Nie próbuj jeszcze czyścić nerwu, ponieważ na tym etapie niezbędna jest szybkość.</li>
	<li>Przetnij nerw jak najbliżej kręgosłupa cienkimi nożyczkami. Aby ułatwić rozwarstwienie, bardzo delikatnie pociągnij koniec nerwu w pobliżu kostki za pomocą kleszczy. Nigdy nie ściskaj nerwu w środku, ale tylko na końcach. Nigdy nie naciągaj nerwu. 
	OPCJONALNIE: W tym momencie, jeśli pozwala na to czas, można przeprowadzić zszywanie obu końców nerwu, aby pomóc w utrzymaniu żywotności. Ogranicz obchodzenie się z nimi do minimum, aby zapobiec uszkodzeniom. Jeśli nie ma wystarczająco dużo czasu (patrz krok 4.5), pomiń ten krok i postępuj zgodnie z krokiem 5.2 później.</li>
	<li>Umieść wypreparowany nerw w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml wypełnionej mKHB (krok 2.1.5), zamknij probówkę i umieść probówkę z powrotem na lodzie do czasu rozpoczęcia procedury czyszczenia.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.1-4.7 dla drugiej nogi. Idealnie, ekstrakcja każdego nerwu powinna zająć 5-10 minut, aby zmaksymalizować żywotność tkanki.</li>
</ol>
5. Procedura oczyszczania nerwów
<ol>
	<li>Napełnić powlekaną szalkę Petriego mniej więcej do połowy schłodzonym natlenionym mKHB. Umieść jeden z wypreparowanych nerwów kulszowych w naczyniu i przypnij oba końce nerwu do naczynia tak, aby nerw był prosty bez załamań, skrętów lub skrętów. Przypnij nerw jak najbliżej końców.</li>
	<li>Używając jedwabnych szwów 6-0 lub cienkiej nici, zawiąż podwójny węzeł wokół każdego końca nerwu, aby zapobiec wyciekowi cytozolu do buforu. Umieść węzły tuż obok szpilek owadów po stronie bliższej środkowi nerwu, ponieważ zapobiegnie to wyciekowi z tkanki nerwowej do bufora. Nie wykonuj tego kroku, jeśli nerw został wcześniej podwiązany.</li>
	<li>Używając mikroskopu do precyzji i kątowych nożyczek sprężynowych 2 mm, usuń tłuszcz, naczynia krwionośne i tkankę mięśniową z nerwu. Przycinaj wszystkie gałęzie nerwowe, które nie będą używane w protokole stymulacji i nagrywania.
	<ol>
		<li>Co 5 minut czyszczenia należy wymieniać bufor na świeżo schłodzony, natleniony mKHB. Użyj cienkich kleszczy, aby pociągnąć za tkankę łączną, tłuszcz i naczynia krwionośne, aby ułatwić rozwarstwienie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść nerwy z powrotem w rurkach transportowych wypełnionych świeżym, natlenionym, schłodzonym mKHB i umieść rurki na lodzie.</li>
</ol>
6. Konfiguracja sprzętu
UWAGA: Konfiguracja sprzętu używanego do przeprowadzania eksperymentów jest zilustrowana na Rysunek 1. Krótko mówiąc, składa się z dwukomorowej kąpieli nerwowej, butelki o pojemności 2 litrów umieszczonej na mieszadle grzewczym, źródła karbogenu do napowietrzania buforu oraz rurki umożliwiającej przepływ buforu z butelki do kąpieli i z powrotem do butelki za pomocą pompy perystaltycznej. Wanna może być wykonana z pleksi lub wydrukowana w 3D z wodoszczelnych materiałów. Ma głębokość około 2 cm, a przegroda oddzielająca dwie komory wanny posiada otwór o średnicy 1,5 mm, który umożliwia przewleczenie nerwu obwodowego w poprzek obu komór. Jedna komora jest duża, musi mieć co najmniej 4 lub 5 cm długości i będzie wypełniona buforem. Druga komora powinna mieć co najmniej 3 cm długości i będzie wypełniona silikonem lub olejem mineralnym. Kąpiel nie może być zbyt duża, ponieważ pogorszy to kontrolę perfuzji, temperatury i pH. W zależności od wielkości badanej tkanki nerwowej mogą być wymagane różne rozmiary kąpieli.
<ol>
	<li>Przygotuj czystą, dwukomorową kąpiel nerwową (specyfikacja projektowa znajduje się w pliku uzupełniającym). Umieść kąpiel nerwową poniżej poziomu 2-litrowej butelki umieszczonej na mieszadle grzewczym, używając standardowych głowic i chwytaków laboratoryjnych. Podłączyć odpływ wanny do wlotu pompy perystaltycznej.</li>
	<li>Podłączyć wylot pompy perystaltycznej do rurki prowadzącej z powrotem do butelki buforowej o pojemności 2 l. Podłącz wlot wanny do rurki z regulowanym zaworem przepływowym i umieść rurkę w butelce o pojemności 2 l. Użyj zaworu trójdrogowego ze strzykawką podłączoną do środkowego wylotu, aby pomóc w zalaniu rurki jako syfonu do grawitacyjnego dopływu bufora.</li>
	<li>Zalać syfon, wciągając strzykawkę, aż bufor wpłynie do niego. Skonfiguruj zawór tak, aby natężenie przepływu buforu do kąpieli wynosiło ~5-6 ml·min-1. Przepływ można początkowo zwiększyć, aby napełnić wannę. Gdy poziom bufora kąpieli osiągnie odpływ, umieść nerwy w wannie.</li>
	<li>Za pomocą szpilki przeciw owadom zabezpiecz koniec nerwu w rogu komory kąpielowej wypełnionej buforem. Używając cienkich kleszczy ustawionych pod kątem 45° i ściskając nerw tylko na końcach, ostrożnie przeciągnij nerw, który ma być stymulowany, przez otwór w przegrodzie między dwiema komorami kąpieli.</li>
	<li>Zabezpiecz drugi koniec nerwu w komorze olejowej kąpieli za pomocą szpilki przeciw owadom, upewniając się, że nerw jest prosty bez rozciągania i jest wolny od załamań i skrętów. Za pomocą smaru silikonowego wykonaj uszczelkę, aby zapobiec wyciekowi bufora z komory buforowej do komory olejowej. Napełnij komorę olejową silikonem lub olejem mineralnym.</li>
	<li>Umieść haki elektrod rejestrujących Ag/AgCl w komorze kąpieli olejowej i zabezpiecz je za pomocą głowic piastowych i chwytaków. Ułóż część nerwu w kąpieli olejowej na haczykach, nie napinając nerwu. Nie ściskaj nerwu; Użyj kleszczy pod kątem, aby podnieść nerw bez szczypania.</li>
	<li>Wyreguluj lub napraw uszczelkę smaru silikonowego, jeśli po przesunięciu nerwu zaobserwuje się jakikolwiek wyciek</li>.
	<li>Podłączyć elektrodę referencyjną Ag/AgCl do masy wzmacniacza i umieścić elektrodę w komorze kąpieli wypełnionej buforem, zabezpieczając ją za pomocą chwytaka laboratoryjnego.</li>
</ol>
7. Implantacja elektrody na nerwie w kąpieli
<ol>
	<li>Przygotuj czystą elektrodę mankietu nerwowego do stymulacji zgodnie z reference21. Umieść elektrodę w komorze kąpieli wypełnionej buforem. Za pomocą kleszczy lub cienkiej pęsety z lub skośnymi końcówkami otwórz elektrodę w wannie, aby zwilżyć wnętrze mankietu.</li>
	<li>Jeśli pozostaną bąbelki, użyj cienkiej strzykawki, aby pobrać bufor z kąpieli i wypchnąć bąbelki z mankietu. Za pomocą pęsety pod nerwem delikatnie otwórz mankiet i wsuń go pod nerw. Zamknij mankiet wokół nerwu, uważając, aby uniknąć załamania lub skręcenia nerwu.</li>
	<li>Podłącz elektrodę stymulacyjną do stymulatora i zabezpiecz przewód elektrody stymulacyjnej taśmą. Podłącz elektrodę powrotną prądu do stymulatora i zabezpiecz przewód taśmą. Jeśli używasz kwadratowej platynowej blachy jako elektrody powrotnej prądu, umieść arkusz z dala od nerwu w kąpieli.</li>
</ol>
8. Stymulacja i nagrywanie
<ol>
	<li>Podłącz wyjście sygnału TTL stymulatora do kanału 4 oscyloskopu, który będzie używany do wyzwalania oscyloskopu. Na ekranie oscyloskopu naciśnij zakładkę Trigger channel (Kanał wyzwalający) i określ Channel 4 (Kanał 4) jako kanał wyzwalający. Ustaw poziom wyzwalania na 1 V za pomocą pokrętła Poziom.</li>
	<li>Na oscyloskopie ustaw rozdzielczość czasową na 1 ms/działkę, a rozdzielczość napięciową na 10 mV/działkę. Wyśrodkuj odniesienie spustu w czasie i ustaw poziom wyzwalania na 1 V. 
	UWAGA: Wykonaj kroki od 8.3 do 8.6, jeśli używasz niestandardowego stymulatora (patrz Tabela materiałów). Zakłada się, że oprogramowanie MATLAB i sterowniki urządzeń zostały zainstalowane na komputerze laboratoryjnym przy użyciu instrukcji udostępnionych bezpłatnie online dla niestandardowego stymulatora neuronowego21. W przeciwnym razie postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi stosowania dostępnego na rynku stymulatora jako alternatywy.</li>
	<li>Podłącz stymulator do komputera laboratoryjnego. Włącz stymulator, podłączając zasilanie bateryjne do wejścia zasilania. Uruchom oprogramowanie MATLAB na komputerze laboratoryjnym.</li>
	<li>Wykonaj niestandardowy skrypt MATLAB: HFAC_4ch_Stimulator_Initialization.m (Tabela materiałów). 
	UWAGA: komunikacyjny USB między komputerem a stymulatorem powinien migać na zielono. Jeśli tak się nie stanie, oznacza to błąd konfiguracji i należy zweryfikować zasilanie i połączenia.</li>
	<li>Otwórz skrypt MATLAB: HFAC_4ch_Monophasic_Stimulation.m (Tabela materiałów). Bezpośrednio edytując skrypt MATLAB, ustaw parametry w następujący sposób: amplituda impulsu stymulatora = -300 μA, szerokość impulsu stymulatora = 300 μs, liczba impulsów stymulatora = 10 i czas stymulatora między impulsami = 1 s.</li>
	<li>Uruchom protokół stymulacji, klikając Uruchom w oprogramowaniu MATLAB.</li>
</ol>

<ol><li>McIntyre, C. C., Richardson, A. G., Grill, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+excitability+of+mammalian+nerve+fibers%3A+Influence+of+afterpotentials+on+the+recovery+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Modeling the excitability of mammalian nerve fibers: Influence of afterpotentials on the recovery cycle.</a> Journal of Neurophysiology. 87 (2), 995-1006 (2002).</li>
<li>Pelot, N. A., Grill, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+quantification+of+excitation+and+kilohertz+frequency+block+of+the+rat+vagus+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">In vivo quantification of excitation and kilohertz frequency block of the rat vagus nerve.</a> Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026005(2020).</li>
<li>Patel, Y. A., Kim, B. S., Rountree, W. S., Butera, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kilohertz+electrical+stimulation+nerve+conduction+block%3A+Effects+of+electrode+surface+area%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Neural+Systems+and+Rehabilitation+Engineering%22%5BJournal%5D)">Kilohertz electrical stimulation nerve conduction block: Effects of electrode surface area.</a> IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 25 (10), 1906-1916 (2017).</li>
<li>Kortelainen, J., Al-Nashash, H., Vipin, A., Thow, X. Y., All, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+anaesthesia+on+somatosensory+evoked+potential+measurement+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">The effect of anaesthesia on somatosensory evoked potential measurement in a rat model.</a> Laboratory Animals. 50 (1), 63-66 (2016).</li>
<li>Oh, S. S., Hayes, J. M., Sims-Robinson, C., Sullivan, K. A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+anesthesia+on+measures+of+nerve+conduction+velocity+in+male+C57Bl6%2FJ+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">The effects of anesthesia on measures of nerve conduction velocity in male C57Bl6/J mice.</a> Neuroscience Letters. 483 (2), 127-131 (2010).</li>
<li>Kuffler, S. W., Williams, E. M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-nerve+junctional+potentials.+The+distribution+of+small+motor+nerves+to+frog+skeletal+muscle%2C+and+the+membrane+characteristics+of+the+fibres+they+innervate%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Small-nerve junctional potentials. The distribution of small motor nerves to frog skeletal muscle, and the membrane characteristics of the fibres they innervate.</a> The Journal of Physiology. 121 (2), 289-317 (1953).</li>
<li>Brunton, E., Blau, C. W., Nazarpour, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separability+of+neural+responses+to+standardised+mechanical+stimulation+of+limbs%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Separability of neural responses to standardised mechanical stimulation of limbs.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11138(2017).</li>
<li>Schmalbruch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber+composition+of+the+rat+sciatic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Fiber composition of the rat sciatic nerve.</a> The Anatomical Record. 215 (1), 71-81 (1986).</li>
<li>Kagiava, A., Theophilidis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+permeability+of+the+rat+sciatic+nerve+epineural+sheath+against+compounds+with+local+anesthetic+activity%3A+an+ex+vivo+electrophysiological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Mechanisms+and+Methods%22%5BJournal%5D)">Assessing the permeability of the rat sciatic nerve epineural sheath against compounds with local anesthetic activity: an ex vivo electrophysiological study.</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 23 (8), 634-640 (2013).</li>
<li>Motori, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+metabolic+rewiring+promotes+resilience+to+neurodegeneration+caused+by+mitochondrial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Neuronal metabolic rewiring promotes resilience to neurodegeneration caused by mitochondrial dysfunction.</a> Science Advances. 6 (35), 8271(2020).</li>
<li>Schwarz, J. R., Eikhof, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na+currents+and+action+potentials+in+rat+myelinated+nerve+fibres+at+20+and+37%C2%B0+C%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%22%5BJournal%5D)">Na currents and action potentials in rat myelinated nerve fibres at 20 and 37° C.</a> Pflügers Archiv. 409 (6), 569-577 (1987).</li>
<li>Cranefield, P. F., Brink, F., Bronk, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oxygen+uptake+of+the+peripheral+nerve+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">The oxygen uptake of the peripheral nerve of the rat.</a> Journal of Neurochemistry. 1 (3), 245-249 (1957).</li>
<li>Lehmann, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+changes+in+pH+on+the+action+of+mammalian+A+nerve+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Legacy+Content%22%5BJournal%5D)">The effect of changes in pH on the action of mammalian A nerve fibers.</a> American Journal of Physiology-Legacy Content. 118 (3), 600-612 (1937).</li>
<li>Hamm, L. L., Nakhoul, N., Hering-Smith, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid-base+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+CJASN%22%5BJournal%5D)">Acid-base homeostasis.</a> Clinical Journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 10 (12), 2232-2242 (2015).</li>
<li>Minasian, S. M., Galagudza, M. M., Dmitriev, Y. V., Kurapeev, D. I., Vlasov, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+protection+against+global+ischemia+with+Krebs-Henseleit+buffer-based+cardioplegic+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiothoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Myocardial protection against global ischemia with Krebs-Henseleit buffer-based cardioplegic solution.</a> Journal of Cardiothoracic Surgery. 8, 60(2013).</li>
<li>Bailey, L. E., Ong, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Krebs-Henseleit+solution+as+a+physiological+buffer+in+perfused+and+superfused+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+Methods%22%5BJournal%5D)">Krebs-Henseleit solution as a physiological buffer in perfused and superfused preparations.</a> Journal of Pharmacological Methods. 1 (2), 171-175 (1978).</li>
<li>Miller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sydney+Ringer%3A+physiological+saline%2C+calcium+and+the+contraction+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Sydney Ringer: physiological saline, calcium and the contraction of the heart.</a> The Journal of Physiology. 555, Pt 3 585-587 (2004).</li>
<li>Yamamoto, D., Suzuki, N., Miledi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockage+of+chloride+channels+by+HEPES+buffer%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B.+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Blockage of chloride channels by HEPES buffer).</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 230 (1258), 93-100 (1987).</li>
<li>Janz, G. J., Taniguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+silver-silver+halide+electrodes.+Preparation%2C+stability%2C+and+standard+potentials+in+aqueous+and+non-aqueous+media%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">The silver-silver halide electrodes. Preparation, stability, and standard potentials in aqueous and non-aqueous media.</a> Chemical Reviews. 53 (3), 397-437 (1953).</li>
<li>Rapeaux, A., Constandinou, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+HFAC+block-capable+and+module-extendable+4-channel+stimulator+for+acute+neurophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">An HFAC block-capable and module-extendable 4-channel stimulator for acute neurophysiology.</a> Journal of Neural Engineering. 17 (4), 046013(2020).</li>
<li>Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch. Next Generation Neural Interfaces. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch>">https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch></a> (2021).</li>
<li>Cuttaz, E. A., Chapman, C. A. R., Syed, O., Goding, J. A., Stretchable Green, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fully+polymeric+electrode+arrays+for+peripheral+nerve+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">fully polymeric electrode arrays for peripheral nerve stimulation.</a> Advanced Science. 8 (8), 2004033(2021).</li>
<li>Lossi, L., Merighi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+ex+vivo+rodent+platforms+in+neuroscience+translational+research+with+attention+to+the+3Rs+philosophy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">The use of ex vivo rodent platforms in neuroscience translational research with attention to the 3Rs philosophy.</a> Frontiers in Veterinary Science. 5, 164(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.
OŚWIADCZENIE O OTWARTYM DOSTĘPIE: Na potrzeby otwartego dostępu autor zastosował licencję Creative Common Attribution (CC BY) (tam, gdzie jest to dozwolone przez UKRI, zamiast niej można podać licencję "Open Government Licence" lub "Creative Commons Attribution No-derivatives (CC BY-ND)) do każdej powstałej wersji Manuskryptu zaakceptowanej przez autora.

UDOSTĘPNIANIE DANYCH: Surowe dane wykorzystane w rycinach niniejszego artykułu zostaną udostępnione przez autorów bez zbędnych zastrzeżeń.

W niniejszej pracy opisaliśmy protokół przygotowania nerwów kulszowych szczurów do neurofizjologii ex vivo. Ekstrakcja tkanek trwa około 30 minut, w tym obchodzenie się ze zwierzętami, znieczulenie, ubój i sekcja, podczas gdy czyszczenie nerwów, umieszczenie w kąpieli i wszczepienie elektrod powinno wymagać dodatkowych 30 minut, zanim będzie można rozpocząć nagrywanie. Przygotowanie buforu można przeprowadzić w ciągu 30 minut, choć można to zrobić przed resztą eksperymentu. Ten rodzaj preparatu i eksperymentu by...

Obecne zrozumienie podstawowej funkcji nerwów modelowanej in silico jest niewystarczające w kilku aspektach, zwłaszcza w odniesieniu do efektów podziału tkanki nerwowej poza somą, aksonem i dendrytami. Interakcje akson-mielina są nadal słabo poznane, o czym świadczy fakt, że nawet szczegółowe obliczeniowe modele nerwowe, takie jak MRG1 (dla nerwów ssaków), które odpowiednio wychwytują konwencjonalną reakcję na stymulację elektryczną, nie wychwytują innych eksperymentalnie zaobserwowanych zachowań, takich jak przenoszenie bloków o wysokiej częstotliwości2 lub wtórna reakcja początkowa3.
Ten protokół dostarcza metody efektywnego badania procesów neurofizjologicznych na poziomie nerwowym w ostrym małym laboratoryjnym modelu zwierzęcym, używając standardowego protokołu przygotowania do izolacji nerwu, kontrolowania jego środowiska i usuwania go z kontekstu in vivo do kontekstu ex vivo. Zapobiegnie to innym procesom zachodzącym w organizmie lub znieczuleniu stosowanym w protokołach stymulacji nerwów in vivo w celu zmiany zachowania nerwów i zakłócenia zmierzonych wyników lub ich interpretacji4,5. Umożliwia to opracowanie bardziej realistycznych modeli skupiających się wyłącznie na efektach specyficznych dla tkanek nerwowych, które są słabo poznane. Protokół ten jest również przydatny jako poligon doświadczalny dla nowych materiałów i geometrii elektrod do stymulacji nerwów i rejestracji, a także nowych paradygmatów stymulacji, takich jak blok wysokiej częstotliwości 2,3. Warianty tej techniki były wcześniej wykorzystywane do badania fizjologii nerwów w ściśle kontrolowanych warunkach6, na przykład do pomiaru dynamiki i właściwości kanałów jonowych lub efektów znieczulenia miejscowego7.
Ta technika zapewnia kilka zalet w porównaniu z alternatywami, takimi jak ostre eksperymenty in vivo na małych zwierzętach8. Technika ta eliminuje potrzebę utrzymywania głębokości znieczulenia, ponieważ tkanka została wyekstrahowana z organizmu, zmniejszając ilość wymaganego sprzętu, takiego jak dyfuzor znieczulający, koncentrator tlenu i poduszka grzewcza. Upraszcza to protokół eksperymentalny, zmniejszając ryzyko błędów. Ponieważ środki znieczulające mogą potencjalnie zmieniać funkcję nerwów4, technika ta gwarantuje, że środki nie zostaną zakłócone przez skutki uboczne tych związków znieczulających. Wreszcie, technika ta jest bardziej odpowiednia niż ostre eksperymenty in vivo podczas badania skutków związków neurotoksycznych, takich jak tetrodotoksyna, które zabiłyby znieczulone zwierzę przez paraliż.
Obwodowe odcinki nerwowe są unikalnym systemem ex vivo, ponieważ istnieje duże prawdopodobieństwo, że włókna odpowiedzialne za rejestrowane sygnały nerwowe nie zawierają żadnej somy. Ponieważ normalnie byłyby one zlokalizowane, w przypadku neuronów ruchowych, w kręgosłupie, a w przypadku neuronów czuciowych w zwojach korzenia grzbietowego obok kręgosłupa, przygotowanie odcinka nerwu ssaków można z grubsza modelować jako zbiór błon rurkowych z kanałami jonowymi, otwartymi na obu końcach9. Metabolizm jest utrzymywany przez mitochondria znajdujące się w aksonie w momencie rozwarstwienia tkanki10. Zachęca się do zszywania otwartych końców axolemmy po ekstrakcji, aby je zamknąć, a tym samym pomóc w utrzymaniu istniejących gradientów jonowych w poprzek błony, które są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania nerwów.
Aby utrzymać homeostazę tkanek poza ciałem, kilka zmiennych środowiskowych musi być ściśle kontrolowanych. Są to: temperature11, oxygenation12, osmolarity, pH13,14, oraz dostęp do glukozy w celu utrzymania metabolizmu. W przypadku tego protokołu podejście polega na użyciu zmodyfikowanego bufora Krebs-Henseleit15,16 (mKHB) stale napowietrzanego mieszaniną tlenu i dwutlenku węgla. mKHB należy do rodziny kardioplagicznych6,17 używane do przechowywania wypreparowanych tkanek poza ciałem, na przykład w eksperymentach ex vivo. te nie zawierają hemoglobiny, antybiotyków ani leków przeciwgrzybiczych i dlatego nadają się tylko do preparatów zawierających niewielkie ilości tkanek przez ograniczony czas. Kontrolę pH osiągnięto za pomocą pary redoks węglanu i dwutlenku węgla, co wymagało stałego napowietrzania buforu dwutlenkiem węgla w celu utrzymania równowagi pH. Ma to na celu uniknięcie stosowania innych popularnych środków buforujących, takich jak HEPES, które mogą modyfikować funkcję komórek nerwowych18. Do natlenienia buforu i zapewnienia kontroli pH użyto mieszaniny 5% dwutlenku węgla w tlenie zwanej karbogenem (95%O2, 5% CO2 ). Do kontroli temperatury pojemnika buforowego użyto mieszadła grzewczego, a bufor przepuszczono przez kąpiel nerwową, a następnie zawrócono do pojemnika wyjściowego. Typowy eksperyment trwałby 6-8 godzin, zanim nerw straci swoją żywotność i nie będzie już wystarczająco reagował na stymulację, aby pomiary były reprezentatywne dla zdrowej tkanki.
Aby zoptymalizować stosunek sygnału do szumu, do nagrania użyto elektrod chlorku srebra, które zostały przygotowane zgodnie z wcześniej opisanymi metodami19. Do stymulacji można zastosować kombinację dostępnych na rynku platynowych elektrod mankietowych i wykonanych na zamówienie elektrod mankietowych z przewodzącego polimeru. Przewodzące polimerowe elektrody mankietowe mają znacznie większą pojemność ładowania, co jest przydatne podczas stymulacji nerwu za pomocą fal o wysokiej amplitudzie20.
Stymulator używany w tym protokole został już wcześniej opisany20. Dokumentacja, pliki projektowe i skrypty programowe do korzystania z niego są publicznie dostępne21. Do wykonania tego protokołu można użyć innych stymulatorów; jednak niestandardowy stymulator jest również zdolny do blokowania prądu alternatywnego o wysokiej częstotliwości (HFAC) < klasa sup = 'xref'>2,<klasa sup = 'xref'>20, co umożliwia szerszy zakres eksperymentów neurofizjologicznych. Aby użyć bloku HFAC, zaleca się mankiety z elastomeru przewodzącego, aby uniknąć uszkodzenia nerwu. Przewodzące mankiety nerwowe z elastomeru to miękkie i w pełni polimerowe układy elektrod wykonane z przewodzących elastomerów jako składnika przewodzącego i polidimetylosiloksanu jako izolacji22. Urządzenia zostały wyprodukowane w konfiguracji bipolarnej przy użyciu konwencjonalnych technik mikrofabrykacji laserowej.

<table><tbody><tr><td>Butelka szklana 1 L</td><td>VWR International Ltd</td><td>215-1595</td><td>Szkło borokrzemianowe</td></tr><tr><td>1 L Kolba miarowa</td><td>szklana VWR International Ltd</td><td>612-3626</td><td>Szkło borokrzemianowe</td></tr><tr><td>2 L Butelka szklana</td><td>VWR International Ltd</td><td>215-1596</td><td>Szkło borokrzemianowe</td></tr><tr><td>2 L Kolba miarowa szklana</td><td>VWR International Ltd</td><td>BRND937254</td><td>Szkło</td></tr> <tr><td>borokrzemianoweAdapter pneumatyczny, 8 mm do 1/4 NPT</td><td>RS UK</td><td>536-2599</td><td>wciskany prosty adapter między wężem tlenowym a rurką dyspersyjną</td></tr> Powłoka <tr><td>alkoksydowa</td><td>Farnell</td><td>1971829</td><td>ACC15 Alkoksylowa powłoka ochronna do preparacji Przygotowanie szalki Petriego</td></tr><tr><td>Anesthetic</td><td>Chanelle</td><td>N/A</td><td>Izofluran znieczulający wziewnie, butelka 250 ml</td></tr><tr><td>Zlewka, 2 L</td><td>VWR International Ltd</td><td>213-0469</td><td>Szkło borokrzemianowe</td></tr><tr><td>Bipolarny mankiet nerwowy</td><td>Cortec GMBH</td><td>N/A</td><td>średnica wewnętrzna 800 mikronów, wyprowadzenie prostopadłe, brak zakończenia złącza</td></tr><tr><td>Głowice</td><td>Nie dotyczy</td><td></td> Nie dotyczy <td>Standardowe mokre głowice laboratoryjne do mocowania chwytaków do prętów</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902-500g</td><td>500 g w plastikowej butelce</td></tr><tr><td>Kanister karbogeniczny</td><td>BOC</td><td>Nie dotyczy</td><td>Kanister F</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe, objętość 15 ml</td><td>VWR International Ltd</td><td>734-0451</td><td>Probówki Falcon</td></tr><tr><td>Przewodzący elastomerowy mankiet nerwowy</td><td>Nie dotyczy</td><td>Nie dotyczy</td><td>mankiet nerwowy o dużej pojemności ładowania do stymulacji, patrz protokół w celu uzyskania informacji o produkcji</td></tr><tr><td>Złącze, Termimate</td><td>Mouser UK</td><td>538-505073-1100-LP</td><td>Należy je do drutu zakończonego zaciskami krokodylkowymi (patrz wpis 11)</td></tr> <tr><td>Złącza krokodylkowe</td><td>RS UK</td><td>212-1203</td><td>Należy je do przewodu zakończonego złączami TermiMate (patrz wpis 10)</td></tr> <tr><td>Woda dejonizowana</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Otrzymywana z dozownika wody dejonizowanej</td></tr><tr><td>Kleszcze kątowe 45 stopni</td><td>InterFocus Ltd</td><td>91110-10</td><td>Kleszcze cienkie, zakres studencki</td></tr><tr><td>Standard Kleszcze Dumont #7</td><td>InterFocus Ltd</td><td>91197-00</td><td>Kleszcze studenckie</td></tr><tr><td>Rurka dyspiratora gazu, porowatość 3</td><td>Merck</td><td>12547866</td><td>Nie dotyczy</td></tr><tr><td>Glukoza bezwodna, proszek</td><td>VWR International Ltd</td><td>101174Y</td><td>500 g w plastikowej butelce</td></tr><tr><td>Chwytaki</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Standardowe mokre chwytaki laboratoryjne montowane na pręcie</td></tr><tr><td>Mieszadło grzewcze</td><td>RS UK</td><td>768-9672</td><td>Stuart US152</td></tr><tr><td>Hemostatyki</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Odpowiedni jest dowolny hemostat o długości >12 cm</td></tr><tr><td>Szpilki do owadów, stal nierdzewna, rozmiar 2</td><td>InterFocus Ltd</td><td>26001-45</td><td>Nie dotyczy</td></tr><tr><td>Laptop</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Każdy bezpieczny laboratoryjnie komputer przenośny z co najmniej 2 nieużywanymi portami USB jest odpowiedni</td></tr><tr><td>Filtr szumów liniowych</td><td>Digitimer</td><td>N/A</td><td>Eliminator szumów humbug (filtr szumów linii 50 Hz)</td></tr><tr><td>Niski poziom hałasu Przedwzmacniacz, SR560</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR560</td><td>Niskoszumowy przedwzmacniacz napięciowy</td></tr><tr><td>Sól siarczanu magnezu</td><td>VWR International Ltd</td><td>291184P</td><td>500g w plastikowej butelce</td></tr><tr><td>Skrypty MATLAB</td><td>Github</td><td>https://github.com/Next-Generation-Neural-Interfaces/HFAC_Stimulator_4ch</td><td>Skrypty inicjalizacji, kalibracji i stymulacji dla niestandardowego stymulatora</td></tr><tr><td>Oprogramowanie MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>N/A</td><td>Pakiet standardowy</td></tr><tr><td>Mikroskop Światło, PL-2000</td><td>Photonic</td><td>N/A Źródło</td><td>światła z łabędzimi szyjami. Produkt można uzyskać od zewnętrznego dostawcy</td></tr><tr><td>Mikroskop, SMZ 745</td><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Nikon</td><td>SM745</td></tr><tr><td>Olej mineralny, nietoksyczny</td><td>VWR International Ltd</td><td>31911.A1</td><td>Olej do kąpieli nerwowej</td></tr><tr><td>Kąpiel nerwowa</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Kąpiel nerwów obrabiana maszynowo z pleksiglasu, szczegółowe informacje można znaleźć w protokole.</td></tr><tr><td>Oscyloskop</td><td>LeCroy</td><td>N/A</td><td>434 Wavesurfer. Produkt można uzyskać od dostawców zewnętrznych</td></tr><tr><td>Wąż tlenowy, 1 metr</td><td>BOC</td><td>N/A Zakończenia</td><td>1/4" NPT</td></tr><tr><td>Regulator tlenu</td><td>BOC</td><td>C106X/2B:3.5BAR-BS3-1/4"NPTF 230Bar</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna P-1</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>N/A</td><td>Produkt można uzyskać od zewnętrznego dostawcy</td></tr><tr><td>Petri Dish, Glass</td><td>VWR International Ltd</td><td>391-0580&nbsp;</td><td>N/a</td></tr><tr><td>Sól chlorku potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405-250g</td><td>250 g w plastikowej butelce</td></tr><tr><td>Sól diwodoru potasu</td><td>Merck</td><td>1.04873.0250</td><td>250 g w plastikowej butelce</td></tr><tr><td>Rat</td><td>Charles River Laboratories</td><td>N/A</td><td>Sprague Dawley, 250-330 gramów, żeńska</td></tr><tr><td>Elektroda referencyjna, ET072</td><td>eDaQ (Australia)</td><td>ET072-1</td><td>Elektroda referencyjna srebrno-chlorkowo-srebrna</td></tr><tr><td>Pręt</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Standardowe mokre pręty laboratoryjne z osprzętem do statywów</td></tr><tr><td>Waga</td><td>Sartorius</td><td>N/A</td><td>M-Power, do ważenia proszków. Produkt można uzyskać od dostawców zewnętrznych</td></tr><tr><td>Nożyczki proste krawędź 12 cm</td><td>InterFocus Ltd</td><td>91400-12</td><td>tępo-zakończenie, zasięg studencki</td></tr><tr><td>Urządzenie do akwizycji sygnału</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td>Micro3-1401</td><td>Micro3-1401 Wielokanałowy ADC</td></tr><tr><td>Smar silikonowy, nietoksyczny</td><td>Farnell</td><td>3821559</td><td>do uszczelniania przegrody wanny</td></tr><tr><td>Rurka silikonowa, wewnętrzna 2 mm średnica</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/D</td></tr><tr><td>Rurka silikonowa, średnica wewnętrzna 5 mm</td><td>N/A</td> N<td></td><td>/A</td></tr><tr><td>Drut srebrny</td><td>Alfa Aesar</td><td>41390</td><td>0,5 mm, wyżarzony</td></tr><tr><td>Sól wodorowęglanu sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761-500g</td><td>500 g w plastikowej butelce</td></tr><tr><td>Sól chlorku sodu</td><td>VWR International Ltd</td><td>27810.295</td><td>1 kg w plastikowej butelce</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe kątowe 2 mm InterFocus</td><td>Ltd</td><td>15010-09</td> N<td>/A</td></tr><tr><td>Stojak</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Standardowe mokre stanowiska laboratoryjne z gniazdami na pręty</td></tr><tr><td>Stymulator</td><td>Digitimer</td><td>DS3</td><td>DS3 lub stymulator niestandardowy (patrz referencje)</td></tr><tr><td>Pchła mieszająca</td><td>VWR International Ltd</td><td>442-0270</td><td>Do użytku z mieszadłem grzewczym</td></tr><tr><td>Końcówka strzykawki,, średnica 1 mm</td><td>N/ A</td><td>N/A</td><td>N/A Końcówka</td></tr><tr><td>strzykawki,, średnica 2 mm</td><td>N/A</td> N<td></td><td>/A N/D</td></tr><tr><td>Strzykawka, plastikowa, objętość 10 ml</td><td>Strzykawka nie</td><td>dotyczy</td><td>powinna mieć złączkę typu luer lock</td></tr><tr><td>Taśma, wodoodporna</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Do mocowania przewodów i przewodów do stołu warsztatowego</td></tr><tr><td>Termometr</td><td>VWR International Ltd</td><td>620-0806</td><td>szklany termometr</td></tr><tr><td>Zasilanie USB Zasilacz Bank</td><td>RS UK</td><td>135-1000</td><td>Custom Stimulator, w pełni naładowany przed eksperymentem. Nie jest potrzebne w przypadku korzystania z zaworu DS3</td></tr><tr><td>, Leuer Lock, 3-Way</td><td>VWR International Ltd</td><td>229-7440</td><td>Do mocowania strzykawki do rurki zasilającej wanny i syfonu zalewowego</td></tr></tbody></table>

przygotowanie nerwu kulszowego szczura do neurofizjologii ex vivo

Preparation of Rat Sciatic Nerve for Ex Vivo Neurophysiology

Preparaty ex vivo umożliwiają badanie wielu procesów neurofizjologicznych w izolacji od reszty ciała, zachowując przy tym lokalną strukturę tkankową. Praca ta opisuje przygotowanie nerwów kulszowych szczurów do neurofizjologii ex vivo, w tym przygotowanie buforu, procedury na zwierzętach, konfigurację sprzętu i rejestrację neurofizjologiczną. Niniejsza praca zawiera przegląd różnych typów eksperymentów możliwych do przeprowadzenia przy użyciu tej metody. Przedstawiona metoda ma na celu zapewnienie 6 godzin stymulacji i zapisu na pobranej tkance nerwów obwodowych w ściśle kontrolowanych warunkach w celu uzyskania optymalnej spójności wyników. Wyniki uzyskane tą metodą to złożone potencjały czynnościowe (CAP) włókna A o amplitudach międzyszczytowych w zakresie miliwoltów przez cały czas trwania eksperymentu. Amplitudy i kształty CAP są spójne i niezawodne, co czyni je przydatnymi do testowania i porównywania nowych elektrod z istniejącymi modelami lub wpływu interwencji na tkankę, takich jak stosowanie chemikaliów, zmiany chirurgiczne lub techniki stymulacji neuromodulacyjnej. Przetestowano zarówno konwencjonalne, dostępne na rynku elektrody mankietowe ze stykami platynowo-irydowymi, jak i wykonane na zamówienie przewodzące elektrody elastomerowe, które dały podobne wyniki pod względem reakcji siły i czasu trwania bodźca nerwowego.

Reprezentatywnymi wynikami, jakie można uzyskać za pomocą tego protokołu, są spójne złożone potencjały czynnościowe (CAP) z włókien nerwowych typu A w obrębie nerwu kulszowego. Potencjały te mają zazwyczaj amplitudę szczyt-szczyt wynoszącą około 1 mV na elektrodzie, a w konsekwencji 100 mV po wzmocnieniu (Rysunek 2). Podobne amplitudy stymulacji i szerokości impulsu powinny dawać zbliżone amplitudy CAP. Przewodzące elastomerowe elektrody mankietowe będą zazwyczaj wymagały nieco wyższych ampl...

Ten protokół opisuje przygotowanie całej tkanki nerwowej rwy kulszowej szczura do elektrofizjologicznej stymulacji ex vivo i zapis w regulowanej środowiskowo, dwukomorowej, perfundowanej kąpieli solankowej.

Przygotowanie nerwu kulszowego szczura do neurofizjologii ex vivo

Ex vivo preparations enable the study of many neurophysiological processes in isolation from the rest of the body while preserving local tissue structure. ...

Protokół ten umożliwia obserwację wielu zjawisk neurofizjologicznych, które nie są dobrze poznane, takich jak przenoszenie blokady nerwowej po wstrzyknięciu prądu o wysokiej częstotliwości/wysokiej amplitudzie, jednocześnie zapobiegając zakłóceniom wynikającym z innych procesów zachodzących w żywym ciele. Technika ta daje wysoce powtarzalne, wiarygodne wyniki i jest bardziej praktyczna niż elektrofizjologia in vivo, ponieważ złożone zmienne, takie jak głębokość znieczulenia, nie muszą być kontrolowane, a zatem nie mogą wpływać na pomiary. Po zabiegu eutanazji w znieczuleniu umieść samicę szczura na stole sekcyjnym, mocno przytrzymaj kostkę między kciukiem, palcem wskazującym i palcem środkowym i przetnij ścięgno piętowe za pomocą 12-centymetrowych prostych nożyczek.Za pomocą cienkich kleszczy i nożyczek wykonaj ostrożne nacięcia przez warstwy mięśni w pobliżu środka tylnej części nogi, aż nerw kulszowy zostanie odsłonięty. Gdy nerw jest widoczny, nawilż jamę za pomocą lodowatego zmodyfikowanego buforu Krebs-Henseleit lub MKHB, aby zapobiec wysuszeniu nerwu. Za pomocą hemostatów pociągnij płaty skóry z każdej strony i utrzymuj nacięcie otwarte, aby uzyskać dokładniejsze rozwarstwien

preparation-of-rat-sciatic-nerve-for-ex-vivo-neurophysiology

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Prezentujemy protokół izolacji aksoplazmy z nerwu kulszowego dorosłego szczura, oparty na wycięciu pęczków nerwowych i inkubacji w medium hipotonicznym w celu uwolnienia mieliny oraz lizy struktur nieaksonalnych, a następnie ekstrakcji pozostałego materiału wzbogaconego w aksony.

Izolacja aksoplazmy z nerwu kulszowego szczura

Ze względu na prostotę zabiegu chirurgicznego oraz wyraźne efekty behawioralne, przewlekłe uciskowe uszkodzenie nerwu kulszowego jest jednym z najważniejszych modeli zwierzęcych bólu neuropatycznego. W ciągu 24 h po operacji rozwija się nadwrażliwość bólowa, którą można zmierzyć ilościowo za pomocą estezjometru von Freya (test mechaniczny) oraz urządzenia do pomiaru analgesii podeszwowej (test termiczny).

Przewlekłe uciskowe uszkodzenie nerwu kulszowego i badanie nadwrażliwości bólowej u szczurów

Ten film pokazuje jednowłóknowe nagranie przewodnictwa nerwowego włókna C u szczurów. Znieczulony szczur jest nacinany w celu odsłonięcia nerwu kulszowego, który zapewnia czuciowe i motoryczne zasilanie kończyn dolnych. Poszczególne włókna C są następnie naświetlane. Stymulacja elektryczna jest dostarczana za pomocą elektrod bodźcowych wszczepionych w stopę, a odpowiedź jest rejestrowana z pojedynczego włókna nerwowego.

Zapis in vivo pojedynczych włókien włókien C nerwu kulszowego u szczurów

Tutaj prezentujemy technikę in vivo transferu genów do komórek Schwanna (SC) w nerwie kulszowym gryzoni. Ta prosta technika jest przydatna do badania mechanizmów sygnalizacyjnych zaangażowanych w rozwój i utrzymanie mielinizujących się SC.

In vivo (in vivo) Transfer genów do komórek Schwanna w nerwie kulszowym gryzoni za pomocą elektroporacji

Techniki pobudliwości aksonalnej dostarczają potężnego narzędzia do badania patofizjologii i zmian biofizycznych, które poprzedzają nieodwracalne zdarzenia zwyrodnieniowe. Manuskrypt ten demonstruje zastosowanie tych technik na nerwie łokciowym znieczulonych szczurów.

In vivo (in vivo)Pomiar elektrofizjologiczny nerwu łokciowego szczura z badaniem pobudliwości aksonalnej

Tutaj prezentujemy protokół do wizualizacji drobnych struktur nerwów obwodowych poprzez uzyskanie i barwienie odcinków 1-2 μm błękitem...

Barwienie błękitem toluidynowym skrawków zatopionych w żywicy w celu oceny morfologii nerwów obwodowych

Zapis jednowłóknisty to skuteczna technika elektrofizjologiczna, która ma zastosowanie do ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego. Wraz z przygotowaniem nienaruszonego DRG z przyczepionym nerwem kulszowym badany jest mechanizm niewydolności przewodzenia. Oba protokoły poprawiają zrozumienie związku obwodowego układu nerwowego z bólem.

Zastosowanie zapisu pojedynczego włókna in vivo i nienaruszonego zwoju korzenia grzbietowego z przyczepionym nerwem kulszowym w celu zbadania mechanizmu uszkodzenia przewodzenia

Ten protokół opisuje in vivo wewnątrzkomórkowy zapis neuronów lędźwiowych szczura z jednoczesną przezrdzeniową stymulacją prądem stałym. Metoda ta pozwala na pomiar właściwości błony i rejestrację rytmicznego odpalania neuronów ruchowych przed, w trakcie i po anodowej lub katodowej polaryzacji rdzenia kręgowego.

Wewnątrzkomórkowy zapis in vivo zidentyfikowanych typów neuronów rdzeniowych szczura podczas transrdzeniowej stymulacji prądem stałym

Zautomatyzowana analiza chodu jest możliwym narzędziem do oceny funkcjonalnego powrotu do zdrowia w modelach gryzoni z uszkodzeniem nerwów obwodowych i uszkodzeniem rdzenia kręgowego. Chociaż wymaga to tylko jednego zestawu do oceny funkcji lokomotorycznych w różnych modelach eksperymentalnych, bardzo ważne jest skrupulatne dostosowanie i szkolenie zwierząt w sprzęcie i sprzęcie.

Zautomatyzowana analiza chodu w celu oceny powrotu do sprawności funkcjonalnej u gryzoni z uszkodzeniem nerwów obwodowych lub stłuczenia rdzenia kręgowego

W systemie kokultury zwojów korzenia grzbietowego i komórek Schwanna, mielinizacja obwodowego układu nerwowego może być badana. Model ten zapewnia eksperymentalne możliwości obserwacji i ilościowego określenia mielinizacji obwodowej oraz zbadania wpływu związków będących przedmiotem zainteresowania na osłonkę mielinową.

Mielinizacja in vitro aksonów obwodowych w kokulturze eksplantatów zwojów korzenia grzbietowego szczura i komórek Schwanna

W tym badaniu demonstrujemy wyrafinowany protokół elektromiografii pojedynczego włókna (SFEMG), który umożliwia pomiar in vivo transmisji połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) w modelach gryzoni. Opisano podejście krok po kroku do techniki SFEMG, aby umożliwić ilościowe określenie zmienności transmisji NMJ i niewydolności mięśnia brzuchatego łydki szczura.

Stymulowana elektromiografia pojedynczych włókien (SFEMG) do oceny transmisji połączeń nerwowo-mięśniowych w modelach gryzoni

Naucz się przygotowywać nerw kulszowy szczura do badań elektrofizjologicznych ex vivo. Ta metoda minimalizuje czynniki zakłócające i zapewnia powtarzalne wyniki w neurofizjologii.

Przygotowanie nerwu kulszowego szczura do neurofizjologii ex vivo

Przeglądaj więcej filmów