Wielokrotne dożylne dawkowanie bolusa i inwazyjna ocena hemodynamiczna w modelu nadciśnienia tętniczego płucnej myszy wywołanego niedotlenieniem
11 listopada 2022
Ten protokół krok po kroku przeprowadza wielokrotne dożylne podawanie dawki bolusa i inwazyjne monitorowanie hemodynamiczne u myszy. Badacze mogą wykorzystać ten protokół do przyszłych badań przesiewowych związków terapeutycznych w kierunku nadciśnienia tętniczego płucnego.
W przypadku związku, który musi być podawany bezpośrednio do krwiobiegu, optymalizacja podawania dożylnego jest kluczową częścią procedury eksperymentalnej. Nasz szczegółowy protokół zawiera instrukcje krok po kroku, jak przeprowadzić wielokrotne dożylne dawkowanie bolusa przez żyłę szyjną myszy oraz jak wykonać cewnikowanie tętnicze i prawe komorowe w celu dokładnej oceny hemodynamicznej w modelu niedotlenienia tętniczego płuc u myszy. Przedstawione tutaj procedury są ważnymi wynikami dla badaczy zainteresowanych platformą podawania dożylnego pierwiastka w celu opracowania metody leczenia pierwotnego nadciśnienia tętniczego.
Badacze mogą użyć tej metody wstrzykiwania bolusa do żyły szyjnej do badań przesiewowych związków związanych z opracowywaniem leków w dowolnych modelach chorób myszy. Skuteczne wstrzyknięcie bolusa dożylnego i pomiary ciśnienia krwi wymagają dużej wprawy. Aby rozpocząć, wyjmij mysz z komory anestezjologicznej.
Umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej na platformie iniekcyjnej pod mikroskopem preparacyjnym. Utrzymuj znieczulenie przez stożek nosowy z 1,5% izofluranem i delikatnie przytrzymuj cztery nogi taśmą klejącą, aby unieruchomić ciało. Delikatnie wyszoruj obszar chirurgiczny trzy razy trzema naprzemiennymi rundami roztworu jodu powidonu i 70% etanolu.
Po wykonaniu 0,5 centymetrowego cięcia podłużnego za pomocą kleszczy oddzielij tkankę mięśniową i tłuszczową oraz zlokalizuj prawą żyłę szyjną zewnętrzną. Następnie wprowadź sterylną igłę 28G do żyły szyjnej. Ze skosem igły skierowanym do góry.
Powoli nacisnąć tłok strzykawki, aby wstrzyknąć związek do żyły. Pozostaw igłę w żyle przez dodatkowe 10 sekund, aby zapobiec cofaniu się. Wyjąć igłę i za pomocą bawełnianego wacika uciskać miejsce wstrzyknięcia, aby zapobiec krwawieniu.
Zszyj skórę szwem 5/0 i umieść zwierzę w klatce rekonwalescencyjnej z dnem klatki przykrytym ręcznikiem papierowym bez ściółki. Najpierw zmierz odległość od miejsca wprowadzenia cewnika do żądanego miejsca końcówki cewnika. Zaznacz dwa oznaczenia odległości cewnika, aby zapewnić wizualne wskazanie głębokości wprowadzenia, nałóż maść weterynaryjną bezpośrednio na powierzchnię oczu myszy, aby zapobiec wysuszeniu.
Umieścić mysz w pozycji leżącej na plecach na platformie iniekcyjnej pod mikroskopem preparacyjnym. Po nacięciu skóry od żuchwy do mostka należy oddzielić gruczoły ślinowe i odsłonić tchawicę. Umieść 0,5 mililitra PBS w jamie, aby spowolnić rozwój skurczu naczyń podczas manipulowania tętnicą szyjną.
Ostrożnie odizoluj pięciomilimetrowy odcinek prawej tętnicy szyjnej, umieszczając kawałek białego papieru pod naczyniem jako tło. Korzystanie z 8-0 szew, zawiąż stały węzeł, aby zamknąć czaszkowy koniec naczynia. Następnie zawiąż pierwszy luźny węzeł, aby tymczasowo zablokować przepływ krwi z aorty.
Następnie zawiąż drugi luźny węzeł między pierwszymi dwoma szwami. Za pomocą igły 25G wykonaj mały otwór, który jest wystarczająco duży, aby przejść przez cewnik w jednej linii z naczyniem między stałym a drugim luźnym węzłem. Przytrzymaj cewnik w odległości 1.5 cala od końcówki i delikatnie włóż końcówkę cewnika przez otwór tętnicy.
Zaciśnij drugi luźny węzeł wokół cewnika i naczynia, które nadal umożliwia przejście cewnika. Delikatnie zwolnij pierwszy luźny węzeł. Kontynuuj wprowadzanie cewnika w kierunku aorty wstępującej zgodnie z oznaczeniem na cewniku, aż analiza ciśnienia wykaże profil ciśnienia tętniczego krwi.
Rejestruj ogólnoustrojowe dane dotyczące ciśnienia krwi za pomocą systemu akwizycji danych i oprogramowania. Poluzuj środkowy węzeł szwu, aby umożliwić wyciągnięcie cewnika. Następnie zapnij pierwszy luźny węzeł, aby zapobiec krwawieniu i wyciągnij cewnik z tętnicy szyjnej.
Ostrożnie odizoluj prawą żyłę szyjną zewnętrzną od otaczającej tkanki łącznej. Korzystanie z 8-0 Zszyć, podwiązać wszystkie małe gałęzie i zawiązać stały węzeł, aby zamknąć czaszkowy koniec naczynia. Następnie zawiąż luźny węzeł na ogonowym końcu naczynia.
Użyj igły 25G, aby zrobić mały otwór proksymalnie do stałego węzła. Przytrzymaj cewnik i włóż cewnik do nacięcia żyły I zaciśnij węzeł ogonowy wokół cewnika i naczynia. Powoli wepchnij cewnik do prawego serca.
Monitoruj głębokość końcówki cewnika na podstawie znaku cewnika. Oceń położenie końcówki cewnika zgodnie ze śledzeniem fal ciśnienia w oprogramowaniu. Gdy końcówka cewnika znajdzie się w prawej komorze, monitor pokaże typowe śledzenie ciśnienia skurczowego w prawej komorze serca.
Utrzymuj cewnik stabilnie i zbieraj dane przez pięć minut. Po zakończeniu zapisu ostrożnie wyciągnij cewnik i obserwuj, czy nie ma zapisu ciśnienia. Zawiąż węzeł ogonowy wokół naczynia.
Umieść cewnik z powrotem w roztworze PBS. Podczas cewnikowania prawej komory serca w czarnej myszy sześciokomorowej C57 kontrolowanej przez normoksję uzyskano udany dostęp do komory prawej komory, co widać po zmianie przebiegu hemodynamicznego w różnych obszarach układu żylnego. Ogólnoustrojowe ciśnienie krwi i ciśnienie skurczowe prawej komory mierzono u myszy z zamkniętą klatką piersiową cztery tygodnie po ekspozycji na niedotlenienie lub normoksję.
W porównaniu z grupą z normoksją, ciśnienie skurczowe prawej komory było znacznie zwiększone w grupie niedotlenionej. Leczenie związkiem mikro RNA 7C1/let-7 skutkowało istotnym obniżeniem ciśnienia skurczowego prawej komory w porównaniu z grupą niedotlenioną, natomiast ogólnoustrojowe ciśnienie krwi nie uległo zmianie w żadnej z grup. Ocena ciśnienia skurczowego czerwonej komory u myszy z zamkniętą klatką piersiową jest wyzwaniem ze względu na złożoną anatomię czerwonej komory.
Badacze powinni unikać długotrwałych i powtarzających się prób cewnikowania czerwonej komory. Nasza procedura dawkowania szyjnego i bolusa może być stosowana do badań przesiewowych związków związanych z opracowywaniem leków w dowolnych modelach chorób myszy. Możemy wykorzystać dożylny korzeń platformy do podawania związków w celu opracowania metody leczenia nadciśnienia tętniczego płucnego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia szczegółową procedurę wielokrotnego podawania dawek dożylnych w formie bolusa oraz inwazyjnego monitorowania hemodynamicznego u myszy. Jest on przeznaczony dla badaczy zainteresowanych opracowywaniem metod leczenia nadciśnienia tętniczego płuc.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Farmakologia
- Badania sercowo-naczyniowe
- Modele zwierzęce
Wstęp
- Podanie dożylne jest kluczowe w przypadku związków wymagających bezpośredniego dostarczenia do krwiobiegu.
- Dokładna ocena hemodynamiczna jest niezbędna w badaniach nad nadciśnieniem tętniczym płuc.
- Modele mysie są powszechnie wykorzystywane do testowania związków terapeutycznych.
- Skuteczne techniki podawania wymagają praktyki i precyzji.
Cel badania
- Dostarczenie protokołu podawania dawek w formie bolusa dożylnie u myszy.
- Ułatwienie monitorowania hemodynamicznego w modelach nadciśnienia tętniczego płuc.
- Wsparcie działań w zakresie opracowywania i przesiewania leków.
Zastosowane metody
- Wielokrotne podawanie dawkami bolus dożylnie poprzez żyłę szyjną myszy.
- Kaniulacja tętnicy i prawej komory w celu oceny hemodynamicznej.
- Monitorowanie ciśnienia tętniczego oraz innych parametrów życiowych.
- Wykorzystanie modelu nadciśnienia płucnego indukowanego hipoksją.
Główne wyniki
- Pomyślne wykonanie wlewów dożylnych w formie bolusa.
- Uzyskanie dokładnych pomiarów hemodynamicznych.
- Wykazanie skuteczności protokołu w badaniach przesiewowych związków.
- Wyniki wspierające przyszłe badania terapeutyczne nad nadciśnieniem tętnicy płucnej.
Wnioski
- Protokół ten stanowi cenny instrument dla badaczy w dziedzinie farmakologii.
- Ułatwia on zrozumienie dróg podawania leków.
- Wspomaga postępy w opracowywaniu metod leczenia nadciśnienia tętniczego płuc.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niezawodne podawanie dawków w formie bolusa dożylnego oraz inwazyjna ocena hemodynamiczna w modelu PAH u myszy indukowanym hipoksją umożliwiają wysoką wiarygodność oceny potencjalnych leków celowanych w naczyniowe choroby płuc. Ten schemat postępowania wspiera predykcyjny screening związków oraz ilościowy pomiar punktów końcowych, co bezpośrednio wpływa na wczesną selekcję portfolio i walidację celu. Powtarzalność protokołu oraz ilościowe wyniki są kluczowe dla zachowania ciągłości translacyjnej od etapu odkrywania po ocenę przedkliniczną.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia rygorystyczną weryfikację hipotez terapeutycznych w istotnym dla choroby systemie in vivo.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez kwantyfikację odpowiedzi hemodynamicznych na związki kandydackie.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki bezpośredniemu pomiarowi zmian ciśnienia skurczowego w prawej komorze.
- Dostarcza danych ilościowych, które pozwalają określić pewność predykcyjną i podjąć wczesne decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go).
Przesiewanie i opracowanie testów
- Ustanawia zwalidowaną platformę do podawania związków i pomiaru odpowiedzi w modelach mysich.
- Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne punkty końcowe hemodynamiczne, odpowiednie do badań przesiewowych porównawczych.
- Umożliwia skalowalność w celu oceny wielu związków oraz ponowne wykorzystanie platformy w programach badawczych nad PAH.
- Wspiera wiarygodną ocenę skuteczności związków in vivo.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje przedkliniczne punkty końcowe z patofizjologią PAH u ludzi w celu opracowania biomarkerów translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość ilościowych danych hemodynamicznych od etapu odkrywania po walidację przedkliniczną.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne poprzez modelowanie klinicznie istotnych mechanizmów i odpowiedzi chorobowych.
- Wspiera dostosowany do ryzyka postęp rozwoju związków wiodących w oparciu o rzetelne dane in vivo.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół integruje proces od odkrycia do etapu przedklinicznego, łącząc wczesny screening związków z translacyjną walidacją in vivo w modelach PAH.
- Biologia odkrywcza: Zapewnia platformę do testowania hipotez i wyjaśniania mechanizmów w chorobach naczyniowych płuc.
- Przesiew: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wyników hemodynamicznych do porównywania związków.
- Analityka: Umożliwia bezpośredni pomiar ciśnienia w prawej komorze oraz ciśnienia systemowego jako punktów końcowych służących do podejmowania decyzji.
- Badania translacyjne: Pozwala na zestawienie danych przedklinicznych z klinicznymi objawami PAH w celu oceny biomarkerów i skuteczności.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje ustandaryzowany, adaptowalny schemat postępowania dla różnorodnych zastosowań związków i modeli chorób.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w procesie odkrywania leków na PAH.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje podawanie związków i pomiar punktów końcowych w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Poprawia wczesne decyzje go/no-go oraz efektywność kapitałową dzięki dostarczeniu rzetelnych danych in vivo.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydackich terapii.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy technicznej w zakresie chirurgii myszy i kateteryzacji hemodynamicznej.
- Wymaga specjalistycznego instrumentarium do pomiaru ciśnienia i akwizycji danych.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów dawkowania i pomiarów pomiędzy zespołami.
- Metoda może być zaadaptowana do innych modeli chorobowych u myszy wymagających dożylnego podawania związków.
- Złożoność techniczna może ograniczać przepustowość i wymaga obszernych szkoleń operatora.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:06
Intravenous Bolus Injection via the Jugular Vein
2:35
Blood Pressure Measurement
3:18
Systemic Blood Pressure Measurement
5:35
Right Ventricular Systolic Pressure Measurement in a Mouse with Pulmonary Hypertension
7:18
Results: Blood Pressure Analysis in Hypoxic Mice
8:16
Conclusion
