Wytwarzanie kultur komórek nabłonka dróg oddechowych na granicy faz powietrze-ciecz z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Protokół ten jest pomocny, ponieważ zapewnia łatwe do wykonania kroki, które pozwalają na generowanie funkcjonalnych komórek nabłonka dróg oddechowych, które można następnie wykorzystać do badania różnych aspektów biologii dróg oddechowych. Główną zaletą tego protokołu jest możliwość generowania wielu funkcjonalnych kultur komórek nabłonka dróg oddechowych przy jednoczesnym uniknięciu trudności związanych z pozyskiwaniem i hodowlą pierwotnych komórek dróg oddechowych. Procedurę zademonstruje Taylor Matte, doktorant z naszego laboratorium.

Zacznij od rozmrożenia wystarczającej objętości matrycy 3D na lodzie. Trzymaj go na lodzie, aż będzie gotowy do użycia. Rozmrozić fiolkę z wcześniej kriokonserwowanymi zawiesinami pojedynczych komórek iBC, inkubując ją w kąpieli wodnej lub perełkowej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż nie będzie widocznych zamrożonych pożywek.

Za pomocą pięciomililitrowej pipety serologicznej przenieś zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Dodaj kroplami od sześciu do 10 mililitrów DMEM / F12 do zawiesiny komórek. Delikatnie wymieszaj i odwiruj w temperaturze 300 RCF przez pięć minut, aby granulować komórki.

Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze podłoża Basal Cell Medium za pomocą mikropipety P1000. Przygotuj podwielokrotność 10 mikrolitrów i wykonaj liczenie komórek. Odwirować komórki w temperaturze 300 RCF przez pięć minut.

Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki o gęstości 4 000 komórek na mikrolitr w uprzednio rozmrożonej matrycy 3D za pomocą mikropipety P1000. Za pomocą mikropipety P200 dodać kroplę roztworu matrycy odpowiadającą około 25 do 50 mikrolitrom do podstawy każdego dołka 12-dołkowej płytki poddanej działaniu kultur tkankowych. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około 15 minut.

Następnie dodaj wystarczającą ilość podłoża z komórek podstawowych do każdej studzienki, aby całkowicie zanurzyć kroplę za pomocą pięciomililitrowej pipety serologicznej. Umieścić płytkę z powrotem w nawilżonym inkubatorze. Odżywiaj komórki co dwa dni za pomocą świeżej pożywki z komórek podstawowych.

Dodać świeżą pożywkę z boku studzienki za pomocą pięciomililitrowej pipety serologicznej, uważając, aby nie naruszyć kropelki komórek. Rozmrozić wystarczającą objętość matrycy 3D na lodzie. Trzymaj go na lodzie, aż będzie gotowy do użycia.

Po około pięciu do siedmiu dniach inkubacji płytek hodowlanych, odessać pożywkę z każdej studzienki, a następnie za pomocą mikropipety P1000 dodać jeden mililitr dyspazy II bezpośrednio na sferoidy, aby oddzielić od kropli matrycy. Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 do 15 minut. Za pomocą mikropipety P1000 wymieszaj dypazę, pipetując dwukrotnie w górę i w dół, rozbijając duże grudki matrycy 3D.

Przywróć płytkę do 37 stopni Celsjusza na dodatkowe 30 do 40 minut, pozwalając matrycy całkowicie się rozpuścić. Gdy kropla matrycy 3D nie jest już widoczna pod mikroskopem świetlnym, dodaj swobodnie unoszące się sferoidy do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów za pomocą pięciomililitrowej końcówki pipety serologicznej. Dodaj DMEM / F12 dla końcowej objętości 10 mililitrów na stożkową probówkę i odwiruj przy 200 RCF przez trzy minuty, aby granulować sferoidy.

Odessać supernatant i dodać jeden mililitr 0,05% trypsyny na każdą początkową zdysocjowaną kroplę. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, rozcierając go co dwie do trzech minut. Oceniaj roztwór za pomocą mikroskopu świetlnego co kilka minut.

Gdy ponad 90% sferoid zostanie zdysocjowanych na pojedyncze komórki, dodaj 10% płodowej surowicy bydlęcej do trypsyny. Przefiltrować komórki przez sitko o średnicy 40 mikrometrów i odwirować przy 300 RCF przez pięć minut. Wykonaj zliczanie komórek i równomiernie ponownie zawieś komórki o gęstości 400 komórek na mikrolitr rozmrożonej matrycy 3D.

Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza. Zawieś ponownie tyle kropel, ile jest potrzebne do dalszej aplikacji. Powtórz ten proces dla każdej studzienki.

Po 10 do 14 dniach od ostatniego pasażu należy zdysocjować sferoidy do zawiesiny pojedynczej komórki, jak pokazano wcześniej, i przeprowadzić zliczanie komórek. Zawieś ponownie komórki w buforze sortowania. To będzie główna populacja.

Przenieś małą porcję od 25 do 50 mikrolitrów do oddzielnej probówki. Będzie to populacja mniejsza. Dodaj sprzężone przeciwciało anty-NGFR do głównej populacji komórek.

Dodaj przeciwciało kontrolne izotypu do populacji komórek mniejszych. Chroń komórki przed światłem i trzymaj je na lodzie przez 30 minut, przerywając rozcieranie komórek, aby zapobiec granulowaniu. Po 30 minutach dodaj bufor sortowania do każdej probówki komórek.

Odwirować komórki przy 300 RCF przez pięć minut. Odessać supernatant, ponownie zawiesić granulowane komórki w buforze sortującym i dodać żywe lub martwe komórki. Stosując odpowiednią strategię dodatniego bramkowania NGFR, posortuj wystarczającą ilość komórek dodatnich NGFR do niezbędnych dalszych zastosowań.

Przygotuj 6,5-milimetrowe porowate wkładki membranowe, dodając matrycę o pojemności 200 mikrolitrów do komory wierzchołkowej zgodnie z instrukcją producenta. Umieść go w temperaturze 37 stopni Celsjusza na co najmniej dwie godziny przed potrzebą. Odessać matrycę powłoki z komory wierzchołkowej wkładu.

Dodaj 500 mikrolitrów podłoża podstawnokomórkowego do komory podstawno-bocznej. Zawiesić co najmniej 30 000 posortowanych komórek dodatnich NGFR w 100 do 200 mikrolitrach pożywki z komórek podstawowych i przenieść do komory wierzchołkowej za pomocą mikropipety P200. Powtórz dla pozostałych dołków.

Umieść płytkę w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. W ciągu dwóch do trzech dni odessać komory wierzchołkowe i podstawno-boczne i karmić świeżą pożywką z komórek podstawnych. Codziennie monitoruj komorę wierzchołkową za pomocą mikroskopu świetlnego.

Gdy komórki osiągną więcej niż 80% konfluencji, zastąp podłoże podstawnokomórkowe podłożem różnicującym ALI zarówno w komorach wierzchołkowych, jak i podstawno-bocznych. Chronić podłoże różnicujące ALI przed światłem, przechowując pojemniki na pożywki owinięte folią i wyłączając światła górne, jeśli to możliwe. Następnego dnia należy odessać pożywkę z komory wierzchołkowej, wystawiając w ten sposób powierzchnię wierzchołkową na działanie powietrza.

Pożywki różnicujące ALI należy wymieniać w komorze podstawno-bocznej co dwa do trzech dni. Monitoruj wygląd kultury co jeden do dwóch dni. Ostrożnie odessać nagromadzony płyn z komory wierzchołkowej, nie naruszając warstwy komórkowej.

Delikatnie dodaj 100 mikrolitrów PBS bez wapnia i magnezu do komory wierzchołkowej, aby usunąć zanieczyszczenia lub śluz. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie ostrożnie odessać PBS. Oceń TEER pod kątem integralności nabłonka.

Po siedmiu do 10 dniach ekspozycji na powietrze obserwuj pojawienie się wielorzęsek za pomocą mikroskopii świetlnej. W zależności od planowanego eksperymentu i odczytu, komórki mogą być analizowane po 14 do 28 dniach ekspozycji na powietrze. Po 10 do 14 dniach od ostatniego przejścia hodowli 3D należy zdysocjować sferoidy do zawiesiny pojedynczej komórki, jak pokazano wcześniej.

Wykonaj zliczanie komórek, ponownie zawieś zawiesinę komórek w podłożu do krioprezerwacji w kriowalu. Umieść kriowiale w pojemniku, aby zapewnić stały spadek temperatury. I przenieś do minus 80 stopni Celsjusza na 24 do 48 godzin, a następnie przenieś do minus 150 stopni Celsjusza w celu długotrwałego przechowywania.

Dzięki tej technice bramkowania 28% żywych pojedynczych komórek było dodatnich pod względem NGFR. Po dwóch dniach poszczególne komórki były początkowo łatwe do zidentyfikowania i miały wydłużony wygląd wrzecionowaty. Po kolejnych dwóch dniach komórki utworzyły zlewającą się i luźno upakowaną monowarstwę.

W ciągu kolejnych dni lub tygodni komórki utworzyły ciasno upakowaną, wysoce komórkową warstwę nabłonka. A po siedmiu do 10 dniach nastąpiło wyraźne pojawienie się bicia rzęsek i produkcji śluzu. Zmierzono TEER próbek, a wyniki były podobne do pomiarów próbek kontrolnych pierwotnych komórek nabłonka dróg oddechowych.

Następnie przeprowadzono utrwalanie aldehydem paraform i znakowanie immunologiczne dla markerów komórek nabłonka kanonicznych dróg oddechowych m.in. dla MUC5AC i acetylowanej alfa-tubuliny. Postępując zgodnie z tym protokołem, naukowcy mogą wygenerować dużą liczbę kultur komórek nabłonka dróg oddechowych pochodzących od pacjenta, aby ocenić różne odczyty, w tym te, które testują funkcje komórek podstawnych, wydzielniczych i wielorzęskowych zarówno w chorobie, jak i zdrowiu.