Name: Wytwarzanie kultur komórek nabłonka dróg oddechowych na granicy faz powietrze-ciecz z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Poznaj metodę różnicowania ludzkich komórek iPSC w nabłonek dróg oddechowych na granicy faz powietrze-ciecz. Protokół umożliwia generowanie funkcjonalnych kultur nabłonkowych do badań biologii dróg oddechowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratoriów Hawkins, Kotton i Davis za ich pomocny wkład na przestrzeni lat w ten i inne projekty. Jesteśmy również wdzięczni Brianowi Tiltonowi (dyrektorowi ds. sortowania komórek BU) za jego poświęcenie i wiedzę techniczną, a także jesteśmy wdzięczni Gregowi Millerowi i Marianne James z Centrum Medycyny Regeneracyjnej Uniwersytetu Bostońskiego (CReM) za ich wsparcie i wiedzę techniczną w zakresie konserwacji i charakterystyki iPSC specyficznych dla pacjenta, wspieranych przez granty NIH NO1 75N92020C00005 i U01TR001810. Praca ta była wspierana przez granty NIH U01HL148692, U01HL134745, U01HL134766 i R01HL095993 dla D.N.K, R01HL139876 dla B.R.D, R01 HL139799 dla F.H. oraz granty Fundacji Mukowiscydozy (CFF) CFF 00987G220 i CFF WANG20GO dla D.N.K, CFF DAVIS15XX1, DAVIS17XX0, DAVIS19XX0 dla B.R.D, CFF SUZUKI19XX0 dla SS, CFF BERICA2010 dla AB, i CFF HAWKIN20XX2 do F.H.

Każdy z poniższych kroków powinien być wykonany przy użyciu sterylnej techniki w okapie z przepływem laminarnym poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2. Wszystkie podłoża powinny być podgrzane do temperatury pokojowej (22 °C) przed dodaniem do komórek, chyba że wyraźnie zaznaczono inaczej. Każdy etap wirowania powinien być przeprowadzany w temperaturze pokojowej (około 22 °C). Rysunek 1 przedstawia schematy protokołu.
1. Przygotowanie wymaganych mediów
UWAGA: Zobacz Plik uzupełniający 1, aby uzyskać szczegółowe informacje.
<ol>
	<li>Podłoże dla komórek podstawnych
	<ol>
		<li>Przygotuj podłoże bazowe zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Do każdych 50 ml pożywki bazowej dodać 5 μl A83-01 (10 mM), 5 μl DMH1 (10 mM), 50 μl Y-27632 (10 mM) i 100 μl Primociny (50 mg/ml). W dalszej części pożywki pożywka nazywana jest pożywką dla komórek podstawnych.</li>
		<li>Przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podłoże różnicujące ALI
	<ol>
		<li>Przygotuj podłoże zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Do każdych 50 ml pożywki różnicującej ALI dodać 100 μl Primocin (50 mg/ml).</li>
		<li>Przechowywać w bezpiecznym miejscu w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bufor sortowania
	<ol>
		<li>Na każde 50 ml buforu sortującego połącz 47,5 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa, 1 ml FBS, 200 μl EDTA (500 mM), 1,25 ml buforu HEPES (1 M), 50 μl Y-27632 (10 mM) i 100 μl Primocin (50 mg / ml).</li>
		<li>Filtr sterylizować przy użyciu porów o wielkości 0,4 μm.</li>
		<li>Przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pożywka do kriokonserwacji
	<ol>
		<li>Na każde 50 ml pożywki do kriokonserwacji należy dodać 45 ml pożywki z komórek podstawowych i 5 ml dimetylosulfotlenku (DMSO).</li>
		<li>Filtr sterylizować przy użyciu porów o wielkości 0,4 μm.</li>
		<li>Przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Rozmrażanie kriokonserwowanych iBC
<ol>
	<li>Rozmrozić (na lodzie) wystarczającą ilość macierzy zewnątrzkomórkowej zredukowanej przez czynnik wzrostu 3D (zwanej dalej matrycą 3D). Przechowywać na lodzie do momentu, gdy będzie gotowy do użycia. 
	UWAGA: Podczas rozmrażania jednej fiolki (zawierającej 250 000 komórek) rozmrozić 100-200 μl matrycy 3D.</li>
	<li>Rozmrozić fiolkę z wcześniej kriokonserwowanymi jednokomórkowymi zawiesinami iBC przez inkubację w kąpieli wodnej lub perełkowej o temperaturze 37 °C, aż do momentu, gdy nie będzie widocznej zamrożonej pożywki (1-2 min).</li>
	<li>Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml dodać zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Dodaj kroplami 6-10 ml DMEM/F12 do zawiesiny komórek, delikatnie wymieszaj i odwiruj przy 300 x g przez 5 minut, aby osadzać komórki.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki z komórek podstawowych za pomocą mikropipety P1000. Usunąć podwielokrotność 10 μl i przeprowadzić liczenie komórek.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki o gęstości 4 000 komórek/μl w uprzednio rozmrożonej matrycy 3D za pomocą mikropipety P1000. 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby unikać dodawania bąbelków do matrycy 3D. Powoli i ostrożnie pipetować matrycę.</li>
	<li>Za pomocą mikropipety P200 dodać jedną kroplę (25 lub 50 μl) do podstawy każdego dołka 12-dołkowej płytki poddanej działaniu kultur tkankowych. Jeśli zaczynasz od 250 000 zamrożonych komórek, oczekiwana liczba kropel na tym etapie wynosi od 3 do 4 (kropel 25 μl), w zależności od żywotności komórek.</li>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez około 15 minut, a następnie dodać tyle podłoża z komórek podstawowych do każdego dołka, aby całkowicie zanurzyć kroplę (1,5 ml na 50 μl; 1 ml na 25 μl), używając pipety serologicznej o pojemności 5 ml. Umieścić płytkę z powrotem w nawilżonym inkubatorze.</li>
	<li>Karmić komórki co 2 dni za pomocą świeżej pożywki z komórek podstawowych. Dodać świeżą pożywkę z boku studzienki za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml, uważając, aby nie naruszyć kropelek komórek. 
	UWAGA: Gęstość komórek posianych na tym etapie jest 10-krotnie wyższa niż rutynowe pasażowanie iBC w sekcji 3.</li>
</ol>
3. Dysocjacja sferoid i ekspansja iBC w kulturze 3-D
<ol>
	<li>Rozmrozić (na lodzie) wystarczającą objętość matrycy 3D. Przechowywać na lodzie do momentu, gdy będzie gotowy do użycia. 
	UWAGA: Wymagana objętość matrycy 3-W będzie się różnić w zależności od liczby komórek wymaganych przez użytkownika.</li>
	<li>Około 5-7 dni później odessać pożywkę z każdej studzienki i za pomocą mikropipety P1000 dodać 1 ml Dispazy II (1 U/ml) bezpośrednio na sferoidy, aby oddzielić się od kropli matrycy.
	<ol>
		<li>Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 10-15 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą mikropipety P1000 odpipetuj Dispase w górę i w dół 1-2 razy, rozbijając duże grudki matrycy 3D. Przywrócić temperaturę płytki do 37 °C na dodatkowe 30-40 minut, pozwalając matrycy całkowicie się rozpuścić.
	<ol>
		<li>Gdy kropla matrycy 3D nie jest już widoczna pod mikroskopem świetlnym, dodaj swobodnie unoszące się sferoidy do stożka o pojemności 15 ml za pomocą końcówki do pipety serologicznej o pojemności 5 ml. Dodać DMEM/F12 do końcowej objętości 10 ml na stożek i odwirować przy 200 x g przez 3 minuty w celu osadzenia sferoid.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odessać supernatant i dodać 1 ml 0,05% trypsyny (37 °C) na każdą początkową kroplę zdysocjowaną (np. jeśli zaczyna się od czterech kropel, dodać 4 ml trypsyny do kolby stożkowej).
	<ol>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C, często rozcierając (co 2-3 minuty).</li>
		<li>Oceniaj za pomocą mikroskopu świetlnego co kilka minut. Gdy większość (>90%) sferoidów zostanie zdysocjowana na pojedyncze komórki, dodaj 10% płodowej surowicy bydlęcej (w DMEM / F12) w stosunku objętościowym 1:1 do trypsyny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przefiltrować komórki przez sitko o wielkości 40 μm i odwirować przy 300 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Wykonaj zliczanie komórek i równomiernie ponownie zawieś komórki o gęstości 400 komórek/μl rozmrożonej matrycy 3D. Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza. Zawieś ponownie tyle kropel, ile jest potrzebne do dalszej aplikacji. Powtórz krok 2.6-2.9 dla każdej studzienki.</li>
</ol>
4. Ocena i oczyszczanie iBC NGFR+
<ol>
	<li>Po 10-14 dniach od ostatniego pasażu rozdzielić sferoidy na zawiesinę pojedynczej komórki, jak w krokach 3.2-3.5 i przeprowadzić liczenie komórek. 
	UWAGA: Różne linie iPSC zachowują się inaczej; w związku z tym zakres 10-14 dni może się różnić dla różnych iBC. Proszę zapoznać się z Rysunek 2, aby zapoznać się z typowym wyglądem 3-D iBC po 1, 4, 8 i 14 dniach, kiedy są one odpowiednie do sortowania komórek NGFR+. Sortowanie wcześniej niż zalecane (np. dzień 8, jak w <silna klasa="xfig">Rysunek 2C), skutkuje ogólnie niższą liczbą komórek przy rzadszym wyrażaniu NGFR. Sortowanie później niż zalecane (np. dłużej niż 14 dni po ostatnim pasażu) prowadzi do słabej przeżywalności komórek po sortowaniu.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki o gęstości 1 x 106 komórek/100 μl w buforze sortującym (populacja główna). Przenieść małą porcję (25-50 μl) do oddzielnej probówki (mniejsza populacja).
	<ol>
		<li>Dodać sprzężone przeciwciało anty-NGFR (rozcieńczenie 1:100) do głównej populacji komórek.</li>
		<li>Dodać przeciwciało kontrolne izotypu (rozcieńczenie 1:200) do populacji komórek o mniejszym znaczeniu.</li>
		<li>Chroń komórki przed światłem i trzymaj na lodzie przez 30 minut, z przerwami (co 5-10 minut) rozcierając komórki, aby zapobiec granulowaniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po 30 minutach dodaj bufor sortujący w stosunku 1:1 do każdej probówki komórek. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 min.</li>
	<li>Odessać supernatant, ponownie zawiesić granulowane komórki w buforze sortowania o gęstości 10 x 106 komórek/ml i dodać żywe lub martwe komórki.</li>
	<li>Stosując odpowiednią strategię bramkowania NGFR+ (opartą na kontroli izotypu, patrz Rysunek 3), posortuj wystarczającą ilość żywych komórek NGFR+ do niezbędnych dalszych zastosowań. 
	UWAGA: W przypadku korzystania z iBC z reporterami fluorescencyjnymi (tj. NKX2-1GFP TP63tdTomato) zaleca się sortowanie pod kątem komórek "potrójnie dodatnich" (tj. NKX2-1GFP+, TP63tdTomato+, NGFR+), z odpowiednim wyborem bramki i kompensacją (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3). Podczas tej ekspansji iBC część komórek różnicuje się w komórki wydzielnicze i można również wykryć bardzo mały odsetek komórek wielorzęskowych. Obie te populacje należą do NGFR-.</li>
</ol>
5. Generacja śluzowo-rzęskowych kultur ALI
<ol>
	<li>Przygotować porowate wkładki membranowe o średnicy 6,5 mm, dodając matrycę o pojemności 200 μl do komory wierzchołkowej (matryca kwalifikowana przez ludzkie embrionalne komórki macierzyste lub rekombinowana ludzka laminina-521) zgodnie z instrukcją producenta.
	<ol>
		<li>Umieścić w temperaturze 37 °C na co najmniej 2 godziny przed rozpoczęciem pracy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odessać matrycę powłoki z komory wierzchołkowej wkładu. Dodać 500 μl pożywki z komórek podstawowych do komory podstawno-bocznej.</li>
	<li>Ponownie zawiesić co najmniej 30 000 posortowanych komórek NGFR+ (od kroku 4.5) w 100-200 μl pożywki z komórek podstawowych i przenieść do komory wierzchołkowej za pomocą mikropipety P200. Powtórz dla tylu dołków, ile jest pożądane (i dostępnych komórek). Umieścić płytkę w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>W ciągu 2-3 dni odessać komory wierzchołkowe i podstawno-boczne i karmić świeżą pożywką z komórek bazalnych (500 μl do wierzchołkowych, 100 μl do podstawno-bocznych).</li>
	<li>Codziennie monitoruj komorę wierzchołkową za pomocą mikroskopu świetlnego. Gdy komórki zlewają się w >80% (zwykle 3-7 dni), zastąp pożywkę z komórek podstawnych pożywką różnicującą ALI (nie podgrzaną) zarówno w komorze wierzchołkowej, jak i podstawno-bocznej. Podczas pracy z ALI Differentiation Medium należy chronić przed światłem, trzymając pojemniki na media owinięte w folię i wyłączając górne światła, jeśli jest to możliwe.</li>
	<li>Następnego dnia należy odessać pożywkę z komory wierzchołkowej, wystawiając w ten sposób powierzchnię wierzchołkową na działanie powietrza.</li>
	<li>Pożywkę ALI Differentiation Medium należy wymieniać w komorze podstawno-bocznej co 2-3 dni.
	<ol>
		<li>Monitoruj wygląd kultury co 1-2 dni. Ostrożnie odessać nagromadzony płyn z komory wierzchołkowej, nie naruszając warstwy komórek.</li>
		<li>Oceń przeznabłonkową rezystancję elektryczną (TEER) pod kątem integralności nabłonka. 
		UWAGA: TEER można ocenić w ciągu kilku dni po ekspozycji na powietrze, aby uzyskać odczyt integralności warstwy nabłonkowej. Idealny czas na pomiar TEER nie został ustalony, chociaż wartości zgodne z wysokiej jakości różnicowaniem śluzowo-rzęskowym wynoszą zwykle >500 xcm2.</li>
		<li>Jeśli konieczne jest usunięcie zanieczyszczeń lub śluzu, delikatnie dodaj 100 μL PBS (bez Ca2+ lub Mg2+) do komory wierzchołkowej. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut, a następnie ostrożnie odsysać PBS.</li>
		<li>Po 7-10 dniach ekspozycji na powietrze zwykle pojawiają się ruchliwe rzęski, które można zobaczyć za pomocą mikroskopii świetlnej. W zależności od planowanego eksperymentu i odczytu, komórki mogą być analizowane po 14-28 dniach ekspozycji na powietrze. 
		UWAGA: Jeśli użyto fluorescencyjnych komórek reporterowych i jeśli dostępny jest mikroskop fluorescencyjny z żywymi komórkami, komórki można śledzić za pomocą mikroskopii świetlnej, a także fluorescencji reporterowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Opcjonalna (ale zalecana) kriokonserwacja iBC
<ol>
	<li>Po 10-14 dniach od ostatniego pasażu hodowli 3D, należy dysocjować sferoidy do zawiesiny jednokomórkowej, jak w krokach 3.2-3.5. Wykonaj zliczanie komórek.</li>
	<li>Zawiesić w podłożu do kriokonserwacji o gęstości 250 000 komórek/500 μl w kriowalu.</li>
	<li>Umieścić kriowial (kriowialisty) w pojemniku, aby zapewnić stały spadek temperatury (1 °C/min) i przenieść do -80 °C na 24-48 godzin, a następnie przenieść do -150 °C w celu długotrwałego przechowywania. 
	UWAGA: Przeprowadzono powtórną kriokonserwację, a także kriokonserwację wcześniej posortowanych komórek NGFR+, ale nie zostały one odpowiednio ocenione pod kątem żywotności komórek i zdolności do tworzenia funkcjonalnych kultur ALI. Szczególnie w przypadku wydłużonego pasażu komórkowego zaleca się ocenę kariotypu, ponieważ zauważono, że różni się on w komórkach iPSC i pochodzących z iPSC.</li>
</ol>

<ol><li>GBD Chronic Respiratory Disease Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+attributable+health+burden+of+chronic+respiratory+diseases%2C+1990-2017%3A+A+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2017%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Respiratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Prevalence and attributable health burden of chronic respiratory diseases, 1990-2017: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017.</a> The Lancet. Respiratory Medicine. 8 (6), 585-596 (2020).</li>
<li>Alysandratos, K. -D., Herriges, M. J., Kotton, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+stem+and+progenitor+cells+in+lung+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Epithelial stem and progenitor cells in lung repair and regeneration.</a> Annual Review of Physiology. 83, 529-550 (2021).</li>
<li>Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Well-differentiated+human+airway+epithelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Well-differentiated human airway epithelial cell cultures.</a> Methods in Molecular Medicine. 107, 183-206 (2005).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Fibroblasts+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+facing+airway+epithelial+cell-based+therapy+for+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis.</a> Frontiers in Pharmacology. 10, 74(2019).</li>
<li>Jacob, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+self-renewing+lung+alveolar+epithelial+type+II+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Derivation of self-renewing lung alveolar epithelial type II cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 14 (12), 3303-3332 (2019).</li>
<li>Gotoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+alveolar+epithelial+spheroids+via+isolated+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).</li>
<li>Huang, S. X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2013).</li>
<li>Mou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multipotent+lung+and+airway+progenitors+from+mouse+ESCs+and+patient-specific+cystic+fibrosis+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of multipotent lung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cystic fibrosis iPSCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (4), 385-397 (2012).</li>
<li>Hawkins, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+airway+basal+stem+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Derivation of airway basal stem cells from human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 28 (1), 79-95 (2021).</li>
<li>Suzuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+functional+airway+basal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human pluripotent stem cells into functional airway basal stem cells.</a> STAR Protocols. 2 (3), 100683(2021).</li>
<li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li>
<li>Mou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+SMAD+signaling+inhibition+enables+long-term+expansion+of+diverse+epithelial+basal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

HBEC są złotym standardem typu komórek do badania chorób nabłonka dróg oddechowych. Ze względu na ich ograniczenia (w tym dostępność i trudność w manipulacji genetycznej) opracowaliśmy protokół do wyprowadzania kultur iBC i ALI. Komórki te mogą pochodzić od dowolnego dawcy i zachowują swoje unikalne tło genetyczne, co pozwala na podstawowe badania rozwojowe, modelowanie chorób i opracowywanie nowych terapii.
Chociaż każdy pojedynczy krok opisanego protokołu jest konieczny, jest kilka, które zasługują na dodatkową wzmiankę. Po pierwsze, na każdym etapie, który wymaga dysocjacji sferoid na pojedyncze komórki, bardzo ważne jest, aby unikać nadmiernego pipetowania; Trawienie enzymatyczne (z dipazą lub trypsyną) sprzyja lepszemu przeżyciu komórek, podczas gdy nadmierne pipetowanie prowadzi do znacznej śmierci komórki. Po drugie, podczas oczyszczania iBC NGFR+ kluczowe znaczenie ma wykorzystanie kontroli izotypu i zalecamy wybór komórek NGFR+ o najwyższej ekspresji z FACS (Rysunek 3). Efektem takiego podejścia są optymalne hodowle ALI z odpowiednim różnicowaniem śluzowo-rzęskowym. Wreszcie, precyzyjnie udokumentowane w protokole przygotowanie i wysiew porowatych błon ma fundamentalne znaczenie dla przetrwania kultur ALI. Podczas gdy zwykle wysiewamy 30 000-60 000 komórek na wkładkę, odnieśliśmy sukces z zaledwie 20 000 komórek. Podczas gdy udane hodowle można wygenerować przy użyciu powłoki matrycowej kwalifikowanej do zarodków ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, ostatnio zastosowaliśmy ludzką rekombinowaną lamininę-521 o znacznie wyższej trwałości kultur ALI.
Bardzo rzadko zróżnicowanie iPSC może nie być w stanie zwiększyć odpowiedniego odsetka iBC NGFR+. W tym przypadku szeregowe pasażowanie iBC (w hodowli 3D) może z czasem skutkować zwiększoną częstotliwością NGFR. Ograniczenia tego protokołu obejmują czas, koszt i wiedzę specjalistyczną potrzebną do wygenerowania tych komórek. Ponadto zdajemy sobie sprawę, że wielu badaczy jest zainteresowanych mniej powszechnymi typami komórek nabłonka dróg oddechowych (np. jonocyty, komórki neuroendokrynne). Chociaż wykryliśmy niektóre z tych rzadszych typów komórek, jak w pierwotnych hodowlach HBEC, nie są one odtwarzalnie identyfikowane, prawdopodobnie z powodu niepełnej wiedzy na temat sygnałów rozwojowych wymaganych do wytworzenia tych komórek.
Jak jest napisane, powyższy protokół rozpoczyna się od rozmrożenia już kriokonserwowanych iBC. Szczegóły poprzedzające tę kriokonserwację są już wcześniej opisane i wykraczają poza zakres tego manuskryptu11,12.
Nasza metoda hodowli ALI nabłonka dróg oddechowych pozwala na wytworzenie funkcjonalnych komórek nabłonka dróg oddechowych od prawie każdego dawcy. To znacznie zwiększa dostęp do cennych, genetycznie kontrolowanych komórek nabłonka dróg oddechowych, które mogą być wykorzystane do modelowania chorób, badań przesiewowych leków, przyszłych terapii komórkowych, a także do lepszego zrozumienia wzorców rozwojowych w nabłonku dróg oddechowych.

Przewlekłe choroby płuc stanowią dużą część zachorowalności i śmiertelności na całym świecie1. Stany, które wpływają na przewodzące drogi oddechowe, takie jak astma, mukowiscydoza (CF), pierwotna dyskineza rzęsek (PCD) i infekcje wirusowe, stanowią zarówno powszechne, jak i rzadsze choroby, nabyte i genetyczne, które przyczyniają się do tego ogólnoświatowego obciążenia. Główne funkcje przewodzących dróg oddechowych to: 1) działanie jako kanał dla laminarnego przepływu powietrza oraz 2) zapewnienie śluzowo-rzęskowego usuwania patogenów i zanieczyszczeń. Komórki wydzielnicze, wielorzęskowe i podstawne reprezentują główne typy komórek nabłonkowych przewodzących dróg oddechowych. Rzadsze typy komórek nabłonkowych obejmują jonacyty, komórki kępek i komórki neuroendokrynne i zostały omówione gdzie indziej2.
Ogólnie rzecz biorąc, główną przeszkodą w zrozumieniu mechanizmów choroby i rozwoju podejść terapeutycznych był ciągły brak ludzkiej pierwotnej tkanki do wykorzystania w modelach przedklinicznych. HBEC są powszechnie uważane za złoty standard w biologii nabłonka dróg oddechowych człowieka i odgrywają kluczową rolę w badaniach nad mukowiscydozą, w szczególności3. Jednak zazwyczaj są one izolowane albo z biopsji bronchoskopowych, albo z tkanki płucnej po operacji, albo z płuc odrzuconych do przeszczepu. Dostęp do HBEC od osób z chorobami genetycznymi, w tym priorytety badawcze dotyczące mukowiscydozy i PCD, jest rzadki i nieprzewidywalny. Konieczne jest pokonanie tego wąskiego gardła w komórkach nabłonka dróg oddechowych pochodzących od pacjenta. iPSC są łatwo generowane od każdego osobnika, zachowują unikalne tło genetyczne dawcy i mają niezwykłą zdolność do namnażania się i przetrwania przez długi czas w warunkach hodowli komórkowej4,5,6. Poprzez rekapitulację kluczowych etapów embriologicznych, iPSC przechodzą "ukierunkowane różnicowanie" do typów komórek specyficznych dla narządów. Wraz z innymi opracowaliśmy protokoły generowania komórek progenitorowych płuc pochodzących z iPSC, komórek pęcherzyków płucnych typu 27,8 oraz komórek przewodzących dróg oddechowych, w tym komórek podstawnych dróg oddechowych9,10,11,12.
Komórka podstawna dróg oddechowych jest komórką macierzystą przewodzącej drogi oddechowej13. We wcześniej opublikowanych pracach nasza grupa wygenerowała komórki nabłonka dróg oddechowych pochodzące z iPSC, w tym podzbiór (iBC), który wyraża kanoniczne markery komórek podstawnych, w tym TP63, KRT5 i NGFR. Podążając za wskazówkami z biologii podstawowej komórki dorosłej, hamowanie podwójnych szlaków SMAD (TGF-β i BMP) prowadzi do regulacji w górę NGFR+ iBCs11,14. iBC NGFR+ są ponownie zawieszane w postaci pojedynczych komórek w kropelkach macierzy zewnątrzkomórkowej i hodowane w pożywce dla komórek podstawnych. Odnawiają się samoodnawiają, aby utrzymać populację iBC i tworzą sferoidy nabłonkowe; jednak część różnicuje się również w komórki wydzielnicze w tym formacie (określanym jako hodowla 3D). W poniższym protokole szczegółowo opisujemy kroki mające na celu utrzymanie i ekspansję tych iBC w hodowli 3D, a także kroki wymagane do wygenerowania funkcjonalnej 2-D śluzowo-rzęskowej hodowli ALI.
Początkowe kroki tego protokołu różnicowania zostały wcześniej opublikowane i nie będą tutaj omawiane11,12. Niniejszy manuskrypt skupi się na ekspansji i oczyszczaniu iBC, a następnie ich różnicowaniu w funkcjonalne komórki wydzielnicze i wielorzęskowe w hodowli ALI.

<table><tbody><tr><td>12-dołkowa płytka poddana hodowli tkankowej</td><td>Corning</td><td>3515</td><td>płaskie dno</td></tr><tr><td>3-D czynnik wzrostu zredukowany Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>293910</td><td></td></tr><tr><td>Wkładki do hodowli komórkowych (Transwell)</td><td>Corning</td><td>3470</td><td>średnica 6,5 mm; 0,4 i mu; m wielkość porów</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II, proszek</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>DMH1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>412610</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Podłoże / mieszanka składników odżywczych (DMEM):F-12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco ( PBS) (1X)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Fisher</td><td>SH3007003E</td><td></td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14175-079</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>z certyfikatem hESC Matrigel</td><td>Corning</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Mysia kontrola izotypu IgG1kappa, sprzężony z APC</td><td>Biolegend</td><td>400122</td><td></td></tr><tr><td>Mysi monoklonalny anty-ludzki CD271/NGFR, Biolegend 345108 sprzężony z APC</td><td></td><td></td> PneumaCult-ALI Medium (ALI Differentiation Medium)StemCell Technologies 05001 PneumaCult-Ex Plus Medium (podłoże bazalnokomórkowe)<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>StemCell Technologies</td><td>05040</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-2</td><td></td></tr><tr><td>rhLaminin-521</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A29248</td><td>Stężenie końcowe: 10ug/ml</td></tr><tr><td>roztworu trypsyny-EDTA, 0,05%</td><td>Invitrogen</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie kultur komórek nabłonka dróg oddechowych na granicy faz powietrze-ciecz z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Generation of Airway Epithelial Cell Air-Liquid Interface Cultures from Human Pluripotent Stem Cells

Choroby dróg oddechowych, takie jak astma, mukowiscydoza (CF), pierwotne dyskinezy rzęsek (PCD) i wirusowe infekcje dróg oddechowych są głównymi przyczynami zachorowalności i śmiertelności na całym świecie. Platformy in vitro wykorzystujące ludzkie komórki nabłonka oskrzeli (HBEC) odegrały zasadniczą rolę w naszym zrozumieniu nabłonka dróg oddechowych w zdrowiu i chorobie. Dostęp do HBEC od osób z rzadkimi chorobami genetycznymi lub rzadkimi mutacjami jest wąskim gardłem w badaniach nad płucami.
Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) są łatwo generowane przez "przeprogramowanie" komórek somatycznych i zachowują unikalne tło genetyczne indywidualnego dawcy. Najnowsze osiągnięcia pozwalają na ukierunkowane różnicowanie iPSC do komórek progenitorowych nabłonka płuc, komórek pęcherzyków płucnych typu 2, a także komórek nabłonka przewodów oddechowych za pośrednictwem komórek podstawnych, głównych komórek macierzystych dróg oddechowych.
Tutaj przedstawiamy protokół utrzymania i rozbudowy komórek podstawnych dróg oddechowych pochodzących z iPSC (zwanych dalej iBC), jak również ich trójliniowego różnicowania w kulturach na granicy faz powietrze-ciecz (ALI). iBC są utrzymywane i rozwijane jako sfery nabłonkowe zawieszone w kropelkach macierzy zewnątrzkomórkowej hodowanej w pierwotnym pożywce dla komórek podstawnych, uzupełnionej inhibitorami szlaków sygnałowych TGF-ß i BMP. iBC w tych sferach nabłonkowych wyrażają kluczowe markery podstawowe TP63 i NGFR, mogą być oczyszczane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS), a po posianiu na porowatych błonach w standardowych warunkach hodowli ALI różnicować się w funkcjonalny nabłonek dróg oddechowych. Kultury ALI pochodzące od zdrowych dawców składają się z komórek podstawnych, wydzielniczych i wielorzęskowych i wykazują integralność bariery nabłonkowej, ruchliwe rzęski i wydzielanie śluzu. Kultury pochodzące od osób z mukowiscydozą lub PCD podsumowują dysfunkcyjny transport chlorków za pośrednictwem CFTR lub nieruchome rzęski, odpowiednie chorobowe wady nabłonka.
Tutaj prezentujemy protokół generowania komórek ludzkich, który może być zastosowany do modelowania i zrozumienia chorób dróg oddechowych.

Zgodnie z tym protokołem, 200 000 kriokonserwowanych iBC (wcześniej potwierdzonych pod kątem prawidłowego kariotypu 46XY)11 rozmrożono i namnożono w hodowli 3-D. Po pięciu dniach powstałe sferoidy zdysocjowano, policzono i ponownie pasażowano w celu dalszej ekspansji. Uzyskano około 480 000 komórek, które zawieszono ponownie w matrycy 3-D (12 kropli po 50 µL, gęstość 400 komórek/µL). Co 2-3 dni dodawano świeże Basal Cell Medium. Po dziesięciu dniach komórki ponownie zdysocjowano i policzono. Zebrano łącznie 19,7 x 106 komórek i przygotowano je do analizy FACS. 106 komórek barwiono kontrolą izotypową IgG1κ sprzężoną z APC, a pozostałe 18,7 x 106 komórek barwiono przeciwciałem anty-NGFR sprzężonym z APC przez 30 min w warunkach chronionych przed światłem (Rycina 3).
Bramkowanie dla frakcji NGFR+ wykonano po porównaniu z komórkami kontrolnymi izotypowymi i celowo ustawiono tak, aby wyizolować komórki wykazujące najwyższą ekspresję NGFR+ (Rysunek 3). Przy zastosowaniu tej techniki bramkowania 28% żywych, pojedynczych komórek było NGFR+. Mimo dostępności większej liczby komórek, do dalszych hodowli zebrano 750 000 komórek. Posortowane komórki resuspendowano w pożywce Basal Cell Medium do stężenia 50 000 komórek/100 µL. Następnie na każdy porowaty wkład membranowy o średnicy 6,5 mm naniesiono 50 000 komórek; wkłady zostały uprzednio pokryte ludzką rekombinowaną lamininą-521 (2 µg/200 µL) zgodnie z wytycznymi producenta. Do komory basolateralnej każdego wkładu dodano 500 µL pożywki Basal Cell Medium, a płytkę umieszczono w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C. Po trzech dniach odessano pożywkę z komory apikalnej; w badaniu pod mikroskopem świetlnym stwierdzono, że komórki osiągnęły około 90% konfluencji (Rysunek 4B). Odessano pożywkę z komory basolateralnej, a do komory apikalnej (100 µL) i basolateralnej (500 µL) dodano pożywkę ALI Differentiation Medium. Następnego dnia odessano pożywkę z komory apikalnej.
Przez kolejne 21 dni komórki oceniano okresowo za pomocą mikroskopii świetlnej i zasilano świeżą pożywką do różnicowania ALI (wyłącznie w komorze bazolateralnej) co 2-3 dni. Pojedyncze komórki były początkowo łatwo identyfikowalne (Rysunek 4A), miały wydłużony, wrzecionowaty wygląd i tworzyły luźno upakowaną monowarstwę (Rysunek 4B). W kolejnych dniach i tygodniach komórki utworzyły gęsto upakowaną, silnie komórkową warstwę nabłonkową, a po 7-10 dniach zaobserwowano wyraźne pojawienie się bijących rzęsek oraz produkcję śluzu. Obliczono wartości TEER dla próbek, które były zbliżone do kontrolnych komórek pierwotnych (zakres od 700-1600 Ω x cm2)11. Następnie przeprowadzono utrwalanie (dni 21-28) przy użyciu paraformaldehydu oraz immunoznakowanie w kierunku kanonicznych markerów komórek nabłonka dróg oddechowych, m.in. dla MUC5AC i acetylowanej α-tubuliny (Rysunek 4C). Podsumowując, na podstawie obserwacji ruchomych rzęsek i produkcji śluzu, a także potwierdzającego barwienia immunocytochemicznego komórek wielorzęskowych i wydzielniczych, które było zbliżone do wyników dla pierwotnych HBECs, wyciągnęliśmy wniosek, że z sukcesem wygenerowaliśmy komórki nabłonka dróg oddechowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.
<img alt="Schemat procesu różnicowania komórek; pasaż pojedynczych komórek, sortowanie komórek, różnicowanie śluzowo-rzęskowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63882/63882fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Ogólny schemat protokołu. Kriozachowane iBC są rozmrażane, namnażane i oczyszczane metodą FACS przed wysianiem na wkładki z porowatej membrany, gdzie różnicują się w funkcjonalny nabłonek śluzowo-rzęskowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63882/63882fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy TEM nanocząsteczek przedstawiające rozkład wielkości i morfologię, przydatne do analizy materiałowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63882/63882fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Reprezentatywne obrazy kontrastu fazowego. Reprezentatywne obrazy kontrastu fazowego prezentujące typowy wygląd iBCs w hodowli 3-D po (A) 1 dniu, (B) 4 dniach, (C) 8 dniach i (D) 14 dniach (bezpośrednio przed sortowaniem NGFR). Paski skali reprezentują 500 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63882/63882fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy kropkowe z cytometrii przepływowej pokazujące wiązanie przeciwciał NGFR w liniach bez reportera i z reporterem." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63882/63882fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Reprezentatywne wykresy FACS. Reprezentatywne wykresy FACS dla iBC bez reportera oraz z reporterem fluorescencyjnym. Przedstawiono przykłady kontroli izotypowych, które posłużyły do wyselekcjonowania komórek NGFR+ o najwyższej ekspresji. Linie iPSC zawierające reporter fluorescencyjny są poddawane „potrójnemu sortowaniu” w celu wyizolowania komórek NKX2-1GFP+ TP63tdTomato+ NGFR+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63882/63882fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii SEM i fluorescencyjnej; struktura komórkowa, analiza tubuliny, obserwacja mikrotubul." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63882/63882fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Reprezentatywne obrazy kultur iBC na membranach porowatych. Obrazy w kontraście fazowym przedstawiono (A) 1 dzień oraz (B) 3 dni po wysiewaniu. Reprezentatywne immunozbarwienie kultur śluzowo-rzęskowych pokazano w (C); acetylowana alfa-tubulina (zielony) i MUC5AC (czerwony). Paski skali reprezentują 25 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63882/63882fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Plik uzupełniający 1: Tabela składników pożywek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63882/Media%20components.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ostatnie postępy w protokołach różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych pozwalają na stopniowe wyprowadzanie typów komórek specyficznych dla narządów. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe kroki dotyczące utrzymania i ekspansji komórek podstawnych dróg oddechowych pochodzących z iPSC oraz ich różnicowania w nabłonek śluzowo-rzęskowy w kulturach na granicy faz powietrze-ciecz.

Wytwarzanie kultur komórek nabłonka dróg oddechowych na granicy faz powietrze-ciecz z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Diseases of the conducting airway such as asthma, cystic fibrosis (CF), primary ciliary dyskinesia (PCD), and viral respiratory infections are major ...

Protokół ten jest pomocny, ponieważ zapewnia łatwe do wykonania kroki, które pozwalają na generowanie funkcjonalnych komórek nabłonka dróg oddechowych, które można następnie wykorzystać do badania różnych aspektów biologii dróg oddechowych. Główną zaletą tego protokołu jest możliwość generowania wielu funkcjonalnych kultur komórek nabłonka dróg oddechowych przy jednoczesnym uniknięciu trudności związanych z pozyskiwaniem i hodowlą pierwotnych komórek dróg oddechowych. Procedurę zademonstruje Taylor Matte, doktorant z naszego laboratorium.Zacznij od rozmrożenia wystarczającej objętości matrycy 3D na lodzie. Trzymaj go na lodzie, aż będzie gotowy do użycia. Rozmrozić fiolkę z wcześniej kriokonserwowanymi zawiesinami pojedynczych komórek iBC, inkubując ją w kąpieli wodnej lub perełkowej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż nie będzie widocznych zamrożonych pożywek.Za pomocą pięciomililitrowej pipety serologicznej przenieś zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Dodaj kroplami od sześciu do 10 mililitrów DMEM / F12 do zawiesiny komórek. Delikatnie wymieszaj i odwiruj w temperaturze 300 RCF przez pięć minut, aby granulować komórki.Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze podłoża Basal Cell Medium za pomocą mikropipety P1000. Przygotuj podwielokrotność 10 mikrolitrów i wykonaj liczenie komórek. Odwirować komórki w temperaturze 300 RCF przez pięć minut.Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki o gęstości 4 000 komórek na mikrolitr w uprzednio rozmrożonej matrycy 3D za pomocą mikropipety P1000. Za pomocą mikropipety P200 dodać kroplę roztworu matrycy odpowiadającą około 25 do 50 mikrolitrom do podstawy każdego dołka 12-dołkowej płytki poddanej działaniu kultur tkankowych. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około 15 minut.Następnie dodaj wystarczającą ilość podłoża z komórek podstawowych do każdej studzienki, aby całkowicie zanurzyć kroplę za pomocą pięciomililitrowej pipety serologicznej. Umieścić płytkę z powrotem w nawilżonym inkubatorze. Odżywiaj komórki co dwa dni za pomocą świeżej pożywki z komórek podstawowych.Dodać świeżą pożywkę z boku studzienki za pomocą pięciomililitrowej pipety serologicznej, uważając, aby nie naruszyć kropelki komórek. Rozmrozić wystarczającą objętość matrycy 3D na lodzie. Trzymaj go na lodzie, aż będzie gotowy do użycia.Po około pięciu do siedmiu dniach inkubacji płytek hodowlanych, odessać pożywkę z każdej studzienki, a następnie za pomocą mikropipety P1000 dodać jeden mililitr dyspazy II bezpośrednio na sferoidy, aby oddzielić od kropli matrycy. Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 do 15 minut. Za pomocą mikropipety P1000 wymieszaj dypazę, pipetując dwukrotnie w górę i w dół, rozbijając duże grudki matrycy 3D.Przywróć płytkę do 37 stopni Celsjusza na dodatkowe 30 do 40 minut, pozwalając matrycy całkowicie się rozpuścić. Gdy kropla matrycy 3D nie jest już widoczna pod mikroskopem świetlnym, dodaj swobodnie unoszące się sferoidy do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów za pomocą pięciomililitrowej końcówki pipety serologicznej. Dodaj DMEM / F12 dla końcowej objętości 10 mililitrów na stożkową probówkę i odwiruj przy 200 RCF przez trzy minuty, aby granulować sferoidy.Odessać supernatant i dodać jeden mililitr 0,05% trypsyny na każdą początkową zdysocjowaną kroplę. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza, rozcierając go co dwie do trzech minut. Oceniaj roztwór za pomocą mikroskopu świetlnego co kilka minut.Gdy ponad 90% sferoid zostanie zdysocjowanych na pojedyncze komórki, dodaj 10% płodowej surowicy bydlęcej do trypsyny. Przefiltrować komórki przez sitko o średnicy 40 mikrometrów i odwirować przy 300 RCF przez pięć minut. Wykonaj zliczanie komórek i równomiernie ponownie zawieś komórki o gęstości 400 komórek na mikrolitr rozmrożonej matrycy 3D.Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza. Zawieś ponownie tyle kropel, ile jest potrzebne do dalszej aplikacji. Powtórz ten proces dla każdej studzienki.Po 10 do 14 dniach od ostatniego pasażu należy zdysocjować sferoidy do zawiesiny pojedynczej komórki, jak pokazano wcześniej, i przeprowadzić zliczanie komórek. Zawieś ponownie komórki w buforze sortowania. To będzie główna populacja.Przenieś małą porcję od 25 do 50 mikrolitrów do oddzielnej probówki. Będzie to populacja mniejsza. Dodaj sprzężone przeciwciało anty-NGFR do głównej populacji komórek.Dodaj przeciwciało kontrolne izotypu do populacji komórek mniejszych. Chroń komórki przed światłem i trzymaj je na lodzie przez 30 minut, przerywając rozcieranie komórek, aby zapobiec granulowaniu. Po 30 minutach dodaj bufor sortowania do każdej probówki komórek.Odwirować komórki przy 300 RCF przez pięć minut. Odessać supernatant, ponownie zawiesić granulowane komórki w buforze sortującym i dodać żywe lub martwe komórki. Stosując odpowiednią strategię dodatniego bramkowania NGFR, posortuj wystarczającą ilość komórek dodatnich NGFR do niezbędnych dalszych zastosowań.Przygotuj 6,5-milimetrowe porowate wkładki membranowe, dodając matrycę o pojemności 200 mikrolitrów do komory wierzchołkowej zgodnie z instrukcją producenta. Umieść go w temperaturze 37 stopni Celsjusza na co najmniej dwie godziny przed potrzebą. Odessać matrycę powłoki z komory wierzchołkowej wkładu.Dodaj 500 mikrolitrów podłoża podstawnokomórkowego do komory podstawno-bocznej. Zawiesić co najmniej 30 000 posortowanych komórek dodatnich NGFR w 100 do 200 mikrolitrach pożywki z komórek podstawowych i przenieść do komory wierzchołkowej za pomocą mikropipety P200. Powtórz dla pozostałych dołków.Umieść płytkę w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. W ciągu dwóch do trzech dni odessać komory wierzchołkowe i podstawno-boczne i karmić świeżą pożywką z komórek podstawnych. Codziennie monitoruj komorę wierzchołkową za pomocą mikroskopu świetlnego.Gdy komórki osiągną więcej niż 80% konfluencji, zastąp podłoże podstawnokomórkowe podłożem różnicującym ALI zarówno w komorach wierzchołkowych, jak i podstawno-bocznych. Chronić podłoże różnicujące ALI przed światłem, przechowując pojemniki na pożywki owinięte folią i wyłączając światła górne, jeśli to możliwe. Następnego dnia należy odessać pożywkę z komory wierzchołkowej, wystawiając w ten sposób powierzchnię wierzchołkową na działanie powietrza.Pożywki różnicujące ALI należy wymieniać w komorze podstawno-bocznej co dwa do trzech dni. Monitoruj wygląd kultury co jeden do dwóch dni. Ostrożnie odessać nagromadzony płyn z komory wierzchołkowej, nie naruszając warstwy komórkowej.Delikatnie dodaj 100 mikrolitrów PBS bez wapnia i magnezu do komory wierzchołkowej, aby usunąć zanieczyszczenia lub śluz. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie ostrożnie odessać PBS. Oceń TEER pod kątem integralności nabłonka.Po siedmiu do 10 dniach ekspozycji na powietrze obserwuj pojawienie się wielorzęsek za pomocą mikroskopii świetlnej. W zależności od planowanego eksperymentu i odczytu, komórki mogą być analizowane po 14 do 28 dniach ekspozycji na powietrze. Po 10 do 14 dniach od ostatniego przejścia hodowli 3D należy zdysocjować sferoidy do zawiesiny pojedynczej komórki, jak pokazano wcześniej.Wykonaj zliczanie komórek, ponownie zawieś zawiesinę komórek w podłożu do krioprezerwacji w kriowalu. Umieść kriowiale w pojemniku, aby zapewnić stały spadek temperatury. I przenieś do minus 80 stopni Celsjusza na 24 do 48 godzin, a następnie przenieś do minus 150 stopni Celsjusza w celu długotrwałego przechowywania.Dzięki tej technice bramkowania 28% żywych pojedynczych komórek było dodatnich pod względem NGFR. Po dwóch dniach poszczególne komórki były początkowo łatwe do zidentyfikowania i miały wydłużony wygląd wrzecionowaty. Po kolejnych dwóch dniach komórki utworzyły zlewającą się i luźno upakowaną monowarstwę.W ciągu kolejnych dni lub tygodni komórki utworzyły ciasno upakowaną, wysoce komórkową warstwę nabłonka. A po siedmiu do 10 dniach nastąpiło wyraźne pojawienie się bicia rzęsek i produkcji śluzu. Zmierzono TEER próbek, a wyniki były podobne do pomiarów próbek kontrolnych pierwotnych komórek nabłonka dróg oddechowych.Następnie przeprowadzono utrwalanie aldehydem paraform i znakowanie immunologiczne dla markerów komórek nabłonka kanonicznych dróg oddechowych m.in. dla MUC5AC i acetylowanej alfa-tubuliny. Postępując zgodnie z tym protokołem, naukowcy mogą wygenerować dużą liczbę kultur komórek nabłonka dróg oddechowych pochodzących od pacjenta, aby ocenić różne odczyty, w tym te, które testują funkcje komórek podstawnych, wydzielniczych i wielorzęskowych zarówno w chorobie, jak i zdrowiu.

generation-airway-epithelial-cell-air-liquid-interface-cultures-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Komórki nabłonka nosa, uzyskane poprzez powierzchowną biopsję zeskrobaną ludzkich ochotników, są rozszerzane i przenoszone do wkładek do hodowli tkankowych. Po osiągnięciu konfluencji komórki są hodowane na granicy faz powietrze-ciecz, dając kultury komórek rzęskowych i nierzęskowych. Zróżnicowane hodowle komórek nabłonka nosa dostarczają realnych modeli eksperymentalnych do badania błony śluzowej układu oddechowego.

Hodowla ludzkich komórek nabłonka nosa na granicy faz powietrza i cieczy

Ten protokół skutecznie kieruje endodermę pochodzącą z embrionalnych komórek macierzystych myszy do dojrzałych komórek nabłonka dróg oddechowych. Ta technika różnicowania wykorzystuje trójwymiarowe, zdecelularizowane rusztowania płuc do kierowania specyfikacją linii płuc w zdefiniowanych, wolnych od surowicy warunkach hodowli.

Generowanie komórek nabłonka dróg oddechowych myszy pochodzących z ESC przy użyciu bezkomórkowych rusztowań płuc

Ten artykuł zawiera szczegółową metodologię metod dysocjacji tkanek i frakcjonowania komórkowego, umożliwiając wzbogacenie żywotnych komórek nabłonkowych z bliższych i dalszych obszarów ludzkiego płuca. W tym przypadku podejścia te są stosowane do analizy funkcjonalnej komórek progenitorowych nabłonka płuc poprzez wykorzystanie modeli hodowli organoidów 3D.

Izolacja i wzbogacanie ludzkich komórek progenitorowych nabłonka płuc do hodowli organoidów

Artykuł opisuje stopniowe różnicowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do trójwymiarowych organoidów całego płuca zawierających zarówno proksymalne, jak i dystalne komórki nabłonkowe płuc wraz z mezenchymą.

Generowanie 3D organoidów całych płuc z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do modelowania biologii i chorób rozwojowych płuc

Obecny protokół opisuje ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki nabłonkowe typu 2 z pęcherzyków płucnych typu 2 (iAT2). Komórki te mogą być hodowane jako samoodnawiające się kulki w hodowli 3D lub przystosowane do hodowli na granicy faz powietrze-ciecz (ALI).

Generowanie sfer 3D i kultur 2D granicy faz powietrze-ciecz indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek nabłonka pęcherzyków płucnych typu 2 pochodzących z ludzkich komórek macierzystych

Przedstawiona tutaj jest powtarzalna, przystępna cenowo i solidna metoda izolacji i ekspansji pierwotnych komórek nabłonka oskrzeli do długoterminowego biobankowania i generowania zróżnicowanych komórek nabłonkowych przez hodowlę na granicy powietrze-ciecz.

Izolowanie komórek nabłonka oskrzeli z wyciętej tkanki płucnej w celu biobankowania i tworzenia dobrze zróżnicowanych kultur granicy faz powietrze-ciecz

Ten artykuł opisuje generowanie złożonego, wielokomórkowego modelu bariery dróg oddechowych, składającego się z nabłonka płuc pochodzącego z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), mezenchymów, komórek śródbłonka i makrofagów w hodowli na granicy powietrza i cieczy.

Hodowla komórek nabłonkowych, mezenchymalnych, śródbłonkowych i odpornościowych pochodzących z iPSC w celu modelowania integralności bariery dróg oddechowych w zdrowiu i chorobie płuc

Protokół ten określa metodę wytwarzania organoidów skóry zawierających mieszki włosowe pochodzące z ludzko indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych, wykorzystując płaski, fizjologicznie istotny system hodowli powietrzno-cieczowy, aby odwzorować architekturę i funkcję skóry.

Generowanie ludzko indukowanych pluripotentnych pluripotentnych organoidów skórnych z komórek macierzystych z użyciem systemu hodowli powietrze-ciecz

Celem tego artykułu jest dostarczenie wyczerpującego i szczegółowego protokołu generowania genetycznie zmodyfikowanej ludzkiej organotypowej skóry z keratynocytów naskórka i zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej.

Generowanie genetycznie zmodyfikowanych organotypowych kultur skóry przy użyciu zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej

Ta praca opisuje protokół różnicowania in vitro do produkcji pigmentowanych, dojrzałych melanocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą grzebienia nerwowego i etapu pośredniego melanoblastu przy użyciu 25-dniowego protokołu bez karmienia.

Bezkarmowe pozyskiwanie melanocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj metodę różnicowania ludzkich komórek iPSC w nabłonek dróg oddechowych na granicy faz powietrze-ciecz. Protokół umożliwia generowanie funkcjonalnych kultur nabłonkowych do badań biologii dróg oddechowych.

Wytwarzanie kultur komórek nabłonka dróg oddechowych na granicy faz powietrze-ciecz z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal

Wytwarzanie kultur komórek nabłonka dróg oddechowych na granicy faz powietrze-ciecz z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów