Name: Ilościowe obrazowanie 3D komórek zakażonych Trypanosoma cruzi, uśpionych amastigotów i limfocytów T w nienaruszonych, oczyszczonych narządach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Poznaj mikroskopię fluorescencyjną light-sheet do ilościowego obrazowania 3D komórek zakażonych Trypanosoma cruzi i limfocytów T w oczyszczonych narządach. Ta metoda umożliwia ocenę skuteczności leczenia choroby Chagasa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Etsuo Susaki za cenną pomoc i zalecenia dotyczące protokołów oczyszczania tkanek i barwienia immunologicznego. Jesteśmy również wdzięczni M. Kandasamy z CTEGD Biomedical Microscopy Core za wsparcie techniczne z wykorzystaniem LSFM i obrazowania konfokalnego. Dziękujemy również wszystkim członkom Tarleton Research Group za pomocne sugestie w trakcie tego badania.

<ol><li>Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+Chagas+disease+control%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">The future of Chagas disease control.</a> Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).</li>
<li>Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+chronic+Chagas+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of chronic Chagas heart disease.</a> Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).</li>
<li>Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+cells+in+Trypanosoma+cruzi+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">CD8+ T cells in Trypanosoma cruzi infection.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (3), 233-238 (2015).</li>
<li>Padilla, A. M., Simpson, L. J., Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insufficient+TLR+activation+contributes+to+the+slow+development+of+CD8%2B+T+cell+responses+in+Trypanosoma+cruzi+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Insufficient TLR activation contributes to the slow development of CD8+ T cell responses in Trypanosoma cruzi infection.</a> Journal of Immunology. 183 (2), 1245-1252 (2009).</li>
<li>Basso, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+immune+response+in+experimental+Chagas+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modulation of immune response in experimental Chagas disease.</a> World Journal of Experimental Medicine. 3 (1), 1-10 (2013).</li>
<li>Martin, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T-Cell+responses+to+Trypanosoma+cruzi+are+highly+focused+on+strain-variant+trans-sialidase+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">CD8+ T-Cell responses to Trypanosoma cruzi are highly focused on strain-variant trans-sialidase epitopes.</a> PLOS Pathogens. 2 (8), 77(2006).</li>
<li>Sanchez-Valdez, F. J., Padilla, A., Wang, W., Orr, D., Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+dormancy+protects+Trypanosoma+cruzi+during+extended+drug+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Spontaneous dormancy protects Trypanosoma cruzi during extended drug exposure.</a> Elife. 7, 34039(2018).</li>
<li>Sanchez-Valdez, F., Padilla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+dormant+Trypanosoma+cruzi+amastigotes+using+bioluminescent-fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ detection of dormant Trypanosoma cruzi amastigotes using bioluminescent-fluorescent reporters.</a> Methods in Molecular Biology. 1955, 179-186 (2019).</li>
<li>Vieites-Prado, A., Renier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+3D+imaging+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology.</a> Development. 148 (18), 199369(2021).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21, 61-79 (2020).</li>
<li>Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guidebook+for+DISCO+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">A guidebook for DISCO tissue clearing.</a> Molecular Systems Biology. 17, 9807(2021).</li>
<li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+learning+reveals+cancer+metastasis+and+therapeutic+antibody+targeting+in+the+entire+body%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Deep learning reveals cancer metastasis and therapeutic antibody targeting in the entire body.</a> Cell. 179 (7), 1661-1676 (2019).</li>
<li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDISCO%3A+Advanced+solvent-based+clearing+method+for+imaging+whole+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs.</a> Science Advances. 5, 8355(2019).</li>
<li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22, 317-327 (2019).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Expansion+of+Functional+Mouse+and+Human+Hepatocytes+as+3D+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+landscape+for+tissue+clearing+based+on+hydrophilic+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents.</a> Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).</li>
<li>Murakami, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+single-cell-resolution+whole-brain+atlas+using+CUBIC-X+expansion+microscopy+and+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing.</a> Nature Neuroscience. 21, 625-637 (2018).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+probing+of+intact+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular probing of intact human organs.</a> Cell. 180 (4), 796-812 (2020).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+a+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+for+mapping+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10, 508-513 (2013).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+whole-organ%2Fbody+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11, 1982(2020).</li>
<li>Kubota, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+profiling+of+cancer+metastasis+with+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution.</a> Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Bustamante, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+drug+regimen+clears+active+and+dormant+trypanosomes+in+mouse+models+of+Chagas+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A modified drug regimen clears active and dormant trypanosomes in mouse models of Chagas disease.</a> Science Translational Medicine. 12 (567), (2020).</li>
<li>Wang, H., Khoradmehr, A., Tamadon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACT+or+PACT%3A+A+comparison+between+free-acrylamide+and+acrylamide-based+passive+sodium+dodecyl+sulfate+tissue+clearing+for+whole+tissue+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Journal%22%5BJournal%5D)">FACT or PACT: A comparison between free-acrylamide and acrylamide-based passive sodium dodecyl sulfate tissue clearing for whole tissue imaging.</a> Cell Journal. 21 (2), 103-114 (2019).</li>
<li>Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+tissue+clearing+and+multi-organ+volumetric+imaging+enable+quantitative+visualization+of+sparse+immune+cell+populations+during+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation.</a> Frontiers in Immunology. 11, 599495(2020).</li>
<li>Messal, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+and+clearing+for+whole-organ+immunofluorescence+by+FLASH%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH.</a> Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).</li>
<li>Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+tissue+clearing+methods+and+3D+imaging+techniques+for+visualization+of+GFP-expressing+mouse+embryos+and+embryonic+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+tiling+light+sheet+microscope+for+imaging+of+cleared+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues.</a> Cell Reports. 33, 108349(2020).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Brak szeroko zakrojonego obrazowania pasożytów i odpowiedzi immunologicznej całego narządu ogranicza zrozumienie złożoności interakcji gospodarz-pasożyt i utrudnia ocenę terapii choroby Chagasa. W niniejszym badaniu wykorzystano linię CUBIC do oczyszczenia i barwienia nienaruszonych narządów i tkanek myszy zakażonych T. cruzi.
W tym badaniu przetestowano wiele protokołów oczyszczania tkanek (PACT32, ECi33, FLASH34...

Choroba Chagasa, wywoływana przez pasożytniczego pierwotniaka T. cruzi, jest jedną z najbardziej zaniedbanych chorób tropikalnych na świecie, powodując około 13 000 zgonów rocznie. Infekcja często postępuje od ostrego do przewlekłego stadium, powodując patologię serca u 30% pacjentów, w tym zaburzenia rytmu serca, niewydolność serca i nagłą śmierć1,2. Pomimo silnej odpowiedzi immunologicznej gospodarza wywołanej przeciwko pasożytowi w ostrej fazie, niewielka liczba pasożytów przewlekle utrzymuje się przez całe życie gospodarza w tkankach takich jak serce i mięśnie szkieletowe. Kilka czynników, w tym opóźniony początek adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych i obecność niereplikujących się form pasożyta, może przyczynić się do zdolności T. cruzi do uniknięcia całkowitej eliminacji przez układ odpornościowy3,4,5,6. Co więcej, niereplikujące się uśpione formy pasożyta wykazują niską podatność na leki trypanobójcze i mogą być częściowo odpowiedzialne za niepowodzenie leczenia obserwowane w wielu przypadkach7,8.
Rozwój nowych technik obrazowania daje możliwość uzyskania wglądu w przestrzenne rozmieszczenie pasożytów w zakażonych tkankach i ich związek z komórkami odpornościowymi zaangażowanymi w ich kontrolę. Cechy te mają kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia procesów zwalczania pasożytów przez układ odpornościowy i śledzenia rzadkich uśpionych pasożytów obecnych w tkankach przewlekłych.
Mikroskopia fluorescencyjna z arkuszami świetlnymi (LSFM) jest jedną z najbardziej wszechstronnych i bezstronnych metod obrazowania 3D dużych tkanek lub narządów bez cienkiego przekroju. Mikroskopy z arkuszami świetlnymi wykorzystują cienki arkusz światła tylko do wzbudzania fluoroforów w płaszczyźnie ogniskowej, zmniejszania fotowybielania i fototoksyczności próbek oraz rejestrowania obrazów tysięcy warstw tkanek za pomocą ultraszybkich kamer. Wysoki poziom przezroczystości tkanek niezbędny do prawidłowej penetracji światła laserowego w tkankach uzyskuje się poprzez homogenizację współczynnika załamania światła (RI) po delipidacji i odbarwieniu tkanek, co zmniejsza rozpraszanie światła i pozwala uzyskać wysokiej jakości obrazy9,10,11.
Metody oczyszczania tkanek zostały opracowane do obrazowania całych myszy12,13,14, organoids15,16,17, narządy wyrażające markery fluorescencyjne reportera18,19,20,21,22,23, a ostatnio ograniczona liczba tkanek ludzkich24. Obecne metody oczyszczania tkanek dzielą się na trzy rodziny: (1) metody oparte na rozpuszczalnikach organicznych, takie jak protokoły DISCO25,26, (2) metody oparte na hydrożelu, takie jak CLARITY27, oraz metody wodne, takie jak CUBIC (Clear, Unstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis)18,19,28,29. Protokoły CUBIC utrzymują kształt narządu i integralność tkanek, zachowując fluorescencję endogennych białek reporterowych. Najnowsza aktualizacja tej techniki, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), pozwala również na wykrywanie epitopów za pomocą przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie i znakowania DNA28.
W obecnym protokole, zastosowano potok CUBIC do wykrywania T. cruzi wyrażających białka fluorescencyjne w oczyszczonych, nienaruszonych tkankach myszy. Optycznie przezroczyste tkanki zobrazowano LSFM, zrekonstruowano w 3D, a dokładną całkowitą liczbę zakażonych komórek T. cruzi, uśpionych amastigotów i limfocytów T na narząd automatycznie określono ilościowo. Protokół ten został również z powodzeniem przyjęty w celu uzyskania jednolitego znakowania oczyszczonych narządów przeciwciałami i plamami jądrowymi. Podejścia te są niezbędne do zrozumienia ekspansji i kontroli T. cruzi u zakażonych gospodarzy i są przydatne do pełnej oceny chemo- i immunoterapii choroby Chagasa.

<table><tbody><tr><td>1-metyloimidazol</td><td>Millipore Sigma</td><td>616-47-7</td><td></td></tr><tr><td>2,3-dimetylo-1-fenylo-5-pirazolon (antypiryna</td><td>TCI</td><td>D1876</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki do hodowli komórkowych</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 anty-mysi fragment Fab</td> Jackson <td>Immuno Research Laboratories</td><td>315-607-003</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 anty-królik Fragment Fab</td>: <td>Jackson Immuno Research Laboratories</td><td>111-607-003</td><td></td></tr>, <tr><td>anty-GFP, nanobody Alexa Fluor 647</td>, <td>Chromotek</td><td>gb2AF647-50</td><td></td></tr>, <tr><td>anty-RFP</td><td>Rockland</td><td>600-401-379</td><td></td></tr>, <tr><td>anty-&alfa;-SMA</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td></td></tr><tr><td>B6. C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mysz</td><td>Szczep laboratoryjny Jackson</td><td>#007914</td><td>Nazwa zwyczajowa: Ai14 , Ai14D lub Ai14 (RCL-tdT)-D</td></tr><tr><td>B6. Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J Mysz</td><td>Jackson Laboratory</td><td>Strain #007914</td><td>Nazwa zwyczajowa: Ai14 , Ai14D lub Ai14(RCL-tdT)-D</td></tr><tr><td>BOBO-1 Jodek</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B3582</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>#A7906</td><td></td></tr><tr><td>Mysz C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J Szczep</td><td>laboratoryjny Jackson</td><td>#032080</td><td>Pospolity Nazwa: Cd8a-Cre (E8III-Cre)</td></tr><tr><td>CAPSO</td><td>Sigma</td><td>#C2278</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki czyszczące Kimwipes</td><td>&nbsp; Kimberly-Clark</td><td>T8788</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Zeiss</td><td>LSM 790</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-HV 1 Zestaw do barwienia immunologicznego 3D</td><td>TCI</td><td>C3699</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-HV 1 Zestaw do barwienia jądrowego 3D</td><td>TCI</td><td>C3698</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-L</td><td>TCI</td><td>T3740</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-P</td><td>TCI</td><td>T3782</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-R+</td><td>TCI</td><td>T3741</td><td></td></tr><tr><td>Superglue żelowy na bazie cyjanoakrylanu</td><td>Scotch</td><td>571605</td><td></td></tr><tr><td>DiR (DiIC18(7); jodek 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetrametyloindotrikarbocyjaniny) Firma: Biotium</td><td>Biotium</td><td>#60017</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Probówki wirówkowe 15 ml</td><td>Corning</td><td></td><td></td>CLS430791</tr><tr><td>Probówki wirówkowe Falcon 50&nbsp; ml</td><td>Corning</td><td>CLS430290</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>J16920. BBR</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidaza</td><td>Sigma</td><td>#H3884 lub #H4272</td><td></td></tr><tr><td>Imaris Konwerter plików x64</td><td>BitPlane</td><td>v9.2.0</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Imaris</td><td>BitPlane</td><td>v9.3</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImSpector</td><td>LaVision BioTec, Miltenyi Biotec</td><td>v6.7</td><td></td></tr><tr><td>Igła do iniekcji dożylnych 23-G</td><td>Sartori, Minisart Filtr strzykawkowy</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki Kimwipes</td><td>Niestrzępiące się Mikroskop</td>fluorescencyjny z arkuszem <td></td><td></td></tr><tr><td>świetlnym</td> System obrazowania <td>Miltenyi Biotec</td><td>ULtramicroscope II Metanol</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>041838.K2</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do mikropipet, 10 i mikro; L, 200 i mikro; L oraz 1,000 &mikro; L</td><td>Axygen</td><td>T-300, T-200-Y i T-1000-B</td><td></td></tr><tr><td>Zmotoryzowany dozownik do pipet</td><td>Fisher Scientific, Fisherbrand</td><td>03-692-172</td><td></td></tr><tr><td>Rozwiązanie montażowe</td><td>TCI</td><td>M3294</td><td></td></tr><tr><td>N-butylodietanoloamina</td><td>TCI</td><td>B0725</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>TCI</td><td>N0078</td><td></td></tr><tr><td>N-metylonikotinamid</td><td>TCI</td><td>M0374</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>RedDot 2 Daleko-czerwona plama jądrowa</td><td>Biotium</td><td>#40061</td><td></td></tr><tr><td>System perfuzji Sacrifice</td><td>Leica</td><td>10030-380</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne</td><td>Costar Sterile</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsaniem</td><td>TAITEC</td><td>BR-43FM MR</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu (NaN3)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>447815000</td><td></td></tr><tr><td>Węglan sodu (Na2CO3)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L13098.36</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>447302500</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaHCO3)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>014707.A9</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX-G Zielona plama kwasu nukleinowego</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowe obrazowanie 3d komórek zakażonych trypanosoma cruzi, uśpionych amastigotów i limfocytów t w nienaruszonych, oczyszczonych narządach

Quantitative 3D Imaging of Trypanosoma cruzi-Infected Cells, Dormant Amastigotes, and T Cells in Intact Clarified Organs

Choroba Chagasa to zaniedbana patologia, która dotyka miliony ludzi na całym świecie, głównie w Ameryce Łacińskiej. Czynnik choroby Chagasa, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), jest obligatoryjnym pasożytem wewnątrzkomórkowym o zróżnicowanej biologii, który infekuje kilka gatunków ssaków, w tym ludzi, powodując patologie serca i układu pokarmowego. Wiarygodne wykrywanie zakażeń T. cruzi in vivo było od dawna potrzebne, aby zrozumieć złożoną biologię choroby Chagasa i dokładnie ocenić wyniki schematów leczenia. Obecny protokół demonstruje zintegrowany proces automatycznego oznaczania ilościowego komórek zakażonych T. cruzi w zrekonstruowanych, oczyszczonych narządach zrekonstruowanych w 3D. Mikroskopia fluorescencyjna z arkuszami świetlnymi pozwala na dokładną wizualizację i ilościowe określenie aktywnie proliferujących i uśpionych pasożytów T. cruzi oraz komórek efektorowych układu odpornościowego w całych narządach lub tkankach. Z powodzeniem wdrożono również linię produkcyjną CUBIC-HistoVision w celu uzyskania jednolitego znakowania oczyszczonych narządów za pomocą przeciwciał i barwników jądrowych. Oczyszczanie tkanek w połączeniu z barwieniem immunologicznym 3D zapewnia bezstronne podejście do kompleksowej oceny protokołów leczenia farmakologicznego, poprawy zrozumienia organizacji komórkowej tkanek zakażonych T. cruzi i oczekuje się, że przyspieszy odkrycia związane z odpowiedziami immunologicznymi anty-T. cruzi, uszkodzeniem tkanek i naprawą w chorobie Chagasa.

Utkane tkanki poddano procesowi CUBIC, płucząc je w PBS w celu usunięcia utrwalaczy, a następnie inkubowano z koktajlami CUBIC-L – zasadowym roztworem buforowym aminowych alkoholi, które ekstrahują pigmenty i lipidy z tkanki, co prowadzi do jej odbarwienia przy jednoczesnym zachowaniu architektury tkankowej. Przez tkanki widoczne są linie siatki na papierze, co wskazuje na prawidłowe przejrzyszczenie organów. (Rycina 2A)Po delipidacji tkanki przemyto i zanurzono odpowiednio ...

Obecny protokół opisuje mikroskopię fluorescencyjną z użyciem arkuszy świetlnych oraz zautomatyzowane metody wspomagane oprogramowaniem, aby wizualizować i precyzyjnie określać ilościowo proliferujące i uśpione pasożyty Trypanosoma cruzi oraz limfocyty T w nienaruszonych, oczyszczonych organach i tkankach. Techniki te zapewniają wiarygodny sposób oceny wyników leczenia i oferują nowe informacje na temat interakcji pasożyt-gospodarz.

Ilościowe obrazowanie 3D komórek zakażonych Trypanosoma cruzi, uśpionych amastigotów i limfocytów T w nienaruszonych, oczyszczonych narządach

Chagas disease is a neglected pathology that affects millions of people worldwide, mainly in Latin America. The Chagas disease agent, Trypanosoma cruzi ...

Technika ta zapewniła bardziej kompletny i trójwymiarowy obraz całych przezroczystych narządów i była przydatna do ilościowego określania nie tylko replikacji, ale także uśpionych komórek pasożytów i czynników odpornościowych. Technika ta pozwala nam określić szczególny związek pasożytów, komórek odpornościowych i uszkodzeń tkanek wynikających z infekcji. Barwienie immunologiczne epitopów i znakowanie DNA były również porównywalne z tą techniką.Protokół ten został skutecznie wykorzystany do oceny wyników leczenia w mysich modelach choroby Chagasa. Leczenie wyższymi dawkami indywidualnymi, podawanymi rzadziej przez dłuższy okres leczenia, eliminuje zarówno pasożyty replikujące się, jak i uśpione. Procedurę zademonstruje Caleb Hawkins, technik badawczy z laboratorium Ricka Tarletona.Po eutanazji, sekcji i utrwaleniu narządów zakażonej myszy zgodnie z opisem w rękopisie, zanurz poszczególne narządy w 10 mililitrach 50% rozcieńczonego wodą CUBIC-L, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej w 50-mililitrowych stożkowych rurkach chronionych przed światłem. Następnego dnia zastąp 50%CUBIC-L 10 mililitrami 100%CUBIC-L i inkubuj przez sześć dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza, trzymając probówkę płasko na inkubatorze wytrząsarki. Pod koniec tego okresu inkubacji tkanki powinny być prawie całkowicie przezroczyste.Przezroczyste organy myć dwukrotnie PBS przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając. Przy każdym myciu przenieś chusteczki do nowej 50-mililitrowej stożkowej tuby, aby usunąć Triton X-100. W przypadku barwienia DNA rozcieńczyć dostępny w handlu barwnik kwasu nukleinowego w pięciu mililitrach buforu barwiącego w stosunku 1:2, 500.Następnie zanurz tkankę w 15-mililitrowej stożkowej probówce zawierającej roztwór barwnika jądrowego i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza, delikatnie obracając przez pięć dni w pozycji stojącej. Umyj chusteczkę trzykrotnie 15 mililitrami bufora do barwienia jądrowego 3D przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając. Oblicz wymaganą ilość przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych.Wymieszaj przeciwciała pierwszorzędowe i wtórne w bursztynowej dwumililitrowej probówce i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 1,5 godziny. W celu wymiany buforu wymieszaj 7,5 mililitra 2x HV1 3D buforu do barwienia immunologicznego z 7,5 mililitra podwójnie destylowanej wody. Zanurz próbkę tkanki w buforze i inkubuj przez 1,5 godziny w temperaturze 32 stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów w pozycji poziomej.Pobrać próbkę tkanki z pożywki do wymiany buforowej i zanurzyć ją w roztworze barwiącym przeciwciała. Inkubuj tkanki pojedynczo przez tydzień w temperaturze 32 stopni Celsjusza, delikatnie potrząsając probówkami w pozycji stojącej z dala od światła. Przenieś próbki tkanek do czterech stopni Celsjusza i inkubuj w pozycji stojącej.Po schłodzeniu buforu do płukania immunologicznego HV1 3D do czterech stopni Celsjusza, przemyć próbkę 15 mililitrami buforu dwukrotnie w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut, każdy z delikatnym potrząsaniem w pozycji poziomej. Rozcieńczyć formalinę do 1% w immunobarwiącym buforze płuczącym HV1 3D i zanurzyć próbkę w ośmiu mililitrach roztworu na 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając. Teraz inkubuj próbkę w świeżym 1% roztworze formaliny przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i myj w 15 mililitrach PBS przez dwie godziny w temperaturze 25 stopni Celsjusza.Zanurz przezroczyste organy w 50-mililitrowej stożkowej probówce zawierającej pięć mililitrów 50% rozcieńczonego wodą roztworu CUBIC-R+ w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając. Zastąp go pięcioma mililitrami 100%CUBIC-R+i inkubuj, delikatnie wstrząsając przez dwa dni. Wysuszyć tkanki za pomocą chusteczek Kimwipe, a następnie przenieść je do pięciu mililitrów roztworu montażowego na sześciodołkowej płytce hodowlanej i inkubować w temperaturze pokojowej.Przyklej tkanki do uchwytu na próbkę mikroskopu za pomocą super kleju żelowego. Zanurz próbki w mikroskopowej kuwecie kwarcowej wypełnionej 120 mililitrami roztworu montażowego. Wyobraź je sobie poprzecznie do ich osi podłużnej i przyklej serce, z wierzchołkiem i aortą ustawionymi poziomo.Zrekonstruowane w 3D serce zakażone Trypanosoma cruzi wykazywało wyższy odsetek zakażonych komórek w przedsionku w porównaniu z komorami. Uśpione pasożyty można zidentyfikować w sercu, jak pokazano na powiększonych wstawkach 3D. Limfocyty T z ekspresją ZsGreen1, a także komórki zakażone Trypanosoma cruzi, uwidoczniono w mięśniach szkieletowych myszy reporterowej CD8 zakażonej Trypanosoma cruzi.Zbliżenia 3D zrekonstruowanego obrazu 3D zidentyfikowały limfocyty T w regionie zainfekowanej komórki. Granicę faz limfocytów T w komórkach zakażonych gospodarzem uwidoczniono za pomocą mikroskopii konfokalnej. W sercu myszy z niedoborem odporności wykryto komórki gospodarza zakażone dwoma różnymi szczepami Trypanosoma cruzi, a przecięcie tkanek wykazało liczne komórki zakażone pasożytem w przedsionkach serca na różnych głębokościach tkanki.Immunodetekcja naczyń krwionośnych w sercu zakażonym Trypanosoma cruzi ujawnia skomplikowane unaczynienie serca. Komórki zakażone pasożytami można było zaobserwować w przedsionkach serca. Barwienie jądrowe mięśni szkieletowych wykazało nagromadzenie jąder w obszarach z niewielką liczbą lub niewykrywalnymi pasożytami tdTomato.Wzmocnienie markerów reporterowych tdTomato i GFP za pomocą przeciwciał przeciwko RFP i GFP oraz całych oczyszczonych mięśni szkieletowych spowodowało silną fluorescencję. Tak więc punktami krytycznymi są czas inkubacji w buforze CUBIC, czas rozcieńczania i inkubacji w barwniku DNA, czas inkubacji w przeciwciałach oraz czas inkubacji w załamującym się roztworze dopasowującym indeks. Zastosowanie dodatkowego barwienia, ze specyficznym barwnikiem przeciwciał i szybką reakcją, może znacznie zwiększyć potencjał tej techniki, umożliwiając wykrycie wielu komórek, procesów i struktur w nienaruszonych narządach.Mamy teraz lepszy i bardziej kompletny sposób na zbadanie komórek odpornościowych odpowiedzialnych za zabijanie pasożytów, tkanek, w których pasożyty utrzymują się przewlekle, oraz dystrybucji określonych leków w tkankach.

quantitative-3d-imaging-trypanosoma-cruzi-infected-cells-dormant

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przedstawiamy metodę wykonywania mikroskopii intravitalnej ślezy z wykorzystaniem transgenicznych pasożytów malarii GFP oraz kwantyfikacji ruchliwości pasożytów i przepływu krwi w obrębie tego narządu.

Mikroskopia intravitalna śledziony: ilościowa analiza mobilności pasożytów i przepływu krwi

Opisujemy metodę mikroskopii korelcyjnej, która łączy szybką mikroskopię 3D z żywymi komórkami fluorescencyjnymi i tomografię krioelektronową o wysokiej rozdzielczości. Wykazujemy możliwości metody korelacyjnej poprzez obrazowanie dynamicznych, małych cząstek HIV-1 oddziałujących z komórkami HeLa gospodarza.

Mikroskopia korelacyjna do analizy statyczno-wytrzymałościowej 3D oddziaływań dynamicznych

Korzystając z tego protokołu, byliśmy w stanie zobrazować odcinki mózgu myszy zainfekowane pasożytem Toxoplasma gondii o grubości 160 μm, co umożliwia wizualizację i analizę przestrzennego związku między pasożytem otorbiającym a zainfekowanym neuronem.

Obrazowanie 3D i analiza neuronów zakażonych in vivo Toxoplasma gondii

Ten manuskrypt opisuje użycie bioluminescencyjnego szczepu afrykańskich trypanosomów do śledzenia późnych stadiów infekcji i pokazuje, jak obrazowanie na żywo in vivo może być wykorzystane do wizualizacji infekcji w ośrodkowym układzie nerwowym w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie bioluminescencyjne w celu wykrycia późnego stadium zakażenia trypanosomatozą afrykańską

W tym protokole, fluorescencyjnie znakowane T. cruzi zostały wstrzyknięte do przezroczystych larw danio pręgowanego, a ruchliwość pasożyta zaobserwowano in vivo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem arkusza świetlnego.

Ustanowienie larw danio pręgowanego jako modelu zwierzęcego do badania ruchliwości Trypanosoma cruzi in vivo

Czynnik choroby Chagasa wywołany przez Trypanosoma cruzi powoduje długotrwałe, bezobjawowe infekcje, które nagle przekształcają się w klinicznie rozpoznaną patologię. Poniższy protokół badawczy opisuje krótkoterminowe rodzinne badanie epidemiologiczne mające na celu rozwikłanie infekcji T. cruzi przenoszonej drogą płciową z rodzica na potomstwo.

Przenoszenie płciowe amerykańskich trypanosomów z samców i samic na naiwnych partnerów

Ten protokół opisuje kroki do wygenerowania modelu 3D rozkładu metabolitów podczas infekcji trypanosomatydem, w tym pobieranie próbek, ekstrakcję metabolitów, przegląd akwizycji danych z chromatografii cieczowej i spektrometrii mas tandemowej, generowanie modeli 3D i wreszcie wizualizację danych.

Podejścia kartografii chemicznej do badania zakażenia trypanosomatydem

To badanie pokazuje szczegółowy protokół do przeprowadzenia mikroskopii ekspansji ultrastruktury w trzech etapach cyklu życia in vitro Trypanosoma cruzi, patogenu odpowiedzialnego za chorobę Chagasa. Uwzględniamy zoptymalizowaną technikę białek cytoszkieletu i znakowania pan-proteomu.

Mikroskopia ekspansji ultrastrukturalnej w trzech etapach cyklu życia Trypanosoma cruzi in vitro

Tutaj opisujemy procedurę, która umożliwia wykrywanie bakterii chorobotwórczych w całym narządzie podczas infekcji i ilościowe określanie aktywności fluorescencyjnego reportera.

Trójwymiarowa tomografia całego narządu o wysokiej rozdzielczości zakażeń bakteryjnych

Protokół tutaj opisuje szczegółowe kroki do przeprowadzenia badań skuteczności leków w bioluminescencyjnym modelu zakażenia Trypanosoma cruzi, z naciskiem na pozyskiwanie, analizę i interpretację danych. Dostępne są również procedury rozwiązywania problemów i kontroli jakości w celu zminimalizowania problemów technicznych.

Demistyczne obrazowanie bioluminescencyjne in vivo mysiego modelu choroby Chagasa do badań skuteczności leków

Poznaj mikroskopię fluorescencyjną light-sheet do ilościowego obrazowania 3D komórek zakażonych Trypanosoma cruzi i limfocytów T w oczyszczonych narządach. Ta metoda umożliwia ocenę skuteczności leczenia choroby Chagasa.

Ilościowe obrazowanie 3D komórek zakażonych Trypanosoma cruzi, uśpionych amastigotów i limfocytów T w nienaruszonych, oczyszczonych narządach (Wideo) | JoVE Journal

Ilościowe obrazowanie 3D komórek zakażonych Trypanosoma cruzi, uśpionych amastigotów i limfocytów T w nienaruszonych, oczyszczonych narządach

Przeglądaj więcej filmów