Name: Badanie patogenezy mutacji MYH7 Gly823Glu w rodzinnej kardiomiopatii przerostowej przy użyciu modelu mysiego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 45 s
Description: Poznaj techniki obrazowania ultrasonograficznego u myszy z mutacją G823E w genie MYH7. Ta metoda pozwala badać patogenezę rodzinnej kardiomiopatii przerostowej i oceniać funkcję serca w modelu zwierzęcym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez projekt Funduszu Badań Medycznych prowincji Guangdong (A2022363) oraz główny projekt Komitetu Nauki i Technologii Guangdong w Chinach (grant nr 2022).
Chcielibyśmy podziękować Qingjian Chen z University of Maryland, College Park za pomoc podczas przygotowania tego manuskryptu.

Historie rodzin uzyskano poprzez wywiady z członkami rodziny. Badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Etyczną Prowincjonalnego Szpitala Medycyny Chińskiej w Guangdong (nr 2019074). Uzyskano świadomą pisemną zgodę wszystkich członków rodziny. Wszystkie zwierzęta są leczone zgodnie z wytycznymi etycznymi Szpitala Prowincji Medycyny Chińskiej Guangdong (Guangzhou, Chiny).
1. Tematy badań
UWAGA: W lipcu 2019 roku probant III-3 zasięgnął porady lekarza na Wydziale Chirurgii Sercowo-Naczyniowej Prowincjonalnego Szpitala Medycyny Chińskiej w Guangdong.
<ol>
	<li>Uzyskaj szczegółowy rodzinny wywiad medyczny probanta. Powiadom i zadzwoń do wszystkich członków rodziny probanta. Wszyscy członkowie rodziny przeszli skrupulatne badania fizykalne.
	<ol>
		<li>Wykonaj systematyczny przegląd wszystkich danych klinicznych, w tym dokumentacji medycznej, EKG, echokardiogramów i raportów z cewnikowania serca.</li>
		<li>Potwierdź fenotypy serca u wszystkich pacjentów podczas interwencji lub operacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz łącznie 174 populacyjne kontrolki w dobrej kondycji z lokalnej bazy danych. Pobrać około 4,0 ml krwi żylnej obwodowej od każdego pacjenta.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja DNA
UWAGA: DNA jest ekstrahowane za pomocą dostępnego w sprzedaży zestawu do krwi, zgodnie z instrukcjami producenta.
<ol>
	<li>Lizować komórki krwi anionowym detergentem w obecności stabilizatora DNA zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Dodaj 10 μl roztworu RNazy A do lizatu komórkowego i wymieszaj, odwracając probówkę 25 razy. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut do 1 godziny.</li>
	<li>Usuń białka przez wytrącanie soli. Użyj roztworu do wytrącania białka (0,25 mg albuminy surowicy bydlęcej rozpuszczonej w 25 ml wody destylowanej) i 100% izopropanolu do wytrącenia białek. Następnie użyj 200 μl 70% etanolu i przeprowadź wirowanie przy 12 000 x g/min w 4 °C przez 15 minut, aby przepłukać osad DNA.</li>
	<li>Odzyskaj genomowe DNA przez wytrącanie 500 μl 70% etanolu. Wirować przy 12 000 x g przez 30 s. Odessać, a następnie rozpuścić osad w roztworze hydratacyjnym (1 mM EDTA, 10 mM Tris·Cl, pH 7,5).</li>
	<li>Użyj spektrofotometru (np. NanoDrop 2000), aby określić czystość. Oczyszczone DNA ma zazwyczaj stosunek A260/A280 między 1,7 a 1,9 i ma rozmiar do 200 kb.</li>
	<li>Przechowuj DNA przez długi czas w temperaturze 2-8, -20 lub -80 °C.</li>
</ol>
3. Sekwencjonowanie całego eksomu i analiza wariantów
UWAGA: Aby systematycznie szukać mutacji genów powodujących chorobę, przeprowadzono sekwencjonowanie egzomu u osób dotkniętych chorobą (II-5, II-7, III-3, III-7, III-8, III-9 i IV-3) i zdrowych (III-2, III-5, IV-4).
<ol>
	<li>Użyj sondy egzomu zgodnie z instrukcjami producenta, aby wykonać wychwyt egzomu.</li>
	<li>Zastosuj kwalifikowane biblioteki do sekwencjonowania sparowanych końców 2 × 150 bp na platformie HiSeq X-ten. Patrz plik uzupełniający 1.</li>
	<li>Dopasuj pliki FASTQ do ludzkiego genomu referencyjnego (hg19/GRCh37) z BWA v0.7.1318,19. Posortuj wyrównane pliki (pliki w formacie sam/bam) za pomocą samtools, a następnie oznacz duplikaty za pomocą Picarda. Patrz plik uzupełniający 1.</li>
	<li>Użyj GATK, wyrównaj odczyty lokalnie i ponownie skalibruj podstawowe cechy. Patrz plik uzupełniający 1.</li>
	<li>Generuj statystyki mapowania, które obejmują pokrycie i głębokość z ponownie skalibrowanych plików przez BEDTools i wewnętrzne skrypty perl/python.</li>
	<li>Warianty genotypów (SNV i indels) z ponownie skalibrowanych plików BAM przy użyciu trybu przetwarzania wielu próbek narzędzia HaplotypeCaller firmy GATK.</li>
	<li>Użyj VQSR (ponowna kalibracja wariantowego wyniku jakości), aby zmniejszyć liczbę wyników fałszywie dodatnich w wywołaniach wariantów.</li>
	<li>Za pomocą oprogramowania ANNOVAR21 dodawaj adnotacje do SNV i indeli w wielu bazach danych, w tym Exome Aggregation Consortium (ExAC) (http://exac.broadinstitute.org), Exome Sequencing Project (ESP) (https://esp.gs.washington.edu) i 1,000 G (http://www.1000genomes.org). Interpretacja patogenności wariantów sekwencji zgodnie z wytycznymi ACMG.</li>
</ol>
4. Sekwencjonowanie Sangera
<ol>
	<li>Wykonaj sekwencjonowanie Sangera, aby potwierdzić potencjalne warianty sprawcze i określić segregację wariantów w rodzinie za pomocą sekwencera ABI 3500 23.</li>
	<li>Zaprojektuj sekwencje starterów dla wariantu w genie MYH7 (NM_000257) w następujący sposób: 5'-TTCAAACACAGAGACCTGCAGG-3' i 5'- CGGACTTCTCTAGCGCCTCTT -3'.</li>
	<li>Potwierdź wariant, przeanalizuj wszystkich dostępnych członków rodziny, aby określić segregację wariantów w rodzinie23.</li>
</ol>
5. Generacja myszy knockin C57BL/6N-MYH7em1(G823E) knockin
<ol>
	<li>Użyj systemu CRISPR/Cas9 do wygenerowania myszy knockin C57BL/6N-Myh7em1(G823E). Mysi gen Myh7 (numer dostępu do GenBank: NM_001361607.1; Ensembl: ENSMUSG00000053093) znajduje się na chromosomie 14 myszy i ma 41 eksonów. Kodon start ATG w eksonie 4 i kodon stop TAG w eksonie 41, a G823E znajduje się w eksonie 23. Wybierz ekson 23 jako miejsce docelowe.</li>
	<li>Zaprojektuj sekwencję wektora docelowego gRNA i oligo dawcy (z sekwencją docelową, otoczoną sekwencjami homologicznymi 134 pz połączonymi po obu stronach).
	<ol>
		<li>Zaloguj się na stronie NCBI i kliknij funkcję projektowania podkładu online BLAST po prawej stronie.</li>
		<li>Kliknij funkcję Primer-BLAST u dołu strony, aby zaprojektować podkłady.</li>
		<li>Wklej numer sekwencyjny referencyjny NCBI MYH7 NM_000257.4 w polu szablonu PCR.</li>
		<li>Amplifikuj fragment docelowy (ekson 23 cDNA MYH7 i sąsiednie eksony), więc zaprojektuj starter w górę na eksonie 21 (2392-2528) i starter w dół na eksonie 25 (3205-3350). Wprowadź numer eksonu starterów przed i za starterami w odpowiednim polu zakresu.</li>
		<li>Kliknij przycisk Pobierz startery na dole, aby automatycznie wygenerować wiele par starterów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wprowadzić gen MYH7 do bazy danych ZFIN, wprowadzić miejsce mutacji p.g823e (GGG do GAG) w oligonukleotydzie donorowym i cichą mutację p.r819 (AGG do CGA) do eksonu 23. Cicha mutacja zapobiega wiązaniu i ponownemu cięciu sekwencji przez gRNA po naprawie ukierunkowanej na homologię.
	<ol>
		<li>Zaprojektuj gRNA zgodnie z ogólną sekwencją, sekwencje na obu końcach to TAATACGACTCACTATA- i -GTTTTAGAGCTA. Środek sekwencji to miejsce docelowe wymienione powyżej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Współwstrzykiwać mRNA Cas9, gRNA generowane przez transkrypcję in vitro i oligo dawcy do zapłodnionych jaj w celu produkcji myszy KI.
	<ol>
		<li>Użyj zestawu do wykrywania skuteczności celu Cas9/gRNA, aby przepisać zaprojektowany cel gRNA na gRNA in vitro i wykryć aktywność transkryptu (patrz instrukcje zestawu VK007 dotyczące konkretnych metod wykrywania) zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Rozmrozić składniki zestawu mRNA T7 ARCA, wymieszać i pulsacyjnie wirować w mikrofudzie, aby zebrać roztwory na dnie probówek. Przeprowadzić reakcję w temperaturze pokojowej w następującej kolejności: 2x mieszanina ARCA/NTP do 10 μl, 1 μg matrycy DNA, 2 μl mieszaniny polimerazy RNA T7 i woda wolna od nukleaz do 20 μL.</li>
		<li>Dokładnie wymieszaj i pulsacyjnie wiruj w mikrofuge. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
		<li>Usunąć matrycę DNA, dodając 2 μl DNazy I, dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut w celu uzyskania mRNA.</li>
		<li>Wykonać dootrzewnowe wstrzyknięcie gonadotropiny surowicy i ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej wstępnie przygotowanym samicom myszy C57BL/6 w wieku około 4 tygodni za pomocą strzykawki 0,5 ml w dawce około 5 j. na mysz w odstępie 48 godzin między dwoma wstrzyknięciami.</li>
		<li>Osiemnaście godzin po podaniu należy złożyć w ofierze samice myszy C57BL/6 i jednego 8-12-tygodniowego samca myszy C57BL/6 przez zwichnięcie szyjki macicy po wstrzyknięciu hormonu. Zbierz komórki jajowe i plemniki oddzielnie.</li>
		<li>Plemniki są kapacykowane w płynie kapacytacyjnym. Weź i upuść plemniki na krawędzi płynu do krótko żyjących komórek jajowych w celu zapłodnienia in vitro przez 3-4 godziny.</li>
		<li>Rozcieńczyć pomyślnie transkrybowane gRNA i mRNA Cas9 in vitro wodą wolną od RNaz do 25 ng/μL i 50 ng/μL. Wprowadzić do cytoplazmy zapłodnionych jaj myszy przez mikrowstrzyknięcie. Przeszczep zapłodnione jaja w dobrym stanie do powiększonego jajowodu samic myszy. Wspólna klatka z podwiązanymi samcami myszy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Genotyp szczeniąt metodą PCR. Stosować następujące warunki PCR: 94 °C przez 3 minuty, 35 cykli 94 °C przez 30 s, 60 °C przez 35 s i 72 °C przez 35 s; 72 °C przez 5 min. Następnie przeprowadź analizę sekwencji.
	<ol>
		<li>Odetnij ogony 4-miesięcznych myszy nożyczkami i umieść je w probówce EP o pojemności 1,5 ml. Dodać 180 μl buforu GL, 20 μl proteinazy K i 10 μl RNazy A na końcówkę (2-5 mm) w probówce do mikrowirówki. Uważaj, aby nie obciąć zbyt dużo ogona.</li>
		<li>Inkubować probówkę w temperaturze 56 °C przez noc.</li>
		<li>Wirować w probówce do mikrowirówki o masie 1 000 x g przez 2 minuty, aby usunąć zanieczyszczenia.</li>
		<li>Dodać 200 μl buforu GB i 200 μl bezwodnego alkoholu etylowego po odpowiednim wymieszaniu.</li>
		<li>Umieść kolumnę wirującą w probówce zbiorczej. Umieścić próbkę w wirówce i odwirować przy 1 000 x g przez 2 minuty. Odrzuć przepływ.</li>
		<li>Dodać 500 μl buforu WA do kolumny wirowej i odwirować przy 1 000 x g przez 1 min. Wyrzucić przepływ.</li>
		<li>Dodać 700 μl buforu WB do kolumny wirowej i odwirować przy 1 000 x g przez 1 min. Wyrzucić przepływ. 
		UWAGA: Upewnij się, że bufor WB został wstępnie zmieszany ze 100% etanolem. Dodając Buffer WB, dodaj do ścianki probówki, aby zmyć resztki soli.</li>
		<li>Powtórz krok 5.5.7.</li>
		<li>Umieścić kolumnę wirową w probówce zbiorczej i odwirować przy 1 000 x g przez 2 minuty.</li>
		<li>Umieść kolumnę wirującą w nowej probówce o pojemności 1.5 ml. Dodać 50-200 μl wysterylizowanej wody lub buforu elucyjnego do środka membrany kolumny i odstawić kolumnę na 5 minut. 
		UWAGA: Podgrzewanie sterylizowanej wody lub buforu elucyjnego do 65 °C może zwiększyć wydajność elucji.</li>
		<li>Aby wymyć DNA, odwirować kolumnę przy 1 000 x g przez 2 minuty. Aby zwiększyć wydajność DNA, dodaj przepływ i/lub 50-200 μl wysterylizowanej wody lub buforu elucyjnego do środka membrany kolumny wirującej i pozostaw kolumnę na 5 minut. Wirować przy 1.000 x g przez 2 min.</li>
		<li>Określ ilościowo eluowany genomowy DNA za pomocą elektroforezy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Ocena morfologii i funkcji serca
UWAGA: Zastosuj echokardiografię w trybie M, aby ocenić morfologię i funkcję serca myszy knockin C57BL/6N-Myh7em1(G823E).
<ol>
	<li>Umieść myszy knockin w zamkniętym akrylowym pudełku podłączonym do aparatu do znieczulenia i wyreguluj trójdrożny interfejs, aby umożliwić przepływ izofluranu (stężenie: 3%) do akrylowego pudełka. Po tym, jak myszy knockin przestaną poruszać się autonomicznie, usuń myszy knockin.</li>
	<li>Umieść myszy knockin płasko na platformie monitorowania życia urządzenia do znieczulania małych zwierząt i kontynuuj znieczulenie wziewne zmieszane z tlenem (przepływ: 0,8 l/min) i izofluranem (stężenie: 3%). Nałóż lubrykant do oczu na znieczulone myszy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.</li>
	<li>Zamocuj myszy knockin poziomo na platformie. Przechyl platformę o 30° ogonowo do myszy knockin. Usuń włosy z przedniej ściany klatki piersiowej pukającej myszy za pomocą kremu do depilacji.</li>
	<li>Ustaw sondę pionowo tak, aby guzek był skierowany w stronę głowy zwierzęcia. Następnie obróć sondę w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, około 45°.</li>
	<li>W widoku przymostkowym o długiej osi obróć sondę o 90° zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby obserwować przymostkowy widok w krótkiej osi. Po obróceniu sondy o 90° wyreguluj przemieszczenie osi y, aby uzyskać prawidłowy plasterek.</li>
	<li>Obserwuj obraz serca na długiej osi (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C), a następnie wybierz dane pomiarowe w trybie M.</li>
	<li>Pozyskaj dane ultrasonograficzne z przymostkowych widoków długich osi myszy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Mierzy się tętno (HR), frakcję wyrzutową lewej komory (LVEF), rzut serca (CO), wymiar końcoworozkurczowy lewej komory (LVDd), LVD, wymiar skurczowy lewej komory lewej komory (LVSd), przegrodę międzykomorową (IVS) i tylną ścianę lewej komory (LVPW).</li>
	<li>Po pomiarze zapewnij myszom tlen i umieść je z powrotem w odpowiednich klatkach, gdy odzyskają autonomiczną aktywność.</li>
</ol>

<ol><li>Toepfer, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+sequestration+regulates+sarcomere+function%2C+cardiomyocyte+energetics%2C+and+metabolism%2C+informing+the+pathogenesis+of+hypertrophic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Myosin sequestration regulates sarcomere function, cardiomyocyte energetics, and metabolism, informing the pathogenesis of hypertrophic cardiomyopathy.</a> Circulation. 141 (10), 828-842 (2020).</li>
<li>Writing Committee Members et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2020+AHA%2FACC+guideline+for+the+diagnosis+and+treatment+of+patients+with+hypertrophic+cardiomyopathy%3A+A+report+of+the+American+College+of+Cardiology%2FAmerican+Heart+Association+Joint+Committee+on+Clinical+Practice+Guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">2020 AHA/ACC guideline for the diagnosis and treatment of patients with hypertrophic cardiomyopathy: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Joint Committee on Clinical Practice Guidelines.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 162 (1), 23-106 (2021).</li>
<li>Elliott, P., McKenna, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Hypertrophic cardiomyopathy.</a> Lancet. 363 (9424), 1881-1891 (2004).</li>
<li>Maron, B. J., Maron, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Hypertrophic cardiomyopathy.</a> Lancet. 381 (9862), 242-255 (2013).</li>
<li>Inoue, T., Orgel, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nonenzymatic+RNA+polymerase+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A nonenzymatic RNA polymerase model.</a> Science. 219 (4586), 859-862 (1983).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
<li>Sachidanandam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+map+of+human+genome+sequence+variation+containing+1.42+million+single+nucleotide+polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A map of human genome sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms.</a> Nature. 409 (6822), 928-933 (2001).</li>
<li>Ng, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+capture+and+massively+parallel+sequencing+of+12+human+exomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes.</a> Nature. 461 (7261), 272-276 (2009).</li>
<li>Wong, K. M., Hudson, T. J., McPherson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+genetics+of+cancer%3A+genome+sequencing+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Unraveling the genetics of cancer: genome sequencing and beyond.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 12, 407-430 (2011).</li>
<li>Mattivi, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+utility+of+a+phenotype-enhanced+MYH7-specific+variant+classification+framework+in+hypertrophic+cardiomyopathy+genetic+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation.+Genomic+and+Precision+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clinical utility of a phenotype-enhanced MYH7-specific variant classification framework in hypertrophic cardiomyopathy genetic testing.</a> Circulation. Genomic and Precision Medicine. 13 (5), 453-459 (2020).</li>
<li>Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J. G., Seidman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allele-specific+silencing+of+mutant+Myh6+transcripts+in+mice+suppresses+hypertrophic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy.</a> Science. 342 (6154), New York, N.Y. 111-114 (2013).</li>
<li>Hayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+of+Japanese+patients+with+pediatric+hypertrophic+and+restrictive+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic background of Japanese patients with pediatric hypertrophic and restrictive cardiomyopathy.</a> Journal of Human Genetics. 63 (9), 989-996 (2018).</li>
<li>Gil, W. S., Ávila Vidal, L. A., Vásquez Salguero, M. A., Cajiao, M. B., Peña, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variant+affecting+the+myosin+light+chain+2+related+to+familial+hypertrophic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Intractable+%26+Rare+Diseases+Research%22%5BJournal%5D)">Genetic variant affecting the myosin light chain 2 related to familial hypertrophic cardiomyopathy.</a> Intractable & Rare Diseases Research. 9 (4), 229-232 (2020).</li>
<li>Berge, K. E., Leren, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+hypertrophic+cardiomyopathy+in+Norway%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetics of hypertrophic cardiomyopathy in Norway.</a> Clinical Genetics. 86 (4), 355-360 (2014).</li>
<li>McNamara, J. W., Schuckman, M., Becker, R. C., Sadayappan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+homozygous+intronic+variant+in+TNNT2+associates+with+feline+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A novel homozygous intronic variant in TNNT2 associates with feline cardiomyopathy.</a> Frontiers in Physiology. 11, 608473(2020).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+transcriptome+analysis+of+atrial+septal+defect+identifies+dysregulated+genes+during+heart+septum+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Comparative transcriptome analysis of atrial septal defect identifies dysregulated genes during heart septum morphogenesis.</a> Gene. 575, 303-312 (2016).</li>
<li>Andersen, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+yield%2C+interpretation%2C+and+clinical+utility+of+mutation+screening+of+sarcomere+encoding+genes+in+Danish+hypertrophic+cardiomyopathy+patients+and+relatives%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutations%22%5BJournal%5D)">Diagnostic yield, interpretation, and clinical utility of mutation screening of sarcomere encoding genes in Danish hypertrophic cardiomyopathy patients and relatives.</a> Human Mutations. 30 (3), 363-370 (2009).</li>
<li>Nakashima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifelong+clinical+impact+of+the+presence+of+sarcomere+gene+mutation+in+Japanese+patients+with+hypertrophic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Journal%22%5BJournal%5D)">Lifelong clinical impact of the presence of sarcomere gene mutation in Japanese patients with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Circulation Journal. 84 (10), 1846-1853 (2020).</li>
<li>Hu, L. R., Kontrogianni-Konstantopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+myocardia+containing+the+Obscurin+R4344Q+mutation+linked+to+hypertrophic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of myocardia containing the Obscurin R4344Q mutation linked to hypertrophic cardiomyopathy.</a> Frontiers in Physiology. 11, 478(2020).</li>
<li>Girolami, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+alpha-actinin+2+variant+associated+with+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+and+juvenile+atrial+arrhythmias%3A+a+massively+parallel+sequencing+study%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation.+Cardiovascular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Novel alpha-actinin 2 variant associated with familial hypertrophic cardiomyopathy and juvenile atrial arrhythmias: a massively parallel sequencing study.</a> Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (6), 741-750 (2014).</li>
<li>Salazar-Mendiguchia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+p.%28Cys150Tyr%29+variant+in+CSRP3+is+associated+with+late-onset+hypertrophic+cardiomyopathy+in+heterozygous+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">The p.(Cys150Tyr) variant in CSRP3 is associated with late-onset hypertrophic cardiomyopathy in heterozygous individuals.</a> European Journal of Medical Genetics. 63 (12), 104079(2020).</li>
<li>Teekakirikul, P., Zhu, W., Huang, H. C., Fung, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophic+cardiomyopathy%3A+An+overview+of+genetics+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Hypertrophic cardiomyopathy: An overview of genetics and management.</a> Biomolecules. 9 (12), 878(2019).</li>
<li>Crossley, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+Sanger+sequencing+and+molecular+assay+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Diagnostic+Investigation%22%5BJournal%5D)">Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).</li>
<li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+profile+in+Chinese+patients+with+hypertrophic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Mutations profile in Chinese patients with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 209-216 (2005).</li>
<li>Marian, A. J., Braunwald, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophic+cardiomyopathy%3A+Genetics%2C+pathogenesis%2C+clinical+manifestations%2C+diagnosis%2C+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Hypertrophic cardiomyopathy: Genetics, pathogenesis, clinical manifestations, diagnosis, and therapy.</a> Circulation Research. 121 (7), 749-770 (2017).</li>
<li>Cann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype-driven+molecular+autopsy+for+sudden+cardiac+death%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Phenotype-driven molecular autopsy for sudden cardiac death.</a> Clinical Genetics. 91 (1), 22-29 (2017).</li>
<li>Lafreniere-Roula, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Family+screening+for+hypertrophic+cardiomyopathy%3A+Is+it+time+to+change+practice+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Family screening for hypertrophic cardiomyopathy: Is it time to change practice guidelines.</a> European Heart Journal. 40 (45), 3672-3681 (2019).</li>
<li>Winkelmann, D. A., Forgacs, E., Miller, M. T., Stock, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+drug-induced+allosteric+changes+to+human+beta-cardiac+myosin+motor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural basis for drug-induced allosteric changes to human beta-cardiac myosin motor activity.</a> Nature Communications. 6, 7974(2015).</li>
<li>García-Giustiniani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+and+prognostic+correlations+of+the+converter+region+mutations+affecting+the+%CE%B2+myosin+heavy+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+%28British+Cardiac+Society%29%22%5BJournal%5D)">Phenotype and prognostic correlations of the converter region mutations affecting the β myosin heavy chain.</a> Heart (British Cardiac Society). 101 (13), 1047-1053 (2015).</li>
<li>Moore, J. R., Leinwand, L., Warshaw, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+cardiomyopathy+phenotypes+based+on+the+functional+impact+of+mutations+in+the+myosin+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Understanding cardiomyopathy phenotypes based on the functional impact of mutations in the myosin motor.</a> Circulation Research. 111 (3), 375-385 (2012).</li>
<li>Majewski, J., Schwartzentruber, J., Lalonde, E., Montpetit, A., Jabado, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+can+exome+sequencing+do+for+you%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">What can exome sequencing do for you.</a> Journal of Medical Genetics. 48 (9), 580-589 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnego finansowego konfliktu interesów.

W tym badaniu opisujemy jedną chińską rodzinę Han z HCM. Analiza genetyczna wykazała, że heterozygotyczna mutacja MYH6 p.G823E współsegreguje się z chorobą u członków rodziny z dziedziczeniem autosomalnym dominującym. Aby zweryfikować patogenność mutacji G823E i omówić mechanizmy leżące u jej podstaw, stworzyliśmy mysi model C57BL/6N z G823E w mysim locus Myh7 za pomocą inżynierii genomu za pośrednictwem CRISPR/Cas9.
Charakterystykę fenotypową myszy knockin C57BL / 6N-Myh7em1 (G823E)</sup...

Kardiomiopatia przerostowa (HCM, OMIM: 613690) jest najczęstszą kardiomiopatią w Chinach, z szacowaną częstością występowania 0,2%, dotykającą 150 000 osób1,2.
Patologiczną cechą anatomiczną charakteryzującą HCM jest asymetryczny przerost komorowy, który często obejmuje drogę odpływu komorowego i/lub przegrodę międzykomorową3. Objawem klinicznym jest duszność wysiłkowa, zmęczenie i ból w klatce piersiowej. Indywidualny fenotyp HCM ma zmienność, od klinicznie podstępnej do ciężkiej niewydolności serca. Pacjenci z HCM wymagają leczenia, przeszczepu serca, sprzętu podtrzymującego życie i multidyscyplinarnej obserwacji4.
W ubiegłym stuleciu technologia PCR zmieniła sposób, w jaki badamy DNA5. Metoda sekwencjonowania DNA do diagnozy klinicznej została odkryta przez Sangera i współpracowników6. Technika Sangera została następnie zastosowana w Projekcie Poznania Ludzkiego Genomu, ale podejście to było kosztowne i czasochłonne7. Pojawienie się sekwencjonowania całego genomu (WGS) przyniosło wgląd w ludzkie choroby genetyczne na nowy poziom, ale pozostało zaporowe pod względem kosztów. Technologia sekwencjonowania całego eksomu (WES) jest od dawna stosowana do wykrywania wariantów linii zarodkowej8 i odniosła sukces w identyfikacji mutacji somatycznych w egzomie różnych nowotworów9. Wykrywanie eksonów DNA lub regionów kodujących przez WES może być wykorzystane do ujawnienia wariantów patogennych w większości chorób mendlowskich. Obecnie, wraz ze spadającymi kosztami sekwencjonowania, oczekuje się, że WGS stanie się ważnym narzędziem w badaniach genomicznych i może być szeroko stosowany w wykrywaniu patogennych wariantów genomu.
Technologia WES została również wykorzystana w kardiomiopatii dziedzicznej do identyfikacji wariantów patogennych w celu dalszego wyjaśnienia etiologii. Pojawiające się dowody sugerują, że geny kodujące mutacje genów białka strukturalnego sarkomery, takie jak MYH710, MYH611, MYBPC312, MYL213, MYL314, TNNT215, TNNI316, TNNC117 i TPM118 są odpowiedzialne za etiologię genetyczną HCM. Świadomość patogennych wariantów w rzadkich genach chorobotwórczych (np. oburyna, kalmodulina cytoszkieletowa i RhoGEF ODDZIAŁUJĄCY Z TYTYNĄ (OBSCN, OMIM: 608616)19, działający alfa 2 (ACTN2, OMIM: 102573)20 oraz białko bogate w cysteinę i glicynę 3 (CSRP3, OMIM: 600824)21) również jest związane z HCM. Obecne badania genetyczne zidentyfikowały wiele odrębnych wariantów patogennych w genie białka sarkomerowego u około 40%-60% pacjentów z HCM, a testy genetyczne u pacjentów z HCM wykazały, że większość patogennych wariantów występuje w łańcuchu ciężkim miozyny (MYH7) i białku C wiążącym miozynę (MYBPC3). Jednak genetyczne podstawy HCM pozostają nieuchwytne. Badanie patogenności tych odmian, które leżą u podstaw pacjentów z HCM, pozostaje głównym wyzwaniem22.
W tym badaniu opisujemy patogenny wariant MYH7 u chińskiej rodziny Han z HCM przez WES. W celu zweryfikowania patogenności tego wariantu stworzyliśmy myszy knockin C57BL/6N-Myh7em1(G823E) przy użyciu systemu CRISPR/Cas9. Omawiamy również prawdopodobne mechanizmy tego wariantu.

<table><tbody><tr><td>0,5 razy; TBE</td><td>Szanghaj Sangon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 razy; Taq Master Mix (Dye Plus)</td><td>Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr> Maszyna anestezjologiczna <tr><td></td><td>Agarose Regu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dla małych zwierząt</td><td>Reward Life Technology Co., Ltd.</td><td>R500</td><td></td></tr><tr><td>BEDTools</td><td></td><td>2.16.1</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 metoda trawienia in vitro do wykrywania docelowej wydajności gRNA</td><td>Viewsolid Biotechnology Co., Ltd.</td><td>VK007</td><td></td></tr><tr><td>Marker DNA</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>stabilizator DNA</td><td>Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd.</td><td>DNAstable LD</td><td>zapobiega degradacji DNA</td></tr><tr><td>Elektryczny mikrotom parafinowy</td><td>Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd.</td><td>HS-S7220-B</td><td></td></tr><tr><td>GATK</td><td></td><td>v3.5</td><td></td></tr><tr><td>Gentra Puregene zestaw do krwi</td><td>Santa Clara</td> Szkiełko szkiełkowe, szkiełko <td></td><td></td></tr><tr><td>nakrywkowe</td><td>Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do barwienia Hematoksyliny, roztwór do barwienia eozyny</td><td>Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.</td><td>C0107-500ml, C0109</td><td></td></tr><tr><td>Platforma HiSeq X-ten</td><td>Illumina</td><td></td><td>przeprowadza sekwencjonowanie na przechwyconych bibliotekach</td></tr><tr><td>Wstrzyknięcie gonadotropiny kosmówkowej</td><td>Livzon Pharmaceutical Group Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wstrzyknięcie gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy</td><td>Livzon Pharmaceutical Group Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Lokalni dostawcy</td><td></td><td>znieczulenie wziewne</td></tr><tr><td>Mikroskop mikroiniekcyjny</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ts2</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2000</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do zatapiania parafiny</td><td>Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd.</td><td>HS-B7126-B</td><td></td></tr><tr><td>Picard</td><td></td><td>(2.2.4) 20</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Merck KGaA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>samtools</td><td></td><td>1.3</td><td></td></tr><tr><td>Sekwencer</td><td>Applied Biosystems</td><td>ABI 3500</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>SureSelect Human All Exon V6</td><td>Agilent Technology Co., Ltd.</td><td></td><td>sonda egzomu</td></tr><tr><td>T7 Zestaw mRNA ARCA New</td><td>England BioLabs, Inc.</td><td>NEB-E2065S Skrzynka temperaturowa</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BINDER GmbH</td><td>KBF-S Solid.Line</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Chlorowodorek Roztwór</td><td>Sigma, Merck KGaA</td><td>Nr T2663</td><td></td></tr><tr><td>Weterynaryjny system ultrasonograficzny</td><td>Royal Philips</td><td>CX50</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie patogenezy mutacji myh7 gly823glu w rodzinnej kardiomiopatii przerostowej przy użyciu modelu mysiego

Investigating the Pathogenesis of MYH7 Mutation Gly823Glu in Familial Hypertrophic Cardiomyopathy using a Mouse Model

Rodzinna kardiomiopatia przerostowa (HCM, OMIM: 613690) jest najczęstszą kardiomiopatią w Chinach. Jednak etiologia genetyczna leżąca u podstaw HCM pozostaje nieuchwytna.
Wcześniej zidentyfikowaliśmy heterozygotyczny wariant genu miozyny o ciężkim łańcuchu 7 (MYH7), NM_000257.4: c.G2468A (p.G823E), u dużej chińskiej rodziny Han z HCM. W tej rodzinie wariant G823E ulega kosegregacji z zaburzeniem autosomalnym dominującym. Wariant ten znajduje się w domenie ramienia dźwigni w regionie szyi białka MYH7 i jest wysoce konserwatywny wśród homologicznych miozyn i gatunków. Aby zweryfikować patogenność wariantu G823E, wyprodukowaliśmy mysi model C57BL/6N z mutacją punktową (G823E) w mysim locus MYH7 za pomocą inżynierii genomu za pośrednictwem CRISPR/Cas9. Zaprojektowaliśmy wektory celujące w gRNA i oligonukleotydy donorowe (z sekwencjami celującymi otoczonymi 134 pz homologii). Miejsce p.G823E (GGG do GAG) w oligonukleotydzie donorowym zostało wprowadzone do eksonu 23 MYH7 przez naprawę ukierunkowaną na homologię. Wstawiono również wyciszony p.R819 (AGG do CGA), aby zapobiec wiązaniu gRNA i ponownemu rozszczepieniu sekwencji po naprawie kierowanej homologią. Echokardiografia wykazała przerost ściany tylnej lewej komory (LVPW) ze skurczem u myszy MYH7 G823E/- w wieku 2 miesięcy. Wyniki te zostały również potwierdzone przez analizę histologiczną (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).
Te wyniki pokazują, że wariant G823E odgrywa ważną rolę w patogenezie HCM. Nasze odkrycia wzbogacają spektrum wariantów MYH7 związanych z rodzinnym HCM i mogą stanowić wskazówkę dla poradnictwa genetycznego i diagnostyki prenatalnej w tej chińskiej rodzinie.

Profil kliniczny rodzin 
Drzewa genealogiczne rodzin z HCM zostały sporządzone i przedstawiono je na Rysunku 2. Wszyscy udokumentowani członkowie rodzin zostali zdiagnozowani pod kątem HCM w momencie włączenia do badania.
W rodzinie (Rycyna 2A) probandem był pacjent III-7, u którego w wieku 46 lat zdiagnozowano HCM oraz zwężenie drogi odpływu z lewej komory (LVOTO), w związku z czym przeszedł on operację kardiochirurgiczną. Pacjent...

Na podstawie rodzinnej rodziny kardiomiopatii dziedzicznej znalezionej w naszej pracy klinicznej, stworzyliśmy model myszy C57BL/6N z mutacją punktową (G823E) w mysim locus MYH7 za pomocą inżynierii genomu za pośrednictwem CRISPR/Cas9, aby zweryfikować tę mutację.

Badanie patogenezy mutacji MYH7 Gly823Glu w rodzinnej kardiomiopatii przerostowej przy użyciu modelu mysiego

Familial hypertrophic cardiomyopathy (HCM, OMIM: 613690) is the most common cardiomyopathy in China. However, the underlying genetic etiology of HCM ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ może zapewnić demonstrację ultradźwięków u małych zwierząt. Technika ta może dostarczyć informacji na temat odkrycia genów patogennych w kardiomiopatii dziedzicznej. Zamocuj myszy knockin poziomo na platformie, a następnie przechyl platformę o 30 stopni do myszy knockin.Usuń włosy z przedniej ściany klatki piersiowej myszy knockin za pomocą kremu do depilacji, ustaw sondę pionowo z guzem skierowanym w stronę głowy zwierzęcia. Następnie obróć sondę w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara o około 45 stopni w widoku osi długiej paramostka. Obróć sondę o 90 stopni zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby uzyskać krótką oś przymostkową view.Po obróceniu sondy wyreguluj przemieszczenie osi Y, aby uzyskać prawidłowy plasterek. Obserwuj obraz długiej osi serca, a następnie wybierz dane pomiarowe w trybie M. Uzyskaj dane ultrasonograficzne z widoków długiej osi przymostkowej myszy i zmierz tętno, frakcję wyrzutową lewej komory, pojemność minutową serca, wymiar lewej komory i rozkurczowy, wymiar lewej komory i skurczowy.Ściana tylna lewej komory i przegroda międzykomorowa. Uzyskano rodowody rodzinne kardiomiopatii przerostowej, a u wszystkich udokumentowanych członków rodziny zdiagnozowano kardiomiopatię przerostową. Sekwencjonowanie Sangera potwierdziło ten sam wariant M Y H 7 P G 8 23 E u wszystkich pacjentów, ale nie u zdrowych osób w rodzinach.I 174 kontrole, heterozygotyczne M Y H 7 P G 8 23 E całkowicie współsegregowane w tej rodzinie. Reszta glicyny w kodonie 8 23 w regionie domeny szyi M Y H 7 była wysoce konserwatywna we wszystkich dostępnych sekwencjach miocyny kręgowców. Zgodnie z normami i wytycznymi A C M G wariant M Y H 7 P G 8 23 E został uznany za wariant chorobotwórczy.Myszy knockin rozwinęły zależny od wieku przerost serca po urodzeniu. Echokardiografia wykazała, że przegroda międzykomorowa i tylna ściana lewej komory rozwijały się ze zwiększonym częstością akcji serca u myszy knockin. Potwierdza to również analiza histologiczna.Dane ultrasonograficzne wirusa można uzyskać, obracając sondę pod różnymi kątami w różnych sekcjach myszy.

investigating-pathogenesis-myh7-mutation-gly823glu-familial

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Poprzeczne zwężenie aorty (TAC) u myszy jest powszechnie stosowanym modelem eksperymentalnym do badania mechanizmów leżących u podstaw przerostu mięśnia sercowego i rozwoju niewydolności serca. W niniejszym materiale opisujemy procedury zwężania aorty w celu wywołania powtarzalnego stopnia przerostu serca u myszy.

Poprzeczne zwężenie aorty u myszy

Tutaj opisujemy izolację dorosłych kardiomioktyesów myszy za pomocą systemu perfuzyjnego Langendorffa.  Powstałe komórki tolerują Ca2+, są elektrycznie uśpione i mogą być hodowane i transfekowane adeno- lub lentiwirusami w celu manipulowania ekspresją genów.  Ich funkcjonalność może być również analizowana za pomocą systemu MMSYS i technik zacisków krosowych.

Izolacja, hodowla i charakterystyka funkcjonalna kardiomioktaków dorosłych myszy

Przedstawiono podejście genetyki odwrotnej do zrozumienia rodzin genów związanych z chorobami ludzkimi, używając myszy jako systemu modelowego, a następnie opisano harmonogram fenotypowania myszy. Ponieważ myszy z wadami genu HtrA2 wykazywały objawy parkinsonowskie, schemat fenotypowania koncentruje się na identyfikacji wad neurologicznych.

Schemat fenotypowania dla genetycznie zmodyfikowanych myszy używany do badania genów związanych z chorobami człowieka związanymi ze starzeniem się

Badanie echokardiograficzne jest często stosowane u myszy. W tym celu opracowano drogie urządzenia ultrasonograficzne o wysokiej rozdzielczości. Protokół ten opisuje niedrogą procedurę echokardiograficzną połączoną z histologicznymi analizami morfometrycznymi w celu określenia morfologii serca.

Echokardiograficzne i histologiczne badanie morfologii serca u myszy

Celem tego protokołu jest opisanie krok po kroku techniki minimalnie inwazyjnego poprzecznego zwężenia aorty (TAC) u myszy. Poprzez wyeliminowanie intubacji i wentylacji, które są obowiązkowe w powszechnie stosowanej procedurze standardowej, minimalnie inwazyjny TAC upraszcza procedurę operacyjną i zmniejsza obciążenie zwierzęcia.

Technika minimalnie inwazyjnego poprzecznego zwężenia aorty u myszy w celu indukcji przerostu lewej komory

Metoda generowania modelu kardiomiopatii wywołanej doksorubicyną u dorosłego danio pręgowanego (Danio rerio) jest opisana tutaj. Przedstawiono dwa alternatywne sposoby iniekcji dootrzewnowej i omówiono warunki zmniejszania różnic między różnymi grupami eksperymentalnymi.

Model kardiomiopatii indukowanej doksorubicyną u dorosłych danio pręgowanego

Ten protokół opisuje indukcję nadciśnienia płucnego (PH) u myszy na podstawie ekspozycji na niedotlenienie i wstrzyknięcia antagonisty receptora VEGF. U zwierząt rozwija się PH i przerost prawej komory (RV) 3 tygodnie po rozpoczęciu protokołu. Przedstawiono również charakterystykę funkcjonalną i morfometryczną modelu.

Indukcja i charakterystyka nadciśnienia płucnego u myszy przy użyciu modelu hipoksji/SU5416

Ten artykuł przedstawia metody hodowli miocytów serca o różnych kształtach, które reprezentują różne patologie, oraz sortowania tych przylegających miocytów serca na podstawie ich morfologii na poziomie pojedynczej komórki. Proponowana platforma zapewnia nowatorskie podejście do wysokoprzepustowych badań przesiewowych i badań przesiewowych leków w kierunku różnych rodzajów niewydolności serca.

Podejście do badania transkryptomiki zależnej od kształtu na poziomie pojedynczej komórki

Obecny protokół opisuje pojedynczą mutację M213L w Gja1, która zachowuje pełną generację Connexin43, ale uniemożliwia translację mniejszej wewnętrznie translowanej izoformy GJA1-20k.

Usunięcie wewnętrznego translacyjnego miejsca startowego z mRNA przy zachowaniu ekspresji białka o pełnej długości

Ten protokół przedstawia szczegółowe podejście do replikacji mysiego modelu niewydolności serca wywołanej hiperlipidemią z zachowaną frakcją wyrzutową (HFpEF). Projekt łączy w sobie podawanie receptora lipoproteiny T-lipoproteiny o niskiej gęstości związanego z wirusem 9-sercowym troponiny (AAV9-cTnT-LDLR) i poloksamemu-407 (P-407).

Mysi model niewydolności serca wywołanej hiperlipidemią z zachowaną frakcją wyrzutową

Poznaj techniki obrazowania ultrasonograficznego u myszy z mutacją G823E w genie MYH7. Ta metoda pozwala badać patogenezę rodzinnej kardiomiopatii przerostowej i oceniać funkcję serca w modelu zwierzęcym.

Badanie patogenezy mutacji MYH7 Gly823Glu w rodzinnej kardiomiopatii przerostowej przy użyciu modelu mysiego

Przeglądaj więcej filmów