Name: Śledzenie linii indukowalnych fluorescencyjnie znakowanych komórek macierzystych w mózgu dorosłej myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Poznaj metodę śledzenia linii komórek macierzystych w mózgu dorosłej myszy przy użyciu indukowalnego modelu transgenicznego. Technika ta umożliwia analizę aktywacji, proliferacji i migracji komórek in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy pragną podziękować dr Dianie Carlone (Boston Children's Hospital, Harvard Medical School) i dr Matthew Lynesowi (Joslin Diabetes Center; Instytut Badawczy Maine Medical Center) w celu uzyskania wskazówek dotyczących zwierząt mTert-rtTA.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisano metodę tworzenia, wykorzystania i analizy potrójnej transgenicznej linii śledzącej komórki macierzyste myszy w mózgu dorosłej myszy in vivo. W połączeniu z barwieniem immunologicznym lub oczyszczaniem mózgu, można osiągnąć identyfikację i charakterystykę śledzonych komórek fluorescencyjnych w mózgu. Technika ta daje możliwość zrozumienia potencjału plastycznego/regeneracyjnego/remodelującego znakowanych komórek macierzystych podczas ich aktywacji, migracji, różnicowania lub proliferacji. Podczas gdy popr...

<table><tbody><tr><td>Rozcieńczalnik przeciwciał</td><td>Agilent</td><td>S080983-2</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do odzyskiwania antygenu</td><td>Agilent</td><td>S2367</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-GFP</td><td>Invitrogen</td><td>A2311</td><td>Stosować w 1:500-1:000</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18-4</td><td></td></tr><tr><td>B6. Cg-Tg(tet0-cre)1Szczęk/J</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>JAX:006234</td><td></td></tr><tr><td>B6.129(Cg)-GT(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdPomidor,-EGFP)Luo/J</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>JAX:007676</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór blokujący (IHC)</td><td>Millipore Sigma</td><td>20773</td><td></td></tr><tr><td>igła</td><td>BSTEAN</td><td>X0012SYHIV</td><td></td></tr><tr><td>Koronalny blok mózgu</td><td>Braintree</td><td>BS-2000C</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>Corning</td><td>2850-22</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM1900</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D564</td><td></td></tr><tr><td>Eter dibenzylowy</td><td>Millipore Sigma</td><td>33630</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorometan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Surowica osła</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Hyklat doksycykliny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0718</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna Sól sodowa z błony śluzowej świni</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Histochoice Biologia molekularna Utrwalacz tkanek</td><td>Amresco</td><td>H120</td><td>Ten produkt został wycofany z produkcji, ale można go zastąpić roztworem nadtlenku wodoru Glyo-Fixx (Thermo Scientific, 6764265)</td></tr> <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516813</td><td></td></tr><tr><td>IHC Select TBS Rinse Buffer</td><td>Millipore Sigma</td><td>20845</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Westward</td><td>0143-95095-10</td><td>Ten produkt wymaga licencji DEA na przechowywanie i użytkowanie.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Milipore Block</td><td>Millipore</td><td>20773</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe</td><td>Millipore Sigma</td><td>5013</td><td></td></tr><tr><td>Optymalne rozwiązanie temperatury cięcia</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór PBS (10X)</td><td>Teknova</td><td>P0496</td><td></td></tr><tr><td>Strzałkowy blok mózgu</td><td>Braintree</td><td>RBM-2000S</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Braun</td><td>S8004-5264</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Sudan (Typogen)</td><td>Millipore Sigma</td><td>199664</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>186562</tr><tr><td>Kartridż tkankowy</td><td>Simport</td><td>M512</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td></td> 1610407 <td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Millipore Sigma</td><td>655205</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>AnaSed</td><td>sc-362950Rx</td><td></td></tr></tbody></table>

Śledzenie linii indukowalnych fluorescencyjnie znakowanych komórek macierzystych w mózgu dorosłej myszy

Lineage Tracing of Inducible Fluorescently-Labeled Stem Cells in the Adult Mouse Brain

Linia myszy śledząca linię odwrotnej transkryptazy telomerazy (Tert) została opracowana w celu zbadania zachowania i losu dorosłych tkanek macierzystych komórek, poprzez skrzyżowanie systemu 'Tet-On' myszy oTet-Cre z nowym transgenem transaktywacji odwrotnej tetracykliny (rtTA) połączonym z promotorem Tert, który, jak wykazaliśmy, oznacza nową populację dorosłych komórek macierzystych mózgu. W tym przypadku podanie pochodnej tetracykliny doksycykliny myszom mTert-rtTA::oTet-Cre nieusuwalnie oznaczy populację komórek, które wyrażają 4,4 kb fragment regionu promotorowego genu Tert. Po połączeniu reportera Rosa-mTmG, myszy mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG będą wyrażać błonowy tdTomato (mTomato), dopóki leczenie doksycykliną nie zaindukuje zastąpienia ekspresji mTomato błonowym EGFP (mGFP) w komórkach, które również wyrażają Tert. Dlatego, gdy te potrójnie transgeniczne myszy śledzące linię otrzymają doksycyklinę (okres "impulsu", podczas którego komórki wyrażające TERT są oznaczone), komórki te staną się nieusuwalnie oznaczonymi komórkami mGFP +, które można śledzić przez dowolny pożądany czas po usunięciu doksycykliny (okres "pościgu"), nawet jeśli ekspresja Tert zostanie następnie utracona. Mózgi są następnie utrwalane perfuzją i przetwarzane pod kątem immunofluorescencji i innych dalszych zastosowań w celu interpretacji zmian w aktywacji komórek macierzystych, proliferacji, zaangażowaniu w linię, migracji do różnych nisz mózgowych i różnicowaniu do dojrzałych typów komórek. Korzystając z tego systemu, każda mysz rtTA może zostać skojarzona z oTet-Cre i reporterem Rosa w celu przeprowadzenia indukowanych doksycykliną eksperymentów śledzenia linii "impulsu" przy użyciu markerów komórek macierzystych.

Chociaż sygnał fluorescencyjny wynikający z systemu Tet-On z reporterem fluorescencyjnym będzie różnić się w zależności od wybranego promotora i zastosowanych fluoroforów, w niniejszym opiszemy sposób analizy wyników uzyskanych u zwierząt mTert-rtTA::oTet-Cre::Rosa-mTmG. Analiza mózgów osobników dorosłych po badaniu typu pulse-chase wykazała obecność komórek wykazujących ekspresję GFP w błonie komórkowej w różnych niszach anatomicznych. Należy zwrócić uwagę na różnice w intensywności fluorescencji pomiędzy poszczególnymi...

Możliwość trwałego oznaczania komórek macierzystych i ich potomstwa za pomocą fluoroforu za pomocą indukowalnej linii myszy śledzącej transgeniczną linię genealogiczną pozwala na przestrzenną i czasową analizę aktywacji, proliferacji, migracji i/lub różnicowania in vivo. Śledzenie linii może ujawnić nowe informacje na temat zaangażowania w linię, odpowiedzi na interwencję (interwencje) i multipotencji.

A telomerase reverse transcriptase (Tert) lineage-tracing mouse line was developed to investigate the behavior and fate of adult tissue stem cells, by ...

Znakowanie komórek macierzystych i ich potomstwa indukowalną transgeniczną linią myszy śledzącą linię genealogiczną pozwala na przestrzenną i czasową analizę aktywacji, proliferacji, migracji i/lub różnicowania dorosłych komórek macierzystych w mózgu in vivo. Śledzenie linii może ujawnić nowe informacje na temat zaangażowania w linię, odpowiedzi na interwencje i multipotencji. Zalety podejść do śledzenia linii transgenicznych obejmują specyficzność śledzenia określonej linii komórkowej, nieusuwalną ekspresję białka fluorescencyjnego niezależnie od obrotu lub różnicowania komórek, niską toksyczność doksycykliny, warunkową aktywację i łatwość użycia z powszechnymi dalszymi testami na tkankach śladowych linii, w tym barwienie immunologiczne i immunofluorescencja.Ze względu na szerokie implikacje plastyczności i komórki w dorosłym mózgu, charakterystyka i analiza dorosłych komórek macierzystych pomoże w badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi, wpływem metabolicznym na plastyczność mózgu, starzeniem się i innymi powiązanymi schorzeniami. Na początek ogrzej szkiełka do temperatury pokojowej i po utrwaleniu lodowatym acetonem przez 15 minut. Myj szkiełka przez pięć minut w 1X buforze

lineage-tracing-inducible-fluorescently-labeled-stem-cells-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Genetyczne mapowanie losu indukowalne (GIFM) pozwala na znakowanie i śledzenie komórek z precyzyjną kontrolą przestrzenną i czasową in vivo oraz wyjaśnia, w jaki sposób komórki z konkretnej linii genetycznej przyczyniają się do tworzenia tkanek w rozwoju i u dorosłych osobników. Przedstawione tutaj techniki umożliwiają mapowanie losu zarodków myszy w stadium E12.5 na potrzeby analizy epifluorescencyjnej i analizy eksplantatów.

Praktyczne podejście do genetycznego indukowalnego mapowania losów: wizualny przewodnik po znakowaniu i śledzeniu komórek in vivo

Niniejszy artykuł opisuje zoptymalizowaną sekwencję zdarzeń dla obrazowania multimodalnego przeszczepów komórkowych w mózgu gryzoni z wykorzystaniem: (i) bioluminescencji in vivo i obrazowania rezonansem magnetycznym oraz (ii) pośmiertnej analizy histologicznej. Połączenie tych metod obrazowania u jednego zwierzęcia pozwala na ocenę przeszczepów komórkowych z wysoką rozdzielczością, czułością i swoistością.

Multimodalne obrazowanie implantacji komórek macierzystych w ośrodkowym układzie nerwowym myszy

Ten film demonstruje procedurę barwienia nowo rozmnożonych nerwowych komórek macierzystych w skrawkach tkanki mózgowej za pomocą inkorporacji EdU, a następnie immunofluorescencji w celu wizualizacji określonych białek, zwiększając zrozumienie dynamiki i proliferacji komórek.

Barwienie immunofluorescencyjne do wizualizacji rozproszyłych nerwowych komórek macierzystych w wycinkach mózgu myszy

Źródło: Gómez-Villafuertes, R., et. al., Obrazowanie na żywo, a następnie śledzenie pojedynczych komórek w celu monitorowania biologii komórki i progresji linii wielu populacji neuronów. J. vis. exp. (2017){{}} . Film przedstawia proces przygotowania, obrazowania i śledzenia dorosłych nerwowych komórek macierzystych w czasie rzeczywistym w celu zbadania zachowań komórek, w tym podziału i różnicowania.

 Obrazowanie na żywo i śledzenie pojedynczych komórek w celu monitorowania linii neuronalnej w dorosłych nerwowych komórkach macierzystych

Źródło: Daynac, M., et. al. Sortowanie komórek nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych ze strefy podkomorowej dorosłej myszy i obrazowanie na żywo ich dynamiki cyklu komórkowego. J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje obrazowanie poklatkowe nerwowych komórek macierzystych (NSC) z mózgu transgenicznej myszy przy użyciu konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego. NSC fluoryzują na czerwono podczas fazy G1 i są niefluorescencyjne w innych fazach cyklu komórkowego. Przylegającą...

Obrazowanie poklatkowe podziału nerwowych komórek macierzystych myszy za pomocą mikroskopii konfokalnej

Opisujemy metodę opartą na Fluorescencyjnym Sortowaniu Komórek Aktywowanych (FACS) w celu izolacji nerwowych komórek macierzystych (NSC) i ich potomstwa ze strefy podkomorowej (SVZ) mózgu dorosłej myszy. Stosowany do transgenicznych myszy z fluorescencyjnym wskaźnikiem ubikwitynacji cyklu komórkowego (FUCCI), umożliwia badanie progresji cyklu komórkowego za pomocą obrazowania na żywo.

Sortowanie komórek nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych ze strefy podkomorowej dorosłej myszy i obrazowanie na żywo ich dynamiki cyklu komórkowego

Tutaj opisujemy procedurę opartą na wykorzystaniu cząsteczek lentiwirusowych do długoterminowej modyfikacji genetycznej nerwowych komórek macierzystych i/lub ich sąsiadujących komórek wyściółkowych w dorosłej komorowo-podkomorowej niszy neurogennej, która pozwala na oddzielną analizę autonomicznych i nieautonomicznych, zależnych od niszy efektów na neuronalne komórki macierzyste.

Stabilna i wydajna modyfikacja genetyczna komórek dorosłej myszy V-SVZ do analizy autonomicznych i nieautonomicznych efektów neuronalnych komórek macierzystych

W tym artykule opisujemy zasady projektowania i przeprowadzania wielokolorowego eksperymentu z wykorzystaniem myszy R26R-Confetti. Zapewniamy specjalny protokół śledzenia komórek nabłonka rogówki, który można modyfikować pod kątem innych interesujących tkanek.

Metoda śledzenia linii komórek rogówki przy użyciu wielokolorowych fluorescencyjnych myszy reporterowych

Opisany jest solidny protokół do monitorowania populacji neuronów za pomocą wideomikroskopii poklatkowej, a następnie przetwarzania końcowego opartego na oprogramowaniu. Metoda ta stanowi potężne narzędzie do identyfikacji zdarzeń biologicznych w wybranej populacji podczas eksperymentów obrazowania na żywo.

Obrazowanie na żywo, a następnie śledzenie pojedynczych komórek w celu monitorowania biologii komórki i progresji linii wielu populacji neuronalnych

Przedstawiono protokół do śledzenia linii i funkcjonalnej analizy genetycznej genów kandydujących na poziomie pojedynczej komórki za pomocą analizy mozaikowej z podwójnymi markerami (MADM). Analiza klonalna MADM zapewnia ilościowe ramy do pomiaru zachowania proliferacyjnego, produkcji komórkowej i pokrewieństwa liniowego poszczególnych komórek progenitorowych i ich komórek potomnych.

Śledzenie linii i analiza klonalna w rozwoju kory mózgowej za pomocą analizy mozaiki z podwójnymi markerami (MADM)

Podczas rozwoju kory mózgowej, neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej wyściełającej komorę i migrują w kierunku powierzchni mózgu. W proces ten zaangażowanych jest wiele genów. Protokół ten wprowadza technikę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów i komórek progenitorowych glejowych.

Obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów i progenitorów glejowych w embrionalnych wycinkach mózgu myszy

Poznaj metodę śledzenia linii komórek macierzystych w mózgu dorosłej myszy przy użyciu indukowalnego modelu transgenicznego. Technika ta umożliwia analizę aktywacji, proliferacji i migracji komórek in vivo.

Śledzenie linii indukowalnych fluorescencyjnie znakowanych komórek macierzystych w mózgu dorosłej myszy

Przeglądaj więcej filmów