Połączone makroporowate rusztowania 3D z prętów mikrożelowych
June 16th, 2022
Mikrożelowe pręty z komplementarnymi grupami reaktywnymi są produkowane za pomocą mikrofluidyki z możliwością łączenia się w roztworze wodnym. Anizometryczne mikrożele zacinają się i łączą w stabilne konstrukcje z większymi porami w porównaniu z systemami sferycznymi. Mikrożele modyfikowane za pomocą GRGDS-PC tworzą makroporowate konstrukcje 3D, które można wykorzystać do hodowli komórkowych.
Protokół ten opisuje wytwarzanie prętów z mikrożelem, które łączą się w rusztowania z mikroporami. Rusztowania te mogą być wykorzystywane w połączeniu z komórkami, zapewniając wymaganą przestrzeń do efektywnej interakcji komórek komórkowych. Dwa różne rodzaje prętów mikrożelowych łączą się ze sobą w kontakcie.
Przy wysokim współczynniku kształtu prowadzi to do większych porów przy jednoczesnym zachowaniu stabilności rusztowania przy użyciu mniejszej ilości materiału syntetycznego w porównaniu z sferycznymi mikrożelami. Rusztowania z mikroporami znacznie poprawiłyby infiltrację i interakcję komórek endogennych w celu naprawy uszkodzonej tkanki. Duże pory ułatwią tworzenie naczyń krwionośnych w celu wymiany składników odżywczych z rosnącą tkanką.
Zmniejszenie ilości materiału rusztowania jest korzystne, ponieważ zapewnia więcej otwartych przestrzeni do tworzenia tkanek, co jest ważne zarówno w przypadku zastosowań in vitro, jak i in vivo. Krytycznym aspektem jest technika mikrofityki na chipulacji. Aby zapewnić ciągłą produkcję prętów mikrożelowych, produkt musi być skutecznie transportowany z tuby bez zatykania.
Aby rozpocząć, włóż igły do probówek polietylenowych i usuń gaz ze strzykawki i probówki. Następnie włóż dodatkową rurkę polietylenową do wylotu w celu zebrania produktu. Następnie umieść wszystkie szklane strzykawki i pompy strzykawkowe i włóż każdy koniec rurki do odpowiedniego wlotu.
Następnie skoncentruj mikroskop na przekroju poprzecznym oleju-wody. Uruchom pierwszą pompę strzykawki olejowej, aby najpierw napełnić kanał olejem, aby zapobiec zwilżeniu kanału przez fazę rozproszoną. Następnie zmniejsz natężenie przepływu pierwszego oleju do 30 mikrolitrów na godzinę i uruchom pompę strzykawkową z prepolimerem, aż na przekroju będzie można zaobserwować rozproszoną fazę wodną.
Następnie ustaw natężenie przepływu polimeru wstępnego na 30 mikrolitrów na godzinę i skoncentruj mikroskop na wylocie. Następnie uruchom drugą pompę strzykawki olejowej i poczekaj, aż reżim przepływu się ustabilizuje. Umieść rurkę wylotową w pojemniku zbiorczym i ustaw system naświetlania UV tak, aby natężenie promieniowania mieściło się w zakresie od 900 do 1000 miliwatów na centymetr kwadratowy.
A miejsce napromieniowania to prosta część kanału przed wylotem. Przed naświetlaniem promieniami UV należy wyregulować natężenia przepływu prepolimeru i pierwszego oleju, aby osiągnąć pożądany współczynnik kształtu w zakresie od 3,0 do 4,5 oraz ustawić czas naświetlania fazy rozproszonej na około 2,3 sekundy, w zależności od wielkości plamki naświetlającej. Następnie rozpocznij naświetlanie promieniami UV i w razie potrzeby ponownie wyreguluj natężenie przepływu zgodnie z poprzednim podrozdziałem.
Następnie zmień pojemnik zbiorczy i zanotuj czas rozpoczęcia odbioru produktu i natężenie przepływu. Aby zakończyć zbieranie, wyjmij pojemnik do zbierania, zwracając uwagę na godzinę. Następnie należy przerwać napromienianie i wszystkie pompy strzykawkowe.
Następnie umyj produkt pięć razy za pomocą n-heksanu, izopropanolu i wody dejonizowanej. Następnie usunąć supernatant po sedymentacji pręcików. Przenieść dyspersję pierwszego składnika do stożkowej przezroczystej fiolki o pojemności 1,5 lub 2 mililitrów.
Następnie dodać drugi składnik w sposób kontrolowany w pracy ciągłej za pomocą pipety o pojemności 100 mikrolitrów i wymieszać zawartość bezpośrednio za pomocą pipety, aby pobrać płyn i dodać go ponownie. Następnie dodaj roztwór G R G D S P C do połączonej struktury, aby zmodyfikować wszystkie pozostałe grupy epoksydowe za pomocą peptydu adhezyjnego komórkowego zawierającego wolną aminę i tymal i pozostaw na noc w temperaturze pokojowej. Następnie usuń nieprzereagowane cząsteczki, przemywając je wodą dejonizowaną i usuń supernatant.
Po obniżeniu poziomu wody otwórz fiolkę i odetnij światło UV o długości fali od 250 do 300 nanometrów. Następnie zamknąć fiolkę i przenieść fiolkę na czystą ławkę. Następnie umyj sterylną wodą.
Zastąp wodę w fiolce pożywką do hodowli komórkowych i pozostaw do zrównoważenia przez pięć minut. Następnie przenieś makroporowate rusztowanie na płytkę studzienki do hodowli komórkowej na potrzeby eksperymentu, wylewając lub używając szpatułki. Mikroskopia konfokalna ujawniła, że makroporowaty konstrukt 3D składał się z połączonych ze sobą aminowych i epoksydowych mikrożelowych prętów.
Konstrukcja wykazuje zwartą geometrię około 10 000 mikroprętów żelowych uformowanych w ciągu dwóch lub trzech sekund. Efektywny moduł Younga prętów aminowych i epoksydowych mikrożelowych wraz z mikrokulkami aminowymi i epoksydowymi jest mierzony za pomocą nanowgłębienia. Aby wykryć aktywne grupy funkcyjne, tiocyjanian fluoresceiny izo może być użyty do wizualizacji pierwszorzędowych grup aminowych, a izomer aminy fluoresceiny może być użyty do znakowania grup epoksydowych.
Pręty aminowo-żelowe mają wymiary o średniej długości 553 mikrometrów i średniej szerokości 193 mikrometrów w wodzie dejonizowanej, co daje współczynnik kształtu około 3,0. Średnie wartości makroporów i rusztowań składających się z mikroprętów żelowych wynoszą 100 mikrometrów, przy czym 90% wielkości porów waha się od 30 mikrometrów do ponad 150 mikrometrów. Kula, podobnie jak mikrożele, tworzy klastry o wielkości porów od około 10 do 55 mikrometrów, ze średnią wartością około 22 mikrometrów.
Opisane pręty mikrożelowe są przeznaczone do wytwarzania połączonych ze sobą rusztowań mikroporowych poprzez losowe mieszanie. Kontrolowana procedura mieszania może w przyszłości pozwolić na wytwarzanie bardziej dostosowanych geometrii rusztowań. Sztywność mikrożeli i wskazówki biochemiczne mogą być zróżnicowane w zależności od wymagań sprzedaży.
Łącząc różne elementy konstrukcyjne, można uzyskać szeroką gamę geometrii i właściwości w ramach jednego rusztowania. W ten sposób możemy skutecznie celować w określone komórki, tworząc tkanki wielokomórkowe.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł omawia wytwarzanie mikrożelowych prętów, które łączą się, tworząc mikroporowe ruszty nadające się do hodowli komórek. Unikalna konstrukcja pozwala na większe pory, zachowując stabilność, poprawiając interakcję komórek i naprawę tkanek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biomateriały
- Inżynieria tkankowa
Tło
- Mikrożelowe pręty są wytwarzane za pomocą mikrofluidyki.
- Posiadają uzupełniające grupy reaktywne do łączenia się.
- Te struktury tworzą większe pory w porównaniu do sferycznych mikrożeli.
- Makroporowe konstrukty mogą efektywnie wspierać hodowlę komórek.
Cel badania
- Wytworzenie mikrożelowych prętów, które mogą łączyć się w stabilne ruszty.
- Poprawienie interakcji komórka-komórka w zastosowaniach inżynierii tkankowej.
- Poprawienie wymiany składników odżywczych poprzez większe struktury porów.
Zastosowane metody
- Mikrofluidyczna produkcja mikrożelowych prętów.
- Modyfikacja mikrożeli z GRGDS-PC.
- Ocena stabilności rusztu i wielkości porów.
- Ocena efektywności hodowli komórek w makroporowych konstruktach.
Główne wyniki
- Mikrożelowe pręty łączą się po kontakcie, tworząc stabilne ruszty.
- Wysoki współczynnik proporcji prowadzi do większych mikroporów.
- Ruszty zachowują stabilność przy mniejszej ilości materiału syntetycznego.
- Poprawiona infiltracja i interakcja komórek dla naprawy tkanek.
Wnioski
- Mikrożelowe pręty są skuteczne w tworzeniu rusztów do hodowli komórek.
- Większe pory ułatwiają tworzenie naczyń krwionośnych i wymianę składników odżywczych.
- To podejście może znacząco pomóc w zastosowaniach inżynierii tkankowej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Interlinked macroporous 3D scaffolds fabricated from functionalized microgel rods enable the creation of high-porosity, mechanically stable constructs for advanced cell-based assays and tissue engineering models. This platform supports efficient cell infiltration and interaction, providing a robust foundation for discovery-stage studies requiring physiologically relevant environments. The method's modularity and tunable properties position it as a reusable capability for translational research and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Facilitates interrogation of cell-matrix interactions in a controlled 3D environment.
- Enables functional validation of biomaterial-driven cellular responses.
- Supports predictive confidence in early-stage tissue engineering hypotheses.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible scaffolds for quantitative cell-based assays.
- Enables preparation of high-porosity constructs for compound screening workflows.
- Supports scalability and platform reuse across multiple assay formats.
Translational & Preclinical Research
- Aligns scaffold architecture with disease-relevant tissue models for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement of biomaterial candidates based on functional cell outcomes.
- Supports mechanistic de-risking by allowing post-modification of active functional groups.
Pipeline & Workflow Integration
This scaffold fabrication method integrates from early discovery through preclinical research, supporting lead identification and translational model development.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of cell behavior in tunable 3D matrices.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for cell viability and interaction studies.
- Analytics: Provides measurable outputs such as pore size distribution and scaffold stiffness for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical tissue models through customizable scaffold properties.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform adaptable to diverse cell types and experimental needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-matrix studies.
- Operational Value: Standardizes scaffold production for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling robust, physiologically relevant assays.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of biomaterial and tissue engineering programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics and polymer chemistry for scaffold fabrication.
- Needs access to UV irradiation systems and analytical tools for scaffold characterization.
- Demands cross-team standardization for reproducible scaffold properties and assay integration.
- Adaptable to various cell types and experimental models with post-modification options.
- Practical limitations include flow control precision and potential clogging during microgel rod production.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:11
Production and Purification of Amine and Epoxy Functionalized Microgel Rods
3:34
Macroporous Scaffold Formation and Cell Adhesive Post-Modification
4:24
Sterilization and Transfer into Cell Culture Media
5:02
Results: Interlinked Macroporous 3D Scaffolds from Microgel Rods
6:41
Conclusion
