Wielokrotne pomiary wzrostu mięśni szkieletowych w czasie rzeczywistym u poszczególnych żywych ryb danio pręgowanych poddanych zmienionej aktywności elektrycznej

Nasz protokół pozwala nam badać, w jaki sposób tkanki, takie jak mięśnie szkieletowe, regulują swój rozmiar, co pozostaje kluczowym pytaniem w biologii komórki i rozwoju z ważnymi implikacjami fizjologicznymi i medycznymi. Główną zaletą naszej techniki jest to, że wzrost komórek można obserwować i mierzyć u żywych zwierząt in vivo z dużą dokładnością przestrzenną i czasową. Postęp w podstawowej wiedzy na temat wczesnego wzrostu mięśni może uwypuklić rozwojowe pochodzenie wczesnych problemów z mięśniami i doprowadzić do odkrycia Novo Therapeutics w celu ochrony przed utratą mięśni u osób starszych i pacjentów z zaburzeniami zaniku mięśni.

Przygotuj 1% LMA w 1,5 mililitrowej tubie i przechowuj go w bloku grzewczym o temperaturze 37 stopni Celsjusza do wielokrotnego użycia. Wybierz rybę, która ma być zamontowana i tymczasowo znieczul każdą rybę. Aby uniknąć szoku cieplnego, wyjmij podwielokrotność LMA z bloku grzewczego i pozwól mu ostygnąć do temperatury nieco powyżej ustawienia.

Weź 60-mililitrową szalkę Petriego, która została pokryta warstwą 1% LMA i umieść ją na stoliku mikroskopu preparacyjnego. Przenieść larwę za pomocą jednomililitrowej plastikowej pipety Pasteura na 60-milimetrową pokrytą szalkę Petriego i usunąć jak najwięcej przeniesionego podłoża. Następnie, nadal używając pipety Pasteura, umieść kilka kropli LMA na rybie i szybko ustaw larwę w pobliżu górnej powierzchni LMA z osią przednio-tylną i grzbietowo-brzuszną w odległości 10 stopni od poziomu, używając kleszczy lub polerowanej ogniowo, cienkiej szklanej igły przed zastygnięciem LMA.

Alternatywnie użyj jednomililitrowej plastikowej pipety Pasteura. Zebrać larwy z minimalną ilością podłoża rybnego i przenieść larwy do podwielokrotności schłodzonego LMA. Pozwól larwie zatonąć na pięć sekund, aby całkowicie otoczyła się LMA.

Następnie pobrać larwę i przenieść ją w kropli LMA na pokrytą agarozą szalkę Petriego. Szybko ustaw larwę, jak pokazano wcześniej. Jeśli larwy nie są prawidłowo zamontowane poziomo w pobliżu powierzchni kropli agarozy, usuń i ponownie osadź larwy, larwy można łatwo odzyskać przez delikatne odsysanie za pomocą jednomililitrowej plastikowej pipety Pasteura, a LMA można delikatnie usunąć za pomocą chusteczek chemicznych.

Poczekaj około 10 minut, aż ustawi się LMA. Zalej naczynie około 10 mililitrami pożywki rybnej zawierającej trikainę. Aby uchwycić stosy konfokalne, pozwól zamontowanej rybie odpocząć przez co najmniej 10 minut przed skanowaniem, ponieważ występuje obrzęk agarozy.

Załaduj naczynie na próbkę do stolika systemu konfokalnego. Zlokalizuj larwy i skup się na pożądanym somicie. Somite 17 może być wybrany ze względu na łatwość lokalizacji w pobliżu ujścia odbytu i łatwość obrazowania.

Sprawdź, licząc somity od przedniego. Aby przechwycić obrazy YZ, skonfiguruj je tak, jakby przechwycił stos Z. Zacznij od zdefiniowania górnego i dolnego punktu ryby.

Zarówno lewa, jak i prawa strona mogą być przechwytywane zgodnie z potrzebami, zapewniając, że wszystkie szybkie skany YZ przechwytują żądane obszary. Zorientuj obszar skanowania dla ryb zgodnie z pozwala na to oprogramowanie konfokalne. Ustaw rybę z osią przednio-tylną, równolegle do osi dex obrazu, a osią grzbietowo-brzuszną równolegle do osi Y z somitem 17 w środku pola.

Skoncentruj się na płaszczyźnie środkowego poziomu w najwyższym miotomii, w której widoczne są całe połówki somitu epaxialnego i hypaxjalnego wraz z pionową i poziomą mioseptą i uchwyć obraz XY o wysokiej rozdzielczości. Nazwij plik i zapisz obraz. Aby uchwycić obrazy YZ, narysuj precyzyjną linię grzbietowo-brzuszną w poprzek wybranego somitu, prostopadłą do przednio-tylnej osi ryby.

Dodaj wybraną pozycję przednio-tylną, a następnie wykonaj skanowanie linii stosu Z. Powtórz skanowanie linii YZ trzy razy w zdefiniowanych pozycjach przednio-tylnych wzdłuż wybranego miotomii, aby uchwycić YZA, YZM i YZP. Nazwij i zapisz te obrazy z powiązanym obrazem XY.

Protokół ten został określony jako metoda czterowarstwowa, a obrazy mogą być analizowane za pomocą oprogramowania Zen lub ImageJ. Aby stworzyć komorę stymulacyjną, weź płytkę dołkową o wymiarach sześć na 35 milimetrów i utwórz dwa małe otwory o średnicy mniejszej niż pięć milimetrów, oddalone od siebie o jeden centymetr z każdej strony każdej studzienki za pomocą wąskiej lutownicy. Po utworzeniu komora stymulacyjna może być ponownie wykorzystana.

Przeciągnij parę srebrnych lub platynowych drutów przez otwory każdej studzienki. Klej wielokrotnego użytku można nakładać w pobliżu otworów, aby utrzymać druty na miejscu i zapewnić jednocentymetrową separację między drutami. Po trzech dniach od zapłodnienia podziel rybę na trzy warunki, kontrolę pożywki rybnej, nieaktywną i nieaktywną oraz łodygę.

W przypadku nieaktywnych i nieaktywnych grup plus łodygi znieczulenie larw należy znieczulić 72 godziny po zapłodnieniu 0,6 milimolową trikainą. W przypadku ryb średnio kontrolnych pozostaw je nieznieczulone. Przygotuj 60 mililitrów 2% agarozy w podłożu rybnym.

Rozpuść go dokładnie w kuchence mikrofalowej i pozwól mu ostygnąć. Następnie dodaj tricainę i wlej co najmniej cztery mililitry do każdej studzienki komory stymulacji. Natychmiast dodaj wykonane na zamówienie, czterodołkowe grzebienie między elektrodami.

Odczekaj 10 minut, aż żel stwardnieje. Ostrożnie usuń grzebienie, aby utworzyć cztery prostokątne dołki. Napełnij każdą studzienkę wodą trykainową i umieść pojedynczą znieczuloną, nieaktywną larwę plus łodygę w każdej studzience za pomocą mikropipety, tak aby ich przednio-tylny dostęp był prostopadły do elektrod.

Sprawdź pod mikroskopem fluorescencyjnym preparacyjnym, czy każda ryba jest w pełni znieczulona w każdej studzience komory. Podłącz regulowany elektrofizjologiczny, generujący wzorce stymulator do komory za pomocą regulatora polaryzacji, za pomocą zacisków krokodylkowych podłączonych do każdej elektrody po jednej stronie komory. Następnie stymuluj rybę zgodnie z opisem w rękopisie tekstu.

Regularnie sprawdzaj pod mikroskopem, aby upewnić się, że ryby są stymulowane. Bodziec elektryczny powinien wywoływać widoczny obustronny skurcz i lekki ruch raz na pięć sekund zgodnie z opisanymi parametrami. Po stymulacji ostrożnie wyjmij ryby z każdej studzienki, delikatnie wypłukując je plastikową pipetą i wróć do inkubatora w świeżym, zawierającym trikainę pożywce dla ryb.

Wylej wodę trykainową z wnętrza komory i za pomocą kleszczy przeciąć i usunąć agarozę z każdej studzienki, spłucz studzienki wodą z kranu i pozostaw do wyschnięcia. W celu analizy wielkości mięśni, określanej jako metoda czterech warstw, uzyskano obrazy XY i YZ mięśni larwalnych danio pręgowanego i obliczono objętość somitów. Zaobserwowano silną korelację między metodami czterowarstwowymi i pełnymi, chociaż metoda czterowarstwowa dawała nieco większe oszacowanie objętości.

Analiza wolumetryczna sąsiednich miotomów somitów 16 i 18 wykazała, że każdy somit był o około 7% większy niż ten znajdujący się za nim. Dalsze badania wykazały, że metoda dwuwarstwowa, wymagająca tylko jednego pomiaru YZ, dała dość dokładne oszacowanie objętości miotomii. Miotom urósł zauważalnie pod względem długości i pola przekroju poprzecznego między dwoma a pięcioma dniami po zapłodnieniu, co prowadziło do stałego wzrostu objętości.

Mięśnie, które stały się nieaktywne przez znieczulającą trikainę między trzecim a czwartym dniem po zapłodnieniu, znacznie zmniejszyły objętość, co wskazuje, że wzrost mięśni larw był zależny od aktywności. Większą różnicę w zmniejszeniu wielkości miotomu zaobserwowano podczas pomiaru objętości miotomy po czterech dniach od zapłodnienia, w porównaniu z pomiarem każdej pojedynczej ryby po trzech i czterech dniach od zapłodnienia. Niemniej jednak nie zaobserwowano istotnej różnicy w objętości miotomy między obiema metodami pomiaru miotomii.

Pomiar liczby włókien w miotomie, a także średniej objętości włókien, ujawnił, że aktywność kontroluje oba komórkowe aspekty wzrostu. Upewnij się, że larwy są całkowicie znieczulone za pomocą świeżo przygotowanej tricainy. Częściowe znieczulenie doprowadziłoby do zmiennego wyniku.

Jak wiemy, larwy silniej reagują na stymulację elektryczną. Metoda ta, w połączeniu z transkryptomiką i eksperymentami farmakologicznymi, ujawniła nowe informacje na temat tego, w jaki sposób wyczuwanie siły napędza wzrost mięśni szkieletowych.