Name: Zbieranie danych Cryo-EM z pojedynczymi cząstkami z pochyleniem stolika przy użyciu Leginon (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 52 s
Description: Poznaj metodę zbierania danych cryo-EM z pojedynczymi cząstkami przy użyciu pochylenia stolika w Leginon. Protokół ten poprawia rozkład orientacji cząstek i jakość map EM, redukując stronniczość orientacji próbek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Billowi Andersonowi, Charlesowi Bowmanowi i Jean-Christophe Ducom (TSRI) za pomoc przy mikroskopii, instalacjach Leginon i infrastrukturze transferu danych. Dziękujemy również Gordonowi Louie (Salk Institute) i Yong Zi Tan (National University of Singapore) za krytyczną lekturę manuskryptu. Dziękujemy Chrisowi Russo (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge) za dostarczenie nam plazmidu do ekspresji DPS. Praca ta była wspierana przez granty z amerykańskich National Institutes of Health (U54AI150472, U54 AI170855 i R01AI136680 DL), National Science Foundation (NSF MCB-2048095 do DL), Hearst Foundations (do DL) oraz Arthur and Julie Woodrow Chair (do J. P. N.). T.S. jest wspierany przez stypendium podoktoranckie F32 z National Institutes of Health (GM148049).

1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Używaj siatek zawierających złotą folię i wspornik złotej siatki16 (patrz Tabela materiałów), ponieważ gromadzenie danych pod kątem może uwydatnić ruch wywołany wiązką17. 
	UWAGA: W niniejszym badaniu próbki na siatkach zostały zeszklone przy użyciu techniki ręcznego zanurzania i blottingu18 w wilgotnym (ponad 80%) chłodnym pomieszczeniu (~4 °C).</li>
	<li>Unikaj używania siatek zawierających miedziany wspornik i folię węglową lub ciągłą warstwę amorficznego węgla, chyba że jest to absolutnie konieczne, ponieważ te siatki mogą prowadzić do większego ruchu wywołanego wiązką16, gdy stolik próbki jest przechylony. 
	UWAGA: Alternatywne warstwy nośne, takie jak grafen/tlenek grafenu, wydają się redukować ruch wywołany wiązką w porównaniu z węglem amorficznym 19,20.</li>
	<li>Wstępnie przesiewaj siatki i identyfikuj obszary charakteryzujące się akceptowalną grubością lodu i rozkładem cząstek. Siatki zawierające zbyt ciasno upakowane cząstki będą prowadzić do nakładania się cząstek podczas nachylonego zbierania danych, co może mieć wpływ na dalsze etapy przetwarzania danych. 
	UWAGA: Te kroki są subiektywne, ponieważ identyfikacja dobrych obszarów lodu odbywa się poprzez wizualną kontrolę rozmytych obrazów pod kątem obszarów, w których kontrast cząstek jest wyraźny. Może to nie być wykonalne w przypadku wszystkich próbek, ponieważ niektóre próbki nie będą efektywnie rozprowadzać się w obszarach cienkiego lodu, co prowadzi do problemów podczas zbierania danych (opisanych w sekcji Dyskusja).</li>
	<li>Zeszkleić siatki zawierające próbkę białka. Tutaj, w celach demonstracyjnych, używamy białka DNA Protection during Starvation (DPS) (patrz Tabela materiałów) w zakresie 0,1-0,5 mg/ml ze złotą folią i złotymi siatkami nośnymi. 
	UWAGA: Białko zostało oczyszczone w sposób opisany wcześniej, z wyjątkiem tego, że nie przeprowadzono rozszczepienia proteazy TEV21. Zakres stężeń białka dla próbki będącej przedmiotem zainteresowania będzie musiał być zoptymalizowany indywidualnie, ponieważ trudno jest określić idealny zakres, który ma uniwersalne zastosowanie i prawie na pewno będzie się różnił w zależności od próbki.</li>
</ol>
2. Konfiguracja zbierania danych pod kątem
<ol>
	<li>Ustaw mikroskop tak, aby zapewnić równoległe oświetlenie próbki i zminimalizować aberracje komy22. 
	UWAGA: Mikroskop musi być dobrze ustawiony do standardowego zbierania danych SPA bez pochylenia stolika. Do zbierania danych pod kątem nie są potrzebne żadne specjalne wyrównania, ale dobre wyrównanie zapewni płynne celowanie i obrazowanie. Ogólny schemat porównujący gromadzenie danych w pozycji pochylonej i niepochylonej znajduje się w Rysunek 2.</li>
	<li>Nagraj atlas siatki bez pochylenia stołu montażowego, aby zidentyfikować kwadraty odpowiednie do zbierania danych lub ręcznie sprawdź kwadraty w powiększeniu używanym w węźle akwizycji kwadratów. Szukaj kwadratów, w których folia jest nienaruszona, nie wygląda na odwodnioną i ma idealną grubość lodu. 
	UWAGA: Square Acquisition Node to węzeł o małym powiększeniu używany do obrazowania w wielu skalach w Leginon.
	<ol>
		<li>W przypadku typowego automatycznego zbierania danych bez pochylenia należy zapisać atlas siatki, który zawiera przegląd ogólnej jakości sieci i wstępne wskazanie odpowiednich obszarów do gromadzenia danych.</li>
		<li>Następnie wybierz odpowiednie kwadraty za pomocą atlasu i prześlij je do kolejki. Następnie, poprzez ręczny wybór otworów lub za pomocą automatycznej wyszukiwarki otworów EM, ustaw się w kolejce i prześlij cele dołków.</li>
		<li>Na koniec użyj automatycznego szukacza otworów EM, aby przesłać cele ekspozycji w dużym powiększeniu. 
		UWAGA: W przypadku zbierania danych pod kątem kwadraty mogą wymagać ręcznego kolejkowania w celu uzyskania spójnych wyników, zwłaszcza jeśli optymalny kąt nachylenia nie został wcześniej określony i prawdopodobnie zostanie dostosowany podczas zbierania danych. Atlas siatki może być również rejestrowany przy użyciu wstępnie zdefiniowanego nachylenia stołu montażowego, jeśli kąt nachylenia używany do zbierania danych został wcześniej ustalony.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś stolik z próbką do interesującego go kwadratu.</li>
	<li>Określ wysokość eucentryczną dla pozycji stage za pomocą α-wobler przy nachyleniu ± 15° stage. Dostosuj wysokość Z, aby ustawić stolik na wysokość eucentryczną za pomocą panelu klawiatury mikroskopu. Upewnij się, że przesunięcie obrazu jest minimalne podczas procedury α-chybotania. 
	UWAGA: Jeśli wysokość eucentryczna nie zostanie prawidłowo zidentyfikowana, po przechyleniu stolika przy powiększeniu kwadratowym zostanie zaobserwowane duże przesunięcie obrazu. Może się to również zdarzyć, jeśli na siatce występują lokalne deformacje, na przykład, jeśli siatka jest złamana lub mocno wygięta w pobliżu obrazowanego obszaru. Chociaż najlepiej jest unikać takich regionów do zbierania danych, konieczne jest dokładne oszacowanie wysokości eucentryczności, jeśli reprezentują one jeden z niewielu obiecujących regionów do zbierania danych. Rysunek 3 pokazuje, jak celowanie bez prawidłowego określenia wysokości eucentrycznej może powodować duże przesunięcia obrazu w powiększeniu kwadratu.</li>
	<li>Znajdź dokładniejszą wysokość Z, użyj węzła Focuser (Wyobraź sobie) i naciśnij przycisk Simulate (Symuluj).
	<ol>
		<li>Zazwyczaj oszacuj wysokość Z w węźle wyciągu okularowego przy powiększeniu używanym w węźle akwizycji kwadratowej. 
		UWAGA: Sekwencja ostrości węzła Focuser może również obejmować dokładne oszacowanie ostrości Z w powiększeniu węzła Hole Acquisition (narzędzie w oprogramowaniu Leginon) podczas zbierania danych.</li>
		<li>Dostosuj ustawienia węzła Focuser i włącz/wyłącz opcję precyzyjnego ustawiania ostrości Z podczas początkowego kolejkowania kwadratów. 
		UWAGA: Ważne jest, aby upewnić się, że wysokość eucentryczna jest dokładnie identyfikowana po rozpoczęciu automatycznego zbierania danych, co może wymagać ponownego włączenia precyzyjnego ustawiania ostrości Z (krok 2.10).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przechyl stolik na próbkę do żądanego kąta nachylenia w celu zebrania danych na prawdziwej wysokości eucentrycznej i w razie potrzeby ponownie wyśrodkuj stolik. W tym badaniu zastosowano kąty nachylenia 0°, 30° i 60°. Naciśnij przycisk Symuluj w węźle Akwizycja kwadratowa, aby rozpocząć kolejkowanie celów dla ekspozycji węzła Akwizycja otworów. 
	UWAGA: Jak wskazano w kroku 2.2.1, atlas siatki można zapisać przy użyciu wstępnie zdefiniowanego nachylenia stolika, co pozwoliłoby uniknąć konieczności ponownego przechylania stołu montażowego na tym etapie. Działa to dobrze i przyspiesza proces, jeśli kąt nachylenia używany do zbierania danych jest wstępnie zdefiniowany. Obecny protokół jest napisany z myślą o nowych próbkach, w których użytkownik może chcieć przetestować różne kąty nachylenia w celu zbierania danych.</li>
	<li>Wybierz cel ostrości Z i obszary z otworami odpowiednimi do ekspozycji w dużym powiększeniu.</li>
	<li>Naciśnij przycisk Prześlij cele, aby ustawić się w kolejce do obrazowania. Nie naciskaj przycisku Prześlij cele w kolejce, dopóki nie zakończysz kolejkowania wszystkich kwadratów.</li>
	<li>Przywróć stolik próbki do stanu nieprzechylonego. Przejdź do następnego kwadratu i powtarzaj kroki 2.3-2.8, aż odpowiednia liczba otworów zostanie umieszczona w kolejce.</li>
	<li>Przejdź do węzła Hole Targeting (Celowanie w) i naciśnij przycisk Submit Queued Targets (Prześlij cele w kolejce), gdy wszystkie kwadraty zostaną umieszczone w kolejce. 
	UWAGA: Jeśli precyzyjna ostrość Z była wcześniej wyłączona w celu zaoszczędzenia czasu (krok 2.5), należy ją ponownie włączyć przed przesłaniem kolejki.</li>
	<li>Ręcznie sprawdź cele wybrane przez węzeł akwizycji ekspozycji w dużym powiększeniu, aby sprawdzić, czy automatyczny szukacz otworów EM może dokładnie zidentyfikować odpowiednie obszary do akwizycji obrazu, gdy stolik na próbkę jest przechylony.
	<ol>
		<li>Podczas tej procedury wybierz opcję "Zezwalaj na weryfikację wybranych celów przez użytkownika" w ustawieniach węzła Akwizycja ekspozycji. Gdy użytkownik uzna, że dokładność kierowania jest zadowalająca, odznacz tę opcję, aby automatycznie zbierać dane. 
		UWAGA: Obiekty w węźle akwizycji ekspozycji w dużym powiększeniu są zazwyczaj obrazowane przy użyciu strategii przesunięcia obrazu z pochyleniem wiązki, która działa równie dobrze zarówno w przypadku zbierania danych pod kątem, jak i bez nachylenia23,24,25,26. W celu dokładnego oszacowania CTF na dalszych etapach przetwarzania danych, należy przeprowadzić kalibrację aberracji komy obiektywu dla strategii zbierania danych dotyczących przesunięcia obrazu przy nachyleniu wiązki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przetwarzanie danych
<ol>
	<li>Rozpocznij przetwarzanie danych w locie10,27,28,29 z korekcją ruchu nagranych filmów, estymacją CTF, selekcją cząstek i generowaniem wstępnych rekonstrukcji podczas zbierania danych. 
	UWAGA: W niniejszym badaniu cryoSPARC Live10 (patrz tabela materiałów) został wykorzystany do wstępnego przetwarzania. Przetwarzanie danych w locie zapewnia wstępną rekonstrukcję cryo-EM i przybliżenie rozkładu kątowego, co może poinformować użytkownika o zakresie anizotropii rozdzielczości. Te z kolei mogą być wykorzystywane do informowania użytkownika o tym, czy kąt nachylenia używany do zbierania danych jest wystarczająco wysoki.</li>
	<li>Zwizualizuj zrekonstruowaną mapę i wykreśl rozkład kąta Eulera, aby ocenić zakres preferowanych orientacji cząstek. 
	UWAGA: Rozkłady kątów Eulera można przekształcić bezpośrednio na rozkłady próbkowania przestrzeni Fouriera w celu określenia potencjalnego zakresu anizotropii rozdzielczości. Graficzny interfejs użytkownika (GUI) został opracowany, aby pomóc użytkownikowi w ocenie jakości rozkładu kąta Eulera i określeniu optymalnego kąta nachylenia30,31. Narzędzie można pobrać z repozytorium Github, https://github.com/LyumkisLab/SamplingGui.</li>
	<li>W razie potrzeby należy dostosować kąt nachylenia stołu montażowego, przy którym zbierane są dane, aby zniwelować skutki orientacji preferencyjnej. Kąt można zwiększyć, jeśli orientacja preferencyjna pozostaje problemem, o czym świadczy mapa i rozkład Eulera w 3.2. Alternatywnie użytkownik może chcieć podzielić zbieranie danych na grupy i nagrywać przy użyciu kilku różnych kątów nachylenia, takich jak 20°, 30° i 40°. 
	UWAGA: Chociaż większość TEM musi mieć możliwość przechylenia stolika do 70°, typowe nachylenia stolika próbnego (którego używaliśmy) wahają się od 20° do 40°.</li>
</ol>

<ol><li>Campbell, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movies+of+ice-embedded+particles+enhance+resolution+in+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy.</a> Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).</li>
<li>Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+structures+to+near-atomic+resolution+from+thirty+thousand+cryo-EM+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles.</a> Elife. 2, 00461(2013).</li>
<li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li>
<li>Chua, E. Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cheaper%3A+recent+advances+in+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">cheaper: recent advances in cryo-electron microscopy.</a> Annual Review of Biochemistry. , (2022).</li>
<li>Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+in+cryo-EM+single-particle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities in cryo-EM single-particle analysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (13), 5181-5197 (2019).</li>
<li>Wu, M., Lander, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Present+and+emerging+methodologies+in+Cryo-EM+single-particle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Present and emerging methodologies in Cryo-EM single-particle analysis.</a> Biophysical Journal. 119 (7), 1281-1289 (2020).</li>
<li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+and+limitations+of+neutrons%2C+electrons+and+X-rays+for+atomic+resolution+microscopy+of+unstained+biological+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).</li>
<li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+single+particle+CryoEM+sample+and+grid+characterization+by+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography.</a> Elife. 7, 34257(2018).</li>
<li>Tan, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addressing+preferred+specimen+orientation+in+single-particle+cryo-EM+through+tilting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting.</a> Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cryoSPARC%3A+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li>
<li>Potter, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leginon%3A+a+system+for+fully+automated+acquisition+of+1000+electron+micrographs+a+day%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Leginon: a system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day.</a> Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).</li>
<li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+molecular+microscopy%3A+The+new+Leginon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated molecular microscopy: The new Leginon system.</a> Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).</li>
<li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leginon%3A+New+features+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Leginon: New features and applications.</a> Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).</li>
<li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leginon%3A+An+automated+system+for+acquisition+of+images+from+vitreous+ice+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens.</a> Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).</li>
<li>NYSBC.org Homepage. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Homepage">https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Homepage</a> (2022).</li>
<li>Russo, C. J., Passmore, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy%3A+Ultrastable+gold+substrates+for+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy.</a> Science. 346, 1377-1380 (2014).</li>
<li>Russo, C. J., Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charge+accumulation+in+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Charge accumulation in electron cryomicroscopy.</a> Ultramicroscopy. 187, 43-49 (2018).</li>
<li>Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+blot-and-plunge+freezing+of+biological+specimens+for+single-particle+cryogenic+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (180), e62765(2022).</li>
<li>Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+graphene+oxide+coating+improves+cryo-EM+sample+preparation+and+data+collection+from+tilted+grids%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Naydenova, K., Peet Mathew, J., Russo Christopher J, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+graphene+supports+for+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (24), 11718-11724 (2019).</li>
<li>Naydenova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoEM+at+100+keV%3A+a+demonstration+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">CryoEM at 100 keV: a demonstration and prospects.</a> IUCrJ. 6 (6), 1086-1098 (2019).</li>
<li>Herzik, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHerzik%2C+MA+%22cryoEM%3A+Methods+and+Protocols%22">cryoEM: Methods and Protocols</a>. Gonen, T., Nannenga, B. L. , Springer US. 125-144 (2021).</li>
<li>Cash, J. N., Kearns, S., Li, Y., Cianfrocco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+cryo-EM+using+beam-image+shift+at+200+keV%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">High-resolution cryo-EM using beam-image shift at 200 keV.</a> IUCrJ. 7 (6), 1179-1187 (2020).</li>
<li>Peck, J. V., Fay, J. F., Strauss, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+high-resolution+data+collection+on+a+200+keV+cryo-TEM%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">High-speed high-resolution data collection on a 200 keV cryo-TEM.</a> IUCrJ. 9 (2), 243-252 (2022).</li>
<li>Bouvette, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beam+image-shift+accelerated+data+acquisition+for+near-atomic+resolution+single-particle+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Beam image-shift accelerated data acquisition for near-atomic resolution single-particle cryo-electron tomography.</a> Nature Communications. 12 (1), 1957(1957).</li>
<li>Cheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+single+particle+cryo-electron+microscopy+using+beam-image+shift%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">High resolution single particle cryo-electron microscopy using beam-image shift.</a> Journal of Structural Biology. 204 (2), 270-275 (2018).</li>
<li>Tegunov, D., Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+cryo-electron+microscopy+data+preprocessing+with+Warp%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp.</a> Nature Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).</li>
<li>Structura Biotechnology Inc. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://cryosparc.com/live">https://cryosparc.com/live</a> (2022).</li>
<li>DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+single-particle+cryo-electron+microscopy+%28cryo-EM%29+processing+workflow+with+cryoSPARC%2C+RELION%2C+and+Scipion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion.</a> Journal of Visualized Experiments. (179), e63387(2022).</li>
<li>Baldwin, P. R., Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-uniformity+of+projection+distributions+attenuates+resolution+in+Cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Non-uniformity of projection distributions attenuates resolution in Cryo-EM.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 150, 160-183 (2020).</li>
<li>Baldwin, P. R., Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+visualizing+and+analyzing+Fourier+space+sampling+in+Cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tools for visualizing and analyzing Fourier space sampling in Cryo-EM.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 160, 53-65 (2021).</li>
<li>Aiyer, S., Zhang, C., Baldwin, P. R., Lyumkis, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAiyer%2C+S+%22cryoEM%3A+Methods+and+Protocols%22">cryoEM: Methods and Protocols</a>. Gonen, T., Nannenga, B. L. , Springer US. 161-187 (2021).</li>
<li>Glaeser, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defocus-dependent+Thon-ring+fading%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Defocus-dependent Thon-ring fading).</a> Ultramicroscopy. 222, 113213(2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Preferowana orientacja cząstek spowodowana przyleganiem próbki do granicy faz powietrze-woda jest jednym z ostatnich głównych wąskich gardeł w rutynowym określaniu struktury w wysokiej rozdzielczości przy użyciu cryo-EM SPA 4,5,6. Przedstawiony tutaj schemat zbierania danych zapewnia łatwą do wdrożenia strategię poprawy rozkładu orientacji cząstek w zbiorze danych. Zwracamy uwagę, że protokół nie wymaga żadnego dodatkowego sprzę...

Pojawienie się bezpośrednich detektorów elektronów w ciągu ostatniej dekady1,2,3 spowodowało wykładniczy wzrost liczby struktur makromolekuł i zespołów makromolekularnych o wysokiej rozdzielczości rozwiązanych za pomocą jednocząsteczkowego cryo-EM4,5,6. Oczekuje się, że prawie wszystkie oczyszczone gatunki makromolekularne będą podatne na określanie struktury za pomocą cryo-EM, z wyjątkiem najmniejszych białek o wielkości ~10 kDa lub mniejszej7. Ilość materiału wyjściowego potrzebna do przygotowania siatki i określenia struktury jest co najmniej o rząd wielkości mniejsza niż w przypadku innych technik oznaczania struktury, takich jak spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego i krystalografia rentgenowska4,5,6.
Jednak głównym wyzwaniem dla określenia struktury za pomocą cryo-EM jest odpowiednie przygotowanie siatki do obrazowania. Szeroko zakrojone badanie, w którym oceniono różne próbki przy użyciu różnych strategii witryfikacji i siatek, zasugerowało, że większość podejść do zeszklenia próbek na siatkach krio-EM prowadzi do preferencyjnego przylegania makrocząsteczek do granicy faz powietrze-woda8. Takie przyleganie może potencjalnie spowodować cztery nieoptymalne wyniki: (1) próbka makromolekularna ulega całkowitej denaturacji, w którym to przypadku nie jest możliwe pomyślne zebranie i przetworzenie danych; (2) próbka ulega częściowej denaturacji, w którym to przypadku możliwe jest uzyskanie wglądu strukturalnego w regiony makrocząsteczki, które nie są uszkodzone; (3) próbka zachowuje strukturę natywną, ale na obrazach reprezentowany jest tylko jeden zestaw orientacji cząstek względem kierunku wiązki elektronów; (4) próbka zachowuje strukturę natywną, a niektóre, ale nie wszystkie, możliwe orientacje cząstek względem kierunku wiązki elektronów są przedstawione na obrazach. W przypadkach (3) i (4) gromadzenie danych pod kątem pomoże zminimalizować anizotropię rozdzielczości kierunkowej wpływającą na zrekonstruowaną mapę cryo-EM i zapewni uogólnione rozwiązanie dla szerokiej gamy próbek9. Z technicznego punktu widzenia przechylanie może być również korzystne w przypadku (2), ponieważ denaturacja przypuszczalnie zachodzi na granicy faz powietrze-woda i podobnie ogranicza liczbę odrębnych orientacji reprezentowanych w danych. Zakres odchylenia orientacji w zbiorze danych może zostać potencjalnie zmieniony przez eksperymentowanie z dodatkami do roztworów, ale brak szerokiego zastosowania utrudnia stosowanie tych podejść opartych na próbach i błędach. Przechylenie stolika próbki pod pojedynczym zoptymalizowanym kątem nachylenia jest wystarczające, aby poprawić rozkład orientacji dzięki zmianie geometrii eksperymentu obrazowania9 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Ze względu na konfigurację geometryczną próbki zorientowanej preferencyjnie w stosunku do wiązki elektronów, dla każdego klastra orientacji preferencyjnych, przechylenie siatki generuje stożek kątów oświetlenia w stosunku do środka ciężkości klastra. W związku z tym rozkłada to widoki, a w konsekwencji poprawia próbkowanie przestrzeni Fouriera i izotropię rozdzielczości kierunkowej.
W praktyce istnieją pewne wady przechylania sceny. Przechylenie stolika na próbkę wprowadza gradient ostrości w całym polu widzenia, co może mieć wpływ na dokładność oszacowań funkcji transferu kontrastu (CTF). Gromadzenie danych pod kątem może również prowadzić do zwiększonego ruchu cząstek wywołanego wiązką, spowodowanego zwiększonymi efektami ładowania podczas obrazowania nachylonych próbek. Przechylenie siatki prowadzi również do zwiększenia pozornej grubości lodu, co z kolei prowadzi do głośniejszych mikrofotografii i może ostatecznie wpłynąć na rozdzielczość rekonstrukcji5,9,10. Być może uda się przezwyciężyć te problemy poprzez zastosowanie zaawansowanych schematów obliczeniowego przetwarzania danych, które są pokrótce opisane w sekcjach protokołu i dyskusji. Wreszcie, przechylanie może prowadzić do zwiększonego nakładania się cząstek, co utrudnia późniejszy proces przetwarzania obrazu. Chociaż można to do pewnego stopnia złagodzić, optymalizując stężenie cząstek w sieci, jest to jednak ważna kwestia. W tym miejscu opisano prosty do wdrożenia protokół do gromadzenia danych pod kątem za pomocą pakietu oprogramowania Leginon (oprogramowanie do automatycznego gromadzenia obrazów), dostępnego w otwartym dostępie i kompatybilnego z szeroką gamą mikroskopów11,12,13,14. Metoda wymaga co najmniej wersji 3.0 lub nowszej, przy czym wersje 3.3 i nowsze zawierają dedykowane ulepszenia umożliwiające zbieranie danych pod kątem. Do korzystania z tego protokołu nie jest wymagane żadne dodatkowe oprogramowanie ani sprzęt. Obszerne instrukcje dotyczące infrastruktury obliczeniowej i instrukcje instalacji znajdują się gdzie indziej15.

<table><tbody><tr><td>Cryosparc Live v3.1.0 + 210216</td><td>Structura Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczanie białka</td><td></td><td></td><td>DPS dostosowane do protokołu opisanego w K.Naydenova i in. IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086&ndash;1098.</td></tr><tr><td>K2 Summit Direct Electron Detector</td><td>Pakiet</td> oprogramowania Gatan <td></td><td></td></tr><tr><td>Leginon</td><td>C Suloway i in. Journal of Structural Biology 151 (1): s. 41-60.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ręczne urządzenie</td><td></td><td></td> do zagłębiania <td>Domowe urządzenie gilotynowe do zeszklenia siatek EM</td></tr><tr><td>Talos Arctica</td><td>FEI/Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltrAufoil R1.2/1.3 Siatki 300</td><td>Quantifoil</td><td>N1-A14nAu30-01</td><td></td></tr></tbody></table>

zbieranie danych cryo-em z pojedynczymi cząstkami z pochyleniem stolika przy użyciu leginon

Single-Particle Cryo-EM Data Collection with Stage Tilt using Leginon

Analiza pojedynczych cząstek (SPA) za pomocą mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM) jest obecnie głównym nurtem techniki biologii strukturalnej o wysokiej rozdzielczości. Określanie struktury za pomocą SPA opiera się na uzyskaniu wielu różnych widoków obiektu wielkocząsteczkowego zeszklonego w cienkiej warstwie lodu. Idealnie byłoby, gdyby zbiór równomiernie rozłożonych losowych orientacji projekcji sprowadzał się do wszystkich możliwych widoków obiektu, dając początek rekonstrukcjom charakteryzującym się izotropową rozdzielczością kierunkową. Jednak w rzeczywistości wiele próbek cierpi z powodu preferencyjnych cząstek przylegających do granicy faz powietrze-woda. Prowadzi to do niejednorodnych rozkładów orientacji kątowej w zbiorze danych i niejednorodnego próbkowania przestrzeni Fouriera w rekonstrukcji, co przekłada się na mapy charakteryzujące się rozdzielczością anizotropową. Przechylenie stolika próbki zapewnia uogólnione rozwiązanie problemu przezwyciężenia anizotropii rozdzielczości dzięki poprawie jednorodności rozkładów orientacji, a tym samym izotropii próbkowania w przestrzeni Fouriera. Niniejszy protokół opisuje strategię automatycznego gromadzenia danych w zaawansowanym etapie przy użyciu oprogramowania Leginon, służącego do automatycznego pozyskiwania obrazów. Procedura jest prosta do wdrożenia, nie wymaga żadnego dodatkowego sprzętu ani oprogramowania i jest kompatybilna z większością standardowych transmisyjnych mikroskopów elektronowych (TEM) używanych do obrazowania makrocząsteczek biologicznych.

Do demonstracji obrazowania przy nachyleniach 0°, 30° i 60° wykorzystano DPS w stężeniu 0,3 mg/mL. Dane dla różnych kątów nachylenia zbierano na tej samej siatce, lecz w różnych jej obszarach. Dopasowania rozdzielczości CTF dla większych kątów nachylenia mają tendencję do bycia gorszymi, co zaobserwowano podczas porównywania trzech zestawów danych w niniejszym badaniu. Rycina 4 przedstawia porównawcze reprezentatywne obrazy oraz średnie z klasyfikacji 2D. Chociaż stężenie białka pozostaje ni...

Obecny protokół opisuje uogólniony i łatwy do wdrożenia schemat zbierania danych o pojedynczych cząstkach w eksperymentach kriogenicznych. Taka procedura jest szczególnie przydatna do uzyskania wysokiej jakości mapy EM dla próbek cierpiących na odchylenie preferencyjnej orientacji ze względu na przyleganie do granicy faz powietrze-woda.

Zbieranie danych Cryo-EM z pojedynczymi cząstkami z pochyleniem stolika przy użyciu Leginon

Single-particle analysis (SPA) by cryo-electron microscopy (cryo-EM) is now a mainstream technique for high-resolution structural biology. Structure ...

Przechylanie stolika na próbki zapewnia prosty i uogólniony sposób zwiększania rozkładu orientacji cząstek podczas zbierania danych kriogenicznych pojedynczych cząstek. Równomierny rozkład cząstek uzyskany w wyniku przechylenia stolika próbki umożliwia poprawę ogólnej jakości mapy i możliwości interpretacji. Zacznij od ustawienia mikroskopu, aby zapewnić równoległe oświetlenie próbki i zminimalizować aberracje komy.Aby zidentyfikować kwadraty nadające się do zbierania danych, należy zapisać atlas siatki bez pochylenia stołu montażowego lub z pochyleniem stołu montażowego, który zapewnia przegląd ogólnej jakości siatki i wstępne wskazanie odpowiednich obszarów do gromadzenia danych. Sprawdź kwadraty ręcznie w powiększeniu używanym w węźle akwizycji kwadratu. Poszukaj kwadratów, w których folia jest nienaruszona, nie wygląda na odwodnioną i ma idealną grubość lodu, a następnie przenieś etap próbki do interesującego kwadratu.Określ wysokość eucentryczną dla pozycji stolika za pomocą woblera alfa przy nachyleniu stolika o około 15 stopni i dostosuj wysokość Z, aby ustawić stolik na wysokość eucentryczną za pomocą panelu klawiatury mikroskopu. Upewnij się, że przesunięcie obrazu jest minimalne podczas procedury chybotania alfa. Aby znaleźć dokładniejszą wysokość Z, oszacuj ją w węźle wyciągu okularowego przy powiększeniu używanym w kwadratowym węźle akwizycji.Dostosuj ustawienia węzła wyciągu okularowego i włącz lub wyłącz opcję precyzyjnego ustawiania ostrości Z podczas początkowego kolejkowania kwadratów. Następnie naciśnij przycisk Symuluj. Przechyl stolik na próbkę do żądanego kąta nachylenia w celu zebrania danych na prawdziwej wysokości eucentrycznej i w razie potrzeby ponownie wyśrodkuj stolik.Naciśnij przycisk Symuluj w kwadratowym węźle akwizycji, aby rozpocząć kolejkowanie celów dla ekspozycji całego węzła akwizycji. Następnie wybierz cel ostrości Z i obszary z otworami odpowiednimi do ekspozycji w dużym powiększeniu i prześlij cele do kolejki do obrazowania. Przywróć stolik próbki do stanu niepochylonego, a następnie przejdź do następnego kwadratu.Powtarzaj te kroki, aż odpowiednia liczba całych ekspozycji zostanie umieszczona w kolejce. Gdy wszystkie kwadraty zostaną umieszczone w kolejce, przejdź do całego węzła kierowania i naciśnij Prześlij cele w kolejce. Wybierz opcję Zezwalaj na weryfikację wybranych obiektów przez użytkownika w ustawieniach węzła i ręcznie sprawdź cele wybrane przez węzeł akwizycji ekspozycji w dużym powiększeniu, aby sprawdzić, czy automatyczny szukacz otworów EM może dokładnie zidentyfikować odpowiednie obszary do akwizycji obrazu, gdy stolik próbki jest przechylony.Gdy użytkownik uzna, że dokładność kierowania jest zadowalająca, usuń zaznaczenie opcji Zezwalaj na weryfikację wybranych celów przez użytkownika w celu automatycznego zbierania danych. Reprezentatywne obrazy siatki w powiększeniu kwadratowym z różnymi kątami nachylenia, zebrane w pobliżu i daleko od eucentrycznej wysokości Z, są pokazane tutaj. Środek belki jest wskazywany przez środek czerwonych koncentrycznych pierścieni, a zielona strzałka wskazuje interesujący kwadrat.Do kwadratu zainteresowania przylega przerwana siatka w celach informacyjnych. Poniżej przedstawiono reprezentatywne ekspozycje otworów i średnie klasy 2D zebrane pod kątem nachylenia 0 stopni, 30 stopni i 60 stopni. Chociaż stężenie białka pozostaje niezmienione pod różnymi kątami nachylenia, wyższy kąt nachylenia sprawia, że obrazowany obszar wydaje się bardziej zatłoczony pod względem stężenia cząstek.Średnie klasy 2D, na które wpływ ma przeludnienie, są pokazane w tym czerwonym polu. Prostota protokołu pozwala każdemu standardowemu użytkownikowi mikroskopu łatwo dostosować strategię gromadzenia danych pod kątem nachylenia.

single-particle-cryo-em-data-collection-with-stage-tilt-using-leginon

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przedstawiamy tutaj sposób wykorzystania kriotomografii elektronowej (ECT) do badania ultrastruktury komórek bakteryjnych w stanach zbliżonych do naturalnych, z rozdzielczością „makrocząsteczkową” (~4 nm).

Kriotomografia elektronowa komórek bakteryjnych

Przedstawiamy protokół, jak wykorzystać wysokoprzepustową tomografię krioelektronową do określenia wysokiej rozdzielczości struktur in situ maszyn molekularnych. Protokół pozwala na przetwarzanie dużych ilości danych, pozwala uniknąć typowych wąskich gardeł i skraca przestoje zasobów, pozwalając użytkownikowi skupić się na ważnych kwestiach biologicznych.

Korzystanie z Tomoauto: protokół dla wysokowydajnej zautomatyzowanej tomografii krioelektronowej

Protokół przedstawiony tutaj opisuje użycie Spotiton, nowatorskiego systemu robotycznego, do dostarczenia dwóch interesujących próbek na samozasłaniającą się, nanodrucianą siatkę, które mieszają się przez minimum 90 ms przed zeszkleniem w płynnym kriogenie.

Przygotowanie mikroskopowej siatki krioelektronowej do badań rozdzielczych w czasie przy użyciu nowatorskiego systemu robotycznego, Spotiton

Ten protokół pokazuje, jak obrazować biologiczne próbki kriokonserwowane za pomocą kriostrukturalnej mikroskopii świetlnej. Demonstrujemy metodologię, obrazując cytoszkielet komórek U2OS.

Mikroskopijne gromadzenie danych z komórek zakonserwowanych kriogenicznie

Rosnące zapotrzebowanie na gromadzenie danych na dużą skalę w kriogenicznej tomografii elektronowej wymaga wysokoprzepustowych procedur akwizycji obrazów. Opisano tutaj protokół, który wdraża najnowsze osiągnięcia zaawansowanych strategii akwizycji mających na celu maksymalizację efektywności czasowej i przepustowości gromadzenia danych tomograficznych.

Strategie optymalizacji pozyskiwania danych z kriogenicznej tomografii elektronowej

Określanie struktury kompleksów makromolekularnych za pomocą cryoEM stało się rutyną dla niektórych klas białek i kompleksów. W tym miejscu podsumowano ten proces (przygotowanie próbki, badanie przesiewowe, pozyskiwanie i przetwarzanie danych), a czytelnicy są kierowani do dalszych szczegółowych zasobów i zmiennych, które mogą ulec zmianie w przypadku trudniejszych próbek.

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek: od próbki do struktury

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek wymaga odpowiedniego pakietu oprogramowania i przyjaznego dla użytkownika potoku do wysokowydajnej automatycznej akwizycji danych. W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie w pełni zautomatyzowanego pakietu oprogramowania do akwizycji obrazu, Latitude-S, oraz praktycznego potoku do gromadzenia danych o zeszklonych biomolekułach w warunkach niskich dawek.

Przyjazne dla użytkownika, wysokowydajne i w pełni zautomatyzowane oprogramowanie do akwizycji danych do mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Mapy krio-EM makromolekuł o wysokiej rozdzielczości można również uzyskać za pomocą mikroskopów TEM 200 kV. Protokół ten przedstawia najlepsze praktyki w zakresie ustawiania dokładnych wyrównań optyki, schematów akwizycji danych i wyboru obszarów obrazowania, które są niezbędne do pomyślnego zbierania zestawów danych o wysokiej rozdzielczości przy użyciu TEM 200 kV.

Rutynowe zbieranie zestawów danych krio-EM o wysokiej rozdzielczości przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego 200 KV

Obecny protokół opisuje zdalne pozyskiwanie danych za pomocą tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości za pomocą Tomo5 oraz późniejsze przetwarzanie danych i uśrednianie subtomogramowe za pomocą emClarity. Apoferrytyna jest używana jako przykład do zilustrowania szczegółowych procesów krok po kroku w celu uzyskania struktury krio-ET o rozdzielczości 2,86 A.

Tomografia krioelektronowa: zdalne zbieranie danych i uśrednianie subtomogramu

Badanie przesiewowe z użyciem wielu siatek w mikroskopii krioelektronowej (cryoEM) jest często żmudnym procesem, który wymaga wielu godzin uwagi. Ten protokół pokazuje, jak skonfigurować standardową kolekcję Leginon i Smart Leginon Autoscreen, aby zautomatyzować ten proces. Protokół ten można zastosować do większości dziurawych siatek foliowych cryoEM.

Automatyzacja badań przesiewowych pod mikroskopią krioelektronową w wielu sieciach przy użyciu Smart Leginon

Protokół ten standaryzuje tomografię krioelektronową (cryo-ET) dla grubych tkanek poprzez integrację zamrażania pod wysokim ciśnieniem (HPF) z metodą gofrową, wyciąganie kriogenicznej wiązki jonowej (krio-FIB) oraz równoległe pobieranie pod względem dawki, co daje jednolicie cienkie lamele i próbki zwitryfikowane do powtarzalnej analizy in situ w hipokampie myszy.

Workflow tomografii krioelektronowej dla grubych tkanek wykazany u hipokampa myszy

Poznaj metodę zbierania danych cryo-EM z pojedynczymi cząstkami przy użyciu pochylenia stolika w Leginon. Protokół ten poprawia rozkład orientacji cząstek i jakość map EM, redukując stronniczość orientacji próbek.

Zbieranie danych Cryo-EM z pojedynczymi cząstkami z pochyleniem stolika przy użyciu Leginon

Przeglądaj więcej filmów