Zbieranie danych Cryo-EM z pojedynczymi cząstkami z pochyleniem stolika przy użyciu Leginon
1 lipca 2022
Obecny protokół opisuje uogólniony i łatwy do wdrożenia schemat zbierania danych o pojedynczych cząstkach w eksperymentach kriogenicznych. Taka procedura jest szczególnie przydatna do uzyskania wysokiej jakości mapy EM dla próbek cierpiących na odchylenie preferencyjnej orientacji ze względu na przyleganie do granicy faz powietrze-woda.
Przechylanie stolika na próbki zapewnia prosty i uogólniony sposób zwiększania rozkładu orientacji cząstek podczas zbierania danych kriogenicznych pojedynczych cząstek. Równomierny rozkład cząstek uzyskany w wyniku przechylenia stolika próbki umożliwia poprawę ogólnej jakości mapy i możliwości interpretacji. Zacznij od ustawienia mikroskopu, aby zapewnić równoległe oświetlenie próbki i zminimalizować aberracje komy.
Aby zidentyfikować kwadraty nadające się do zbierania danych, należy zapisać atlas siatki bez pochylenia stołu montażowego lub z pochyleniem stołu montażowego, który zapewnia przegląd ogólnej jakości siatki i wstępne wskazanie odpowiednich obszarów do gromadzenia danych. Sprawdź kwadraty ręcznie w powiększeniu używanym w węźle akwizycji kwadratu. Poszukaj kwadratów, w których folia jest nienaruszona, nie wygląda na odwodnioną i ma idealną grubość lodu, a następnie przenieś etap próbki do interesującego kwadratu.
Określ wysokość eucentryczną dla pozycji stolika za pomocą woblera alfa przy nachyleniu stolika o około 15 stopni i dostosuj wysokość Z, aby ustawić stolik na wysokość eucentryczną za pomocą panelu klawiatury mikroskopu. Upewnij się, że przesunięcie obrazu jest minimalne podczas procedury chybotania alfa. Aby znaleźć dokładniejszą wysokość Z, oszacuj ją w węźle wyciągu okularowego przy powiększeniu używanym w kwadratowym węźle akwizycji.
Dostosuj ustawienia węzła wyciągu okularowego i włącz lub wyłącz opcję precyzyjnego ustawiania ostrości Z podczas początkowego kolejkowania kwadratów. Następnie naciśnij przycisk Symuluj. Przechyl stolik na próbkę do żądanego kąta nachylenia w celu zebrania danych na prawdziwej wysokości eucentrycznej i w razie potrzeby ponownie wyśrodkuj stolik.
Naciśnij przycisk Symuluj w kwadratowym węźle akwizycji, aby rozpocząć kolejkowanie celów dla ekspozycji całego węzła akwizycji. Następnie wybierz cel ostrości Z i obszary z otworami odpowiednimi do ekspozycji w dużym powiększeniu i prześlij cele do kolejki do obrazowania. Przywróć stolik próbki do stanu niepochylonego, a następnie przejdź do następnego kwadratu.
Powtarzaj te kroki, aż odpowiednia liczba całych ekspozycji zostanie umieszczona w kolejce. Gdy wszystkie kwadraty zostaną umieszczone w kolejce, przejdź do całego węzła kierowania i naciśnij Prześlij cele w kolejce. Wybierz opcję Zezwalaj na weryfikację wybranych obiektów przez użytkownika w ustawieniach węzła i ręcznie sprawdź cele wybrane przez węzeł akwizycji ekspozycji w dużym powiększeniu, aby sprawdzić, czy automatyczny szukacz otworów EM może dokładnie zidentyfikować odpowiednie obszary do akwizycji obrazu, gdy stolik próbki jest przechylony.
Gdy użytkownik uzna, że dokładność kierowania jest zadowalająca, usuń zaznaczenie opcji Zezwalaj na weryfikację wybranych celów przez użytkownika w celu automatycznego zbierania danych. Reprezentatywne obrazy siatki w powiększeniu kwadratowym z różnymi kątami nachylenia, zebrane w pobliżu i daleko od eucentrycznej wysokości Z, są pokazane tutaj. Środek belki jest wskazywany przez środek czerwonych koncentrycznych pierścieni, a zielona strzałka wskazuje interesujący kwadrat.
Do kwadratu zainteresowania przylega przerwana siatka w celach informacyjnych. Poniżej przedstawiono reprezentatywne ekspozycje otworów i średnie klasy 2D zebrane pod kątem nachylenia 0 stopni, 30 stopni i 60 stopni. Chociaż stężenie białka pozostaje niezmienione pod różnymi kątami nachylenia, wyższy kąt nachylenia sprawia, że obrazowany obszar wydaje się bardziej zatłoczony pod względem stężenia cząstek.
Średnie klasy 2D, na które wpływ ma przeludnienie, są pokazane w tym czerwonym polu. Prostota protokołu pozwala każdemu standardowemu użytkownikowi mikroskopu łatwo dostosować strategię gromadzenia danych pod kątem nachylenia.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje prostą metodę usprawnienia gromadzenia danych w krio-EM pojedynczych cząsteczek poprzez pochylanie stolika z preparatem. Podejście to jest szczególnie korzystne dla poprawy jakości map EM w przypadku próbek wykazujących tendencję do orientacji preferencyjnej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Kriomikroskopia elektronowa (cryo-EM)
- Biologia strukturalna
- Analiza pojedynczych cząsteczek
Wstęp
- Krio-EM pojedynczych cząsteczek jest kluczowa dla wyznaczania struktur biologicznych makrocząsteczek.
- Próbki często wykazują błąd orientacji podczas przylegania do powierzchni.
- Poprawa orientacji cząsteczek może zwiększyć jakość mapy.
- Nachylenie stolika jest metodą pozwalającą na uzyskanie bardziej jednorodnego rozkładu cząsteczek.
Cel badania
- Przedstawienie protokołu przechylania stolika z preparatem podczas gromadzenia danych w krio-EM.
- Zmniejszenie błędu wynikającego z preferencyjnej orientacji próbek.
- Poprawa interpretowalności map EM.
Zastosowane metody
- Ustawianie mikroskopu w celu uzyskania optymalnego oświetlenia.
- Rejestracja atlasu siatki w celu oceny jej jakości.
- Inspekcja pól w celu zweryfikowania optymalnych warunków przed rozpoczęciem gromadzenia danych.
- Ręczny wybór pól na podstawie integralności folii oraz grubości lodu.
Główne wyniki
- Przechylenie stolika zwiększa rozkład orientacji cząsteczek.
- Zaobserwowano poprawę ogólnej jakości i interpretowalności mapy.
- Pomyślna identyfikacja odpowiednich pól do zbierania danych.
- Redukcja aberracji komy dzięki właściwemu wyrównaniu.
Wnioski
- Przechylanie stolika z preparatem jest skuteczną strategią w krio-EM.
- Metoda ta może znacznie poprawić jakość map EM.
- Przyszłe zastosowania mogą dodatkowo udoskonalić techniki zbierania danych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Krio-EM pojedynczych cząsteczek z pochyleniem stolika rozwiązuje krytyczny problem w biologii strukturalnej poprzez przezwyciężenie preferencyjnej orientacji cząsteczek, która może ograniczać rozdzielczość i interpretowalność mapy. Możliwość ta zwiększa pewność predykcyjną przy wyznaczaniu struktur makromolekularnych, co bezpośrednio wpływa na punkty zwrotne w fazie wczesnego odkrywania i walidacji celów terapeutycznych. Podejście to jest szeroko kompatybilne ze standardowymi platformami TEM, co umożliwia skalowalny i powtarzalny zbiór danych w portfolio badawczo-rozwojowym sektora biofarmaceutycznego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia kompleksową analizę strukturalną celów makromolekularnych poprzez poprawę rozkładu orientacji.
- Zmniejsza niejednoznaczność mechanisticzną w walidacji celu dzięki izotropowej rozdzielczości mapy.
- Zwiększa wiarygodność prognoz w projektowaniu leków opartym na strukturze oraz w selekcji portfolio.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane zestawy danych strukturalnych dla późniejszych analiz obliczeniowych i procesów przesiewowych.
- Umożliwia powtarzalną i ilościową ocenę rozkładu cząstek w różnych warunkach.
- Pozwala na wiarygodną ewaluację protokołów przygotowania próbek oraz jakości siatek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Poprawia ciągłość procesu od odkrycia do walidacji przedklinicznej poprzez dostarczanie wysokiej jakości danych strukturalnych.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka dzięki zwiększonej interpretowalności map.
- Jest zgodne z translacyjnymi strategiami biomarkerów w przypadku, gdy analizy strukturalne stanowią podstawę dla testów funkcjonalnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Gromadzenie danych cryo-EM przy przechylonym stoliku integruje się z continuum od odkrywania do fazy przedklinicznej, umożliwiając solidną charakterystykę strukturalną na wczesnych i pośrednich etapach procesu opracowywania leków.
- Biologia odkrywcza: Zwiększa moc testowania hipotez poprzez ograniczanie błędu orientacji i wyjaśnianie architektury makrocząsteczkowej.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe rozkłady orientacji w celu przygotowania testów i standaryzacji metod.
- Analityka: Zapewnia wysokiej jakości mapy izotropowe do analizy porównawczej i optymalizacji warunków.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość przedkliniczną poprzez zapewnienie niezawodności danych strukturalnych dla zastosowań w dalszych etapach.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje uogólniony, kompatybilny z urządzeniami przepływ pracy do wielokrotnego zastosowania w różnych celach i projektach.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność strukturalną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje gromadzenie danych, zwiększa powtarzalność i jest kompatybilna z istniejącą infrastrukturą TEM.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji go/no-go i zmniejsza ryzyko na późnych etapach dzięki dostarczeniu solidnych dowodów strukturalnych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój strukturalnie zwalidowanych celów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie wyrównywania obrazów cryo-EM oraz przygotowania próbek.
- Wymagany jest dostęp do standardowych mikroskopów TEM oraz oprogramowania Leginon do zautomatyzowanej akwizycji danych.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów przygotowania siatek i gromadzenia danych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest adaptowalna do różnych próbek makromolekularnych i typów siatek.
- Należy monitorować i ograniczać ryzyko zbyt dużego zagęszczenia cząsteczek przy wysokich kątach nachylenia.
