Name: Rozszyfrowywanie organizacji chromatyny 3D w wysokiej rozdzielczości za pomocą Capture Hi-C (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Poznaj metodę Capture Hi-C do analizy organizacji chromatyny 3D z wysoką rozdzielczością. Technika ta umożliwia identyfikację domen TAD i interakcji dalekiego zasięgu w różnych typach komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca w laboratorium Heard została wsparta nagrodą Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych dla zaawansowanych badaczy (XPRESS - AdG671027). A.L. jest wspierany przez indywidualne stypendium Unii Europejskiej w ramach działań "Maria Skłodowska-Curie" (IF-838408). A.H. jest wspierany przez innowacyjną i interdyscyplinarną sieć ITN ChromDesign, w ramach umowy grantowej Marie Skłodowska-Curie 813327. Autorzy są wdzięczni Danielowi Ibrahimowi (MPI for Molecular Genetics, Berlin) za pomocne porady techniczne, platformie NGS w Instytucie Curie (Paryż) oraz Vladimirowi Benešowi i Genomics Core Facility w EMBL (Heidelberg) za wsparcie i pomoc.

Kai Hauschulz jest naukowcem zajmującym się zastosowaniami terenowymi w Agilent Technologies - Diagnostic and Genomics Group. Wszyscy pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

W tym miejscu opisujemy stosunkowo szybki i łatwy protokół Capture Hi-C, aby scharakteryzować organizację wyższego rzędu regionów genomowych o rozmiarach megabaz w rozdzielczości 5-10 kb. Capture Hi-C należy do rodziny technologii Capture-C, które mają na celu wzbogacenie docelowych interakcji chromatyny z matryc 3C lub Hi-C w całym genomie. Do tej pory zdecydowana większość aplikacji Capture-C została wykorzystana do mapowania kontaktów chromatyny stosunkowo małych elementów regulatorowych rozsianych po całym genomie. W pierwszym protokole Capture-C użyto wielu nakładających się na siebie sond biotynylowanych RNA do wychwycenia >400 wstępnie wybranych promotorów w bibliotekach 3C przygotowanych z komórek erytroidalnych31. Ta sama strategia została następnie ulepszona w New Generation (NG) i Nuclear Titrated (NuTi) Capture-C w celu uzyskania profili interakcji o wysokiej rozdzielczości >8 000 promotorów przy użyciu pojedynczych przynęt DNA 120 pz obejmujących pojedyncze miejsca restrykcyjne i dwie sekwencyjne rundy wychwytywania w celu maksymalizacji wzbogacenia informacyjnych fragmentów ligacji32,40. Strategie te doprowadziły do funkcjonalnej sekcji elementów działających cisowo w wielu różnych kontekstach, w tym rozwoju embrionalnego myszy, różnicowania komórek, inaktywacji chromosomu X i nieprawidłowej regulacji genów w stanach patologicznych 46,63,65,66,67,68,69,70,71.
W Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) >22 000 adnotowanych promotorów zawierających fragmenty restrykcyjne zostało ściągniętych z bibliotek Hi-C przez hybrydyzację pojedynczych 120-merowych biotynylowanych sond RNA na jednym lub obu końcach fragmentu restrykcyjnego34,72. Metoda ta pozwoliła na rozbiór międzyaktomii tysięcy promotorów w szybko rosnącej liczbie typów komórek, w tym mysich embrionalnych komórek macierzystych, komórek wątroby płodu i adipocytów 34,35,72,73, ale także ludzkich linii limfoblastoidalnych, krwiotwórczych komórek progenitorowych, keratynocytów naskórka i komórek pluripotencjalnych 37,74,75,76, Lokal mieszkalny 77.
W porównaniu z tymi technologiami wzbogacania celów, Capture Hi-C jest ukierunkowany na ciągłe regiony genomu aż do skali megabazowej, obejmując w ten sposób jeden lub więcej TAD i obejmując krajobrazy regulacyjne genów. Cały obszar zainteresowania musi być pokryty szeregiem biotynylowanych sond obejmujących każde miejsce restrykcji DpnII w obrębie celu. Hybrydyzacja biotynylowanej macierzy do matrycy 3C, jej późniejsze wychwytywanie na bazie streptawidyny i przetwarzanie w celu sekwencjonowania multipleksowanego odbywa się przy użyciu systemu wzbogacania celu do sekwencjonowania multipleksowanego Illumina Paired-End. Cały protokół jest szybki, ponieważ można go wykonać w ciągu 1 tygodnia od przygotowania biblioteki 3C do sekwencjonowania NGS i wymaga jedynie drobnych adaptacji i/lub rozwiązywania problemów specyficznych dla użytkownika.
Protokół zapewnia również korzyści w porównaniu z innymi metodami opartymi na 3C. Aby uzyskać mapy interakcji w rozdzielczości 5-10 kb, zsekwencjonowaliśmy 100-120 mln odczytów sparowanych końców. Dla porównania, użyliśmy tutaj zestawu danych Hi-C 571 M odczytów, aby osiągnąć rozdzielczość 20 kb64 (GSM2053973), a co najmniej 1 miliard odczytów byłby wymagany do osiągnięcia rozdzielczości 5 kb z Hi-C22 dla całego chromosomu.
Capture Hi-C zastosowany w niniejszym badaniu osiąga znacznie wyższą rozdzielczość niż poprzednio opublikowany 5C oparty na enzymie restrykcyjnym 6-bp47 (Tabela uzupełniająca 1). Co ważne, strategia mająca na celu wzbogacenie i amplifikację docelowych interakcji w 5C nie pozwala na analizę oddziaływań chromatyny specyficzną dla alleli. Wręcz przeciwnie, dane Capture Hi-C mogą być mapowane specyficznie dla alleli, co pozwala na analizę 3D krajobrazów strukturalnych par homologicznych chromosomów, na przykład w komórkach ludzkich lub w hybrydowych liniach komórkowych F1 pochodzących ze skrzyżowania genetycznie różnych szczepów myszy78. Aby wygenerować specyficzne dla alleli mapy interakcji Capture Hi-C w rozdzielczości 5 kb, zsekwencjonowaliśmy 150 bp odczytów sparowanych końców, aby zwiększyć pokrycie SNP. Podobne podejścia specyficzne dla alleli można zastosować do ludzkich linii komórkowych, dla których dostępna jest adnotacja SNP22.
Co ważne, chociaż Capture Hi-C ogólnie zapewnia wysoką rozdzielczość, jednocześnie poprawiając przystępność kosztów sekwencjonowania, produkcja dostosowanych do potrzeb klienta biotynylowanych oligonukleotydów ma wpływ na całkowity koszt tej metody. W związku z tym wybór najbardziej odpowiedniej metody 3C będzie się różnił dla różnych zastosowań i będzie zależał od pytania biologicznego, które jest poruszane, i wymaganej rozdzielczości, a także od wielkości obszaru zainteresowania. Inne opracowane protokoły Capture Hi-C mają kluczowe cechy wspólne z opisanym tutaj protokołem. Na przykład zastosowano strategię Capture Hi-C w celu scharakteryzowania regionów genomu o wielkości od ~50 kb do 1 Mb obejmujących niekodujące warianty związane z ryzykiem raka piersi i jelita grubego; w tym protokole regiony docelowe zostały ściągnięte z bibliotek Hi-C poprzez hybrydyzację przynęt 120-merowego RNA, układając regiony docelowe przy3-krotnym pokryciu 33,38,79. Podobnie, HYbrid Capture Hi-C (Hi-C2) został wykorzystany do celowania w interakcje w obszarach zainteresowania do 2 Mb80. W obu protokołach zastosowanie matrycy Hi-C wzbogaconej o fragmenty ligacji ściąganej biotyną zwiększyło odsetek całkowitych odczytów informacyjnych w porównaniu z naszym protokołem. Na przykład w zestawie danych Hi-C, którego użyliśmy do porównania64 (GSM2053973), odsetek prawidłowych par po usunięciu duplikatów jest 4,8-krotnie wyższy niż w przypadku prawidłowych par uzyskanych w Capture Hi-C, jak opisano na rysunku 3 i w tabeli uzupełniającej 1. Jednak kolejne ściąganie biotynylowanych ligowanych fragmentów i zhybrydyzowanych sond sprawia, że protokół jest znacznie bardziej złożony i czasochłonny, jednocześnie prawdopodobnie zmniejszając złożoność przechwyconego regionu.
Inną dostępną metodą wzbogacania szablonów 3C za pomocą sond kafelkowych jest Tiled-C, która została zastosowana do badania architektury chromatyny w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej podczas różnicowania erytroidalnego myszy43. W Tiled-C panel biotynylowanych sond o długości 70 pz jest używany do wzbogacania kontaktów w dużych regionach w dwóch kolejnych rundach przechwytywania w celu wygenerowania map ukierunkowanych interakcji o bardzo wysokiej rozdzielczości43,81. Podwójne wzbogacenie przechwytywania sprawia również, że protokół jest dłuższy i bardziej złożony w porównaniu do Capture Hi-C. Jednak w przeciwieństwie do strategii Capture-C ukierunkowanych na pojedyncze miejsca z ograniczeniami, w Tiled-C druga runda przechwytywania nie wydaje się znacząco zwiększać skuteczności przechwytywania, a zatem prawdopodobnie można ją pominąć43. Wreszcie, podobne podejście do kafelkowania oparte na tej samej strategii wzbogacania docelowego, które zastosowano w tym badaniu, zastosowano do rozbioru krajobrazów regulacyjnych obejmujących warianty strukturalne opisane u pacjentów z wrodzonymi wadami rozwojowymi i przeprojektowane u myszy transgenicznych 41,42. W tym przypadku układ kafelkowy sond został zaprojektowany na całej powierzchni docelowej, a nie w pobliżu miejsc ograniczeń DpnII41. Niemniej jednak praca ta była przełomowa w podkreślaniu wrażliwości i mocy tej strategii w celu osiągnięcia charakterystyki dużych regionów genomu w wysokiej rozdzielczości w różnych kontekstach 41,42,48.
Podsumowując, opisany tutaj protokół stanowi łatwą, solidną i potężną strategię charakteryzowania 3D w wysokiej rozdzielczości dowolnych regionów genomu będących przedmiotem zainteresowania. Zastosowanie tego podejścia do różnych systemów modelowych, typów komórek, regulowanych rozwojowo krajobrazów chromatyny i regulacji genów w zdrowych i patologicznych warunkach prawdopodobnie ułatwi nam zrozumienie wzajemnych oddziaływań i przyczynowości między topologią genomu a regulacją genów, co jest jednym z podstawowych otwartych pytań w dziedzinie epigenetyki. Co więcej, zastosowanie Capture Hi-C do mapowania interakcji dalekiego zasięgu i fałdowania chromatyny wyższego rzędu wariantów ryzyka zidentyfikowanych w badaniach GWAS może ujawnić funkcjonalne znaczenie niekodujących loci genomowych związanych z chorobami ludzkimi w różnych kontekstach, dostarczając tym samym nowych informacji na temat procesów potencjalnie leżących u podstaw patogenezy.

Liniowy genom zawiera wszystkie informacje niezbędne do tego, aby organizm mógł przejść rozwój embrionalny i przetrwać przez całe dorosłe życie. Jednak instruowanie genetycznie identycznych komórek, aby wykonywały różne funkcje, ma fundamentalne znaczenie dla dokładnego kontrolowania, które informacje są używane w określonych kontekstach, w tym w różnych tkankach i/lub etapach rozwoju. Uważa się, że trójwymiarowa organizacja genomu uczestniczy w tej dokładnej czasoprzestrzennej regulacji aktywności genów poprzez ułatwianie lub zapobieganie fizycznej interakcji między elementami regulatorowymi, które mogą być oddzielone przez kilkaset kilozasad w genomie liniowym (dla recenzji1,2,3). W ciągu ostatnich 20 lat nasza wiedza na temat wzajemnych zależności między fałdowaniem genomu a aktywnością gwałtownie wzrosła, głównie dzięki rozwojowi technologii wychwytywania konformacji chromosomów (3C) (dla przeglądu4,5,6,7). Metody te mierzą częstotliwość interakcji między dowolnymi regionami genomu i opierają się na ligacji sekwencji DNA, które znajdują się w bliskiej odległości 3D w jądrze. Najpopularniejsze protokoły 3C rozpoczynają się od utrwalenia populacji komórek za pomocą środka sieciującego, takiego jak formaldehyd. Usieciowana chromatyna jest następnie trawiona enzymem restrykcyjnym, chociaż zastosowano również trawienie MNazą8,9. Po trawieniu wolne końce DNA znajdujące się w bliskiej odległości przestrzennej są ponownie ligowane, a sieciowanie jest odwrócone. Ten krok daje początek "bibliotece" lub "szablonowi" 3C, mieszanej puli fragmentów hybrydowych, w których sekwencje, które znajdowały się w 3D blisko jądra, mają większe szanse na ligację w tym samym fragmencie DNA. Kwantyfikacja tych hybrydowych fragmentów umożliwia wnioskowanie o konformacji 3D regionów genomu, które znajdują się tysiące par zasad w genomie liniowym, ale mogą wchodzić w interakcje w przestrzeni 3D.
Wiele różnych podejść zostało opracowanych do scharakteryzowania biblioteki 3C, różniąc się zarówno pod względem tego, które podzbiory fragmentów ligacji są analizowane, jak i technologii używanej do ich dalszej kwantyfikacji. Oryginalny protokół 3C opierał się na wyborze dwóch regionów zainteresowania i ilościowym określeniu częstotliwości ich interakcji "jeden na jeden" za pomocą PCR10,11. Podejście 4C (wychwytywanie konformacji chromosomu kołowego) mierzy interakcje między pojedynczym locus zainteresowania (tj. "punktem widzenia") a resztą genomu ("jeden kontra wszystko")12,13,14. W 4C biblioteka 3C przechodzi drugą rundę trawienia i ponownej ligacji w celu wygenerowania małych kolistych cząsteczek DNA, które są amplifikowane PCR przez startery specyficzne dla punktu widzenia15. 5C (chromosome conformation capture carbon copy) umożliwia charakteryzację interakcji 3D w większych obszarach zainteresowania, dostarczając wglądu w fałdowanie chromatyny wyższego rzędu w tym regionie ("wiele kontra wiele")16. W 5C biblioteka 3C jest hybrydyzowana do puli oligonukleotydów nakładających się na miejsca restrykcyjne, które mogą być następnie amplifikowane przez multipleksowy PCR z uniwersalnymi starterami15. Zarówno w 4C, jak i 5C, informacyjne fragmenty DNA były początkowo oznaczane ilościowo za pomocą mikromacierzy, a następnie za pomocą sekwencjonowania nowej generacji (NGS)17,18,19. Strategie te charakteryzują docelowe obszary zainteresowania, ale nie mogą być stosowane do mapowania interakcji w całym genomie. Ten ostatni cel został osiągnięty dzięki Hi-C, wysokoprzepustowej strategii opartej na 3C, w której masowo równoległe sekwencjonowanie matrycy 3C pozwala na bezstronną charakterystykę fałdowania chromatyny na poziomie całego genomu ("wszyscy kontra wszyscy")20. Protokół Hi-C obejmuje włączenie biotynylowanej reszty na końcach strawionych fragmentów, po czym następuje ściąganie fragmentów ligacji za pomocą kulek streptawidyny w celu zwiększenia odzysku podwiązanych fragmentów20.
Hi-C ujawniło, że genomy ssaków są strukturalnie zorganizowane w wielu skalach w jądrze 3D. W skali megapodstawowej genom jest podzielony na regiony aktywnej i nieaktywnej chromatyny, odpowiednio przedziały A i B20,21. Istnienie dalszych podprzedziałów reprezentowanych przez różne stany chromatyny i aktywności zostało również następnie wykazane22. W wyższej rozdzielczości genom jest dalej dzielony na sub-megabazy, samooddziałujące domeny zwane topologicznie asocjującymi domenami (TAD), po raz pierwszy ujawnione przez analizę Hi-C i 5C genomów człowieka i myszy23,24. W przeciwieństwie do przedziałów, które różnią się w sposób specyficzny dla tkanki, TAD mają tendencję do bycia stałymi (chociaż istnieje wiele wyjątków). Co ważne, granice TAD są zachowane we wszystkich gatunkach25. W komórkach ssaków TAD często obejmują geny o tym samym krajobrazie regulacyjnym i wykazano, że reprezentują ramy strukturalne, które ułatwiają koregulację genów, jednocześnie ograniczając interakcje z sąsiednimi domenami regulacyjnymi (dla przeglądu3,26,27,28). Ponadto, w obrębie TAD, interakcje spowodowane miejscami CTCF u podstawy pętli ekstrudowanych kohezyny mogą zwiększać prawdopodobieństwo interakcji promotor-wzmacniacz lub wzmacniacz-wzmacniacz (dla przeglądu29).
W Hi-C, kompartmenty i TADy mogą być wykrywane w rozdzielczości od 1 Mb do 40 kb, ale wyższą rozdzielczość można osiągnąć do scharakteryzowania kontaktów o mniejszej skali, takich jak pętle interakcji między elementami dystalnymi w skali 5-10 kb. Jednak zwiększenie rozdzielczości, aby móc skutecznie wykrywać takie pętle za pomocą HiC, wymaga znacznego zwiększenia głębokości sekwencjonowania, a tym samym kosztów sekwencjonowania. Sytuacja ta nasila się, jeśli analiza musi być specyficzna dla alleli. Rzeczywiście, X-krotny wzrost rozdzielczości wymaga X2-krotnego zwiększenia głębokości sekwencjonowania, co oznacza, że podejścia o wysokiej rozdzielczości i specyficzne dla alleli całego genomu mogą być zbyt drogie30.
Aby poprawić opłacalność i przystępność cenową przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej rozdzielczości, docelowe obszary zainteresowania mogą być fizycznie ściągane z bibliotek 3C lub Hi-C całego genomu po ich hybrydyzacji z komplementarnymi sondami oligonukleotydowymi znakowanymi biotyną przed sekwencjonowaniem dalej. Te strategie wzbogacania celu są określane jako metody Capture-C i umożliwiają badanie interakcji setek docelowych loci rozsianych po całym genomie (tj. Promoter Capture (PC) Hi-C; Przechwytywanie nowej generacji (NG) C; Przechwytywanie niskiego sygnału wejściowego (LI)-C; Wychwytywanie metodą miareczkowania jądrowego (NuTi)-C; Tri-C)31,32,33,34,35,36,37,38,39,40, lub w regionach obejmujących do kilku megabaz (np. Capture HiC; HYbrid Capture Hi-C (Hi-C2); Tiled-C)41,42,43. Dwa aspekty mogą się różnić w metodach opartych na wychwytywaniu: (1) charakter i konstrukcja biotynylowanych oligonukleotydów (tj. RNA lub DNA, pojedyncze oligonukleotydy wychwytujące rozproszone cele genomowe lub wiele oligonukleotydów układających się w obszar zainteresowania); oraz (2) szablon, który jest używany do ściągania celów, które mogą być biblioteką 3C lub Hi-C, przy czym ta ostatnia składa się z biotynylowanych fragmentów restrykcyjnych pobranych z biblioteki 3C.
Tutaj opisany jest protokół Capture Hi-C oparty na wzbogacaniu kontaktów docelowych z biblioteki 3C. Protokół opiera się na zaprojektowaniu specjalnie dostosowanej macierzy kafelków biotynylowanych sond RNA i może być wykonany w ciągu 1 tygodnia od przygotowania biblioteki 3C do sekwencjonowania NGS. Protokół jest szybki, prosty i pozwala scharakteryzować organizację 3D wyższego rzędu obszarów zainteresowania o rozmiarach megabaz w rozdzielczości 5 kb, jednocześnie poprawiając efektywność czasową i przystępność cenową w porównaniu z innymi metodami 3C. Protokół Capture Hi-C został zastosowany do głównego locus regulatorowego inaktywacji chromosomu X (XCI), centrum inaktywacji chromosomu X (Xic), w którym znajduje się niekodujący RNA Xist. Xic był wcześniej przedmiotem obszernych analiz strukturalnych i funkcjonalnych (dla review44,45). U ssaków XCI kompensuje dawkę genów sprzężonych z chromosomem X między samicami (XX) i samcami (XY) i obejmuje transkrypcyjne wyciszenie prawie całego jednego z dwóch chromosomów X w komórkach żeńskich. Xic stanowi potężny, złoty standard locus do badań nad topologią genomu 3D i wzajemnym oddziaływaniem z regulacją genów44. Analiza 5C Xic w embrionalnych komórkach macierzystych myszy (mESC) doprowadziła do odkrycia i nazwania TAD, dostarczając pierwszych informacji na temat funkcjonalnego znaczenia partycjonowania topologicznego i koregulacji genów24. Następnie wykazano, że organizacja topologiczna Xic jest krytycznie zaangażowana w odpowiedni czas rozwoju regulacji w górę Xist i XCI46, a nieoczekiwane elementy cis-regulatorowe, które mogą wpływać na aktywność genów w obrębie i między TAD, zostały również niedawno odkryte w Xic47,48,49. Zastosowanie Capture Hi-C do 3 Mb mysiego chromosomu X obejmującego Xic demonstruje moc tego podejścia w analizie fałdowania chromatyny na dużą skalę w wysokiej rozdzielczości. Zapewniony jest szczegółowy i łatwy do naśladowania protokół, począwszy od zaprojektowania zestawu biotynylowanych sond w każdym miejscu restrykcji DpnII w regionie zainteresowania, po generowanie biblioteki 3C obejmującej cały genom, hybrydyzację i przechwytywanie kontaktów docelowych oraz dalszą analizę danych. Uwzględniono również przegląd odpowiednich kontroli jakości i oczekiwanych wyników, a także omówiono zarówno mocne strony, jak i ograniczenia tego podejścia w świetle podobnych istniejących metod.

<table><tbody><tr><td>10x PBS pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>37% (vol/vol) roztwór paraformaldehydu</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15686</td><td>jednorazowe szklane fiolki; nie używać ponownie</td></tr><tr><td>50 ml PP stożkowa rurka</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma</td><td>A9539-500g</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizator</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>Skrobaki do komórek - Uchwyt 25 cm i ostrze 3,0 cm</td><td>Falcon</td><td>353089</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Axon Medchem BV</td><td>Axon 1386</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini, koktajl inhibitorów proteazy (bez EDTA)</td><td>Szkiełka komory do</td> liczenia komórek Merck <td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Hrabina II FL</td><td>Invitrogen</td><td>ZGEXSCCOUNTESS2FL</td><td>Automated licznik komórek</td></tr><tr><td>Covaris S2</td><td>Covaris</td><td>500217</td><td>Sonicator</td></tr><tr><td>DNA LoBind probówka, 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td></td></tr><tr><td>DpnII (50000 jednostek/ml)</td><td>New England Biolabs</td><td>R0543M</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle (DMEM)</td><td>Merck</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (100%)</td><td>Merck</td><td>1.00983.2500</td><td></td></tr><tr><td>Płód Surowica bydlęca (FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>żelatyna ze skóry świni</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus Drabinka DNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0313</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9516</td><td>Coprecipitant</td></tr><tr><td>Chipsy Bioanlayzer o wysokiej czułości</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Duże chłodzenie Wirówka 5920 R</td><td>Eppendorf</td><td>5948000018</td><td></td></tr><tr><td>czynnik hamujący białaczkę (LIF)</td><td>Merck</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>Liquiport</td><td>KNF</td><td>NF300</td><td>Stołowy system aspiracji</td></tr><tr><td>Niskowiążące końcówki filtrujące</td><td>Biozym</td><td>VT0260U, VT0240, VT0220, VT0200U</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy białologii molekularnej</td><td>Merck</td><td>W3500-6x500ML</td><td></td></tr><tr><td>Następny sekwencja 500</td><td>Illumina</td><td>SY-415-1001</td><td></td></tr><tr><td>Next Seq 500 High Output v2 Kit (300 cykli)</td><td>Illumina</td><td>FC-404-2004</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 Substytut (NP40)</td><td>Merck</td><td>11332473001</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Axon Medchem BV</td><td>Axon 1408</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy (bez EDTA)</td><td>Merck</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K - rekombinowany, Klasa PCR (20 mg / ml)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q32871</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do testów kubitowych</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Qubit dsDNA o wysokiej czułości</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>RNaza A (10 mg / ml)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu pH 5,2 (3M)</td><td>Szybki</td> koncentrator próżniowy Merck <td>S7899</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>EP5305000100-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPureXP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Koraliki SPRI</td></tr><tr><td>SureSelect Target Enrichment Box 1</td><td>Agilent</td><td>5190-8645</td><td></td></tr><tr><td>SureSelect Target Enrichment Kit ILM Indexing Hyb Module Box 2</td><td>Agilent</td><td>5190-4455</td><td></td></tr><tr><td>SureSelect XT Zestaw przygotowawczy do biblioteki ILM</td><td>Agilent</td><td>5500-0132</td><td></td></tr><tr><td>T4 ligaza (30 sztuk/&mikro; L)</td>Wirówka stołowa <td>Thermo Scientific</td><td>EL0013</td><td></td></tr><tr><td>5427 R</td><td>Eppendorf</td><td>5409000012</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100 (500 mL)</td><td>Merck</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Thermo Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Glycine</td><td>Thermo Scientific</td><td>15527013</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Thermo Scientific</td><td>31350010</td><td></td></tr></tbody></table>

rozszyfrowywanie organizacji chromatyny 3d w wysokiej rozdzielczości za pomocą capture hi-c

Deciphering High-Resolution 3D Chromatin Organization via Capture Hi-C

Przestrzenna organizacja genomu przyczynia się do jego funkcji i regulacji w wielu kontekstach, w tym transkrypcji, replikacji, rekombinacji i naprawy. Zrozumienie dokładnego związku przyczynowo-skutkowego między topologią a funkcją genomu ma zatem kluczowe znaczenie i jest coraz częściej przedmiotem intensywnych badań. Technologie wychwytywania konformacji chromosomów (3C) pozwalają na wnioskowanie o strukturze 3D chromatyny poprzez pomiar częstotliwości interakcji między dowolnym regionem genomu. Tutaj opisujemy szybki i prosty protokół do wykonywania Capture Hi-C, metody wzbogacania celów opartej na 3C, która charakteryzuje specyficzną dla alleli organizację 3D celów genomowych o dużych rozmiarach w wysokiej rozdzielczości. W Capture Hi-C regiony docelowe są wychwytywane przez szereg biotynylowanych sond przed sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości. W ten sposób uzyskuje się wyższą rozdzielczość i swoistość alleli przy jednoczesnej poprawie efektywności czasowej i przystępności cenowej technologii. Aby zademonstrować jego mocne strony, protokół Capture Hi-C zastosowano do mysiego centrum inaktywacji chromosomu X (Xic), głównego miejsca regulatorowego inaktywacji chromosomu X (XCI).

Opisany protokół Capture Hi-C opiera się na przygotowaniu matrycy 3C w skali całego genomu z wykorzystaniem enzymu tnącego co cztery zasady (DpnII). Następnie wzbogacenie fragmentów ligacji w obrębie interesującego regionu genomowego uzyskuje się poprzez hybrydyzację zestawu płytek sondujących RNA (tiling RNA probes) i ich wychwyt z użyciem streptawidyny, zgodnie z systemem wzbogacania celowanego zastosowanym w niniejszym badaniu (Rysunek 1). Wybrano biotynilowane sondy RNA, ponieważ wykazują one silniejsze powinowactwo wiązania do swoich celów w porównaniu z sondami DNA52,60Przechwycone biblioteki są następnie indeksowane i łączone w celu przeprowadzenia multipleksowego sekwencjonowania wysokoprzepustowego. Dane Capture Hi-C mogą być wizualizowane jako wysokorozdzielcze mapy oddziaływań Hi-C, ale także jako mapy kontaktów z pojedynczym punktem widzenia (typu 4C), aby specyficznie zobrazować oddziaływania mniejszych sekwencji, takich jak promotory lub wzmacniacze, w obrębie całego przechwyconego regionu. Schemat procedury przedstawiono w Rycina 4Kontrolę jakości przed sekwencjonowaniem przedstawiono w Rycina 2 oraz obejmuje ocenę prawidłowego trawienia i religacji matrycy 3C oraz jej efektywnego ścinania i oczyszczania na poszczególnych etapach protokołu. Oczekuje się, że ścinane DNA matrycy 3C będzie migrować w zakresie od 150 do 700 bp i nie wystąpi wzbogacenie fragmentów &gt;Należy wykryć fragment o wielkości 2 kb. W kolejnych etapach przeprowadza się kilka procedur oczyszczania DNA i selekcji wielkości z użyciem kulek magnetycznych — najpierw po fragmentacji, a następnie po reakcjach PCR przed i po wzbogaceniu (pre-capture i post-capture). Oczyszczone biblioteki wykazują wyraźny profil wzbogacenia fragmentów, co można zwizualizować za pomocą bioanalizatora DNA o wysokiej czułości (Rycina 2). Średnia wielkość fragmentów zwiększa się w trakcie przygotowywania biblioteki na skutek ligacji adapterów, primerów sekwencyjnych i indeksujących. Po sekwencjonowaniu przeprowadzono kontrolę jakości poprzez Hi-C Pro oraz przedstawiono w Rycina 3Zaproponowano wiele różnych aplikacji bioinformatycznych do przetwarzania i analizy danych typu 3C. Wśród nich rurociąg HiC-Pro jest jednym z najpopularniejszych rozwiązań, umożliwiającym przetwarzanie surowych danych sekwencjonowania aż do końcowych map kontaktów w różnych rozdzielczościach.55HiC-Pro wykorzystuje dwuetapową strategię mapowania do dopasowania odczytów sekwencjonowania do genomu referencyjnego. Następnie produkty 3C są rekonstruowane i filtrowane w celu usunięcia nieinformacyjnych par kontaktów oraz wygenerowania map kontaktów. Ponadto narzędzie to umożliwia wykorzystanie listy znanych polimorfizmów do przeprowadzenia analizy allelocentrycznej i rozdzielenia kontaktów pochodzących od dwóch alleli rodzicielskich na osobne mapy kontaktów. Niedawno HiC-Pro został włączony i rozszerzony w ramach struktury nf-core (nf-core-hic), zapewniając wysoce skalowalny i powtarzalny potok analiz tworzony przez społeczność.61,62.
Aby uchwycić mysie Xic, zaprojektowano zestaw 28 913 sond RNA pokrywających 3 Mb chromosomu X. Obszar ten obejmuje kluczowy element procesu XCI, długi niekodujący gen Xist oraz jego znany obszar regulacyjny o wielkości ~800 kb (Rysunek 5). Ten region o wielkości ~800 kb jest podzielony na dwie domeny TAD: jedną zawierającą promotor Xist oraz jego znane pozytywne regulatory (tj. niekodujące transkrypty Ftx, Jpx i Xert oraz gen kodujący białko Rnf12) oraz sąsiednią domenę TAD obejmującą negatywne regulatory cis Xist (tj. jego transkrypt antysensowny Tsix, element wzmacniający Xite oraz niekodujący transkrypt Linx) (przegląd literatury44,45).
Zastosowanie opisanego protokołu Capture Hi-C do Xic pozwoliło na uzyskanie organizacji topologicznej tego locus z niespotykaną dotąd rozdzielczością (Rysunek 6 oraz Rysunek 7). Jest to szczególnie widoczne przy porównaniu profilu Capture Hi-C z wcześniej opublikowanymi profilami 5C47 (Rysunek 6 oraz Rysunek 7; Tabela uzupełniająca 1) oraz Hi-C61 (Rysunek 6 oraz Rysunek 7; Tabela uzupełniająca 1). Na przykład struktury sub-TAD są bardziej wyraźne — TAD zawierający promotor Xist (Xist-TAD) jest wyraźnie podzielony na dwie mniejsze domeny (Rysunek 6A, niebieska strzałka). Wcześniej można było to jedynie wizualnie „przypuszczać” na podstawie profilu 5C (Rysunek 6B), mimo wykrycia granicy w tym regionie za pomocą algorytmu insulation score. Podobnie rozdzielczość profilu Capture Hi-C pozwala na identyfikację dwóch mniejszych domen w sąsiednim TAD (Rysunek 6A, B), który zawiera promotor locus Tsix (Tsix-TAD); nie udało się tego wcześniej osiągnąć za pomocą 5C (Rysunek 6B). Warto zauważyć, że granice topologiczne wyznaczone przez insulation score z danych Capture Hi-C i 5C są zazwyczaj wykrywane w nieco innych lokalizacjach i z różną siłą względną.
Co więcej, z danych Capture Hi-C wyraźnie widoczne są inne struktury sub-TAD, takie jak pętle kontaktowe, na przykład pętla między Xist a Ftx (Rysunek 7A), zidentyfikowana wcześniej metodą Capture-C63, oraz pętla między Xist a Xert (Rysunek 7B), niedawno zidentyfikowana przy użyciu podobnego protokołu Capture Hi-C48. Dzięki zwiększonej rozdzielczości profili Capture Hi-C można również dokładniej zmapować inne kontakty, takie jak te tworzące znane punkty zapalne (hotspots) kontaktów w obrębie Tsix-TAD pomiędzy locusami Linx, Chic1 i Xite (Rysunek 7A).
W porównaniu z danymi Hi-C przedstawionymi na Rysunku 7, metoda Capture Hi-C pozwoliła na czterokrotny wzrost rozdzielczości, wymagając jednocześnie jedynie jednej czwartej głębokości sekwencjonowania (tj. 126 M odczytów w porównaniu do 571 M) (Tabela uzupełniająca 1). Ten wzrost rozdzielczości umożliwia wykrycie subTAD-ów oraz interakcji pętlowych, których nie można było wykryć za pomocą Hi-C przy głębokości sekwencjonowania przedstawionej na Rysunku 6 oraz Rysunku 7. Opisany protokół Capture Hi-C pozwala zatem na znacznie bardziej szczególną charakterystykę o wysokiej rozdzielczości dużego, interesującego regionu genomowego w porównaniu do poprzednich podejść.
<img alt="Schemat mapowania chromosomowego; miejsce restrykcyjne DpnII; sondy genowe; analiza sekwencji; szczegóły ChrX." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64166/64166fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Projektowanie sond. Schematyczna reprezentacja strategii wykorzystanej do projektowania sond. Wybrano regiony o długości 300 bp powyżej i poniżej każdego miejsca restrykcyjnego DpnII w obrębie 3 Mb docelowego obszaru, które następnie pokryto nakładającymi się biotynowanymi sondami RNA. Przedstawiono jeden z tych wybranych regionów, chrX: 102,474,805-102,475,500. W każdej sondzie dopuszczono maksymalnie 40 zasad sekwencji repetytywnych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64166/64166fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Żel elektroforetyczny z rozdziałem fragmentów DNA; wykresy fluorescencji dla analizy biblioteki 3C." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64166/64166fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Kontrole jakości przed sekwencjonowaniem w metodzie Capture Hi-C. (A) Reprezentatywny przykład kontroli jakości matrycy 3C. Na 1% żel agarozowy naniesiono 200 ng DNA. Ścieżka 1: drabinka 1 kb. Ścieżka 2: Niestrawiona, sieciowana i nienaruszona chromatyna przebiega jako ostry prążek przy &gt;10 kb. Ścieżka 3: Sieciowana chromatyna trawiona enzymem DpnII przebiega jako rozmycie (smear) o rozmiarze od 1 kb do 3 kb. Ścieżka 4: Końcowa biblioteka lub matryca 3C; wolne końce strawionych, sieciowanych fragmentów DNA zostały religowane. Rozmycie DNA o niższej masie cząsteczkowej jest prawie niewykrywalne, a produkt ligacji jest wykrywany jako prążek &gt;10 kb. (B) Reprezentatywne przykłady profili DNA z bioanalizatora o wysokiej czułości. Górna lewa część: pomyślnie pofragmentowana biblioteka 3C wykazująca rozkład rozmiaru fragmentów między 150 bp a 700 bp. Górna prawa część: niezadowalająca pofragmentowana biblioteka 3C. Niepofragmentowane DNA jest wykrywane jako szerokie wzbogacenie fragmentów &gt;2 kb. (C) Dolna lewa część: próbka pofragmentowanego DNA po selekcji rozmiaru strony lewej w stosunku 1:1 przy użyciu kulek SPRI. Wzbogacone są fragmenty o rozmiarze ~300 bp. Dolna środkowa część: profil PCR przed przechwytywaniem po ligacji adapterów do końców parzystych zgodnie z protokołem producenta. Dolna prawa część: końcowa biblioteka Capture Hi-C zawierająca adaptery, primery do sekwencjonowania i indeksowania dla sekwencjonowania multipleksowego. Skróty: bp = pary zasad, FU = dowolna jednostka fluorescencji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64166/64166fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy analizy statystycznej HiC-Pro; mapowanie, parowanie, filtrowanie, dane dotyczące kontaktów, alleli i wychwytu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64166/64166fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Kontrola jakości po sekwencjonowaniu Capture Hi-C z wykorzystaniem HiC-Pro. (A) Przykład współczynnika mapowania w genomie referencyjnym dla pierwszego odczytu z par sekwencjonowania. Jasnoniebieska frakcja reprezentuje odczyty wyrównane przez HiC-Pro obejmujące miejsce ligacji. Metryka ta może zatem służyć do walidacji eksperymentalnego etapu ligacji. (B) Po wyrównaniu par sekwencjonowania w genomie, do analizy zachowywane są tylko jednoznacznie wyrównane pary odczytów. (C) Pary nieważne (na czerwono), takie jak wolne końce (dangling-end), samokolizje (self-circle) lub religacje, są odrzucane z analizy. Frakcja par ważnych jest dobrym wskaźnikiem wydajności ligacji i pull-down. (D) Pary ważne mogą być dalej podzielone na kontakty wewnątrz- i międzychromosomalne oraz krótkie i długie zasięgi. Zduplikowane pary odczytów, które prawdopodobnie reprezentują artefakty PCR, są odrzucane z analizy. (E) W analizie specyficznej dla alleli HiC-Pro raportuje liczbę odczytów allelicznych wspieranych przez jeden lub dwa odczyty z pary dla każdego genomu rodzicielskiego (tj. C57BL/6J x CASTEi/J). Oczekuje się podobnej frakcji odczytów przypisanych do allela matczynego i ojcowskiego. (F) Na koniec, do budowy map kontaktów wybierane są tylko ważne pary nakładające się na region wychwytu. Pary typu capture-capture reprezentują kontakty w obrębie regionu docelowego, natomiast pary capture-reporter obejmują interakcje między regionem docelowym a regionem poza docelowym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64166/64166fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat workflowu przechwytywania konformacji chromatyny: sieciowanie, trawienie DpnII, sekwencjonowanie, analiza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64166/64166fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Workflow protokołu Capture Hi-C. Schematyczne przedstawienie poszczególnych etapów protokołu. W celu wytworzenia matrycy 3C dla całego genomu, chromatynę najpierw sieciuje się formaldehydem, a następnie trawi enzymem restrykcyjnym DpnII. Wolne końce DNA są następnie religowane, sieciowanie jest odwracane, a DNA oczyszczane. Aby wzbogacić fragmenty obejmujące region docelowy, zestaw biotynylowanych sond RNA jest hybrydyzowany z matrycą 3C i przechwytywany za pomocą pull-down z udziałem streptawidyny. Biblioteki Capture są przetwarzane w celu sekwencjonowania multipleksowego, a prawidłowe fragmenty ligacji są kwantyfikowane, aby wywnioskować częstotliwość kontaktów chromatyny w obrębie celu, co jest wizualizowane w postaci map interakcji o wysokiej rozdzielczości. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64166/64166fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat chromosomu X myszy; geny i lokalizacje; od centromeru do telomeru; mapowanie genetyczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64166/64166fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Przegląd regionu obejmującego Xic na chromosomie X myszy. Schematyczne przedstawienie chromosomu X myszy oraz powiększenie uchwyconego regionu o wielkości 3 Mb (ChrX: 102 475 000-105 475 000). Region docelowy obejmuje ok. 800 kb DNA odpowiadających Xic, głównemu locus regulacyjnemu XCI. Xic zawiera długie niekodujące geny, w tym Xist, kluczowy element XCI, oraz jego krajobraz regulacyjny. Pozytywne regulatory Xist zaznaczono na zielono, a negatywne regulatory na fioletowo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64166/64166fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wychwytywanie chromatyny: Hi-C, 5C, schematy oddziaływań genomowych, siła granicy, wskaźnik izolacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64166/64166fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Mapy oddziaływań Capture Hi-C, 5C i Hi-C w obrębie wychwyconego regionu o wielkości 3 Mb. (A) Mapa oddziaływań Capture Hi-C celu o wielkości 3 Mb obejmującego mysi region Xic przy rozdzielczości 10 kb (niniejsze badanie). (B) Mapa oddziaływań 5C tego samego regionu celu co w A przy rozdzielczości 6 kb (dane przetworzone ponownie z47). Regiony powtarzalne, niewłączone do analiz, są zamaskowane kolorem białym. Dane 5C wymagają oddzielnego przetwarzania bioinformatycznego (patrz47). Po oczyszczeniu i dopasowaniu, mapy 5C w rozdzielczości starterów są grupowane za pomocą ruchomej mediany (okno = 30 kb, krok = 5), aby uzyskać końcową rozdzielczość 6 kb. (C) Mapa oddziaływań Hi-C tego samego regionu genomowego co w A i B przy rozdzielczości 40 kb (dane przetworzone ponownie z64). Wszystkie mapy oddziaływań zostały wygenerowane z mysich komórek ESC. Wskaźnik izolacji obliczono za pomocą cooltools i przedstawiono w formie histogramów z minimami izolacji na granicach TAD. Granice TAD są przedstawione jako linie pionowe poniżej mapy. Wysokość każdej linii wskazuje siłę granicy. Geny są przedstawione jako strzałki wskazujące kierunek transkrypcji. Granice sub-TAD, które są wykrywane wyłącznie lub dokładniej na mapach Capture Hi-C, są oznaczone purpurowymi i niebieskimi grotami strzałek odpowiednio dla sub-TAD w obrębie TAD-ów Tsix i Xist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64166/64166fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mapy ciepła interakcji chromatyny; Capture Hi-C, 5C, schemat; siła granicy, wynik izolacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64166/64166fig07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Mapy interakcji Capture Hi-C, 5C i Hi-C na odcinku 1 Mb w obrębie uchwyconego regionu. (A) Mapa interakcji Capture Hi-C regionu genomowego 1 Mb obejmującego mysie Xic przy rozdzielczości 5 kb (niniejsze badanie). (B) Mapa interakcji 5C tego samego regionu genomowego co w A przy rozdzielczości 6 kb (dane przetworzone ponownie z47). Regiony powtarzalne, niewłączone do analiz, są zamaskowane kolorem białym. Należy zauważyć, że dane 5C wymagają oddzielnego przetwarzania bioinformatycznego (patrz47). Po czyszczeniu i dopasowaniu, mapy 5C w rozdzielczości starterów są grupowane za pomocą ruchomej mediany (okno = 30 kb, krok = 5), aby osiągnąć końcową rozdzielczość 6 kb. (C) Mapa interakcji Hi-C tego samego regionu genomowego co w A i B przy rozdzielczości 20 kb (dane przetworzone ponownie z64). Wszystkie mapy interakcji zostały wygenerowane z mESCs. Wynik izolacji został obliczony przy użyciu cooltools i jest przedstawiony w formie histogramów z minimami izolacji na granicach TAD. Granice TAD są pokazane jako linie pionowe pod mapą. Wysokość każdej linii wskazuje siłę granicy. Geny są przedstawione jako strzałki wskazujące kierunek transkrypcji. Pętle kontaktowe, które zostały wykryte wyłącznie lub dokładniej w Capture Hi-C, są oznaczone magenta i niebieskimi gwiazdkami odpowiednio dla pętli w TAD-ach Tsix i Xist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64166/64166fig07large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Statystyki po sekwencjonowaniu dla zbiorów danych użytych w niniejszym manuskrypcie: Capture Hi-C (niniejsza praca), Hi-C64 oraz 5C47. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64166/Supplementary%20Table%201-corrected.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten protokół opisuje metodę Capture Hi-C używaną do charakteryzowania organizacji 3D docelowych regionów genomowych o rozmiarach mega w wysokiej rozdzielczości, w tym granic topologicznie asojacujących domen (TADs) i interakcji chromatyny dalekiego zasięgu między regulatorowymi i innymi elementami sekwencji DNA.

Rozszyfrowywanie organizacji chromatyny 3D w wysokiej rozdzielczości za pomocą Capture Hi-C

The spatial organization of the genome contributes to its function and regulation in many contexts, including transcription, replication, recombination, ...

Capture Hi-C pozwala na rozszyfrowanie organizacji chromatyny 3D w interesującym nas regionie genomowym o rozmiarach megazasad w wysokiej rozdzielczości. Dzięki Capture Hi-C uzyskuje się wyższą rozdzielczość i swoistość alleli, jednocześnie poprawiając efektywność czasową i przystępność cenową techniki. Zastosowanie Capture IC do różnych systemów modelowych, typów komórek i regulowanych rozwojowo krajobrazów chromatyny w warunkach zdrowotnych i patologicznych prawdopodobnie ułatwi nam zrozumienie wzajemnych zależności między topologią genomu a regulacją genów.Na początek tryftonizuj i policz komórki z płytki kontrolnej przygotowanej specjalnie do zliczania komórek za pomocą automatycznego licznika komórek. Uwzględnij barwienie żywotności, aby określić procent żywotnych komórek. Na podstawie tej liczby komórek oszacuj całkowitą liczbę komórek na płytce przygotowanej do sieciowania.Usuń pożywkę hodowlaną z płytek przygotowanych do sieciowania i zastąp ją roztworem utrwalającym. Utrwal na 10 minut w temperaturze pokojowej pod delikatnym mieszaniem na shakerze. Utrwaloną reakcję utrwalić przez dodanie 2,5 molowej glicyny PBS do końcowego stężenia 0,125 molowca.Dodaj 530 mikrolitrów 2,5 molowej glicyny PBS do 10 mililitrów w 10-centymetrowej płytce. Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając na shakerze. Przenieś płytki do lodu i inkubuj przez dodatkowe 15 minut na lodzie, delikatnie mieszając na shakerze.Usunąć roztwór utrwalający z komórek, przelewając go do zlewki, aby zapewnić szybką obsługę. Szybko przepłucz 10-centymetrową płytkę dwa razy pięcioma mililitrami zimnej 0,125 molowej glicyny PBS, aby zmyć zanieczyszczenia i martwe komórki. Usuń płyn z płytki, wlewając go do zlewki, aby zapewnić szybką obsługę.Dodaj pięć mililitrów zimnej 0,125 molowej glicyny PBS do 10-centymetrowej płytki. I szybko zeskrob komórki z płytki za pomocą plastikowego skrobaka do komórek. Przenieść zawiesinę komórkową do wstępnie schłodzonej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów za pomocą pipety serologicznej.Przepłukać płytkę dwukrotnie pięcioma mililitrami zimnej 0,125 molowej glicyny PBS i dodać zawiesinę komórkową do stożkowej probówki wirówkowej. Wiruj w temperaturze 480 G przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza. Usunąć supernatant przez zasysanie za pomocą laboratoryjnego systemu aspiracji.Ponownie zawiesić komórki i poddzielić 500 mikrolitrów zawiesiny komórek do obliczonej liczby 1,5 mililitra mikroprobówek wirówkowych. Wirować w dół 480 razy G przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza i przechowywać granulki suchych komórek w temperaturze 80 stopni Celsjusza. W celu lizy komórek rozmrozić zamrożone granulki na lodzie.Przygotuj 1,5 mililitra buforu do lizy w wodzie. Dodaj 600 mikrolitrów buforu do lizy na zimno i dobrze zawieś na lodzie. Wirować w temperaturze 2 655 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć supernatant za pomocą laboratoryjnego systemu aspiracji.Zawiesić w 100 mikrolitrach 0,5% SDS. Po inkubacji w temperaturze 62 stopni Celsjusza wirującej z prędkością 1400 obr./min przez 10 minut, dodaj 290 mikrolitrów wody plus 50 mikrolitrów 10% Triton X 100 i dobrze wymieszaj, unikając pęcherzyków powietrza. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wirowaniem z prędkością 1400 obr./min przez 10 minut przed dodaniem 50 mikrolitrów buforu probówkowego 10 X DPN i odwrócić probówkę do wymieszania.Weź 50 mikrolitrów niestrawionego DNA do kontroli jakości do osobnej probówki. Nie należy zapominać o pobraniu niestrawionej próbki kontrolnej. Do mineralizacji DPN2 dodaj 10 mikrolitrów DPN2 o wysokim stężeniu i wymieszaj, odwracając.Próbki i niestrawioną kontrolę inkubować w mieszalniku termicznym w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wirując z prędkością 1400 obrotów na minutę przez ponad cztery godziny. W celu ligacji i odwrócenia sieciowania należy pobrać 50 mikrolitrów ligowanego, strawionego DNA do kontroli jakości w osobnej probówce. Przechowuj niestrawione i niepodwiązane kontrole w temperaturze 20 stopni Celsjusza.Dodaj 800 mikrolitrów koktajlu ligacyjnego. Inkubować w temperaturze 16 stopni Celsjusza, wirując z prędkością 1000 obrotów na minutę przez noc. W celu oczyszczenia DNA przenieś próbki na lodzie do wstępnie schłodzonych stożkowych probówek wirówek o pojemności 15 mililitrów i dodaj dwa mililitry wody, 10,5 mililitra lodowatego etanolu i 583 mikrolitry trzymolowego octanu sodu.Dodaj 200 mikrolitrów lodowatego etanolu, 10,8 mikrolitrów octanu sodu i jeden mikrolitr miedziacypitu do niestrawionych i podwiązanych kontroli jakości. Inkubować w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez co najmniej cztery godziny, aż do nocy. Wiruj 15-mililitrowe probówki w temperaturze 2200 G w czterech stopniach Celsjusza przez 45 minut.Ostrożnie usunąć etanol i wysuszyć próbki i kontrole na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut. Nie suszyć nadmiernie. Zawiesić próbki i kontrole odpowiednio w 100 mikrolitrach i 20 mikrolitrach wody.W celu kontroli jakości przygotowania matrycy 3C należy załadować od 100 do 200 nanogramów każdej próbki i każdą kontrolę na 1% żel agros 1XTBE. Następnie, aby wykonać wzbogacenie celu dla sekwencjonowania multipleksowego na końcu pared, weź cztery mikrogramy matrycy 3C, zawieś ją ponownie w 130 mikrolitrach wody dla każdej reakcji wychwytywania. Poddać próbkę sonifikacji i kontynuować przygotowanie z trzema mikrogramami ściętego DNA.Aby zhybrydyzować przygotowane próbki DNA z docelowymi sondami RNA, użyj 750 nanogramów próbek DNA w końcowej objętości 3,4 mikrolitra, co daje początkowe stężenie 221 nanogramów na mikrolitr. W razie potrzeby użyj szybkiego stężenia próżni, aby osiągnąć końcową objętość 3.4 mikrolitra. W przypadku próbek zawieszonych w 10 mikrolitrach wystarczy 15 do 20 minut zagęszczenia.Mieszaninę hybrydyzacyjną inkubować przez 16 do 18 godzin w temperaturze 65 stopni Celsjusza pod podgrzewaną pokrywką w temperaturze 105 stopni Celsjusza, zgodnie z instrukcjami producenta. Aby uchwycić docelowe fragmenty ligacji, dodaj streptivide w sprzężonych kulkach do próbki zhybrydyzowanej sondy. Na koniec, aby przygotować próbki do sekwencjonowania multipleksowego, kontynuuj protokół zgodnie z docelowym systemem wzbogacania zastosowanym w tym badaniu do sekwencjonowania sparowanego i multipleksowanego.Rozdzielczość mapy interakcji Capture Hi-C pozwala na identyfikację dwóch mniejszych domen w Tsix-tad, który zawiera promotor locus Tsix. Wcześniej nie udało się tego osiągnąć w przypadku 5C. Co więcej, inne struktury podrzędne, takie jak pętle kontaktowe, są wyraźnie widoczne na danych Capture Hi-C, takich jak pętla między Xist i FTX, wcześniej zidentyfikowana za pomocą Capture C oraz pętla między Xist i Xert niedawno zidentyfikowana przy użyciu podobnego protokołu dla Capture Hi-C.Inne kontakty mogą być również mapowane bardziej precyzyjnie dzięki zwiększonej rozdzielczości profili Capture Hi-C, takich jak te tworzące znane hotspoty kontaktowe w obrębie Tsix-tad między loci Linx, Chic1 i Xite. W porównaniu z pokazanymi danymi Hi-C, Capture Hi-C pozwolił na czterokrotne zwiększenie rozdzielczości, ale wymagał tylko jednej czwartej głębokości sekwencjonowania. Bardzo ważne jest, aby nie zapomnieć o pobraniu 50 mikrolitrów niestrawionych i nieligowanych próbek DNA w celu kontroli jakości przygotowania matrycy 3C.

deciphering-high-resolution-3d-chromatin-organization-via-capture-hi-c

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metoda Hi-C umożliwia bezstronną, genomową identyfikację oddziaływań chromatyny (1). Hi-C łączy ligację bliskościową z sekwencjonowaniem masowo równoległym. Wynikowe dane mogą być wykorzystane do badania architektury genomowej w wielu skalach: wstępne wyniki pozwoliły zidentyfikować takie cechy jak terytoria chromosomowe, segregacja chromatyny otwartej i zamkniętej oraz struktura chromatyny w skali megabazy.

Hi-C: Metoda badania trójwymiarowej architektury genomów.

Łącząc natywną i sieciującą immunoprecypitację chromatyny ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości, podejście ChroP umożliwia analizę złożonej architektury proteomicznej modyfikacji histonów, wariantów i białek niehistonicznych synergizujących się w funkcjonalnie odrębnych domenach chromatyny.

Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny

Ta metoda jest przeznaczona do śledzenia tworzenia domen chromatyny za pośrednictwem PRC2 w liniach komórkowych, a metoda może być dostosowana do wielu innych systemów.

Metoda badania tworzenia się de novo domen chromatyny

Informujemy o zastosowaniu ilościowego wychwytywania konformacji chromosomów, a następnie sekwencjonowania wysokoprzepustowego w ciałach embrionalnych generowanych z embrionalnych komórek macierzystych. Technika ta pozwala na identyfikację i ilościowe określenie kontaktów między domniemanymi wzmacniaczami a regionami promotorowymi danego genu podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych.

Identyfikacja kontaktów wzmacniacz-promotor w ciałach embrionalnych poprzez ilościowe wychwytywanie konformacji chromosomów (4C)

Ten protokół prezentuje technikę mapowania miejsc replikacji w strukturalnie zachowanej chromatynie in situ, która wykorzystuje kombinację wstępnego znakowania EdU-streptawidyny-Nanogold i ChromEMT.

Obrazowanie domen replikacyjnych w ultrastrukturalnie zachowanej chromatynie za pomocą tomografii elektronowej

Kurtyna DNA, wysokoprzepustowa technika obrazowania pojedynczych cząsteczek, stanowi platformę do wizualizacji w czasie rzeczywistym różnych interakcji białko-DNA. Niniejszy protokół wykorzystuje technikę kurtyny DNA do zbadania biologicznej roli i mechanizmu molekularnego Abo1, ATPazy AAA + zawierającej bromodomenę Schizosaccharomyces pombe.

Rozszyfrowanie molekularnego mechanizmu składania histonów za pomocą techniki kurtyny DNA

Hi-C 3.0 to ulepszony protokół Hi-C, który łączy sieciujące formaldehyd i glutaran disuccinimidylu z koktajlem enzymów restrykcyjnych DpnII i DdeI, aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu i rozdzielczość wykrywania interakcji chromatyny.

Rejestrowanie konformacji chromosomów w różnych skalach długości

Protokół mapowania trójwymiarowej organizacji genomu z rozdzielczością nukleosomów przy użyciu metody przechwytywania konformacji chromosomów w całym genomie Micro-C-XL jest przedstawiony tutaj.

Mapowanie interakcji genomu 3D ssaków za pomocą Micro-C-XL

Tutaj szczegółowo prezentujemy adaptację techniki przechwytywania konformacji chromosomów (3C) z naciskiem na zaangażowanie i naukę na studiach licencjackich.

Uzyskanie A z 3Cs: Przechwytywanie konformacji chromosomów dla studentów

Przedstawiamy trójkolorowy protokół mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczkowej chromatyny (SMLM), który umożliwia powtarzalne mapowanie euchromatyny, heterochromatyny i RNAP II do analizy przestrzennej. Protokół ten umożliwia efektywne wielokolorowe oznakowanie w gęstych środowiskach jądrowych, w tym na celach związanych z chromatyną, co pozwala na niezawodne jednoczesne wykrywanie.

Protokół mikroskopii lokalizacyjnej pojedynczej cząsteczki wieloznaczny do badania chromatyny w gęstym środowisku jądrowym

Przedstawiamy tutaj protokół umożliwiający wychwycenie interakcji chromatyny DNA z RNA w celu mapowania trójwymiarowej organizacji genomu powiązanej z RNA.

Metoda interakcji chromatyny DNA z DNA związanej z RNA

Poznaj metodę Capture Hi-C do analizy organizacji chromatyny 3D z wysoką rozdzielczością. Technika ta umożliwia identyfikację domen TAD i interakcji dalekiego zasięgu w różnych typach komórek.

Rozszyfrowywanie organizacji chromatyny 3D w wysokiej rozdzielczości za pomocą Capture Hi-C

Przeglądaj więcej filmów