Rozszyfrowywanie organizacji chromatyny 3D w wysokiej rozdzielczości za pomocą Capture Hi-C

Capture Hi-C pozwala na rozszyfrowanie organizacji chromatyny 3D w interesującym nas regionie genomowym o rozmiarach megazasad w wysokiej rozdzielczości. Dzięki Capture Hi-C uzyskuje się wyższą rozdzielczość i swoistość alleli, jednocześnie poprawiając efektywność czasową i przystępność cenową techniki. Zastosowanie Capture IC do różnych systemów modelowych, typów komórek i regulowanych rozwojowo krajobrazów chromatyny w warunkach zdrowotnych i patologicznych prawdopodobnie ułatwi nam zrozumienie wzajemnych zależności między topologią genomu a regulacją genów.

Na początek tryftonizuj i policz komórki z płytki kontrolnej przygotowanej specjalnie do zliczania komórek za pomocą automatycznego licznika komórek. Uwzględnij barwienie żywotności, aby określić procent żywotnych komórek. Na podstawie tej liczby komórek oszacuj całkowitą liczbę komórek na płytce przygotowanej do sieciowania.

Usuń pożywkę hodowlaną z płytek przygotowanych do sieciowania i zastąp ją roztworem utrwalającym. Utrwal na 10 minut w temperaturze pokojowej pod delikatnym mieszaniem na shakerze. Utrwaloną reakcję utrwalić przez dodanie 2,5 molowej glicyny PBS do końcowego stężenia 0,125 molowca.

Dodaj 530 mikrolitrów 2,5 molowej glicyny PBS do 10 mililitrów w 10-centymetrowej płytce. Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając na shakerze. Przenieś płytki do lodu i inkubuj przez dodatkowe 15 minut na lodzie, delikatnie mieszając na shakerze.

Usunąć roztwór utrwalający z komórek, przelewając go do zlewki, aby zapewnić szybką obsługę. Szybko przepłucz 10-centymetrową płytkę dwa razy pięcioma mililitrami zimnej 0,125 molowej glicyny PBS, aby zmyć zanieczyszczenia i martwe komórki. Usuń płyn z płytki, wlewając go do zlewki, aby zapewnić szybką obsługę.

Dodaj pięć mililitrów zimnej 0,125 molowej glicyny PBS do 10-centymetrowej płytki. I szybko zeskrob komórki z płytki za pomocą plastikowego skrobaka do komórek. Przenieść zawiesinę komórkową do wstępnie schłodzonej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 mililitrów za pomocą pipety serologicznej.

Przepłukać płytkę dwukrotnie pięcioma mililitrami zimnej 0,125 molowej glicyny PBS i dodać zawiesinę komórkową do stożkowej probówki wirówkowej. Wiruj w temperaturze 480 G przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza. Usunąć supernatant przez zasysanie za pomocą laboratoryjnego systemu aspiracji.

Ponownie zawiesić komórki i poddzielić 500 mikrolitrów zawiesiny komórek do obliczonej liczby 1,5 mililitra mikroprobówek wirówkowych. Wirować w dół 480 razy G przez 10 minut w czterech stopniach Celsjusza i przechowywać granulki suchych komórek w temperaturze 80 stopni Celsjusza. W celu lizy komórek rozmrozić zamrożone granulki na lodzie.

Przygotuj 1,5 mililitra buforu do lizy w wodzie. Dodaj 600 mikrolitrów buforu do lizy na zimno i dobrze zawieś na lodzie. Wirować w temperaturze 2 655 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć supernatant za pomocą laboratoryjnego systemu aspiracji.

Zawiesić w 100 mikrolitrach 0,5% SDS. Po inkubacji w temperaturze 62 stopni Celsjusza wirującej z prędkością 1400 obr./min przez 10 minut, dodaj 290 mikrolitrów wody plus 50 mikrolitrów 10% Triton X 100 i dobrze wymieszaj, unikając pęcherzyków powietrza. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wirowaniem z prędkością 1400 obr./min przez 10 minut przed dodaniem 50 mikrolitrów buforu probówkowego 10 X DPN i odwrócić probówkę do wymieszania.

Weź 50 mikrolitrów niestrawionego DNA do kontroli jakości do osobnej probówki. Nie należy zapominać o pobraniu niestrawionej próbki kontrolnej. Do mineralizacji DPN2 dodaj 10 mikrolitrów DPN2 o wysokim stężeniu i wymieszaj, odwracając.

Próbki i niestrawioną kontrolę inkubować w mieszalniku termicznym w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wirując z prędkością 1400 obrotów na minutę przez ponad cztery godziny. W celu ligacji i odwrócenia sieciowania należy pobrać 50 mikrolitrów ligowanego, strawionego DNA do kontroli jakości w osobnej probówce. Przechowuj niestrawione i niepodwiązane kontrole w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Dodaj 800 mikrolitrów koktajlu ligacyjnego. Inkubować w temperaturze 16 stopni Celsjusza, wirując z prędkością 1000 obrotów na minutę przez noc. W celu oczyszczenia DNA przenieś próbki na lodzie do wstępnie schłodzonych stożkowych probówek wirówek o pojemności 15 mililitrów i dodaj dwa mililitry wody, 10,5 mililitra lodowatego etanolu i 583 mikrolitry trzymolowego octanu sodu.

Dodaj 200 mikrolitrów lodowatego etanolu, 10,8 mikrolitrów octanu sodu i jeden mikrolitr miedziacypitu do niestrawionych i podwiązanych kontroli jakości. Inkubować w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez co najmniej cztery godziny, aż do nocy. Wiruj 15-mililitrowe probówki w temperaturze 2200 G w czterech stopniach Celsjusza przez 45 minut.

Ostrożnie usunąć etanol i wysuszyć próbki i kontrole na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 10 do 15 minut. Nie suszyć nadmiernie. Zawiesić próbki i kontrole odpowiednio w 100 mikrolitrach i 20 mikrolitrach wody.

W celu kontroli jakości przygotowania matrycy 3C należy załadować od 100 do 200 nanogramów każdej próbki i każdą kontrolę na 1% żel agros 1XTBE. Następnie, aby wykonać wzbogacenie celu dla sekwencjonowania multipleksowego na końcu pared, weź cztery mikrogramy matrycy 3C, zawieś ją ponownie w 130 mikrolitrach wody dla każdej reakcji wychwytywania. Poddać próbkę sonifikacji i kontynuować przygotowanie z trzema mikrogramami ściętego DNA.

Aby zhybrydyzować przygotowane próbki DNA z docelowymi sondami RNA, użyj 750 nanogramów próbek DNA w końcowej objętości 3,4 mikrolitra, co daje początkowe stężenie 221 nanogramów na mikrolitr. W razie potrzeby użyj szybkiego stężenia próżni, aby osiągnąć końcową objętość 3.4 mikrolitra. W przypadku próbek zawieszonych w 10 mikrolitrach wystarczy 15 do 20 minut zagęszczenia.

Mieszaninę hybrydyzacyjną inkubować przez 16 do 18 godzin w temperaturze 65 stopni Celsjusza pod podgrzewaną pokrywką w temperaturze 105 stopni Celsjusza, zgodnie z instrukcjami producenta. Aby uchwycić docelowe fragmenty ligacji, dodaj streptivide w sprzężonych kulkach do próbki zhybrydyzowanej sondy. Na koniec, aby przygotować próbki do sekwencjonowania multipleksowego, kontynuuj protokół zgodnie z docelowym systemem wzbogacania zastosowanym w tym badaniu do sekwencjonowania sparowanego i multipleksowanego.

Rozdzielczość mapy interakcji Capture Hi-C pozwala na identyfikację dwóch mniejszych domen w Tsix-tad, który zawiera promotor locus Tsix. Wcześniej nie udało się tego osiągnąć w przypadku 5C. Co więcej, inne struktury podrzędne, takie jak pętle kontaktowe, są wyraźnie widoczne na danych Capture Hi-C, takich jak pętla między Xist i FTX, wcześniej zidentyfikowana za pomocą Capture C oraz pętla między Xist i Xert niedawno zidentyfikowana przy użyciu podobnego protokołu dla Capture Hi-C.

Inne kontakty mogą być również mapowane bardziej precyzyjnie dzięki zwiększonej rozdzielczości profili Capture Hi-C, takich jak te tworzące znane hotspoty kontaktowe w obrębie Tsix-tad między loci Linx, Chic1 i Xite. W porównaniu z pokazanymi danymi Hi-C, Capture Hi-C pozwolił na czterokrotne zwiększenie rozdzielczości, ale wymagał tylko jednej czwartej głębokości sekwencjonowania. Bardzo ważne jest, aby nie zapomnieć o pobraniu 50 mikrolitrów niestrawionych i nieligowanych próbek DNA w celu kontroli jakości przygotowania matrycy 3C.