Stworzenie stawu kolanowego na chipie do modelowania chorób stawów i testowania leków
27 stycznia 2023
Udostępniamy szczegółowe metody generowania czterech typów tkanek z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych, które są używane do rekapitulacji chrząstki, kości, poduszeczki tłuszczowej i błony maziowej w ludzkim stawie kolanowym. Te cztery tkanki są zintegrowane z dostosowanym bioreaktorem i połączone za pomocą mikrofluidyki, tworząc w ten sposób staw kolanowy na chipie.
Nasza zdolność do dokładnego przewidywania, jak ludzie reagują na leki podczas badań klinicznych, jest ograniczona ze względu na brak fizjologicznie istotnych modeli przedklinicznych. Ten system mikrofizjologiczny może zniwelować tę rozbieżność. Ten system oparty na komórkach ludzkich dokładnie naśladuje całą naturę choroby stawów w chorobie zwyrodnieniowej stawów w ludzkim kolanie, co pozwala na testowanie leków modyfikujących chorobę zwyrodnieniową stawów przed badaniami klinicznymi, potencjalnie oszczędzając miliony dolarów.
Przygotowanie żelatyny metakrylowanej lub GelMA należy rozpocząć od dodania 17 gramów żelatyny typu B do 500 mililitrów wody destylowanej. Mieszaj przez 30 minut na shakerze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i dodaj 13 mililitrów bezwodnika metakrylowego przed wymieszaniem na noc na shakerze. Następnego dnia należy przygotować około 60 mililitrów porcji GelMA do worków do dializy.
Umieścić wszystkie worki dializacyjne w wodzie destylowanej z mieszadłem na siedem dni. Zmieniaj wodę kilka razy dziennie i zostaw worki w temperaturze czterech stopni Celsjusza na noc. Siódmego dnia wlej GelMA do naczynia i zamroź go w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przed liofilizacją.
Następnie liofilizuj GelMA, umieszczając go w komorze próżniowej liofilizatora. Zapewnić całkowite wyschnięcie przed wyjęciem z liofilizatora. Następnie rozpuść liofilizowany GelMA w zbalansowanym roztworze soli Hanksa o stężeniu 15% i dostosuj pH do 7,4 za pomocą niewielkiej ilości wodorotlenku sodu.
W zależności od uzyskanej objętości uzupełnij roztwór antybiotykiem przeciwgrzybiczym i 0,15% fosforianem fenylu litu lub LAP. Roztwór GelMA należy chronić przed światłem i przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu dalszego użycia. Autoklaw Drukowane w 3D komory bioreaktora z podwójnym przepływem, pokrywy i wkładki w workach autoklawu w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 20 minut z parą.
A potem przez 20 minut na suchym ogniu. Po sterylizacji namocz komory bioreaktora, pokrywy i wkładki w 15 mililitrach sterylnego PBS przez noc w komorze bezpieczeństwa biologicznego, a następnie całkowicie wysusz. Za pomocą pipety o pojemności 1000 mikrolitrów ponownie zawiesić 20 razy 10 do szóstych mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego lub MSC na mililitr komórek w 15% roztworze GelMA.
Następnie dociśnij sterylną, suchą silikonową formę do szalki Petriego, używając sterylnych rękawiczek. Umieść jedną wkładkę w każdym otworze silikonowej formy za pomocą kleszczyków stroną z otworem wkładki skierowaną w dół. Po zakończeniu dodaj około 50 mikrolitrów zawiesiny komórek na wkładkę za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów.
Usieciuj żel wewnątrz wkładu, wystawiając górę na działanie latarki UV o długości fali 395 nanometrów przez 1,5 minuty, a następnie oświetlając drugą stronę przez 30 sekund. Za pomocą sterylnych kleszczy natychmiast przenieś wkładki do ośmiu mililitrów pożywki wzrostowej na sześciodołkowej płytce z kulturą nietkankową i pozwól komórkom zregenerować się przez noc. Aby zainicjować różnicowanie tkanki tłuszczowej, przenieś wkładki do ośmiu mililitrów pożywki adipogennej i hoduj je przez 28 dni z codzienną wymianą podłoża.
Aby zaprojektować jednostki kostno-chrzęstne, umieść wkładki w komorach bioreaktora z podwójnym przepływem, zakryj studzienki i napełnij dwa strumienie oddzielnie z natężeniem przepływu pięciu mikrolitrów na minutę z 35 mililitrami pożywki osteogennej i 35 mililitrami pożywki chondrogennej. Utrzymuj komórki w stanie różnicowania przez 28 dni, wykonując co dwa tygodnie zmiany strzykawki z odpowiednimi typami pożywki. Aby uzyskać fibroblasty, należy rozróżnić MSCs w hodowli 2D w kolbie do hodowli komórek tkankowych T o powierzchni 150 centymetrów kwadratowych zawierającej 20 mililitrów pożywki fibrogennej przez 21 dni.
Utrzymuj cotygodniową zmianę podłoża. Po 21 dniach użyj czterech mililitrów trypsyny, aby odłączyć komórki. Kapsułkuj żele 3D we wkładkach.
Aby uzyskać tkankę włóknistą podobną do maziowej lub SFT, postępuj zgodnie z podobnym protokołem. Podłącz silikonową rurkę o średnicy wewnętrznej 0,062 cala i średnicy zewnętrznej 0,125 cala do pręta bioreaktora minijoint na jednym końcu i łączników blokady przynęty F 1/16th na drugim końcu. Następnie autoklaw bioreaktorów 3D minijoint wraz z silikonowymi rurkami i pokrywkami.
Przygotuj i załaduj 35 mililitrów pożywki, która ma być użyta do hodowli minijointów, do zbiorników pożywki. Użyj prostych kleszczy, aby przenieść jednostki kostno-chrzęstne z bioreaktora o podwójnym przepływie do prawej studzienki bioreaktora minijoint. Przenieś wkładkę z tkanki tłuszczowej i wkładkę z tkanki włóknistej odpowiednio do lewej i środkowej studzienki, a następnie przykryj wszystkie studzienki wysterylizowanymi pokrywkami.
Podłącz wloty zacisków minijointów do zbiorników pożywki, a wyloty do strzykawek. Następnie zamontować strzykawki na pompie strzykawkowej. Przenieś pompę i wióry do inkubatora.
Umieść zbiorniki pożywki na lodzie na zewnątrz inkubatora. Uruchomić pompę w trybie poboru, zasysając medium ze zbiornika medium do komory bioreaktora minijoint. Kontynuuj ten proces hodowli minijointów przez 28 dni.
Aby modelować stan zapalny stawów i zwyrodnienie chrząstki, dodaj interleukinę jedną beta do szczepu pożywki fibrogennej w dawce 10 nanogramów na mililitr przez siedem dni. Należy pamiętać o wymianie strzykawki na trzeci dzień przed podaniem świeżej interleukiny beta do podłoża fibrogennego. W przypadku testów narkotykowych, po trzech dniach leczenia interleukiną w wersji beta, należy podać lek albo we wspólnym pożywce, symulując podawanie dostawowe, albo we wszystkich typach pożywki, symulując podawanie ogólnoustrojowe.
Po siedmiu dniach leczenia interleukiną beta należy pobrać poszczególne tkanki do analizy. Po wyjęciu wkładek za pomocą sterylnych kleszczy przepchnij stempel biopsyjny przez środek wkładki, aby usunąć żel i umieścić żel w PBS. Następnie przetnij żele kostno-chrzęstne na pół, oceniając ekspresję genu.
Zebrać i odwirować około 1,5 mililitra pożywki z każdego źródła w temperaturze 14 000 G przez 10 minut. Po wyrzuceniu osadu należy błyskawicznie zamrozić kondycjonowane media w ciekłym azocie. W przypadku barwienia histologicznego i barwienia immunologicznego, najpierw utrwal tkankę kostno-chrzęstną i maziową podobną do tkanki włóknistej lub próbki SFT w 10% buforowanej formalinie i odwadnij je w etanolu o rosnących stężeniach.
Oczyść próbkę w ksylenie, zanurz je w parafinie, a na koniec pokrój próbki na grubość sześciu mikrometrów. W przypadku tkanki tłuszczowej 10% zbuforowane próbki formalne i utrwalone należy zabarwić bezpośrednio roztworem czerwieni olejowej O lub BODIPY. Fenotypy specyficzne dla tkanek były dobrze zachowane dla poszczególnych mikrotkanek.
Wszystkie tkanki minijointa pobrano w celu przeanalizowania ich fenotypów po 28 dniach hodowli. Składnik kostny mikrotkanek jednostek kostno-chrzęstnych wykazywał wysoki poziom osteokalcyny. W części chrzęstnej kości kostno-chrzęstnej tkanki wykazywały znacznie wysoki poziom kolagenu typu drugiego i agrekanu.
Poziomy ekspresji reprezentatywnych genów adipogennych, adiponektyny i leptyny były wyższe w tkance tłuszczowej. Odkładanie się minerałów wapniowych, fosfatazy alkalicznej i białka osteokalcyny obserwowano przede wszystkim w wielkości kości mikrotkanek kostno-chrzęstnych. Strona chrzęstna tkanek kostno-chrzęstnych wykazywała dobrze zachowany glikozaminoglikan i kolagen typu drugiego.
Ekspresja markerów związanych z hipertrofią chondrocytów, kolagenu typu 10 i jeża indyjskiego, była znacznie obniżona po 28 dniach hodowli. W tkance tłuszczowej stwierdzono obfite odkładanie się kropelek lipidowych. Barwienie immunofluorescencyjne wykazało silną ekspresję lubrycyny i kadheryny 11 przez SFT po czterech tygodniach hodowli.
W modelu choroby leczenie IL one beta spowodowało apoptozę komórek i podwyższony poziom MMP-13 w SFT. Degradację chrząstki leczono za pomocą IL one beta, co sugeruje występowanie przesłuchów między tkankami kostno-chrzęstnymi a SFT. Skuteczność terapeutyczna naproksenu po podaniu ogólnoustrojowym wykazała zmniejszoną degradację chrząstki w ministawie IL one beta.
PCR w czasie rzeczywistym wykazał, że cztery potencjalne leki modyfikujące chorobę zwyrodnieniową stawów częściowo odwróciły utratę chrząstki. Do najważniejszych etapów tej procedury należy sieciowanie żeli we wkładkach i umieszczenie ich w bioreaktorze. Czip umożliwia badanie udziału innych czynników ryzyka w chorobie zwyrodnieniowej stawów, takich jak otyłość i urazy mechaniczne.
Może być również używany do badania innych chorób stawów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metody generowania czterech typów tkanek z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych, a mianowicie chrząstki, kości, tkanki tłuszczowej oraz błony maziowej, w celu stworzenia modelu stawu kolanowego na chipie (knee joint-on-a-chip). Ten mikrofizjologiczny system ma na celu lepsze przewidywanie reakcji organizmu człowieka na leki w badaniach klinicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórek macierzystych
- Systemy mikrofizjologiczne
Wprowadzenie
- Obecne modele przedkliniczne nie odzwierciedlają dokładnie fizjologii człowieka.
- Choroba zwyrodnieniowa stawów jest powszechną chorobą stawów, która wymaga skutecznych testów leków.
- Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste mogą różnicować się w różne typy tkanek.
- Systemy mikroprzepływowe mogą usprawnić integrację różnych tkanek.
Cel badania
- Opracowanie modelu stawu kolanowego na chipie (knee joint-on-a-chip) do badań nad chorobą zwyrodnieniową stawów.
- Zapewnienie platformy do testowania leków modyfikujących przebieg choroby zwyrodnieniowej stawów.
- Poprawa dokładności przewidywania odpowiedzi na leczenie w badaniach klinicznych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie żelatyny metakrylowanej (GelMA) do rusztowań tkankowych.
- Integracja czterech typów tkanek w dostosowanym bioreaktorze.
- Wykorzystanie mikroprzepływów do zapewnienia łączności tkanek.
- Testowanie odpowiedzi na leki w modelu stawu kolanowego na chipie (knee joint-on-a-chip).
Główne wyniki
- Model stawu kolanowego na chipie (knee joint-on-a-chip) precyzyjnie naśladuje warunki występujące w chorobie zwyrodnieniowej stawów.
- Testy leków z wykorzystaniem tego modelu wykazują potencjał do redukcji kosztów w badaniach klinicznych.
- Skuteczna integracja tkanek chrząstki, kości, poduszki tłuszczowej oraz błony maziowej.
- Wykazanie możliwości wykorzystania tkanek pochodzenia ludzkiego do testowania leków.
Wnioski
- Opracowany model może znacząco usprawnić przedkliniczne badania nad lekami.
- Rozwiązuje on ograniczenia obecnych modeli w przewidywaniu reakcji organizmu człowieka.
- Podejście to może prowadzić do opracowania bardziej skutecznych metod leczenia choroby zwyrodnieniowej stawów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Fizjologicznie istotne modele przedkliniczne mają kluczowe znaczenie dla wiarygodności prognostycznej w procesie odkrywania leków na chorobę zwyrodnieniową stawów oraz w badaniach translacyjnych. System stawu kolanowego na chipie (knee joint-on-a-chip) umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka i walidację celów terapeutycznych poprzez odtworzenie złożoności i interakcji tkanek stawowych człowieka. Platforma ta wspiera decyzje dotyczące portfela projektów z uwzględnieniem ryzyka, umożliwiając rzetelną, ilościową ocenę leków modyfikujących przebieg choroby zwyrodnieniowej stawów (DMOADs) przed przejściem do fazy badań klinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych w kontekście wielotkankowego ludzkiego stawu.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez modelowanie interakcji tkankowych i zaburzeń istotnych dla przebiegu choroby.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez kontrolowaną indukcję stanu zapalnego i degeneracji stawów.
- Zapewnia platformę do oceny wpływu czynników ryzyka, takich jak otyłość i urazy mechaniczne, na progresję choroby.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane, wielotkankowe układy ludzkie do dalszych etapów procesów przesiewowych leków.
- Zapewnia ilościowe i powtarzalne wyniki, w tym odczyty ekspresji genów, analizy histologiczne oraz immunostaining.
- Umożliwia standaryzowaną ocenę skuteczności związków poprzez systemowe lub wewnątrzstawowe drogi podania.
- Wspiera skalowalną i wielokrotnego użytku rozbudowę testów do oceny kandydatów na leki DMOAD.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z biologią ludzkich stawów w kontekście chorób, co sprzyja translacyjnemu odkrywaniu biomarkerów.
- Zapewnia ciągłość od wczesnej fazy odkryć po walidację przedkliniczną poprzez modelowanie reakcji tkanek ludzkich.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka i predykcyjne dane istotne dla człowieka.
- Ułatwia badania mechanistyczne nad interakcjami tkankowymi i odpowiedzią na lek w kontrolowanym środowisku.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta platforma typu joint-on-a-chip łączy etapy wczesnego odkrywania, identyfikacji wiodących kandydatów oraz badań przedklinicznych, zapewniając fizjologicznie istotny, wielotkankowy model ludzki do testowania hipotez i oceny leków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących mechanizmów chorób stawów i odpowiedzi specyficznych dla tkanek.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki do oceny skuteczności i toksyczności związków.
- Analityka: Umożliwia analizę porównawczą ekspresji genów, markerów białkowych i integralności tkanek w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Jest spójne z biologią chorób ludzi w zakresie walidacji biomarkerów i ciągłości przedklinicznej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako wielokrotnego użytku, modułowa platforma, którą można dostosować do badań nad innymi chorobami stawów i czynnikami ryzyka.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w procesie opracowywania leków na chorobę zwyrodnieniową stawów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje modelowanie wielotkanowe oraz powtarzalność testów dla skalowalnych procesów badawczo-rozwojowych.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnej redukcji ryzyka dla kandydatów na leki DMOAD.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój kandydatów na leki w oparciu o dane istotne dla organizmu ludzkiego.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie różnicowania komórek macierzystych, inżynierii tkankowej oraz obsługi mikrofluidycznych bioreaktorów.
- Wymaga dostępu do druku 3D, hodowli komórkowych oraz infrastruktury analitycznej do charakterystyki tkanek.
- Konieczna jest standaryzacja przygotowania tkanek, kontroli przepływu i protokołów analitycznych pomiędzy zespołami.
- Możliwość adaptacji do różnych modeli chorób stawów i perturbacji czynników ryzyka poprzez modyfikację protokołu.
- Ograniczenia praktyczne obejmują limity przepustowości oraz konieczność specjalistycznego przeszkolenia technicznego.
