Name: Przygotowanie cytoplazmatycznych i jądrowych długich RNA z komórek pierwotnych i hodowanych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Poznaj metodę izolacji RNA z frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych w hodowanych komórkach z walidacją qPCR. To opłacalne podejście umożliwia badanie lokalizacji molekuł i ich roli w procesach komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wspierane przez granty z Amerykańskiego Towarzystwa Hematologicznego, Fundacji Roberta Wooda Johnsona, Fundacji Charytatywnej Doris Duke, Fundacji Edwarda P. Evansa i National Cancer Institute (1K08CA230319).

Komórki K562 są używane w niniejszym badaniu. Ten protokół został zoptymalizowany do pracy dla 1 x 106-5 x 106 milionów komórek. Procedurę tę można jednak zwiększyć w przypadku większych ilości komórek, odpowiednio zwiększając ich objętość.
1. Przygotowanie 0,25x buforu do lizy
<ol>
	<li>Przygotować 0,25-krotny bufor do lizy, mieszając następujące składniki podane w tabeli 1A. 
	UWAGA: Próbki wymagają około 300 μl 0,25x buforu do lizy. Zalecana objętość = liczba próbek x 300 μL.</li>
</ol>
2. Separacja frakcji jądrowej i cytoplazmatycznej
<ol>
	<li>Granulować komórki za pomocą probówek o pojemności 1,5 ml przez wirowanie przez 5 minut w temperaturze 2000 x g (temperatura pokojowa). Usunąć supernatant za pomocą pipety zasysającej. 
	UWAGA: Komórki K562 zostały wykorzystane podczas tego protokołu. Protokół można jednak dostosować do różnych linii komórkowych.</li>
	<li>Zawiesić osad w 300 μl lodowatego buforu 0,25x bufor do lizy. 
	UWAGA: Trzymaj na lodzie przez 2 minuty i obracaj rurkę co 45 sekund, aby zapewnić prawidłową lizę komórek.</li>
	<li>Wirować probówki z najwyższą prędkością (12 000 x g) w temperaturze 4 °C przez 2 minuty.</li>
	<li>Po odwirowaniu ostrożnie usunąć supernatant i umieścić go w nowej probówce o pojemności 1,5 ml. Będzie to frakcja cytoplazmatyczna. Zostanie osiągnięte około 300 μL frakcji cytoplazmatycznej.</li>
	<li>Pozostała pastylka będzie frakcją jądrową. Dodać 500 μl lodowatego PBS do osadu i odwirować przy 2 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Na tym etapie usuwany jest nadmiar DNA.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie RNA za pomocą zestawu do oczyszczania RNA
UWAGA: Ten protokół został osiągnięty przy użyciu komercyjnie dostępnego zestawu do oczyszczania RNA (zobacz Tabelę materiałów).
<ol>
	<li>Oddziel próbki cytoplazmatycznego RNA i próbki cytoplazmy jądrowej (ponieważ etapy frakcjonowania różnią się między nimi).
	<ol>
		<li>Aby oddzielić frakcję cytoplazmatyczną, dodaj 1,050 μl 3,5x buforu do lizy RLT (patrz tabela materiałów) i krótko odwiruj. Następnie dodaj 750 μl 90% etanolu i załaduj go do kolumny z zestawu do czyszczenia RNA. 
		UWAGA: Roztwór musi być dobrze wymieszany przed załadowaniem na kolumnę.</li>
		<li>Aby oddzielić frakcję jądrową, dodaj 600 μl 3,5x buforu do lizy i wiru. Następnie dodaj 600 μl 70% etanolu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załaduj zarówno frakcję cytoplazmatyczną, jak i jądrową na kolumny RNA (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: W pozostałej części kroku 3 zarówno próbki cytoplazmatyczne, jak i jądrowe podlegają tej samej procedurze. Należy jednak upewnić się, że próbki te pozostają od siebie niezależne.
	<ol>
		<li>Załaduj zarówno frakcje cytoplazmatyczne, jak i jądrowe na kolumny RNA i wiruj przez 30 s w temperaturze 8 000 x g w temperaturze pokojowej. Wyrzuć nadmiar przepływu.</li>
		<li>Dodać 350 μl buforu płuczącego z dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania (bufor RW1, patrz tabela materiałów), ponownie odwirować i odrzucić przepływ.</li>
		<li>Dodać roztwór DNAzy (1U/uL) przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 350 μl buforu do mycia, ponownie odwiruj i wylej przepływ.</li>
		<li>Dodać 500 μl łagodnego buforu myjącego (RPE, patrz tabela materiałów), ponownie odwirować i wylać przepływ. Dodać 500 μl łagodnego buforu myjącego, ponownie odwirować, ale tylko przez 2 min.</li>
		<li>Przenieś kolumnę do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i dodaj 30 μl wody do kolumny wirowej. Pozostaw kolumnę na 1 minutę przed odwirowaniem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Walidacja separacji jądrowej od cytoplazmy
<ol>
	<li>Przeprowadzanie syntezy cDNA
	<ol>
		<li>Po wyekstrahowaniu i oczyszczeniu subkomórkowych przedziałów RNA potwierdź rozdzielenie przedziałów za pomocą qPCR. Aby to zrobić, najpierw przekształć RNA w cDNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Przygotuj mastermix odwrotnej transkryptazy. Dodaj szablon RNA. Inkubacja reakcji w termocyklerze. 
		UWAGA: W przypadku heksamerów losowych stosowane parametry cykliczne podano w tabeli 2A. Reakcję odwrotnej transkryptazy należy natychmiast zastosować lub przechowywać w temperaturze -20 °C (Tabela 1B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić ilościową reakcję łańcuchową polimerazy (qPCR) i analizę.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć syntezę cDNA wodą DEPC (patrz tabela materiałów), aby uzyskać końcowe stężenie 20 ng / ml.</li>
		<li>Używając głównej mieszanki PCR, przygotuj reakcję dla każdej próbki, korzystając z ręcznych instrukcji wymienionych poniżej.</li>
		<li>Zdobądź komercyjne sondy niezbędne do wykrywania frakcjonowania cytoplazmatycznego i jądrowego. Użyj MALAT1 jako markera jądrowego i TUG1 jako markera cytoplazmatycznego (patrz Tabela materiałów). 
		UWAGA: Sekwencje dla MALAT1 i TUG1 przedstawiono w Tabeli 3.</li>
		<li>Obliczyć objętość każdego składnika, mnożąc każdy składnik przez 3 dla każdej z kontrprób technicznych dla danej próbki.</li>
		<li>Dla każdej próbki jądrowej i cytoplazmatycznej należy uzyskać następujące mieszaniny dla każdej: a) frakcji jądrowej z MALAT1, b) frakcji cytoplazmatycznej z MALAT1, c) frakcji jądrowej z TUG1 i (d) frakcji cytoplazmatycznej z TUG1 (tabela 1C).</li>
		<li>Krótko przetrząsnąć, aby wymieszać roztwory i przenieść 20 μl mieszaniny do każdego dołka płytki reakcji optycznej (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Przykryj płytkę przezroczystą folią samoprzylepną używaną do qPCR (patrz tabela materiałów) i krótko odwiruj płytkę w celu usunięcia pęcherzyków powietrza, a następnie odwiruj próbkę przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Korzystając z oprogramowania do projektowania i analizy (patrz tabela materiałów), wybierz krzywą standardową dla parametrów cyklicznych (tabela 2B).</li>
		<li>Korzystając z oprogramowania qPCR, wybierz opcję Uruchom instalator (rysunek uzupełniający 1).</li>
		<li>Na stronie Data File Properties (Właściwości pliku danych) wybierz opcję Method and input cycle parameters (Metoda i parametry cyklu wejściowego) z tabeli 2B (Rysunek uzupełniający 2).</li>
		<li>Po wprowadzeniu parametrów cyklu wybierz zakładkę Płyta i wprowadź próbki do uruchomienia (Rysunek uzupełniający 3). Wybierz pozycję Start Run. 
		UWAGA: Opisane kroki zostały wykonane w maszynie qPCR przy użyciu dostępnej na rynku mieszanki wzorcowej (patrz Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzanie analizy danych
	<ol>
		<li>Po zakończeniu przebiegu utwórz arkusz kalkulacyjny danych z nazwą próbki, nazwą docelową i cyklem kwantyfikacji (Cq) (tabela uzupełniająca 1).</li>
		<li>Zacznij od próbek MALAT1, aby obliczyć frakcję jądrową. Odejmij frakcję cytoplazmatyczną MALAT1 od frakcji jądrowej MALAT1 (Tabela 4).</li>
		<li>Następnie oblicz ΔCq (2^(-wartość)) (Tabela 5).</li>
		<li>Kontynuuj z próbkami MALAT1 w celu obliczenia frakcji cytoplazmatycznej, odejmij frakcję jądrową MALAT1 od frakcji cytoplazmatycznej MALAT1, a następnie oblicz ΔCq (2^(-wartość)) (Tabela 6). 
		UWAGA: Patrząc na ΔCq, obserwuje się, że frakcja jądrowa MALAT1 (zielone podświetlenie) ma większy marker MALAT1 niż cytoplazma (czerwone podświetlenie), ale teraz wymagane jest potwierdzenie, aby upewnić się, że frakcja cytoplazmatyczna jest głównie cytoplazmą i że frakcja jądrowa nie zawiera zanieczyszczenia cytoplazmatycznego.</li>
		<li>W przypadku próbek TUG1 wykonaj te same obliczenia, co powyżej (kroki 4.3.2-4.3.4) (Tabela 7). 
		UWAGA: Patrząc na ΔCq, obserwuje się, że cytoplazmatyczna frakcja TUG1 (zielone podświetlenie) ma większy marker TUG1 niż frakcja jądrowa (czerwone podświetlenie), potwierdzając w ten sposób dobrą separację frakcji cytoplazmatycznej i jądrowej (Tabela 8, <silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Conrad, T., Orom, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+fractionation+and+isolation+of+chromatin-associated+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular fractionation and isolation of chromatin-associated RNA.</a> Methods in Molecular Biology. 1468, 1-9 (2017).</li>
<li>Bashirullah, A., Cooperstock, R. L., Lipshitz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+localization+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">RNA localization in development.</a> Annual Review of Biochemistry. 67, 335-394 (1998).</li>
<li>Liu, X., Fagotto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+separate+nuclear%2C+cytosolic%2C+and+membrane-associated+signaling+molecules+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">A method to separate nuclear, cytosolic, and membrane-associated signaling molecules in cultured cells.</a> Science Signaling. 4 (203), (2011).</li>
<li>Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+localization%3A+message+on+the+move%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">mRNA localization: message on the move.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (4), 247-256 (2001).</li>
<li>Carlevaro-Fita, J., Johnson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+positioning+system%3A+Understanding+long+noncoding+RNAs+through+subcellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Global positioning system: Understanding long noncoding RNAs through subcellular localization.</a> Molecular Cell. 73 (5), 869-883 (2019).</li>
<li>Voit, E. O., Martens, H. A., Omholt, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((150+years+of+the+mass+action+law%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">150 years of the mass action law.</a> PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004012(2015).</li>
<li>El-Tanani, M., Dakir el, H., Raynor, B., Morgan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+nuclear+export+in+cancer+and+resistance+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of nuclear export in cancer and resistance to chemotherapy.</a> Cancers (Basel). 8 (3), 35(2016).</li>
<li>Turner, J. G., Dawson, J., Sullivan, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+export+of+proteins+and+drug+resistance+in+cancer%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Nuclear export of proteins and drug resistance in cancer).</a> Biochemical Pharmacology. 83 (8), 1021-1032 (2012).</li>
<li>Boesenberg-Smith, K. A., Pessarakli, M. M., Wolk, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+DNA+yield+and+purity%3A+an+overlooked+detail+of+PCR+troubleshooting%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Newsletter%22%5BJournal%5D)">Assessment of DNA yield and purity: an overlooked detail of PCR troubleshooting.</a> Clinical Microbiology Newsletter. 34 (1), 1-6 (2012).</li>
<li>Taylor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+nuclear+export+signal+recognition+as+a+driver+of+oncogenesis+altered+nuclear+export+signal+recognition+drives+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Altered nuclear export signal recognition as a driver of oncogenesis altered nuclear export signal recognition drives oncogenesis.</a> Cancer Discovery. 9 (10), 1452-1467 (2019).</li>
<li>Ayupe, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+biogenesis%2C+stability+and+sub-cellular+localization+of+lncRNAs+mapping+to+intragenic+regions+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Global analysis of biogenesis, stability and sub-cellular localization of lncRNAs mapping to intragenic regions of the human genome.</a> RNA Biology. 12 (8), 877-892 (2015).</li>
<li>Ghuysen, J. -M., Hakenbeck, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGhuysen%2C+J-M+%22Bacterial+Cell+Wall%22">Bacterial Cell Wall</a>. , Elsevier. (1994).</li>
<li>Fersht, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFersht%2C+A+%22Enzyme+Structure+and+Mechanism%22">Enzyme Structure and Mechanism</a>. , (1985).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22How+to+win+the+battle+with+RNase%22">How to win the battle with RNase</a>. 2019 (2), Cold Spring Harbor Protocols. (2019).</li>
<li>Blumberg, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+a+ribonuclease-free+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Creating a ribonuclease-free environment.</a> Methods in Enzymology. 152, 20-24 (1987).</li>
<li>Abmayr, S. M., Yao, T., Parmely, T., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+nuclear+and+cytoplasmic+extracts+from+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of nuclear and cytoplasmic extracts from mammalian cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 12, Unit 12.1 (2006).</li>
<li>Taylor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selinexor%2C+a+first-in-class+XPO1+inhibitor%2C+is+efficacious+and+tolerable+in+patients+with+myelodysplastic+syndromes+refractory+to+hypomethylating+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Selinexor, a first-in-class XPO1 inhibitor, is efficacious and tolerable in patients with myelodysplastic syndromes refractory to hypomethylating agents.</a> Blood. 132, Supplement 1 233(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W trakcie trwania protokołu podjęto pewne kroki w celu optymalizacji elementów, aby były jak najbardziej skuteczne dla linii komórkowej będącej przedmiotem zainteresowania. Chociaż kroki w ramach protokołu są stosunkowo proste, może być konieczna analiza i drobne korekty w krytycznych aspektach protokołu. Najważniejszym krokiem w protokole jest modyfikacja stężenia buforu do lizy do odpowiedniego stężenia w oparciu o linię komórkową będącą przedmiotem zainteresowania i cel komórkowy. Ponieważ wykorzystanie buforu do lizy...

Frakcjonowanie komórek na składniki subkomórkowe pozwala na izolację i badanie zdefiniowanych domen biochemicznych oraz pomaga w określeniu lokalizacji określonych procesów komórkowych i jak może to wpłynąć na ich funkcję1. Izolacja RNA z różnych lokalizacji wewnątrzkomórkowych może pozwolić na poprawę dokładności analizy genetycznej i biochemicznej zdarzeń na poziomie transkrypcji i innych interakcji między jądrem a cytoplazmą, co służy jako główny cel obecnego protokołu2. Protokół ten został opracowany w celu zapewnienia izolacji cytoplazmatycznych i jądrowych RNA w celu określenia ich odpowiednich ról w eksporcie jądrowym oraz zrozumienia, w jaki sposób subkomórkowa lokalizacja RNA w jądrze i cytoplazmie może wpływać na ich funkcję w procesach komórkowych. Korzystając z materiałów pochodzących z typowych warunków laboratoryjnych, możliwe było osiągnięcie frakcjonowania jądrowego i cytoplazmatycznego w sposób bardziej efektywny i tańszy niż wcześniej ustalone protokoły bez narażania na szwank jakości wyników3.
Dodatkowo, wymiana cząsteczek między cytoplazmą a jądrem może być badana bezpośrednio poprzez rozdzielenie tych regionów. Mówiąc dokładniej, zrozumienie transkryptomu jest niezbędne do zrozumienia rozwoju i choroby. Jednak RNA mogą znajdować się na różnych poziomach dojrzewania w danym momencie i mogą komplikować dalszą analizę. Protokół ten pozwala na izolację RNA z jądrowych i cytoplazmatycznych frakcji subkomórkowych, co może pomóc w badaniach RNA i pozwolić na lepsze zrozumienie konkretnego RNA będącego przedmiotem zainteresowania, takiego jak lokalizacja niekodujących RNA lub analiza połączeń splicingowych w jądrze.
Ten protokół został zoptymalizowany do izolowania cytoplazmatycznych i jądrowych długich RNA, w tym mRNA, rRNA i długich niekodujących RNA (lncRNA), ze względu na selektywność wielkości zastosowanej kolumny oczyszczającej RNA, która może być modyfikowana w celu wyizolowania innych interesujących RNA. Wcześniej funkcja długich RNA, takich jak mRNA i lncRNA, w dużym stopniu zależała od ich odpowiedniej lokalizacji w komórce4,5. W związku z tym badanie eksportu z jądra do domen subkomórkowych stało się bardziej ukierunkowane na zrozumienie roli, jaką eksport RNA lub innych składników komórkowych może odgrywać w komórce. lncRNA są tego doskonałym przykładem, ponieważ ich translacja i późniejsze efekty zależą w dużej mierze od bliskości i interakcji z innymi formami RNA6. Co więcej, wymiana elementów komórkowych między regionami jądrowymi i cytoplazmatycznymi jest powiązana z mechanizmami oporności na różne metody leczenia raka7. Izolacja przedziałów wewnątrzkomórkowych pozwoliła na opracowanie inhibitorów eksportu jądrowego, co zmniejszyło wpływ mechanizmów oporności na różne terapie8.
Po oddzieleniu jądrowego i cytoplazmatycznego RNA, wykonywane są kroki mające na celu oczyszczenie interesującego RNA. Ponieważ zestawy do oczyszczania RNA są powszechnie spotykane w laboratoriach i służą do oczyszczania i izolowania długich RNA, dobrze spełniają cel tego protokołu. W przypadku oczyszczania RNA generowanie proporcji 260:280 większych niż 1,8 ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia jakości próbek do sekwencjonowania RNA lub innych podobnych procedur wymagających wysokiego poziomu czystości i izolacji. Nieregularne wartości 260:280 wskazują na zanieczyszczenie fenolem, wykazując słabą izolację i dając niedokładne wyniki9.
Gdy oczyszczanie RNA zostanie zakończone i potwierdzono, że wartości 260:280 przekraczają dopuszczalny zakres, qPCR został wykorzystany do walidacji wyników izolacji frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych. W tym celu użyto starterów specyficznych dla obszaru zainteresowania, aby zademonstrować poziomy frakcjonowania jądrowego i cytoplazmatycznego. W tym protokole MALAT1 i TUG1 zostały użyte jako markery jądrowe i cytoplazmatyczne odpowiednio10. Razem pozwalają one na wykazanie wysokiego poziomu frakcjonowania jądrowego za pomocą MALAT1, podczas gdy oczekuje się, że frakcjonowanie cytoplazmatyczne będzie niskie. I odwrotnie, gdy stosuje się TUG1, oczekuje się, że poziomy frakcjonowania cytoplazmatycznego będą wyższe niż poziomy frakcjonowania jądrowego.
Korzystając z tego protokołu, możliwe było wyizolowanie RNA na podstawie ich pozycji działania w komórce. Ze względu na powszechny dostęp do wielu materiałów i wykorzystanie podczas tego eksperymentu wyłącznie buforu do lizy i technik wirowania opartych na gęstości, zastosowanie do innych typów RNA i innych składników komórkowych jest powszechne. Może to dostarczyć ważnych informacji, rzucając światło na zdarzenia wyrażeń specyficzne dla lokalizacji, które w przeciwnym razie byłyby nie do odróżnienia bez separacji.

<table><tbody><tr><td>Agilent Tapestation</td><td>Agilent</td><td>G2991BA</td><td>System Agilent TapeStation to zautomatyzowane rozwiązanie do elektroforezy do kontroli jakości próbek DNA i RNA.&nbsp;</td></tr><tr><td>0,5% Nonidet P-40</td><td>Thermo-Fischer</td><td>28324</td><td>Stosowany do wytwarzania buforu do lizy</td></tr><tr><td>50 mM Tris-Cl pH 8,0</td><td>Thermo-Fischer</td><td>15568025</td><td>Stosowany do wytwarzania buforu do lizy</td></tr><tr><td>MALAT1 GE Test</td><td>Thermo-Fischer</td><td>Hs00273907_s1</td><td>Używany do potwierdzania frakcji jądrowej.</td></tr><tr><td>Optyczna 96-dołkowa płytka reakcyjna MicroAmp z kodem kreskowym</td><td>Thermo-Fischer</td><td>4326659</td><td>Optyczna 96-dołkowa płytka reakcyjna MicroAmp firmy Applied Biosystems z kodem kreskowym została zoptymalizowana, aby zapewnić niezrównaną dokładność i jednorodność temperatury w celu szybkiej i wydajnej amplifikacji PCR. Ta płytka, wykonana z pojedynczego sztywnego kawałka polipropylenu w formacie 96-dołkowym, jest kompatybilna z 96-dołkowymi systemami PCR w czasie rzeczywistym i termocyklerami firmy Applied Biosystems.</td></tr><tr><td>Optyczna folia samoprzylepna MicroAmp</td><td>Thermo-Fischer</td><td>4311971</td><td>Stosowana przezroczysta folia samoprzylepna MicroAmp zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia od studni do studni i parowania próbki po nałożeniu na mikropłytkę podczas qPCR</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-023</td><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) to zrównoważony roztwór soli, który jest używany do różnych zastosowań w hodowlach komórkowych, takich jak mycie komórek przed dysocjacją, transport komórek lub próbek tkanek, rozcieńczanie komórek do liczenia i przygotowywanie odczynników.</td></tr><tr><td>Qiagen RNA Clean Up Kit-Rneasy Mini Kit</td> Zestawy do oczyszczania RNA <td>Qiagen</td><td>74106</td><td>umożliwiają skuteczne oczyszczanie RNA z reakcji enzymatycznych i oczyszczanie RNA oczyszczonego różnymi metodami. Zawiera RW1, RLT, RW1 wymienione w całym protokole.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie QuantStudio 6</td><td>Thermo-Fischer</td><td>A43180</td><td>qPCR wykorzystywane podczas protokołu. Zawiera oprogramowanie do projektowania i analizy do analizy próbek frakcjonowanych</td></tr><tr><td>Bufor RLT</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>Bufor do lizy z zestawu do czyszczenia RNA</td></tr><tr><td>Bufor RPE</td><td>1018013</td><td></td><td>Wash Bufor z zestawu do czyszczenia</td></tr><tr><td>RNA Bufor RW1 Bufor</td><td>Qiagen</td><td>1053394</td><td>Wash z zestawu do czyszczenia RNA</td></tr><tr><td>Testy ekspresji genów Taqman</td><td>Thermo-Fischer</td><td>4331182</td><td>Testy ekspresji genów TaqMan firmy Applied Biosystems stanowią największy zbiór wstępnie zaprojektowanych testów w branży, z ponad 2,8 milionami testów dla 32 gatunków eukariotycznych i licznych drobnoustrojów. Testy ekspresji genów TaqMan umożliwiają szybkie uzyskanie wyników bez marnowania czasu na optymalizację starterów SYBR Green i bez dodatkowego czasu spędzonego na uruchamianiu i analizowaniu krzywych topnienia.</td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Thermo-Fischer</td><td>4305719</td><td>TaqMan Universal PCR Master Mix to idealne rozwiązanie odczynnika, gdy potrzebujesz mieszanki wzorcowej do wielu zastosowań nukleazy DNA 5'. Odczynniki Applied Biosystems zostały zwalidowane za pomocą testów TaqMan i systemów czasu rzeczywistego Applied Biosystems, aby zapewnić czułe, dokładne i niezawodne działanie za każdym razem.</td></tr><tr><td>Test TUG1 GE</td><td>Thermo-Fischer</td><td>Hs00215501_m1</td><td>Służy do potwierdzania frakcji cytoplazmatycznej.</td></tr><tr><td>Woda uzdatniona UltraPure DEPC</td><td>Thermo-Fischer</td><td>750024</td><td>Woda uzdatniona UltraPure DEPC nadaje się do stosowania z RNA. Przygotowuje się go przez inkubację z 0,1% dietylowęglanem (DEPC), a następnie jest sterylizowany w autoklawie w celu usunięcia DEPC. Sterylne z filtrem.</td></tr></tbody></table>

przygotowanie cytoplazmatycznych i jądrowych długich rna z komórek pierwotnych i hodowanych

Preparation of Cytoplasmic and Nuclear Long RNAs from Primary and Cultured Cells

Rozdzielanie składników wewnątrzkomórkowych jest kluczowym narzędziem w biologii komórkowej od wielu lat i jest w stanie dostarczyć użytecznych informacji na temat tego, jak ich lokalizacja może wpływać na ich funkcję. W szczególności oddzielenie jądrowego i cytoplazmatycznego RNA stało się ważne w kontekście komórek nowotworowych i poszukiwania nowych celów dla leków. Zakup zestawów do ekstrakcji jądrowo-cytoplazmatycznego RNA może być kosztowny, gdy wiele wymaganych materiałów można znaleźć w typowych warunkach laboratoryjnych. Korzystając z obecnej metody, która może zastąpić droższe zestawy lub inne czasochłonne procesy, do wyizolowania jądrowego i cytoplazmatycznego RNA potrzebny jest tylko domowy bufor do lizy, wirówka stołowa i kolumny oczyszczające do izolacji RNA. Bufor do lizy służy do delikatnej lizy zewnętrznej błony komórki bez wpływu na integralność otoczki jądrowej, co pozwala na uwolnienie jej składników wewnątrzkomórkowych. Następnie jądra można wyizolować za pomocą prostego etapu wirowania, ponieważ mają one większą gęstość niż roztwór do lizy. Wirowanie stosuje się do oddzielenia tych obszarów na podstawie ich różnic gęstości w celu wyizolowania elementów subkomórkowych w jądrze od tych w cytoplazmie. Po odwirowaniu wyizolowania różnych składników, zestaw do czyszczenia RNA jest używany do oczyszczania zawartości RNA, a qPCR jest wykonywany w celu walidacji jakości separacji, określonej ilościowo na podstawie ilości jądrowego i cytoplazmatycznego RNA w różnych frakcjach. Osiągnięto statystycznie istotne poziomy separacji, co ilustruje skuteczność protokołu. Ponadto system ten można dostosować do izolacji różnych typów RNA (całkowitego, małego RNA itp.), co pozwala na ukierunkowane badanie interakcji cytoplazma-jądro i pomaga w zrozumieniu różnic w funkcji RNA, które znajdują się w jądrze i cytoplazmie.

Aby upewnić się, że uzyskano separację frakcji jądrowej i cytoplazmatycznej, przeprowadzono analizę qPCR w celu walidacji wyników. W tym celu wykorzystano primery specyficzne dla interesującego regionu, aby wykazać poziom frakcjonowania jądrowego i cytoplazmatycznego. W niniejszym badaniu jako primery dla frakcji jądrowej i cytoplazmatycznej zastosowano odpowiednio MALAT1 i TUG1. Pozwalają one na wykazanie wysokiego poziomu frakcjonowania jądrowego, gdzie MALAT1 służy jako kontrola pozytywna dla elementów jądrowych, podc...

Obecny protokół oferuje efektywną i elastyczną metodę izolacji RNA z frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych za pomocą hodowanych komórek, a następnie walidacji za pomocą qPCR. Skutecznie służy jako zamiennik dla innych zestawów do przygotowania RNA.

Przygotowanie cytoplazmatycznych i jądrowych długich RNA z komórek pierwotnych i hodowanych

The separation of intracellular components has been a key tool in cellular biology for many years now and has been able to provide useful insight into how ...

Protokół ten jest niezbędny do oceny różnych ról zdefiniowanych elementów biochemicznych w jądrze i cytoplazmie oraz do analizy interakcji wewnątrzkomórkowych między tymi domenami w różnych liniach komórkowych. Technika ta wykorzystuje zwykły sprzęt laboratoryjny i odczynniki do skuteczniejszego oddzielania frakcji cytoplazmatycznej i jądrowej. Ten protokół może to zrobić taniej i szybciej niż inne protokoły.W miarę jak badania nad interakcjami cytoplazmatycznymi i jądrowymi stają się coraz bardziej powszechne, wpływ lokalizacji na zdarzenia wewnątrzkomórkowe może stać się lepiej poznany. Wymiana między cytoplazmą a jądrem może być analizowana, wskazując, czy pewne cząsteczki podczas tych wymian mogą prowadzić do rozwoju raka, jak wykazały badania nad białkami jądrowymi. Najważniejszym krokiem w protokole jest modyfikacja stężenia buforu do lizy do odpowiedniego stężenia.Ponieważ użycie buforu do lizy w dużej mierze zależy od przerwania błon komórkowych i istnieją naturalne warianty skuteczności buforu do lizy na różnych liniach komórkowych. Na początek należy granulować komórki za pomocą 1,5 mililitrowych probówek przez wirowanie przez pięć minut w temperaturze 2000 G. Wyrzucić supernatant za pomocą pipety zasysającej. Zawiesić osad w 300 mikrolitrach lodowatego buforu do lizy.Następnie obracaj rurki z prędkością około 12 000 G w czterech stopniach Celsjusza przez dwie minuty. Ostrożnie usuń supernatant i umieść go w nowej probówce o pojemności 1,5 mililitra. Pozostała pastylka będzie frakcją jądrową.Następnie dodaj 500 mikrolitrów lodowatego PBS do osadu i odwiruj w 2000 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Aby potwierdzić rozdzielenie przedziałów za pomocą qPCR, najpierw przekształć RNA w komplementarne DNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu. Przygotuj główną mieszankę odwrotnej transkryptazy.Dodaj szablon RNA. Inkubuj reakcje w termocyklerze. Przejdź do przeprowadzenia ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy i analizy.Zacznij od rozcieńczenia syntezy cDNA wodą DEPC, aby uzyskać końcowe stężenie 20 nanogramów na mililitr. Używając głównej mieszanki PCR, przygotuj reakcję dla każdej próbki, korzystając z instrukcji ręcznych. Zdobądź komercyjne sondy niezbędne do wykrywania frakcjonowania cytoplazmatycznego i jądrowego.Użyj MALAT1 jako markera jądrowego i TUG1 jako markera cytoplazmatycznego. Obliczyć objętość każdego składnika, mnożąc każdy składnik przez trzy dla każdej z kontrprób technicznych dla danej próbki. Dla każdej próbki jądrowej i cytoplazmatycznej należy uzyskać frakcję jądrową mieszaniny z MALAT1, frakcję cytoplazmatyczną z MALAT1, frakcję jądrową z TUG1 i frakcję cytoplazmatyczną z TUG1.Krótko wirować, aby wymieszać roztwory i przenieść 20 mikrolitrów mieszaniny do każdej studzienki optycznej płytki reakcyjnej. Przykryj płytkę przezroczystą folią samoprzylepną używaną do qPCR i krótko odwiruj płytkę, aby wyeliminować pęcherzyki powietrza, a następnie odwiruj próbkę w dół z prędkością 300 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Korzystając z oprogramowania do projektowania i analizy, wybierz krzywą standardową dla parametrów cyklicznych.Korzystając z oprogramowania qPCR, wybierz uruchomienie instalacji. Na stronie właściwości pliku danych wybierz metodę i parametry cyklu wejściowego. Po wprowadzeniu parametrów cyklu wybierz zakładkę płyta i wprowadź próbki do uruchomienia.Wybierz pozycję rozpocznij uruchamianie. Po zakończeniu przebiegu utwórz arkusz kalkulacyjny danych z nazwą próbki, nazwą docelową i cyklem kwantyfikacji. Zacznij od próbek MALAT1, aby obliczyć frakcję jądrową.Odejmij frakcję cytoplazmatyczną MALAT1 od frakcji jądrowej MALAT1. Kontynuować z próbkami MALAT1 w celu obliczenia frakcji cytoplazmatycznej. Odejmij frakcję jądrową MALAT1 od frakcji cytoplazmatycznej MALAT1, a następnie oblicz dwie podniesione do ujemnej delta CQ. Obliczenia należy wykonać na próbkach TUG1.Gdy TUG1 jest obecny jako kontrola pozytywna dla elementów cytoplazmatycznych, oczekuje się, że poziomy frakcjonowania cytoplazmatycznego będą wyższe niż poziomy frakcjonowania jądrowego. Wynik ujemny, w przypadku gdy w próbce z MALAT1 obserwuje się poziomy frakcjonowania cytoplazmatycznego. Wskazuje to na zanieczyszczenie RNA wyizolowanego z frakcji jądrowej, potencjalnie z powodu zbyt niskich lub zbyt wysokich stężeń lizy.MALAT1 i TUG1 wykazywały najwyższą korelację z separacją jądrową i cytoplazmatyczną, co potwierdzono za pomocą elektroforezy Western blot i RNA, co potwierdziło czystość i jakość próbek. Dodatkowo czystość ekstraktów jądrowych i cytoplazmatycznych można wykazać za pomocą Western blot przy użyciu laminy jako markera frakcji jądrowej i alfa-tubuliny jako dodatniego markera frakcji cytoplazmatycznej. Nie zaobserwowano piku w elektroforezie cytoplazmatycznego RNA, co świadczy o wysokiej jakości i niewielkim lub zerowym zanieczyszczeniu próbki cytoplazmatycznego RNA.Zastosowanie buforu do lizy ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego frakcjonowania, a optymalizacja stężenia buforu do lizy do pożądanej linii komórkowej jest niezbędna. Technika ta pozwala na ukierunkowane badanie oddziaływań jądrowych i cytoplazmatycznych, co ma szerokie zastosowanie w różnych tematach badawczych i pozwala lepiej zrozumieć, w jaki sposób lokalizacja określonych elementów biologicznych może korelować z ich funkcją.

preparation-cytoplasmic-nuclear-long-rnas-from-primary-cultured

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W niniejszym artykule opisujemy prostą metodę izolacji pojedynczych komórek z pierwotnych kultur neuronalnych szczura oraz późniejszą analizę transkryptomu z wykorzystaniem amplifikacji aRNA. Metoda ta może zostać zastosowana do każdego typu komórek.

Analiza transkryptomu pojedynczych komórek

Opisano protokół przygotowania stabilnych ekstraktów jądrowych z komórek HeLa w małej skali. Protokół ten jest wartościowy dla analiz wymagających użycia niewielkich populacji komórek, takich jak komórki poddane działaniu leków lub RNAi. Metoda powinna być możliwa do zastosowania w szerokim zakresie analiz ekspresji genów oraz w przypadku innych typów komórek, w tym komórek pobranych od pacjentów.

Małoskalowe ekstrakty jądrowe do analiz funkcjonalnych aparatów ekspresji genów

RNA polimeraza II syntetyzuje prekursorowy RNA, który wykracza poza koniec 3' dojrzałego mRNA. Koniec dojrzałego RNA jest generowany kotranskrypcyjnie, w miejscu dyktowanym przez sekwencje RNA, poprzez aktywność endonukleazy kompleksu rozszczepienia. Tutaj szczegółowo opisujemy metodę badania reakcji rozszczepienia in vitro.

Analiza reakcji przetwarzania RNA przy użyciu systemów bezkomórkowych: 3' końcowe rozszczepienie substratów pre-mRNA in vitro

Analiza ekspresji genów w podzbiorze komórek w określonej tkance stanowi duże wyzwanie. W tym artykule opisano, jak wyizolować wysokiej jakości całkowite RNA z określonej populacji komórek, łącząc metodę szybkiego znakowania immunologicznego z mikrodysekcją wychwytu laserowego.

Izolacja RNA z subpopulacji specyficznych dla komórek za pomocą mikrodysekcji laserowej w połączeniu z szybkim znakowaniem immunologicznym

Tutaj przedstawiono protokół tworzenia zakaźnego bakteryjnego sztucznego chromosomu zawierającego pełnowymiarowe cDNA pozytywnej nici genomowego RNA wirusa japońskiego zapalenia mózgu. Protokół ten może być wykorzystany do skonstruowania funkcjonalnego cDNA innych wirusów o dodatniej nici RNA, co czyni go potężnym narzędziem genomicznym do badania biologii wirusów.

Sztuczne chromosomy bakteryjne: funkcjonalne narzędzie genomiczne do badania wirusów o dodatniej nici RNA

Ten manuskrypt opisuje podejście do izolacji wybranych pokrewnych RNP powstałych w komórkach eukariotycznych poprzez specyficzne wzbogacenie ukierunkowane na oligonukleotydy. Wykazujemy możliwość zastosowania tego podejścia poprzez wyizolowanie pokrewnego RNP związanego z retrowirusowym regionem 5' bez translacji, który składa się z helikazy DHX9 / RNA A.

Izolacja pokrewnych kompleksów RNA-białko z komórek za pomocą elucji kierowanej oligonukleotydami

Ta metoda ściągania RNA pozwala na identyfikację celów RNA długiego niekodującego RNA (lncRNA). Opierając się na hybrydyzacji domowej roboty, zaprojektowanych antysensownych sond oligonukleotydowych DNA specyficznych dla tego lncRNA w odpowiednio utrwalonej tkance lub linii komórkowej, skutecznie umożliwia wychwycenie wszystkich celów RNA lncRNA.

Procedura ściągania RNA w celu identyfikacji celów RNA długiego niekodującego RNA

Tutaj prezentujemy protokół szybkiego izolowania wysokiej jakości jąder ze świeżej lub zamrożonej tkanki do dalszego masowo równoległego sekwencjonowania RNA. Uwzględniamy opcje detergencyjno-mechanicznego i hipotoniczno-mechanicznego rozbijania tkanek oraz lizy komórek, które można wykorzystać do izolacji jąder.

Izolacja dorosłych jąder rdzenia kręgowego do masowo równoległego sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra

Tutaj prezentujemy podejście bioinformatyczne i analizy mające na celu zidentyfikowanie ekspresji LINE-1 na poziomie specyficznym dla locus.

Sekwencjonowanie RNA nowej generacji i proces bioinformatyczny w celu identyfikacji ekspresji LINE-1 na poziomie specyficznym dla locus

Izolacja pojedynczych jąder opiera się na dysocjacji i przenikaniu błony komórkowej za pomocą detergentów, etapach, które wymagają optymalizacji i są podatne na wprowadzanie artefaktów technicznych. Demonstrujemy bezdetergentowy i bezenzymatyczny protokół szybkiej izolacji nienaruszonych jąder bezpośrednio z całej tkanki, uzyskując jądra odpowiednie do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra (snRNA-Seq) lub ATAC-seq.

Izolacja jąder z całej tkanki metodą bezdetergentową i enzymatyczną

Poznaj metodę izolacji RNA z frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych w hodowanych komórkach z walidacją qPCR. To opłacalne podejście umożliwia badanie lokalizacji molekuł i ich roli w procesach komórkowych.

Przygotowanie cytoplazmatycznych i jądrowych długich RNA z komórek pierwotnych i hodowanych

Przeglądaj więcej filmów