In vivo (in vivo) Szerokokątne i dwufotonowe obrazowanie wapnia za pomocą myszy przy użyciu dużego okna czaszki
4 sierpnia 2022
Obecny protokół opisuje wykonanie dużego (6 x 3 mm2) okna czaszki przy użyciu folii spożywczej, przezroczystego silikonu i szkła nakrywkowego. To okno czaszkowe pozwala na eksperymenty in vivo z obrazowaniem wapnia w szerokim polu i z dwoma fotonami na tej samej myszy.
Protokół ten pokazuje tworzenie dużego okna czaszkowego do pomiaru aktywności rezerwacji szerokiego pola i pojedynczej komórki u tej samej myszy. Korzystając z naszej metody, duże i stabilne okno czaszki można wykonać z folii spożywczej przy niskich kosztach. Ta metoda jest skuteczna w badaniu aktywności neuronalnej i glejowej podczas zachowania na poziomie makroskopowym i mikroskopowym.
Zaleca się rozpoczęcie od małego okna czaszkowego. Następnie, jeśli to się powiedzie, zwiększ rozmiar okna. Zacznij od usunięcia dodatkowego cementu z czaszki za pomocą wiertła dentystycznego.
Zaznacz obszar do wycięcia długopisem. Naciąć kość za pomocą skalpela z końcówką, aby upewnić się, że końcówka nie przebije czaszki. Kilkakrotnie zeskrob kość skalpelem, aby pogłębić rowek, aż kość w obszarze, który ma być przycięty, poruszy się po lekkim dotknięciu.
Usuń naciętą kość delikatną pęsetą. Uważaj, aby nie wepchnąć płata kostnego do mózgu, co może spowodować uszkodzenie mózgu. Aby usunąć oponę twardą, przetnij oponę twardą za pomocą wyciągniętej szklanej pipety ze zwężającą się końcówką o długości około 10 mikrometrów.
Użyj igły w kształcie litery U, aby rozszerzyć to cięcie na całe okno. Pod mikroskopem stereoskopowym ustawionym na zoom od 60 do 100x usuń odciętą oponę twardą za pomocą ultracienkiej pęsety. W przypadku krwawienia spłukać płynem mózgowo-rdzeniowym lub użyć gąbki żelatynowej w celu zatrzymania krwawienia.
Następnie wysterylizuj duży kawałek folii PVDC przez autoklawowanie i 70% etanol. Pod mikroskopem stereoskopowym użyj pęsety i skalpela, aby wyciąć owijkę o wymaganym rozmiarze. Umieść okład na powierzchni mózgu, pozostawiając aCSF na powierzchni.
Odessać aCSF z krawędzi chusty, pozwalając owijce mocno przylegać do powierzchni mózgu. Przytnij okład skalpelem i pęsetą tak, aby między krawędzią okienka czaszki a okładem był około jednego milimetra marginesu. Po założeniu owijki przyklej krawędź owijki do czaszki za pomocą kleju biologicznego.
Pozostaw klej do wyschnięcia na około 30 minut. Za pomocą dozownika z końcówką mieszającą nałóż przezroczysty elastomer silikonowy na wierzch folii. Umieść na wierzchu szkło nakrywkowe o grubości od 0,12 do 0,17 milimetra.
Uszczelnij obwód szkła nakrywkowego wodoodporną folią, klejem Superglue lub cementem dentystycznym. Najpierw wymieszaj roztwory fibroiny i AAV w stosunku od jednego do czterech w małej probówce z próbką. Upuść porcję roztworu na folię spożywczą na okienko czaszki i susz przez co najmniej trzy godziny.
Następnie przymocuj opaskę do powierzchni mózgu, jak pokazano w poprzedniej sekcji. Regularnie sprawdzaj stan myszy i okien, przez dwa do czterech tygodni. Do tego czasu genetycznie kodowane wskaźniki wapnia zostaną wystarczająco wyrażone po utworzeniu okna leczonego AAV.
Korzystając z tego protokołu, okna czaszkowe można było utrzymać u ośmiu z 10 myszy przez okres do 10 tygodni. Szerokie okno jest tworzone z folii, przezroczystego silikonu i szkła nakrywkowego u transgenicznej myszy eksprymującej zakotwiczony w błonie genetycznie kodowany wskaźnik wapnia w astrocytach. Przez to okno przeprowadzono obrazowanie wapnia w szerokim polu i zaobserwowano zmiany fluorescencji, gdy zastosowano stymulację zaciągania się powietrzem do przeciwległych wąsów.
Przebieg w czasie zmiany fluorescencji w korze somatosensorycznej wykazał aktywność korową. Obrazowanie dwufotonowe pozwoliło na obserwację obrazów fluorescencyjnych pojedynczych komórek specyficznych dla komórek glejowych. Zmiany fluorescencji wywołane stymulacją sensoryczną obserwowano w pojedynczych komórkach z różnych obszarów kory mózgowej.
Wrap kodowany genetycznie kodowanym wskaźnikiem wapnia z ekspresją AAV; A fibroina została użyta do wykonania okna czaszkowego. Obrazowanie wapnia w szerokim polu wykazało aktywność kory mózgowej rozprzestrzeniającą się w korze mózgowej indukowaną stymulacją sensoryczną dwa do czterech tygodni po operacji. Ponieważ okno było duże, zobrazowano różne obszary korowe tej samej myszy i zaobserwowano zmiany fluorescencji wywołane stymulacją sensoryczną w poszczególnych komórkach.
Ważne jest, aby uniknąć uszkodzenia mózgu podczas tworzenia okna czaszkowego. Na myszach z dużym oknem czaszkowym można wykonywać zadania behawioralne. Pozwoli to na zbadanie związku między aktywnością neuronalną a zachowaniem myszy.
Metodę tę można zastosować w różnych badaniach neurobiologicznych. Na przykład może być używany do obserwacji aktywności kory mózgowej podczas podejmowania decyzji, biegania motorycznego oraz w masowych modelach uszkodzeń i chorób mózgu.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół tworzenia dużego okna czaszkowego u myszy z wykorzystaniem folii spożywczej, przezroczystego silikonu oraz szkiełka podstawowego. Okno to umożliwia obrazowanie wapnia w szerokim polu oraz z wykorzystaniem dwufotonowego mikroskopu w celu zbadania aktywności neuronów i gleju podczas zachowań, co pozwala na uzyskanie wglądu w dynamikę kory oraz integrację sensoromotoryczną.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Obrazowanie wapnia
- Techniki obrazowania in vivo
Wstęp
- Pomiar aktywności neuronalnej jest kluczowy dla zrozumienia funkcji mózgu.
- Okna czaszkowe umożliwiają przewlekłe obrazowanie u żywych osobników.
- Proponowana metoda jest kosztowo efektywna i skalowalna.
- Wcześniejsze techniki mogły nie zapewniać możliwości obrazowania dużych obszarów.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody tworzenia dużych okien czaszkowych.
- Umożliwienie obserwacji aktywności neuronalnej i glejowej w czasie rzeczywistym.
- Umożliwienie badania zależności między zachowaniem a odpowiedzią u myszy.
Zastosowane metody
- Duże okna czaszkowe wykonano przy użyciu folii spożywczej, silikonu i szkiełek podstawowych.
- Model obejmował myszy transgeniczne wykazujące ekspresję genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.
- Szczegółowy opis przygotowania okna, w tym etapy chirurgiczne i zastosowane materiały.
- Technika ta wymagała ostrożnego postępowania w celu uniknięcia uszkodzeń mózgu.
- Obrazowanie wapnia przeprowadzono od dwóch do czterech tygodni po operacji.
Główne wyniki
- Duże okno umożliwiło obserwację aktywności kory indukowanej stymulacją sensoryczną.
- Odnotowano zmiany fluorescencji, co wskazywało na odpowiedzi neuronalne w różnych obszarach kory.
- U ośmiu z dziesięciu myszy okna pozostały funkcjonalne przez okres do dziesięciu tygodni.
- Wstępne próby zasugerowały, że rozpoczęcie od mniejszych okien zwiększa szanse na sukces.
Wnioski
- Niniejszy protokół umożliwia szczegółowe badania aktywności mózgu u myszy podczas zachowań.
- Metoda ta znajduje potencjalne zastosowanie w różnych obszarach badań nad neuronauką.
- Zdobyta wiedza może przyczynić się do lepszego zrozumienia plastyczności neuronalnej oraz neuronauki behawioralnej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Przygotowanie dużego okna czaszkowego u myszy umożliwia jednoczesne szerokopolowe i dwufotonowe obrazowanie wapnia, co pozwala na wielkoskalową analizę dynamiki neuronów i gleju podczas zachowań. Możliwość ta zwiększa pewność predykcyjną w przedklinicznych modelach neuronauki poprzez powiązanie makroskopowej aktywności obwodów z rozdzielczością pojedynczych komórek. Efektywność kosztowa oraz stabilność tej metody ułatwiają prowadzenie skalowalnych i powtarzalnych badań istotnych dla wczesnych etapów odkryć oraz procesów badań translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią obserwację aktywności neuronalnej i glejowej w odpowiedzi na bodźce behawioralne.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez korelację odpowiedzi na poziomie obwodów i komórek.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów w systemach neuronalnych istotnych dla przebiegu choroby.
Przesiew i opracowanie testu
- Zapewnia zwalidowaną platformę in vivo do ilościowych pomiarów obrazowania wapnia.
- Wspiera powtarzalność i standaryzację testów w wielu obszarach kory mózgowej.
- Umożliwia przesiewowe badanie interwencji genetycznych lub farmakologicznych z wysoką rozdzielczością przestrzenną.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie modeli przedklinicznych do dynamiki obwodów neuronalnych istotnych dla przebiegu choroby.
- Umożliwia prowadzenie badań podłużnych nad plastycznością neuronalną oraz modelami uszkodzeń.
- Wspiera podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez powiązanie zachowania z aktywnością neuronalną.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta łączy wczesne etapy odkrywania, identyfikację związków wiodących oraz walidację przedkliniczną, umożliwiając obrazowanie wieloskalowe u myszy w trakcie zachowania.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących funkcji obwodów neuronalnych i oddziaływań glejowych.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki obrazowania do przesiewania związków chemicznych lub genetycznego.
- Analityka: Zapewnia dane o wysokiej zawartości (high-content) do porównywania odpowiedzi neuronalnych w różnych warunkach i punktach czasowych.
- Badania translacyjne: Ułatwia przejście od podstawowych odkryć do modelowania chorób i poszukiwania biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalną, kosztowo efektywną platformę, którą można dostosować do różnorodnych programów B+R w dziedzinie neuronauki.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad celami neuronalnymi.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy w obrazowaniu in vivo i wspiera powtarzalność między badaniami.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje go/no-go oraz efektywność kapitałową dzięki umożliwieniu solidnego, wielkoskalowego gromadzenia danych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację aktywów neuronaukowych i modeli translacyjnych z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikrochirurgii oraz technik obrazowania in vivo.
- Wymaga dostępu do infrastruktury mikroskopii szerokopolowej i dwufotonowej.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie przygotowania okna oraz protokołów obrazowania.
- Metoda jest możliwa do adaptacji dla różnych strategii znakowania transgenicznego lub wirusowego celów neuronalnych i glejowych.
- Staranna technika chirurgiczna jest niezbędna, aby uniknąć uszkodzenia mózgu i zapewnić długotrwałą szczelność okna.
