In vivo (in vivo) Szerokokątne i dwufotonowe obrazowanie wapnia za pomocą myszy przy użyciu dużego okna czaszki

Protokół ten pokazuje tworzenie dużego okna czaszkowego do pomiaru aktywności rezerwacji szerokiego pola i pojedynczej komórki u tej samej myszy. Korzystając z naszej metody, duże i stabilne okno czaszki można wykonać z folii spożywczej przy niskich kosztach. Ta metoda jest skuteczna w badaniu aktywności neuronalnej i glejowej podczas zachowania na poziomie makroskopowym i mikroskopowym.

Zaleca się rozpoczęcie od małego okna czaszkowego. Następnie, jeśli to się powiedzie, zwiększ rozmiar okna. Zacznij od usunięcia dodatkowego cementu z czaszki za pomocą wiertła dentystycznego.

Zaznacz obszar do wycięcia długopisem. Naciąć kość za pomocą skalpela z końcówką, aby upewnić się, że końcówka nie przebije czaszki. Kilkakrotnie zeskrob kość skalpelem, aby pogłębić rowek, aż kość w obszarze, który ma być przycięty, poruszy się po lekkim dotknięciu.

Usuń naciętą kość delikatną pęsetą. Uważaj, aby nie wepchnąć płata kostnego do mózgu, co może spowodować uszkodzenie mózgu. Aby usunąć oponę twardą, przetnij oponę twardą za pomocą wyciągniętej szklanej pipety ze zwężającą się końcówką o długości około 10 mikrometrów.

Użyj igły w kształcie litery U, aby rozszerzyć to cięcie na całe okno. Pod mikroskopem stereoskopowym ustawionym na zoom od 60 do 100x usuń odciętą oponę twardą za pomocą ultracienkiej pęsety. W przypadku krwawienia spłukać płynem mózgowo-rdzeniowym lub użyć gąbki żelatynowej w celu zatrzymania krwawienia.

Następnie wysterylizuj duży kawałek folii PVDC przez autoklawowanie i 70% etanol. Pod mikroskopem stereoskopowym użyj pęsety i skalpela, aby wyciąć owijkę o wymaganym rozmiarze. Umieść okład na powierzchni mózgu, pozostawiając aCSF na powierzchni.

Odessać aCSF z krawędzi chusty, pozwalając owijce mocno przylegać do powierzchni mózgu. Przytnij okład skalpelem i pęsetą tak, aby między krawędzią okienka czaszki a okładem był około jednego milimetra marginesu. Po założeniu owijki przyklej krawędź owijki do czaszki za pomocą kleju biologicznego.

Pozostaw klej do wyschnięcia na około 30 minut. Za pomocą dozownika z końcówką mieszającą nałóż przezroczysty elastomer silikonowy na wierzch folii. Umieść na wierzchu szkło nakrywkowe o grubości od 0,12 do 0,17 milimetra.

Uszczelnij obwód szkła nakrywkowego wodoodporną folią, klejem Superglue lub cementem dentystycznym. Najpierw wymieszaj roztwory fibroiny i AAV w stosunku od jednego do czterech w małej probówce z próbką. Upuść porcję roztworu na folię spożywczą na okienko czaszki i susz przez co najmniej trzy godziny.

Następnie przymocuj opaskę do powierzchni mózgu, jak pokazano w poprzedniej sekcji. Regularnie sprawdzaj stan myszy i okien, przez dwa do czterech tygodni. Do tego czasu genetycznie kodowane wskaźniki wapnia zostaną wystarczająco wyrażone po utworzeniu okna leczonego AAV.

Korzystając z tego protokołu, okna czaszkowe można było utrzymać u ośmiu z 10 myszy przez okres do 10 tygodni. Szerokie okno jest tworzone z folii, przezroczystego silikonu i szkła nakrywkowego u transgenicznej myszy eksprymującej zakotwiczony w błonie genetycznie kodowany wskaźnik wapnia w astrocytach. Przez to okno przeprowadzono obrazowanie wapnia w szerokim polu i zaobserwowano zmiany fluorescencji, gdy zastosowano stymulację zaciągania się powietrzem do przeciwległych wąsów.

Przebieg w czasie zmiany fluorescencji w korze somatosensorycznej wykazał aktywność korową. Obrazowanie dwufotonowe pozwoliło na obserwację obrazów fluorescencyjnych pojedynczych komórek specyficznych dla komórek glejowych. Zmiany fluorescencji wywołane stymulacją sensoryczną obserwowano w pojedynczych komórkach z różnych obszarów kory mózgowej.

Wrap kodowany genetycznie kodowanym wskaźnikiem wapnia z ekspresją AAV; A fibroina została użyta do wykonania okna czaszkowego. Obrazowanie wapnia w szerokim polu wykazało aktywność kory mózgowej rozprzestrzeniającą się w korze mózgowej indukowaną stymulacją sensoryczną dwa do czterech tygodni po operacji. Ponieważ okno było duże, zobrazowano różne obszary korowe tej samej myszy i zaobserwowano zmiany fluorescencji wywołane stymulacją sensoryczną w poszczególnych komórkach.

Ważne jest, aby uniknąć uszkodzenia mózgu podczas tworzenia okna czaszkowego. Na myszach z dużym oknem czaszkowym można wykonywać zadania behawioralne. Pozwoli to na zbadanie związku między aktywnością neuronalną a zachowaniem myszy.

Metodę tę można zastosować w różnych badaniach neurobiologicznych. Na przykład może być używany do obserwacji aktywności kory mózgowej podczas podejmowania decyzji, biegania motorycznego oraz w masowych modelach uszkodzeń i chorób mózgu.