Name: In vivo (in vivo) Szerokokątne i dwufotonowe obrazowanie wapnia za pomocą myszy przy użyciu dużego okna czaszki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Poznaj metodę tworzenia dużego okna czaszki u myszy przy użyciu folii spożywczej i silikonu do szerokokątowego oraz dwufotonowego obrazowania wapnia. Ta technika umożliwia badanie aktywności neuronów i komórek glejowych podczas zachowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Grant-in-Aid for Transformative Research Areas (A) 'Glial Decoding' (JP21H05621 do SM), JSPS KAKENHI (JP19K06883 do SM, 15KK0340 do ES, JP22H00432, JP22H05160, JP17H06312 do HB, a JP17H06313 do KK), Grant-in-Aid for Brain Mapping by Integrated Neurotechnologies for Disease Studies (Brain/MINDS) (JP19dm0207079h0002 do SM, JP19dm0207079 do HB, oraz JP19dm0207080 do KK), Narishige Neuroscience Research Foundation (do SM), Grant dla Młodego Naukowca z prefektury Yamanashi (do SM) oraz Takeda Science Foundation (do SM) i częściowo wspierane przez The Frontier Brain Research Grant z Univ. Yamanashi.
Dziękujemy N. Yaguchi i K. Okazaki za opiekę nad zwierzętami i pomoc techniczną oraz członkom laboratorium Kitamura za pomocne dyskusje.

Procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu Yamanashi. W badaniu wykorzystano myszy typu dzikiego (C57BL/6J, Japan SLC) i transgeniczne wykazujące ekspresję GECI zakotwiczonego w błonie (Lck-GCaMP6f) w astrocytach. Transgeniczne myszy uzyskano przez skrzyżowanie myszy AldH1l1-CreERT2 [B6N. FVB-Tg(Aldh1l1-cre/ERT2)1Khakh/J, uzyskany komercyjnie, patrz tabela materiałów] i myszy Flx-Lck-GCaMP6f [C57BL/6N-Gt(ROSA)26Sor<tm1(CAG-GCaMP6f)Khak>/J, uzyskane komercyjnie] myszy. Transgeniczne myszy leczono tamoksyfenem (20 mg / ml) przez 5 dni (0,05 ml / 10 g masy ciała, i.p.) w celu ekspresji GCaMP6f. Wszystkie użyte myszy były samcami i samicami w wieku co najmniej 4 tygodni. Schemat okna jest pokazany w <silna klasa="xfig">Rysunek 1A, a procedura chirurgiczna jest podsumowana w <silna klasa="xfig">Rysunek 1B.
1. Przygotowanie do operacji okna czaszkowego
<ol>
	<li>Znieczulenie myszy izofluranem (indukcja: 3%, operacja: 1%-1,5%, natężenie przepływu: 0,2-0,3 l/min). Potwierdź głębokość znieczulenia przez utratę odruchu szczypania ogona lub palca. Utrzymuj temperaturę ciała za pomocą poduszki grzewczej (36-38 °C). Nałóż maść na oczy za pomocą bawełnianego wacika, aby zapobiec wysychaniu oczu myszy pod narkozą.</li>
	<li>Wstrzyknąć 15% roztwór mannitolu (patrz Tabela materiałów) dootrzewnowo (3 ml/100 g masy ciała). Zamocuj głowę myszy na stereotaktycznej ramie z nausznikami. Usuń włosy z głowy myszy za pomocą golarki i kremu do depilacji.</li>
	<li>Trzykrotnie zdezynfekuj powierzchnię skóry jodonem powidonem i alkoholem.Stosuj miejscowo lidokainę, aby zapewnić prewencyjną analgezję. Usuń skórę z obszaru zainteresowania nożyczkami chirurgicznymi i odsłoń czaszkę (rozmiar: 15 x 15 mm). Jeśli występuje krwawienie, użyj bawełnianego wacika, aby zatrzymać krwawienie. 
	UWAGA: W tym badaniu skóra została usunięta, aby obserwować korę przedczołową do kory wzrokowej.</li>
	<li>Usuń okostną nad odsłoniętą czaszką za pomocą mikrokirety i osusz powierzchnię czaszki, aby mocno przymocować płytkę głowy do czaszki za pomocą cementu dentystycznego (patrz Tabela materiałów) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). 
	UWAGA: Wykonana na zamówienie płyta czołowa jest tworzona za pomocą drukarki 3D. Plik projektu jest deponowany w repozytorium Github (https://github.com/Satoshi-Manita/Head-plates).</li>
	<li>Przymocuj płytę głowicy za pomocą cementu dentystycznego (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C). Odczekaj co najmniej 20 minut, aż cement stwardnieje. Zabezpiecz płytę czołową za pomocą uchwytu płyty czołowej35.</li>
</ol>
2. Tworzenie okna czaszkowego
<ol>
	<li>Usuń nadmiar cementu z czaszki za pomocą wiertła dentystycznego (patrz Tabela materiałów). Uważaj, aby nie przewiercić kości i nie uszkodzić mózgu podczas wiercenia.</li>
	<li>Zaznacz obszar do cięcia długopisem i wciąć w kość skalpelem. Stępić końcówkę skalpela, aby upewnić się, że końcówka nie przebije czaszki (rysunek uzupełniający 1). Zapoznaj się z atlasem mózgu, aby określić, gdzie zrobić okno. 
	UWAGA: W niniejszym badaniu utworzono okienko między -2 mm a +4 mm od bregmy w osi przednio-tylnej i od szwu strzałkowego do +3 mm w osi przyśrodkowo-bocznej, w tym kory ruchowej, somatosensorycznej i wzrokowej.</li>
	<li>Kilkakrotnie zeskrob kość skalpelem, aby pogłębić rowek, aż kość w obszarze, który ma być przycięty, porusza się dobrze po lekkim dotknięciu.</li>
	<li>Usuń naciętą kość delikatną pęsetą. Nie należy wpychać płata kostnego do mózgu, ponieważ może to spowodować uszkodzenie mózgu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1Ba). 
	UWAGA: Jeśli po usunięciu kości zaobserwuje się krwawienie, należy natychmiast nałożyć i odessać sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF, patrz Tabela Materiałów) i powtarzać ten proces, aż krwawienie ustanie. Alternatywnie umieść hemostatyczną gąbkę żelatynową (około 3 mm kwadratowej kostki) nasączoną ACSF w miejscu krwawienia.</li>
	<li>Jeśli opona twarda nie zostanie usunięta, przejdź do kroku 2.7.</li>
	<li>Usuń oponę twardą, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Usuń oponę twardą, na przykład, w następujących sytuacjach: transfekcja przy użyciu metody filmu fibroina-AAV36 i obserwowanie małych struktur, takich jak kolce dendrytyczne.</li>
		<li>Przeciąć oponę twardą za pomocą wyciągniętej szklanej pipety ze zwężającą się końcówką o średnicy około 10 μm. Aby rozszerzyć to nacięcie na całe okno, użyj igły w kształcie litery U.</li>
		<li>Ustaw zoom mikroskopu stereoskopowego na 60-100x i usuń odciętą oponę twardą za pomocą ultracienkiej pęsety. Jeśli usunięcie opony twardej powoduje krwawienie, spłucz je ACSF lub użyj gąbki żelatynowej w celu zatrzymania krwawienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytnij folię PVDC.
	<ol>
		<li>Wysterylizuj duży (na przykład 10 x 15 mm) kawałek folii PVDC (około 11 μm, patrz Tabela materiałów, <silna klasa="xfig">Rysunek 2A a) przez autoklawowanie i 70% etanolu.</li>
		<li>Pod mikroskopem stereoskopowym użyj pęsety i skalpela, aby wyciąć owijkę o wymaganym rozmiarze. 
		UWAGA: Rozmiar owijki musi być o około 10 mm większy niż rozmiar okna czaszki, ale mniejszy niż otwór w płycie głowy. W przypadku okna czaszkowego o wymiarach 6 x 3mm2 przygotuj owijkę o wymiarach 15 x 10mm2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dokładnie umieść chustę, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Umieść okład na powierzchni mózgu, pozostawiając ACSF na powierzchni. Odessać ACSF od krawędzi chusty, pozwalając owijce mocno przylegać do powierzchni mózgu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1Bb,c). 
		UWAGA: Zastosowana chusta jest odporna na zagniecenia, więc samo umieszczenie jej na powierzchni mózgu prawie nie powoduje zmarszczek.</li>
		<li>Przytnij owijkę skalpelem i pęsetą tak, aby między krawędzią okienka czaszki a okładem był około 1 mm margines (<silna klasa="xfig">Rysunek 1Bd).</li>
		<li>Gdy owijka jest już na miejscu, przyklej krawędź chusty do czaszki za pomocą kleju biologicznego (patrz Tabela Materiałów, <silna klasa="xfig">Rysunek 2D). Pozostaw klej do wyschnięcia na około 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nałożyć przezroczysty elastomer silikonowy.
	<ol>
		<li>Nałóż dostępny w handlu przezroczysty elastomer silikonowy (patrz Tabela materiałów) na wierzch opakowania za pomocą dozownika z końcówką mieszającą (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1Be, 2A b-d) i umieść szkło nakrywkowe (grubość 0,12-0,17 mm) na wierzchu (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2E).</li>
		<li>Uszczelnij obwód szkła nakrywkowego wodoodporną folią, klejem superglue lub cementem dentystycznym (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1Bf).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po operacji należy monitorować mysz, aż odzyska przytomność, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Następnie trzymaj myszy pojedynczo i pozwól im dojść do siebie w klatce domowej przez co najmniej 7 dni.
	<ol>
		<li>Aby zmniejszyć stres i ból, podawaj leki przeciwzapalne i przeciwbólowe (np. deksametazon i ketoprofen, po 5 mg/kg, i.p.).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Regularnie monitoruj myszy pod kątem infekcji. Jeśli zakażenie zostanie potwierdzone, należy podać lek przeciwbakteryjny (np. 10% enrofloksacyny, 1,7 μl/ml) w wodzie do picia do czasu ustąpienia infekcji (zwykle krócej niż 4 tygodnie).</li>
</ol>
3. Wytwarzanie folii AAV na folii przy użyciu roztworu fibroiny
UWAGA: Krok 3 jest opcjonalny.
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór fibroiny z kokonów jedwabników zgodnie z wcześniej opublikowaną metodą37.
	<ol>
		<li>Krótko mówiąc, zagotuj dostępne w handlu normalne kokony jedwabników (5 g, patrz tabela materiałów) w roztworze węglanu sodu (0,02 M, 2 l). Kokony umyj w ultraczystej wodzie i wysusz przez noc.</li>
		<li>Wysuszone kokony rozpuścić w roztworze bromku litu (9,3 M, 20% w/v fibroiny) podczas ogrzewania w piecu w temperaturze 60 °C przez 4 godziny. Rozpuszczony roztwór kokonu należy poddać dializie, odwirować (dwukrotnie w temperaturze 12 700 x g, w temperaturze 4 °C przez 20 min) 37 i zebrać supernatant.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj folię fibroiny-AAV, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Wymieszaj roztwory fibroiny i AAV20 w stosunku 1:4 w małej probówce na próbkę za pomocą mikropipety. Umieść porcję mieszaniny roztworu fibroiny i AAV na folię do okienka czaszki i susz przez co najmniej 3 godziny 
		UWAGA: Aby uzyskać odciąg pokarmu na obszarze o średnicy 3 mm, nanieś 5 μl kropli roztworu fibroiny-AAV. Stosunek ten określa ilość roztworu dla danego obszaru.</li>
		<li>Po wyschnięciu pokrój folię na wymagany rozmiar dla okna (na przykład 10 x 15 mm) i umieść ją na powierzchni mózgu. Następnie postępuj zgodnie z wyżej wymienioną metodą od kroku 2.8.1. 
		UWAGA: Przed umieszczeniem opaski na powierzchni mózgu, usuń ACSF z powierzchni mózgu tak bardzo, jak to możliwe. Dzieje się tak, ponieważ oczekuje się, że ACSF rozpuści film fibroina-AAV i zmniejszy stężenie cząstek AAV.</li>
		<li>Odczekaj około 2-4 tygodnie po utworzeniu okna leczonego AAV, aż GECI zostaną wystarczająco wyrażone. Podczas tego procesu regularnie sprawdzaj stan myszy i okien.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Obrazowanie i analiza wapnia
UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat obrazowania i analizy, zobacz poprzednio opublikowane raporty1,2,38.
<ol>
	<li>Wykonaj obrazowanie szerokokątne, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Unieruchomić mysz za pomocą urządzenia do mocowania głowy pod makroskopem fluorescencyjnym z tandemową soczewką (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Oświetl korę mózgową myszy światłem wzbudzenia ze źródła światła LED 465 nm przez filtr wzbudzenia, zwierciadło dichroiczne i soczewkę obiektywu.</li>
		<li>Zbierz obrazy fluorescencyjne kory mózgowej za pomocą kamery CCD przez soczewkę obiektywu (1,0x), zwierciadło dichroiczne, filtr emisyjny i soczewkę obrazującą (2,0x). Połączenie tych soczewek daje łączne powiększenie około 0,5x.</li>
		<li>Rejestruj obrazy z częstotliwością próbkowania 50 Hz. Po pobraniu danych przeanalizuj obrazy za pomocą oprogramowania ImageJ. Wybierz obszar zainteresowania (ROI) ręcznie. Obliczać zmianę fluorescencji w każdym ROI jako ΔF/F = (Ft - F0) / F0, gdzie Ft to surowa wartość fluorescencji każdej klatki, a F0 to średnia wartość fluorescencji uzyskana ze średniego obrazu wszystkich klatek. 
		UWAGA: Program makr dla ImageJ jest zdeponowany w serwisie GitHub (https://github.com/Satoshi-Manita/ImageJ-macro), który oblicza obrazy ΔF/F na podstawie danych obrazowania wapnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie dwufotonowe, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Unieruchom mysz pod mikroskopem dwufotonowym za pomocą urządzenia do mocowania głowy. Zidentyfikuj obszar do obrazowania za pomocą mikroskopu w trybie jasnego pola z soczewką obiektywu o małym powiększeniu (5x).</li>
		<li>Przełącz się na obrazowanie dwufotonowe. Użyj soczewki obiektywowej o dużym powiększeniu (16x lub 25x) i oświetl laser w celu wzbudzenia dwufotonowego. 
		UWAGA: Zielony Lck-GCaMP6f22 i czerwony XCaMP-R36 zostały wzbudzone przez ultraszybki laser o długości fali wzbudzenia odpowiednio 920 nm i 1070 nm.</li>
		<li>Rejestruj obrazy fluorescencyjne przy 30 Hz. Po pozyskaniu danych popraw artefakty ruchu za pomocą funkcji rejestracji oprogramowania suite2p39. Uzyskaj ROI i ΔF/F z obrazów przy użyciu tej samej metody dla obrazowania szerokokątnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykreśl dane przy użyciu języka Python z następującymi bibliotekami: NumPy, Matplotlib i Pandas (patrz tabela materiałów).</li>
</ol>

<ol><li>Ren, C., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wide-field+calcium+imaging+of+cortex-wide+activity+in+awake%2C+head-fixed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Wide-field calcium imaging of cortex-wide activity in awake, head-fixed mice.</a> STAR Protocols. 2 (4), 100973(2021).</li>
<li>Couto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic%2C+cortex-wide+imaging+of+specific+cell+populations+during+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chronic, cortex-wide imaging of specific cell populations during behavior.</a> Nature Protocols. 16 (7), 3241-3263 (2021).</li>
<li>Kauvar, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+Observation+by+Synchronous+Multifocal+Optical+Sampling+Reveals+Widespread+Population+Encoding+of+Actions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cortical Observation by Synchronous Multifocal Optical Sampling Reveals Widespread Population Encoding of Actions.</a> Neuron. 107 (2), 351-367 (2020).</li>
<li>Clancy, K. B., Orsolic, I., Mrsic-Flogel, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locomotion-dependent+remapping+of+distributed+cortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Locomotion-dependent remapping of distributed cortical networks.</a> Nature Neuroscience. 22 (5), 778-786 (2019).</li>
<li>MacDowell, C. J., Buschman, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dimensional+spatiotemporal+dynamics+underlie+cortex-wide+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Low-dimensional spatiotemporal dynamics underlie cortex-wide neural activity.</a> Current Biology. 30 (14), 2665-2680 (2020).</li>
<li>Makino, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+cortex-wide+emergent+properties+during+motor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transformation of cortex-wide emergent properties during motor learning.</a> Neuron. 94 (4), 880-890 (2017).</li>
<li>Murphy, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+task+training+and+longitudinal+monitoring+of+mouse+mesoscale+cortical+circuits+using+home+cages%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Automated task training and longitudinal monitoring of mouse mesoscale cortical circuits using home cages.</a> eLife. 9, 559654(2020).</li>
<li>Rynes, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+head-mounted+microscope+for+whole-cortex+mesoscale+imaging+in+freely+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniaturized head-mounted microscope for whole-cortex mesoscale imaging in freely behaving mice.</a> Nature Methods. 18 (4), 417-425 (2021).</li>
<li>Cardin, J. A., Crair, M. C., Higley, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoscopic+imaging%3A+Shining+a+wide+light+on+large-scale+neural+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mesoscopic imaging: Shining a wide light on large-scale neural dynamics.</a> Neuron. 108 (1), 33-43 (2020).</li>
<li>Ren, C., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+cortex-wide+dynamics+with+wide-field+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Characterizing cortex-wide dynamics with wide-field calcium imaging.</a> The Journal of Neuroscience. 41 (19), 4160-4168 (2021).</li>
<li>Hamodi, A. S., Martinez Sabino, A., Fitzgerald, N. D., Moschou, D., Crair, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transverse+sinus+injections+drive+robust+whole-brain+expression+of+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Transverse sinus injections drive robust whole-brain expression of transgenes.</a> eLife. 9, 53639(2020).</li>
<li>Michelson, N. J., Vanni, M. P., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+transgenic+and+AAV-PHP.eB-mediated+expression+of+GCaMP6s+using+in+vivo+wide-field+functional+imaging+of+brain+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Comparison between transgenic and AAV-PHP.eB-mediated expression of GCaMP6s using in vivo wide-field functional imaging of brain activity.</a> Neurophotonics. 6 (2), 025014(2019).</li>
<li>Oomoto, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+cortical-wide+field-of-view+two-photon+imaging+with+quick+neonatal+adeno-associated+virus+injection%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for cortical-wide field-of-view two-photon imaging with quick neonatal adeno-associated virus injection.</a> STAR Protocols. 2 (4), 101007(2021).</li>
<li>Fan, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-rate+imaging+of+biological+dynamics+at+centimetre+scale+and+micrometre+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Video-rate imaging of biological dynamics at centimetre scale and micrometre resolution.</a> Nature Photonics. 13 (11), 809-816 (2019).</li>
<li>Stuart, G. J., Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+integration%3A+60+years+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dendritic integration: 60 years of progress.</a> Nature Neuroscience. 18 (12), 1713-1721 (2015).</li>
<li>Grienberger, C., Chen, X., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+function+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Dendritic function in vivo.</a> Trends in Neurosciences. 38 (1), 45-54 (2015).</li>
<li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locally+synchronized+synaptic+inputs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Locally synchronized synaptic inputs.</a> Science. 335 (6066), 353-356 (2012).</li>
<li>Kitamura, K., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+calcium+signaling+triggered+by+spontaneous+and+sensory-evoked+climbing+fiber+input+to+cerebellar+Purkinje+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dendritic calcium signaling triggered by spontaneous and sensory-evoked climbing fiber input to cerebellar Purkinje cells in vivo.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (30), 10847-10858 (2011).</li>
<li>Manita, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+top-down+cortical+circuit+for+accurate+sensory+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A top-down cortical circuit for accurate sensory perception.</a> Neuron. 86 (5), 1304-1316 (2015).</li>
<li>Stobart, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+circuit+activity+evokes+rapid+astrocyte+calcium+signals+on+a+similar+timescale+to+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons.</a> Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+signaling+in+astrocytes+from+Ip3r2%28-%2F-%29+mice+in+brain+slices+and+during+startle+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo.</a> Nature Neuroscience. 18 (5), 708-717 (2015).</li>
<li>Shigetomi, E., Patel, S., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+complexities+of+astrocyte+calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Probing the complexities of astrocyte calcium signaling.</a> Trends in Cell Biology. 26 (4), 300-312 (2016).</li>
<li>Tischbirek, C., Birkner, A., Jia, H., Sakmann, B., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+two-photon+brain+imaging+with+a+red-shifted+fluorometric+Ca2%2B+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Deep two-photon brain imaging with a red-shifted fluorometric Ca2+ indicator.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (36), 11377-11382 (2015).</li>
<li>Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+the+medial+prefrontal+cortex+and+hippocampus+without+cortical+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion.</a> eLife. 6, 26839(2017).</li>
<li>Demas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cortex-wide+volumetric+recording+of+neuroactivity+at+cellular+resolution+using+light+beads+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">cortex-wide volumetric recording of neuroactivity at cellular resolution using light beads microscopy.</a> Nature Methods. 18 (9), 1103-1111 (2021).</li>
<li>Ota, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cell-resolution%2C+contiguous-wide+two-photon+imaging+to+reveal+functional+network+architectures+across+multi-modal+cortical+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">cell-resolution, contiguous-wide two-photon imaging to reveal functional network architectures across multi-modal cortical areas.</a> Neuron. 109 (11), 1810-1824 (2021).</li>
<li>Sofroniew, N. J., Flickinger, D., King, J., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+field+of+view+two-photon+mesoscope+with+subcellular+resolution+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A large field of view two-photon mesoscope with subcellular resolution for in vivo imaging.</a> eLife. 5, 14472(2016).</li>
<li>Stirman, J. N., Smith, I. T., Kudenov, M. W., Smith, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wide+field-of-view%2C+multi-region%2C+two-photon+imaging+of+neuronal+activity+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Wide field-of-view, multi-region, two-photon imaging of neuronal activity in the mammalian brain.</a> Nature Biotechnology. 34 (8), 857-862 (2016).</li>
<li>Yu, C. H., Stirman, J. N., Yu, Y., Hira, R., Smith, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diesel2p+mesoscope+with+dual+independent+scan+engines+for+flexible+capture+of+dynamics+in+distributed+neural+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Diesel2p mesoscope with dual independent scan engines for flexible capture of dynamics in distributed neural circuitry.</a> Nature Communications. 12 (1), 6639(2021).</li>
<li>Barson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+mesoscopic+and+two-photon+imaging+of+neuronal+activity+in+cortical+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous mesoscopic and two-photon imaging of neuronal activity in cortical circuits.</a> Nature Methods. 17 (1), 107-113 (2020).</li>
<li>Wekselblatt, J. B., Flister, E. D., Piscopo, D. M., Niell, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+imaging+of+cortical+dynamics+during+sensory+perception+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Large-scale imaging of cortical dynamics during sensory perception and behavior.</a> Journal of Neurophysiology. 115 (6), 2852-2866 (2016).</li>
<li>Kim, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+optical+access+to+an+estimated+one+million+neurons+in+the+live+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-term optical access to an estimated one million neurons in the live mouse cortex.</a> Cell Reports. 17 (12), 3385-3394 (2016).</li>
<li>Ghanbari, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortex-wide+neural+interfacing+via+transparent+polymer+skulls%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cortex-wide neural interfacing via transparent polymer skulls.</a> Nature Communications. 10 (1), 1500(2019).</li>
<li>Takahashi, T., Zhang, H., Otomo, K., Okamura, Y., Nemoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+constructing+an+extensive+cranial+window+utilizing+a+PEO-CYTOP+nanosheet+for+in+vivo+wide-field+imaging+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for constructing an extensive cranial window utilizing a PEO-CYTOP nanosheet for in vivo wide-field imaging of the mouse brain.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100542(2021).</li>
<li>Suzuki, T., Murayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Craniotomy+for+cortical+voltage-sensitive+dye+imaging+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Craniotomy for cortical voltage-sensitive dye imaging in mice.</a> Bio-Protocol. 6 (3), 1722(2016).</li>
<li>Jackman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silk+fibroin+films+facilitate+single-step+targeted+expression+of+optogenetic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Silk fibroin films facilitate single-step targeted expression of optogenetic proteins.</a> Cell Reports. 22 (12), 3351-3361 (2018).</li>
<li>Rockwood, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Materials+fabrication+from+Bombyx+mori+silk+fibroin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).</li>
<li>Jia, H., Rochefort, N. L., Chen, X., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+of+sensory-evoked+dendritic+calcium+signals+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging of sensory-evoked dendritic calcium signals in cortical neurons.</a> Nature Protocols. 6 (1), 28-35 (2011).</li>
<li>Pachitariu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suite2p%3A+beyond+10%2C000+neurons+with+standard+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Suite2p: beyond 10,000 neurons with standard two-photon microscopy.</a> bioRxiv. , 061507(2017).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+transgenic+mouse+lines+for+selectively+targeting+astrocytes+and+studying+calcium+signals+in+astrocyte+processes+in+situ+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li>
<li>Inoue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+engineering+of+XCaMPs%2C+a+multicolor+GECI+suite+for+in+vivo+imaging+of+complex+brain+circuit+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rational engineering of XCaMPs, a multicolor GECI suite for in vivo imaging of complex brain circuit dynamics.</a> Cell. 177 (5), 1346-1360 (2019).</li>
<li>Patriarchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+neuronal+imaging+of+dopamine+dynamics+with+designed+genetically+encoded+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ultrafast neuronal imaging of dopamine dynamics with designed genetically encoded sensors.</a> Science. 360 (6396), (2018).</li>
<li>Sun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+fluorescent+sensor+enables+rapid+and+specific+detection+of+dopamine+in+flies%2C+fish%2C+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded fluorescent sensor enables rapid and specific detection of dopamine in flies, fish, and mice.</a> Cell. 174 (2), 481-496 (2018).</li>
<li>Marvin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+fluorescent+probe+for+visualizing+glutamate+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission.</a> Nature Methods. 10 (2), 162-170 (2013).</li>
<li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+fluorescent+sensor+for+rapid+and+specific+in+vivo+detection+of+norepinephrine%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded fluorescent sensor for rapid and specific in vivo detection of norepinephrine.</a> Neuron. 102 (4), 745-761 (2019).</li>
<li>Piatkevich, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+imaging+of+neural+activity+in+awake+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Population imaging of neural activity in awake behaving mice.</a> Nature. 574 (7778), 413-417 (2019).</li>
<li>Sabatini, B. L., Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neurotransmitter+and+neuromodulator+dynamics+in+vivo+with+genetically+encoded+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neurotransmitter and neuromodulator dynamics in vivo with genetically encoded indicators.</a> Neuron. 108 (1), 17-32 (2020).</li>
<li>Roome, C. J., Kuhn, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+cranial+window+with+access+port+for+repeated+cellular+manipulations%2C+drug+application%2C+and+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chronic cranial window with access port for repeated cellular manipulations, drug application, and electrophysiology.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 379(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule przedstawiono niedrogą metodę tworzenia dużego okna czaszkowego za pomocą folii PVDC, przezroczystego silikonu i szkła nakrywkowego. Korzystając z tej metody, wykazaliśmy, że obrazowanie wapnia w szerokim polu może być wykonywane na dużym obszarze kory mózgowej. Dwufotonowe obrazowanie wapnia można wykonać z kilku różnych obszarów kory mózgowej u tej samej myszy, która została poddana obrazowaniu szerokokątnemu. Co więcej, wykazano, że folia fibroina-AAV na plastikowej folii używanej do okna może wyrażać GECI na dużym obszarze kory.
Kroki krytyczne Ważne jest, aby unikać infekcji i uszkodzenia mózgu podczas wykonywania okien czaszkowych za pomocą folii. W tych warunkach nie można zaobserwować aktywności neuronalnej i glejowej, a obrazowanie głębszych obszarów jest niemożliwe. Uszkodzenie naczyń krwionośnych powoduje również krwawienie, co uniemożliwia obrazowanie z powodu krwi. Aby uniknąć infekcji, bardzo ważne jest, aby powierzchnia mózgu i okład były przymocowane tak mocno, jak to możliwe, poprzez odsysanie ACSF. Podawanie mannitolu jest ważne, aby uniknąć uszkodzenia mózgu i naczyń krwionośnych poprzez zapobieganie wzrostowi ciśnienia w mózgu podczas operacji. Utrzymuje to przestrzeń między powierzchnią mózgu a oponą twardą i zapobiega dotykaniu mózgu i naczyń krwionośnych podczas usuwania czaszki i opony twardej. Mikroskop stereoskopowy z dużym powiększeniem i pęseta z ostrymi końcówkami są również skuteczne w dokładnej operacji.
W metodzie fibroiny-AAV konieczne jest stosowanie kokonów jedwabników z mięsa, niezamrażanie roztworu fibroiny, wystarczające wysuszenie roztworu fibroiny-AAV i nałożenie wystarczającej objętości roztworu (5 μl na 3 mm średnicy). Gdy używano starszych kokonów, wydajność ekspresji była niższa. Dzieje się tak, ponieważ fibroina ze starych kokonów może łatwo ulec denaturacji. Gdy roztwór fibroiny zamrożono w temperaturze -80 °C i rozmrożono w momencie użycia, skuteczność odciągania była słaba. Może to być spowodowane denaturacją białka w wyniku zamrażania i rozmrażania. Ponieważ roztwory fibroiny przechowywane w temperaturze 4 °C mogą być skutecznie stosowane aż do żelowania, zaleca się, aby roztwory fibroiny były przechowywane w lodówce i ponownie oczyszczone z kokonów po żelowaniu. Roztwór fibroiny-AAV należy suszyć przez co najmniej 3 godziny, ponieważ wyraz jest słaby po mniej niż 3 godzinach. Wreszcie, obszar ekspresji zależy od ilości użytego roztworu fibroiny-AAV. W przykładzie na rysunku 3M ilość była niewielka (5 μL); w ten sposób folia fibroina-AAV zakrywała tylko górną połowę okna, co powodowało niejednolitą ekspresję nad oknem. Jeśli użyjesz wystarczającej ilości fibroiny-AAV, ekspresja będzie jednolita w całym oknie.
Modyfikacje techniki Nowatorska technika okna czaszkowego pozwala na zbadanie makroskopowej aktywności obwodów korowych i leżącej u ich podstaw aktywności na poziomie pojedynczej komórki u tej samej myszy. Dzięki temu metoda może być stosowana w różnych badaniach neurobiologicznych. Na przykład może być używany do obserwacji aktywności kory mózgowej podczas zadań związanych z podejmowaniem decyzji, uczeniem się motorycznym oraz w mysich modelach urazów i chorób mózgu. Uważamy również, że metoda może być stosowana nie tylko u gryzoni, ale także u naczelnych.
Artykuł ten pokazuje, że duże okno czaszkowe jest skuteczne w obrazowaniu myszy transgenicznych i myszy, którym wstrzyknięto funkcjonalne białka eksprymujące AAV. W szczególności wykazano, że folia fibroina-AAV na owijce jest znacznie łatwiejsza niż konwencjonalna metoda wstrzykiwania AAV do ekspresji GECI na szerokim obszarze kory. Wykorzystując mieszaninę dwóch AAV kodujących GECI o różnych kolorach41, korelacja między aktywnością neuronów i komórek glejowych może być jednocześnie obrazowana na dużym obszarze kory mózgowej. Co więcej, metoda błony fibroinowo-AAV może być również stosowana do innych genetycznie kodowanych biosensorów 42,43,44,45,46,47.
Możliwe jest również większe okno czaszki, które może obrazować obie półkule. Mikroskopy dwufotonowe o znacznie szerszym polu widzenia (~25 mm2) zostały ostatnio opracowane 25,26,27,28,29. Połączenie tej techniki obrazowania dwufotonowego z jednofotonowym obrazowaniem szerokokątnym za pomocą opisanego tutaj szerokiego okna czaszkowego pozwoli nam zbadać związek między aktywnością populacji a aktywnością pojedynczych komórek na niespotykaną dotąd skalę.
Ograniczenia Folia spożywcza nie przepuszcza żadnych substancji. To sprawia, że metoda ta jest trudna do wykorzystania w eksperymentach farmakologicznych. Trudno jest również zdjąć folię, co uniemożliwia włożenie szklanej pipety lub elektrody. W związku z tym trudno jest przeprowadzić eksperymenty w połączeniu z innymi metodami, takimi jak jednoczesne obrazowanie wapnia i zapisy elektrofizjologiczne oraz miejscowe podawanie leków za pomocą szklanej pipety. Możliwym rozwiązaniem tych ograniczeń jest zastosowanie folii i szklanego okienka z otworem. Umożliwia to dostęp do mózgu za pomocą szklanej pipety lub elektrody rejestrującej, przy jednoczesnym utrzymaniu sterylności okna czaszki przez długi czas48.

Obrazowanie wapnia w szerokim polu skutecznie bada wzorzec aktywności czasoprzestrzennej na dużym obszarze mózgu zwierzęcia1,2,3. Obrazowanie szerokokątne jest szeroko stosowane do obserwacji całej powierzchni kory gryzoni, ponieważ ich kora jest stosunkowo płaska2,3,4,5,6,7,8,9,10. Transgeniczne myszy lub myszy, którym wstrzyknięto wirusa związanego z adenowirusem (AAV), który specyficznie eksprymuje GECI w różnych komórkach, takich jak neurony i komórki glejowe, mogą być używane do obrazowania wapnia w szerokim polu widzenia11,12,13. Jednak rozdzielczość przestrzenna tej techniki zwykle nie wystarcza do rozdzielenia aktywności poszczególnych komórek in vivo14. Nie nadaje się również do obrazowania komórek znajdujących się w głębszych warstwach.
Z drugiej strony, dwufotonowe obrazowanie wapnia może obserwować aktywność wielu komórek jednocześnie z subkomórkową rozdzielczością przestrzenną, co pozwala na obserwację aktywności pojedynczych komórek nawet w dendrytach neuronalnych i procesach glejowych15,16,17,18,19,20,21,22. Może również obserwować komórki w głębszych warstwach kory mózgowej23,24. Chociaż najnowsze osiągnięcia technologiczne w mikroskopii dwufotonowej umożliwiają obrazowanie z obszarów korowych o szerokości milimetra25,26,27,28,29, nadal trudno jest zaobserwować obszar porównywalny z obrazowaniem szerokokątnym za pomocą obrazowania dwufotonowego.
Aby zrozumieć fizjologiczne znaczenie aktywności mózgu od pojedynczej komórki do całego mózgu, kluczowe jest wypełnienie luki między aktywnością obszarów korowych w całej korze a tą w rozdzielczości pojedynczej komórki w lokalnych obwodach neuronowych. Dlatego połączenie obrazowania szerokokątnego i dwufotonowego wapnia wykonanego u tej samej myszy jest szczególnie skuteczne. Aby to zrealizować, należy stworzyć szerokie i stabilne okno czaszkowe, najlepiej przez długi czas.
Poprzednio opracowano kilka technik tworzenia okien czaszkowych, aby umożliwić wykonywanie obrazowania szerokiego pola i dwóch fotonów w tym samym myszy30,31. Okna ze szkła nakrywkowego w kształcie trapezu (kryształowa czaszka), które są formowane na kształt powierzchni kory mózgowej w celu zastąpienia usuniętej kości, umożliwiają dostęp optyczny na całej powierzchni kory32. Alternatywnie, okna czaszkowe na bazie polimerów mogą być wykonane z politereftalanu etylenu (PET)33 lub nanosheet34. Wykazano, że każda metoda utrzymuje stabilne okno przez ponad 1 miesiąc. Jednak produkcja tych okien nie jest łatwa, a używane materiały i sprzęt są często drogie.
Niniejsze badanie opisuje nową metodę tworzenia dużego okna czaszkowego przy użyciu folii PVDC (plastikowej folii spożywczej) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Korzystając z tego okna, można przeprowadzić eksperymenty obrazowania szerokokątnego i dwufotonowego in vivo na tych samych myszach. Wykazano również, że GECI mogą ulegać ekspresji w neuronach na dużym obszarze kory myszy, tworząc cienką warstwę filmu zawierającego cząsteczki AAV na owijce.

<table><tbody><tr><td>4% roztwór buforowy fosforanu paraformaldehydu</td><td>NACALAI TESQUE, Kioto, Japonia</td><td>TritonX</td><td>Skuteczność ekspresji owijania metodą folii fibroinowo-AAV</td></tr><tr><td>Zlewka</td><td></td><td></td><td></td>50 ml</tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji</td><td>Widzenie mózgu</td><td>BV_Ana</td><td>Do szerokokątnego obrazowania wapnia GCaMP6f</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji</td><td>Hamamatsu photonics</td><td>Oprogramowanie do nagrywania z dużą prędkością: HSR</td><td>Do szerokokątnego obrazowania wapnia XCaMP-R</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji</td><td>Vibrio Technologies</td><td>scanImage</td><td>Do dwufotonowego obrazowania wapnia</td></tr><tr><td>ACSF (sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy)</td><td></td><td></td> <td>150 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH = 7,4 z</td></tr><tr><td>igłą</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>do aspiracji 1M NaOH ACSFWirus związany z adenowirusem</td><td>VectorBuilder</td><td>wykonane na zamówienie</td><td>AAV-DJ/8-Syn1-XCaMP-R</td></tr><tr><td>Kleje do użytku biologicznego</td><td>Daiichi Sankyo</td><td>Aron Alpha-A Aparat</td><td></td></tr><tr><td>anestezjologiczny</td><td>Shinano seisakusho</td><td>SN-487</td><td></td></tr><tr><td>Znieczulenie</td><td>Kyoritsu Seiyaku Corporation</td><td>pentobarbital</td><td>Skuteczność ekspresji chusty metodą folii fibroiny-AAV</td></tr><tr><td>Pomocniczy Pasek na ucho</td><td>Narishige</td><td>EB-5N Kamera</td><td></td></tr><tr><td>CCD</td><td>Widzenie mózgu</td><td>MiCAM02-HR</td><td>Do szerokokątnego obrazowania wapnia GCaMP6f</td></tr><tr><td>Przezroczysty polisiloksan winylowy</td><td>GC</td> Kamera <td>Exaclear</td><td></td></tr><tr><td>CMOS</td><td>Hamamatsu photonics</td><td>ORCA-spark</td><td>Do szerokokątnego obrazowania wapnia XCaMP-R</td></tr><tr><td>Wacik</td><td></td><td></td><td></td>bawełniany</tr><tr><td>Szkło</td> <td>nakrywkoweMatsunami</td><td>18 x 18 NO.1</td><td>Rozmiar: 18 x 18 mm, Grubość: 0,13-0,17 mm, Szkło borokrzemianowe</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td>Skuteczność wyrażania chusty metodą folii fibroinowo-AAV</td></tr><tr><td>Kaseta do dializ</td><td>3,5K MWCO, Slide-A-Lyzer</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Klej dentystyczny żywica cementowa</td><td>SUN MEDICAL</td><td>Super-Bond</td><td></td></tr><tr><td>Wiertło dentystyczne</td><td>Nakanishi</td><td>VOLVERE Vmax</td><td></td></tr><tr><td>Waga cyfrowa</td><td>Dretec</td><td>KS-243</td><td></td></tr><tr><td>Filtry</td><td>Widzenie</td><td></td> mózgu <td>EM: BP466/40-25, DM: DM506, EX: BP520/36-50</td></tr><tr><td>Filtry</td><td>Olympus</td><td></td><td>U-MRFPHQ, EM: BP535-555HQ, DM: DM565HQ, Ex: BA570-625HQ</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Keyence</td><td>BZ-X810</td><td>Skuteczność ekspresji owijki metodą folii fibroiny-AAV</td></tr><tr><td>Koraliki fluorescencyjne</td><td>Fluoresbrite YG Karboksylan Mikrosfery</td><td>0,1 i mikro; m</td><td>Ocena funkcji rozrzutu punktowego w konwencjonalnym i nowym oknie czaszkowym w obrazowaniu dwufotonowym</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>FST</td><td>nr 11252-20</td><td>cienko zakończone, do usuwania opony twardej</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>KFI</td><td>K-7, nr J 18-8</td><td>do ogólnego zastosowania</td></tr><tr><td>Żelatyna do hemostazy</td><td>Johnson & Johnson</td><td>Spongostan</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan gentamycyny</td><td>Iwaki seiyaku</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szklana pipeta</td><td>wykonana na</td><td></td><td></td>zamówienie</tr><tr><td>Depilator</td><td>Reckitt Japan</td><td>Veet</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do mocowania głowicy</td> wykonane <td>na</td><td></td> zamówienie <td>Kraniotomia do korowego obrazowania barwnika wrażliwego na napięcie u myszy. Suzuki, T. i Murayama, M. Protokół biologiczny 2016 6:e1722.</td></tr><tr><td>Płyta czołowa</td><td>wykonana</td><td></td> na zamówienie <td>z aluminium lub żywicy, wymiary: 40 x 25 mm, grubość: 1,5 mm lub 2 mm, otwór w środku: 15 x 10 mm (head_plate_06 v3.f3d)</td></tr><tr><td>Poduszka</td><td></td><td></td><td></td>grzewcza</tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazu (do analizy danych obrazowania wapnia)</td><td></td><td>ImageJ</td><td>https://imagej.net</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Pfizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Źródło światła</td><td>Hayashi-repic</td><td>LA-HDF108AA</td><td></td></tr><tr><td>Źródło światła</td><td>Widzenie mózgu</td><td>LEX2-LZ4-B</td><td>Do szerokokątnego obrazowania wapnia GCaMP6f</td></tr><tr><td>Źródło światła</td><td>Olympus</td><td>U-HGLGPS</td><td>Do szerokokątnego obrazowania wapnia XCaMP-R</td></tr><tr><td>Roztwór mannitolu (15% z solą fizjologiczną)</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Mikrołyżeczka</td><td>FST</td><td>nr 10080-05</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Widzenie</td><td></td> mózgu <td>Do szerokokątnego obrazowania wapnia w mikroskopie GCaMP6f</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>MVX10</td><td>Do szerokokątnego obrazowania wapnia w mikroskopie XCaMP-R</td></tr><tr><td></td><td>Sutter Instruments</td><td>MOM</td><td>Do dwufotonowego obrazowania wapnia</td></tr><tr><td>Mikroslicer</td><td>Dosaka EM</td><td>DTK-1000N</td><td>Skuteczność ekspresji owijki metodą folii fibroinowo-AAV</td></tr><tr><td>Końcówka</td><td>mieszająca GC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igła (30 g)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polietylenowe spoidy</td><td>AS ONE</td><td>1-4656-01</td><td></td></tr><tr><td>Folia z polichlorku winylidenu (PVDC)</td><td>Asahi Kasei</td><td>Asahi Wrap (lub Saran Wrap)</td><td></td></tr><tr><td>Powidon-jod</td><td>Mundipharma</td><td>Isodine</td><td></td></tr><tr><td>Python libralies</td><td></td><td>Pakiet NumPy</td><td>do obliczeń naukowych, https://numpy.org/doc/stable/index.html#</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Biblioteka Matplotlib</td><td>do wizualizacji, narzędzie do</td></tr> <tr><td>analizy i manipulacji</td>danymi https://matplotlib.org/stable/index.html#<td></td><td></td><td>pandas</td>, https://pandas.pydata.org</tr><tr><td>Skalpel</td><td>Kai</td><td>No. 11</td><td></td></tr><tr><td>Golarka do dozowników</td> silikonu dla zwierząt <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>GC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kokon jedwabnika</td><td>Satoyama Craft News</td><td></td><td>https://sato-yama.jp/</td></tr> <tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>LEICA</td><td>MZ6</td><td>soczewka obiektywu: 0,63x, okular: 25x</td></tr><tr><td>Środek powierzchniowo czynny</td><td>NACALAI TESQUE</td><td>TritonX</td><td>Skuteczność ekspresji okładu metodą folii fibroinowo-AAV</td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>FST</td><td>nr 91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka do mannitolu iniekcja</td><td>Terumo</td><td>1mL</td><td></td></tr><tr><td>Transdermal znieczulenie</td><td>AstraZeneca</td><td>Lidocaine</td><td></td></tr><tr><td>Transgeniczne myszy używane do obrazowania wapnia astrocytów</td><td></td><td></td><td>Myszy uzyskano następującą metodą. Myszy AldH1l1-CreERT2: B6N. FVB-Tg(Aldh1l1-cre/ERT2)1Khakh/J (Laboratorium Jacksona, szczep #: 031008) Indukowana tamoksyfenem ekspresja rekombinazy Cre skierowana na wysokie poziomy do zdecydowanej większości astrocytów Myszy Flx-Lck-GCaMP6f: C57BL/6N-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-GCaMP6f)Khak]/J (Laboratorium Jacksona, szczep #: 029626) Zależna od Cre ekspresja GCaMP6f. Mysz urodzona z krzyżowania tych myszy leczono tamoksyfenem (20 mg/ml) przez 5 dni ( 0,05 ml/10 g masy ciała, i.p.) , aby wyrazić GCaMP6f.</td></tr><tr><td>Przestrajalne ultraszybkie lasery</td><td>Spectra-Physics</td><td>InSight X3</td><td>Do dwufotonowego obrazowania wapnia</td></tr><tr><td>Wodoodporna folia</td><td>Nichiban</td><td>BFR5</td><td></td></tr><tr><td>Myszy typu dzikiego</td><td>Japonia SLC</td><td>C57BL/6J</td><td>Samiec i samica, >4 tygodnie</td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) szerokokątne i dwufotonowe obrazowanie wapnia za pomocą myszy przy użyciu dużego okna czaszki

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

Szerokokątne obrazowanie wapnia z kory nowej myszy pozwala obserwować aktywność neuronalną w całej korze mózgowej związaną z różnymi funkcjami mózgu. Z drugiej strony, obrazowanie dwufotonowe może rozwiązać problem aktywności lokalnych obwodów neuronalnych na poziomie pojedynczej komórki. Bardzo ważne jest, aby stworzyć duże okno czaszki w celu przeprowadzenia analizy w wielu skalach przy użyciu obu technik obrazowania w tej samej myszy. Aby to osiągnąć, należy usunąć dużą część czaszki i pokryć odsłoniętą powierzchnię kory mózgowej przezroczystymi materiałami. Wcześniej w tym celu opracowano szklane czaszki i okna czaszkowe na bazie polimerów, ale materiały te nie są łatwe do wytworzenia. Niniejszy protokół opisuje prostą metodę wykonania dużego okna czaszkowego składającego się z dostępnej na rynku folii owijającej z polichlorku winylidenu (PVDC), przezroczystej silikonowej zatyczki i szkła nakrywkowego. W przypadku obrazowania grzbietowej powierzchni całej półkuli rozmiar okna wynosił około 6 x 3 mm2. Silnych wibracji mózgu nie zaobserwowano pomimo tak dużego okna. Co ważne, stan powierzchni mózgu nie pogarszał się przez okres dłuższy niż miesiąc. Szerokokątne obrazowanie myszy wykazującej ekspresję genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia (GECI), GCaMP6f, szczególnie w astrocytach, ujawniło zsynchronizowane odpowiedzi w ciągu kilku milimetrów. Obrazowanie dwufotonowe tej samej myszy wykazało wyraźne reakcje wapnia w poszczególnych astrocytach w ciągu kilku sekund. Co więcej, cienka warstwa wirusa związanego z adenowirusem została nałożona na warstwę PVDC i z powodzeniem uległa ekspresji GECI w neuronach korowych nad oknem czaszki. Technika ta jest niezawodna i opłacalna w przypadku tworzenia dużego okna czaszkowego i ułatwia badanie dynamiki neuronalnej i glejowej oraz ich interakcji podczas zachowania na poziomie makroskopowym i mikroskopowym.

Ocena dużego okna czaszkowego wykonanego metodą z użyciem folii PVDC 
Bezpośrednio po zabiegu sukces lub niepowodzenie można ocenić na podstawie stanu powierzchni kory, np. obecności krwawienia oraz zmiany koloru wynikającej z uszkodzenia lub niedokrwienia. Długo po operacji powierzchnia kory może zostać pokryta nieprzezroczystą białą błoną z powodu infekcji lub okno może zostać zasłonięte przez krew w wyniku krwawienia (Rycina 2G). W takich przypadkach kora może nie być w zdrowym stanie, co może uniemożliwić obrazowanie. Przyczyny mogą tkwić w częściowo przerwanym owinięciu lub niewystarczającym przymocowaniu folii za pomocą kleju. W przypadku powtarzających się infekcji skuteczne może być zastosowanie antybiotyków, np. siarczanu gentamycyny (10 µL, 50 mg/mL), naniesionego na powierzchnię mózgu podczas umieszczania okna. Regeneracja opon mózgowych lub kości jest również obserwowana, gdy przerwa pionowa między powierzchnią kory a folią jest zbyt duża. Aby temu zapobiec, kluczowe jest jak najciaśniejsze dociśnięcie folii do powierzchni mózgu podczas przygotowywania okna. Można to osiągnąć, nakładając folię plastikową na powierzchnię mózgu i odsysając jak najwięcej ACSF. W przypadku braku ACSF można po prostu położyć folię plastikową na powierzchni mózgu. O braku uszkodzeń mózgu i naczyń krwionośnych świadczy brak odbarwień tkanki mózgowej oraz brak przerwania naczyń krwionośnych.
Trwałość okna zależy w dużej mierze od jakości przeprowadzonego zabiegu chirurgicznego. Przy prawidłowym stanie nie stwierdzono oznak infekcji, krwawienia ani regeneracji ponad miesiąc po operacji (Rysunek 2F oraz Rysunek 3B). U 8 z 10 myszy okno pozostawało przejrzyste przez okres do 10 tygodni lub dłużej. W przypadku dwóch myszy nie udało się utrzymać okna ze względu na infekcję lub krwawienie. Mimo że duże okno może być podatne na stres mechaniczny lub uderzenia, nie zaobserwowano pęknięć ani uszkodzeń okien.
Aby ocenić jakość obrazowania nowego okna czaszkowego z owijką, silikonem i szkłem, porównano funkcję rozmycia punktu (PSF) pod nowym oknem z funkcją pod konwencjonalnym oknem szklanym, obrazując fluorescencyjne kuleczki o średnicy 0.1 µm w agarze (patrz Supplementary File 1). Wyniki nie wykazały różnic w pełnej szerokości połówki maksimum (FWHM) dla obu warunków. [Oś X (µm): tylko szkło, 1.99 ± 0.07, owijka, 1.76 ± 0.13, Oś Y (µm): tylko szkło, 2.11 ± 0.27, owijka, 1.90 ± 0.15, Oś Z (µm): tylko szkło, 25.29 ± 0.71, owijka, 26.64 ± 1.02, N = 7 kuleczek, p &gt; 0.05, test U Manna-Whitneya, Supplementary Figure 2A,B]. Zatem nowe dodane elementy (owijka i silikon) nie pogorszyły jakości obrazowania.
Artefakty wibracyjne spowodowane oddychaniem, biciem serca i ruchami ciała występują w obrazowaniu szerokopolowym oraz dwufotonowym. Aby określić stopień drgań nowego okna czaszkowego, z danych obrazowania dwufotonowego in vivo wybrano małą fluorescencyjną cząstkę i zbadano, jak bardzo przesuwał się jej obraz w ciągu 60 s. Stwierdzono, że odchylenie standardowe centroidu tej fluorescencyjnej cząstki wynosiło około 0.3 µm, co jest porównywalne z wynikami uzyskanymi przy zastosowaniu konwencjonalnego okna szklanego (Rycina uzupełniająca 2C). Wskazuje to, że dzięki unieruchomieniu mózgu za pomocą przezroczystego silikonowego korka i szkiełka nakrywkowego, wibracje były porównywalne do tych obserwowanych w konwencjonalnych mniejszych oknach, a offline'owa rejestracja obrazu była wystarczająca do wyeliminowania artefaktów wibracyjnych.
W szerokopolowym obrazowaniu wapniowym można zaobserwować aktywność korową rozprzestrzeniającą się w obrębie kory pod wpływem stymulacji sensorycznej (Rycina 3A-D,K-N). Obrazowanie dwufotonowe umożliwiło obserwację obrazów fluorescencyjnych pojedynczych komórek specyficznych dla neuronów i komórek glejowych (Rycina 3E,O). Zmiany fluorescencji indukowane stymulacją sensoryczną można było obserwować w poszczególnych komórkach (Rycina 3E-J,O-T).
Ekspresja genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (GECIs) w szerokim obszarze kory mózgowej przy użyciu powłoki PVDC i AAV 
Powłokę PVDC dla okna można zastosować w celu ekspresji funkcjonalnych białek w szerokim obszarze kory. Osiągnięto to przy użyciu AAV oraz fibroiny, białka składnikowego kokonów jedwabników, które są powszechnie stosowane jako biomateriały37. Poprzednie badanie wykazało, że fibroinę można mieszać z AAV, tworząc filmy implantowane w mózgu w celu ekspresji białek funkcjonalnych, takich jak opsyny fotoaktywne lub GECIs36. W niniejszym badaniu AAV wykazujący GECI oraz fibroina zostały zmieszane i wysuszone na powłoce, a powłoka pokryta AAV została wykorzystana do wykonania okna czaszkowego. Doprowadziło to do ekspresji GECI w szerokim obszarze kory 2-4 tygodnie po operacji (Rysunek 3K-M). Ponieważ okno było duże, możliwe było obrazowanie różnych obszarów kory tego samego myszy (Rysunek 3M-T).
Aby potwierdzić wydajność ekspresji tej metody, policzono liczbę komórek wykazujących ekspresję GECI w utrwalonym mózgu (Rycina uzupełniająca 2D). Stwierdzono, że zastosowana strategia z wykorzystaniem owinięcia fibroiną-AAV doprowadziła do ekspresji GECI z wydajnością około 20% zarówno w warstwach powierzchownych, jak i głębszych (L2/3: 20,78%, komórki wykazujące ekspresję XCaMP-R: 32 komórki, DAPI: 154 lokalizacje, L5: 20,08%, komórki wykazujące ekspresję XCaMP-R: 51 komórek, DAPI: 254 lokalizacje). Zatem metoda ta pozwoliła na ekspresję GECI w komórkach nie tylko warstw powierzchniowych, ale również warstw głębszych.
<img alt="Schemat chirurgiczny okna czaszkowego myszy, odsłonięta kora mózgowa, silikonowe szkiełko nakrywką." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64224/64224fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat koncepcyjny dużego okna czaszkowego. (A) Po lewej, schematyczna ilustracja nowego okna czaszkowego. Jest ono większe od konwencjonalnego okna (średnica 3 mm). Po prawej, widok w przekroju. Metoda wykonania dużego okna czaszkowego wykorzystuje folię spożywczą, przezroczysty elastomer silikonowy oraz szkiełko nakrywkę, co umożliwia obrazowanie szerokopolowe i dwufotonowe u tej samej myszy. (B) Procedura wykonania okna czaszkowego: (a) Usunięcie kości. (b) Usunięcie ACSF spod folii. (c) Przywieranie folii do powierzchni mózgu poprzez usunięcie ACSF. (d) Odcięcie nadmiaru folii. (e) Nałożenie przezroczystego silikonu. (f) Przymocowanie szkiełka nakrywki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64224/64224fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Przygotowanie do zabiegu stworzenia okna czaszkowego u gryzonia; sekwencja od przygotowania do wyników implantacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64224/64224fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Przegląd zabiegu stworzenia okna czaszkowego. (A) Materiały i sprzęt wymagane do wykonania okna czaszkowego. (a) Folia opakowaniowa z polichloreku winylidenu (PVDC). (b) Dozownik przezroczystego elastomeru silikonowego z końcówką mieszającą. (c) Szkiełko przykrywowe. (d) Przezroczysty silikon umieszczony pomiędzy dwoma kawałkami szkiełka przykrywowego. (B) Zdjęcie skóry głowy myszy po nacięciu w celu odsłonięcia czaszki. Mysz została poddana znieczuleniu, a jej głowa została unieruchomiona za pomocą prętów usznych. Następnie usunięto owłosienie z głowy, zastosowano miejscowe znieczulenie i wykonano nacięcie skóry. (C) Zdjęcie po zamontowaniu płytki głownej. Płytka główna (wykonana z żywicy na drukarce 3D) została przymocowana do głowy myszy za pomocą cementu dentystycznego. (D) Zdjęcie okna czaszkowego. Okno czaszkowe utworzono w korze prawej półkuli mózgu myszy. Usunięto oponę twardą i przyklejono folię. (E) Zdjęcie okna wykonanego z folii z przezroczystym silikonem i szkiełkiem przykrywowym na wierzchu. (F) Typowy przykład udanego okna (prawa półkula, 7 tygodni po operacji). (G) Przykład nieudanego okna (obie półkule, 5 tygodni po operacji). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64224/64224fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazowanie wapnia u myszy TG z GCaMP6f; bodźce z podmuchów powietrza; diagramy zmian fluorescencji; analiza ΔF/F." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64224/64224fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Duże okno umożliwia obrazowanie wapnia w szerokim polu oraz obrazowanie dwufotonowe u tej samej myszy. (A) Obrazowanie wapnia przeprowadzono u myszy transgenicznej wykazującej ekspresję zakotwiczonego w błonie GECI (Lck-GCaMP6f) w astrocytach40. (B) Po lewej: duże okno wykonane z folii plastikowej, przezroczystego silikonu i szkła cover glass. Obrazowanie szerokopolowe przeprowadzono przez to okno. Po prawej: zdjęcie wykonane 79 dni po instalacji okna czaszkowego. (C) Po zastosowaniu stymulacji podmuchami powietrza do przeciwległych wibrysów zaobserwowano zmiany fluorescencji. (D) Przedstawiono przebieg czasowy zmiany fluorescencji w korze somatosensorycznej (czerwony kwadrat w C). Czerwone i niebieskie paski wskazują odpowiednio czas podmuchu powietrza oraz ramy czasowe „przed”, „w trakcie” i „po” w (C). (E) Pole widzenia (FOV 1 w C) obrazowania dwufotonowego wapnia. Ponieważ GCaMP6f był eksponowany w celu lokalizacji w błonie, obszary zainteresowania (białe kwadraty) rozmieszczono ręcznie, aby wykryć lokalną odpowiedź w wypustkach astrocytów. (F) Przedstawiono zmiany fluorescencji w kolorowych kwadratach z (E). (G) Przedstawiono zmiany fluorescencji we wszystkich kwadratach z (E). Osie pozioma i pionowa wskazują odpowiednio czas oraz liczbę komórek. (H-J) Pokazano dane dla FOV 2 (w korze wzrokowej) w (C). FOV 2 obrazowano po obrazowaniu w FOV 1. (K) Czerwony GECI, XCaMP-R, został wyeksponowany w neuronach za pomocą metody fibroin-AAV u myszy typu dzikiego. (L) Fotografia wykonana dwa tygodnie po operacji, podczas której okno stworzono przy użyciu filmu fibroinowego. (M) U tej myszy przeprowadzono szerokopolowe obrazowanie wapnia. (N) Przedstawiono zmianę fluorescencji wywołaną stymulacją wibrysów z najbardziej prominentnego miejsca (kora somatosensoryczna, czerwony kwadrat w (M)). Czerwone i niebieskie linie wskazują odpowiednio czas podmuchu powietrza oraz ramy czasowe „przed” i „w trakcie” w (M). (O) Pole widzenia (kora somatosensoryczna, FOV 1 w (M)) dwufotonowego obrazowania wapnia na głębokości 300 µm. ROI rozmieszczono ręcznie na somatach neuronalnych. (P) Przedstawiono zmiany fluorescencji w kolorowych kwadratach z (O). (Q) Zmiany fluorescencji we wszystkich kwadratach z (O) przedstawiono w kolorze. (R-T) Pokazano dane dla FOV 2 w (M) zlokalizowanego w korze ciemieniowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64224/64224fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Rysunek uzupełniający 1: Końcówki skalpeli. Porównanie końcówki nowego skalpela (góra) z końcówką skalpela stępionego podczas przecinania czaszki (dół). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64224/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 2: Walidacja nowego okna czaszkowego oraz metody ekspresji fibroin-AAV. (A) Profil intensywności fluorescencji kulek fluorescencyjnych o średnicy 0,1 µm w agarze. Górny rząd przedstawia dane z warunków, w których nad kulkami fluorescencyjnymi zmieszanymi z agarem umieszczono jedynie szkiełko nakrywkowe, a dolny rząd przedstawia dane z warunków, w których umieszczono owijkę, przezroczysty silikon oraz szkiełko nakrywkowe. Szare linie przedstawiają dopasowanie funkcji Gaussa do profilu intensywności fluorescencji dla każdej kulki, a czerwone linie pokazują ich wartości średnie (n = 7). (B) Podsumowanie danych z (A). Każny wykres przedstawia pełną szerokość połówkową (FWHM) funkcji rozproszenia punktowego (PSF) na osiach XYZ. Szary wykres pokazuje dane dla każdej kulki, a czerwony ich średnią i błąd standardowy. (C) Z 2 000 klatek (rejestracja trwająca 60 s) danych obrazowania in vivo wybrano małą cząstkę fluorescencyjną i zbadano, jak bardzo obraz przemieszczał się w ciągu tych 60 s. Obraz fluorescencyjny w centrum stanowi średnią z 2 000 klatek. Obrazy zostały rzutowane poprzez uśrednianie w kierunkach osi X i Y. Histogramy przedstawiają rozkład centroidu w każdej klatce. Odchylenia standardowe centroidu wyniosły X: 0,36 oraz Y: 0,315 µm. (D) Przykład ekspresji GECI metodą fibroin-AAV. Po lewej: przekrój kory mózgowej z zastosowaniem metody ekspresji fibroin-AAV. Kolor czerwony i niebieski wskazują odpowiednio fluorescencję XCaMP-R oraz DAPI; XCaMP-R wykazano nie tylko w komórkach warstwy 2/3, ale również w komórkach warstwy 5. Środek i prawa strona: powiększone widoki odpowiednio warstwy 2/3 i 5 z rysunku po lewej stronie (cyjanowe kwadraty). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64224/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 1: (A) Wydajność ekspresji wrapu z zastosowaniem metody filmu fibroina-AAV oraz (B) Ocena funkcji rozproszonego punktu podczas obrazowania dwufotonowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64224/Supplementary%20File%201_FINAL.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Obecny protokół opisuje wykonanie dużego (6 x 3 mm2) okna czaszki przy użyciu folii spożywczej, przezroczystego silikonu i szkła nakrywkowego. To okno czaszkowe pozwala na eksperymenty in vivo z obrazowaniem wapnia w szerokim polu i z dwoma fotonami na tej samej myszy.

In vivo (in vivo) Szerokokątne i dwufotonowe obrazowanie wapnia za pomocą myszy przy użyciu dużego okna czaszki

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

Protokół ten pokazuje tworzenie dużego okna czaszkowego do pomiaru aktywności rezerwacji szerokiego pola i pojedynczej komórki u tej samej myszy. Korzystając z naszej metody, duże i stabilne okno czaszki można wykonać z folii spożywczej przy niskich kosztach. Ta metoda jest skuteczna w badaniu aktywności neuronalnej i glejowej podczas zachowania na poziomie makroskopowym i mikroskopowym.Zaleca się rozpoczęcie od małego okna czaszkowego. Następnie, jeśli to się powiedzie, zwiększ rozmiar okna. Zacznij od usunięcia dodatkowego cementu z czaszki za pomocą wiertła dentystycznego.Zaznacz obszar do wycięcia długopisem. Naciąć kość za pomocą skalpela z końcówką, aby upewnić się, że końcówka nie przebije czaszki. Kilkakrotnie zeskrob kość skalpelem, aby pogłębić rowek, aż kość w obszarze, który ma być przycięty, poruszy się po lekkim dotknięciu.Usuń naciętą kość delikatną pęsetą. Uważaj, aby nie wepchnąć płata kostnego do mózgu, co może spowodować uszkodzenie mózgu. Aby usunąć oponę twardą, przetnij oponę twardą za pomocą wyciągniętej szklanej pipety ze zwężającą się końcówką o długości około 10 mikrometrów.Użyj igły w kształcie litery U, aby rozszerzyć to cięcie na całe okno. Pod mikroskopem stereoskopowym ustawionym na zoom od 60 do 100x usuń odciętą oponę twardą za pomocą ultracienkiej pęsety. W przypadku krwawienia spłukać płynem mózgowo-rdzeniowym lub użyć gąbki żelatynowej w celu zatrzymania krwawienia.Następnie wysterylizuj duży kawałek folii PVDC przez autoklawowanie i 70% etanol. Pod mikroskopem stereoskopowym użyj pęsety i skalpela, aby wyciąć owijkę o wymaganym rozmiarze. Umieść okład na powierzchni mózgu, pozostawiając aCSF na powierzchni.Odessać aCSF z krawędzi chusty, pozwalając owijce mocno przylegać do powierzchni mózgu. Przytnij okład skalpelem i pęsetą tak, aby między krawędzią okienka czaszki a okładem był około jednego milimetra marginesu. Po założeniu owijki przyklej krawędź owijki do czaszki za pomocą kleju biologicznego.Pozostaw klej do wyschnięcia na około 30 minut. Za pomocą dozownika z końcówką mieszającą nałóż przezroczysty elastomer silikonowy na wierzch folii. Umieść na wierzchu szkło nakrywkowe o grubości od 0,12 do 0,17 milimetra.Uszczelnij obwód szkła nakrywkowego wodoodporną folią, klejem Superglue lub cementem dentystycznym. Najpierw wymieszaj roztwory fibroiny i AAV w stosunku od jednego do czterech w małej probówce z próbką. Upuść porcję roztworu na folię spożywczą na okienko czaszki i susz przez co najmniej trzy godziny.Następnie przymocuj opaskę do powierzchni mózgu, jak pokazano w poprzedniej sekcji. Regularnie sprawdzaj stan myszy i okien, przez dwa do czterech tygodni. Do tego czasu genetycznie kodowane wskaźniki wapnia zostaną wystarczająco wyrażone po utworzeniu okna leczonego AAV.Korzystając z tego protokołu, okna czaszkowe można było utrzymać u ośmiu z 10 myszy przez okres do 10 tygodni. Szerokie okno jest tworzone z folii, przezroczystego silikonu i szkła nakrywkowego u transgenicznej myszy eksprymującej zakotwiczony w błonie genetycznie kodowany wskaźnik wapnia w astrocytach. Przez to okno przeprowadzono obrazowanie wapnia w szerokim polu i zaobserwowano zmiany fluorescencji, gdy zastosowano stymulację zaciągania się powietrzem do przeciwległych wąsów.Przebieg w czasie zmiany fluorescencji w korze somatosensorycznej wykazał aktywność korową. Obrazowanie dwufotonowe pozwoliło na obserwację obrazów fluorescencyjnych pojedynczych komórek specyficznych dla komórek glejowych. Zmiany fluorescencji wywołane stymulacją sensoryczną obserwowano w pojedynczych komórkach z różnych obszarów kory mózgowej.Wrap kodowany genetycznie kodowanym wskaźnikiem wapnia z ekspresją AAV; A fibroina została użyta do wykonania okna czaszkowego. Obrazowanie wapnia w szerokim polu wykazało aktywność kory mózgowej rozprzestrzeniającą się w korze mózgowej indukowaną stymulacją sensoryczną dwa do czterech tygodni po operacji. Ponieważ okno było duże, zobrazowano różne obszary korowe tej samej myszy i zaobserwowano zmiany fluorescencji wywołane stymulacją sensoryczną w poszczególnych komórkach.Ważne jest, aby uniknąć uszkodzenia mózgu podczas tworzenia okna czaszkowego. Na myszach z dużym oknem czaszkowym można wykonywać zadania behawioralne. Pozwoli to na zbadanie związku między aktywnością neuronalną a zachowaniem myszy.Metodę tę można zastosować w różnych badaniach neurobiologicznych. Na przykład może być używany do obserwacji aktywności kory mózgowej podczas podejmowania decyzji, biegania motorycznego oraz w masowych modelach uszkodzeń i chorób mózgu.

in-vivo-wide-field-two-photon-calcium-imaging-from-mouse-using-large

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Aby zrozumieć dynamikę sieci mikroukładów w neocortex, niezbędne jest jednoczesne rejestrowanie aktywności dużej liczby neuronów. Dwufotonowy obrazowanie wapnia in-vivo jest jedyną metodą pozwalającą na rejestrację aktywności gęstej populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczych komórek.

Obrazowanie wapnia metodą dwufotonową in vivo w warstwie 2/3 kory mózgowej myszy

Zależne od doświadczenia zmiany molekularne w neuronach są niezbędne dla zdolności mózgu do adaptacji w odpowiedzi na wyzwania behawioralne.  Opisano tutaj metodę obrazowania dwufotonowego in vivo, która umożliwia śledzenie takich zmian molekularnych w poszczególnych neuronach korowych za pomocą genetycznie kodowanych reporterów.

In vivo (in vivo) Dwufotonowe obrazowanie zależnych od doświadczenia zmian molekularnych w neuronach korowych

Tutaj opisujemy procedury eksperymentalne związane z dwufotonowym obrazowaniem kory myszy podczas zachowania w środowisku wirtualnej rzeczywistości.

Dwufotonowe obrazowanie wapnia u myszy poruszających się w środowisku rzeczywistości wirtualnej

Obrazowanie poklatkowe u żywego zwierzęcia dostarcza cennych informacji na temat reorganizacji strukturalnej w nienaruszonym mózgu. Tutaj wprowadzamy preparat z rozcieńczoną czaszką, który umożliwia przezczaszkowe obrazowanie znakowanych fluorescencyjnie struktur synaptycznych w żywej korze myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Dwufotonowe obrazowanie in vivo kolców dendrytycznych w korze myszy przy użyciu preparatu z rozrzedzoną czaszką

Przedstawiamy protokół odsłaniania pnia mózgu dorosłej myszy od strony brzusznej. Dzięki zastosowaniu soczewki o indeksie gradientowo-refrakcyjnym z miniaturowym mikroskopem, obrazowanie wapnia można wykorzystać do zbadania aktywności somatów nerwowych dolnych oliwek in vivo.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia u myszy z oliwek dolnych

Prezentowany tutaj jest protokół wszczepienia przewlekłego okna czaszkowego do podłużnego obrazowania komórek mózgowych u obudzonych, skrępowanych głową myszy.

Implantacja okna czaszkowego w celu powtórzenia obrazowania in vivo u obudzonych myszy

Tutaj opisujemy protokół łączący wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem z implantacją okna czaszkowego w celu jednoczesnego obrazowania dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy

To badanie demonstruje dostarczanie powtarzających się urazowych uszkodzeń mózgu myszom i jednoczesne wszczepienie okna czaszkowego do późniejszego przyżyciowego obrazowania EGFP wyrażonego przez neuron za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Przyżyciowe obrazowanie ekspresji białek fluorescencyjnych u myszy z urazowym uszkodzeniem mózgu i okienkiem czaszkowym przy użyciu mikroskopu dwufotonowego

Ten protokół szczegółowo opisuje procedurę obrazowania reakcji wapnia w górnym wzgórku (SC) obudzonych myszy, w tym obrazowanie aktywności pojedynczego neuronu za pomocą mikroskopii dwufotonowej przy jednoczesnym pozostawieniu nienaruszonej kory mózgowej u myszy typu dzikiego, oraz obrazowanie całego SC za pomocą mikroskopii szerokiego pola u myszy z mutacją częściowej kory  mózgowej.

Obrazowanie wapnia u myszy Superior Colliculus

Protokół ten zawiera szczegółowy opis krok po kroku podejścia dla przewlekłego modelu myszy z przewlekłym oknem czaszki oraz mikronaczyniowym zatorem naczyniowym, zoptymalizowanego do mikroskopii in vivo dwufotonowej z użyciem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych.

Model mikronaczyniowej embolii myszy do mikroskopii in vivo dwufotonowej z wykorzystaniem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych

Protokół ten opisuje obrazowanie wapnia in vivo neuronów podwzgórza za pomocą miniaturyzowanego mikroskopu (miniscope) u swobodnie zachowujących się myszy podczas manipulacji stanem społecznym (izolacja społeczna i spotkanie społeczne). Metoda ta umożliwia obrazowanie aktywności podwzgórza w rozdzielczości pojedynczych neuronów, reprezentując potrzeby społeczne i nasycenie, umożliwiając mechanistyczne badania homeostazy społecznej.

In Vivo Obrazowanie wapnia mikroskopem miniaturowym w podwzgórzu w celu zrozumienia zachowań społecznych u myszy

Poznaj metodę tworzenia dużego okna czaszki u myszy przy użyciu folii spożywczej i silikonu do szerokokątowego oraz dwufotonowego obrazowania wapnia. Ta technika umożliwia badanie aktywności neuronów i komórek glejowych podczas zachowania.

In vivo (in vivo) Szerokokątne i dwufotonowe obrazowanie wapnia za pomocą myszy przy użyciu dużego okna czaszki

Przeglądaj więcej filmów