Name: Hodowla komórkowa IDG-SW3 w trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-13T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Poznaj protokół hodowli komórek IDG-SW3 w trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej do badań osteogenezy i formowania się dendrytów. Ta metoda umożliwia zaawansowaną analizę obrazową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Lyndzie F. Bonewald za podarowanie linii komórkowej IDG-SW3. Prace te były wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82070902, 82100935 i 81700778) oraz Shanghai "Science and Technology Innovation" Sailing Project (21YF1442000).

Ten protokół jest odpowiedni do hodowli komórek w czterech dołkach z 24-dołkowymi płytkami. W przypadku przygotowywania wielu próbek lub płytek należy odpowiednio zwiększyć ilości odczynników.
1. Przygotowanie mieszanki kolagenu I
UWAGA: Kolagen I i żel macierzy błony podstawnej szybko w temperaturze pokojowej. Dlatego z kolagenem należy obchodzić się na lodzie (od 2 °C do 8 °C). Wszystkie użyte końcówki i rurki muszą być wstępnie schłodzone, chyba że wskazano inaczej. Wszystkie zabiegi powinny być wykonywane w kapturze ochronnym.
<ol>
	<li>Umieść wszystkie odczynniki i probówki wirówkowe na lodzie.</li>
	<li>Powoli odpipetować 0,48 ml kolagenu I (5 mg/ml) i 0,1 ml 10x minimalnej niezbędnej pożywki (MEM) (z czerwienią fenolową) do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml trzymanej na lodzie. Dobrze wymieszaj, delikatnie pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Zgodnie z paletą kolorów wskaźnika czerwieni fenolowej użyj odpowiedniej objętości 7,5% (w/v) NaHCO3 (około 0,2 ml), aby dostosować wskaźnik czerwieni fenolowej do koloru pomarańczowego, co oznacza, że wartość pH mieści się w zakresie 7,0-7,4, 
	UWAGA: W zależności od pH pożywki, objętość NaHCO3 jest używana do doprowadzenia pH do około 7,0-7,4. Dodatkowo NaOH służy do neutralizacji pH.</li>
	<li>Doprowadzić końcową objętość mieszaniny do 1 ml, dodając odpowiednią objętość ddH2O. Dobrze wymieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół, aby przygotować się do użycia. 
	UWAGA: Ostateczna objętość ddH2O będzie zależeć od ilości NaHCO3 lub NaOH użytej w kroku 1.3.</li>
</ol>
2. Przygotowanie mieszaniny komórkowo-matrycowej
<ol>
	<li>Powoli odpipetować 0,9 ml macierzy membrany podstawnej do nowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml na lodzie.</li>
	<li>Hodować komórki IDG-SW3 w kolbie T25 z 4 ml kompletnej pożywki (alfa-MEM zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej [FBS]) uzupełnionej 50 U/ml INF-γ w temperaturze 33 °C.</li>
	<li>Gdy komórki IDG-SW3 osiągną 90% konfluencję, usuń pożywkę i umyj komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS, pH 7,4 w całym protokole) pipetą. Trawić komórki 0,5 ml 0,25% kwasu trypsyno-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w temperaturze 37 °C przez 30 s.</li>
	<li>Inaktywuj trypsynę, dodając 3,5 ml kompletnej pożywki (alfa-MEM zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej [FBS]). Przenieść zawiesinę komórek o objętości 4 ml do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirowywać zawiesinę komórek w temperaturze 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 1 ml kompletnej pożywki na lodzie.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i dostosuj końcową gęstość komórek za pomocą kompletnej pożywki do 4 × 105 komórek/ml. Dodać 0,1 ml przygotowanej zawiesiny komórkowej do 0,9 ml macierzy zewnątrzkomórkowej z kroku 2.1. Dobrze wymieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół. 
	UWAGA: Jeśli potrzebna jest kontrola bezkomórkowa, dodaj 0,1 ml kompletnej pożywki do 0,9 ml macierzy zewnątrzkomórkowej jako kontrolę ujemną.</li>
</ol>
3. Powlekanie mieszaniny komórkowo-żelowej
<ol>
	<li>Delikatnie dobrze wymieszaj obie mieszaniny z kroku 2.6 i kroku 1.4 do 2 ml, pipetując lód w górę i w dół. Odpipetować 0,5 ml końcowej mieszaniny do każdego dołka (cztery dołki na płytce 24-dołkowej). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w celu uzyskania mieszaniny komórek i żelu.</li>
	<li>Dodaj 0,5 ml pożywki osteogennej (kompletna pożywka zawierająca 50 μg/ml kwasu askorbinowego i 4 mM β-glicerofosforanu, znanego również jako pożywka indukcyjna osteogenna)4 do mieszaniny komórkowo-żelowej w każdym dołku, aby rozpocząć różnicowanie osteogenne w temperaturze 37 °C. Rozważ to jako Dzień 0.</li>
	<li>Co 2 dni zastępować połowę pożywki świeżą pożywką osteogenną utrzymywaną w temperaturze 37 °C. Kontynuować hodowlę przez 35 dni.</li>
</ol>
4. Identyfikacja żywotności komórek i dendrytów komórkowych za pomocą mikroskopu konfokalnego
<ol>
	<li>Barwienie komórek 
	UWAGA: Ester acetoksymetylowy kalceiny (kalceina AM) jest barwnikiem przenikającym komórki, który można wykorzystać do określenia żywotności komórek. Ethidium homodimer-I (EthD-1) nie przenika przez błonę nienaruszonych/żywotnych komórek9. W ten sposób kalceina AM/EthD-1 może być używana do identyfikacji żywotności komórek i dendrytów komórkowych.
	<ol>
		<li>W dniu 1 i 7 hodowli wyjąć z zamrażarki roztwór podstawowy kalceiny AM (4 mM w DMSO) i roztwór podstawowy EthD-1 (2 mM w DMSO/H2O 1:4 [v/v]) i pozostawić do ogrzania do temperatury pokojowej. 
		UWAGA: Zmineralizowana matryca ma silny sygnał autofluorescencyjny, więc stadium preosteocytów bez ekspresji Dmp1 w ciągu 7 dni od hodowli4 jest bardziej odpowiednie do obserwacji barwienia komórek.</li>
		<li>Dodać 4 μl 2 mM roztworu podstawowego EthD-1 i 5 μl 4 mM roztworu podstawowego kalceiny AM do 2 ml buforowanego fosforanem soli fizjologicznej (D-PBS) firmy Dulbecco i dobrze wymieszać. Daje to około 2 μM kalceiny AM i 4 μM EthD-1 jako roztwory robocze.</li>
		<li>Odpipetować 0,5 ml roztworu roboczego do studzienek na płytce 24-dołkowej. Inkubować przez 30-45 minut w temperaturze pokojowej w celu wybarwienia matrycy komórkowo-żelowej.</li>
		<li>Po inkubacji dodać około 0,5 ml świeżego D-PBS do nowego naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm ze szklanym dnem. Przykryj naczynie, aby zapobiec zanieczyszczeniu lub wysuszeniu próbek.</li>
		<li>Za pomocą kleszczyków zakończonych łokciami ostrożnie przenieść wybarwioną matrycę komórkowo-żelową z kroku 4.1.3 do naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm z kroku 4.1.4. Unikaj uszkadzania lub ścinania matrycy komórkowo-żelowej.</li>
		<li>Zobacz oznakowane komórki pod laserowym konfokalnym mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zestaw do skanowania mikroskopem
	<ol>
		<li>Umieść szalkę 35 mm na scenie. Wybierz obszary matrycy żelu komórkowego, które mają być skanowane przez okular za pomocą obiektywu 10x. Obiektywy o większym powiększeniu nie są zalecane ze względu na rozmiar rozszerzonych dendrytów.</li>
		<li>Wybierz filtry optyczne. Kalceina może być postrzegana jako zielona ze standardowym filtrem pasmowoprzepustowym fluoresceiny, a EthD-1 może być postrzegana jako czerwona z filtrami jodku propidyny lub barwnika Texas Red. Wybierz "tryb linii" do skanowania i ustaw "otworek" na 2 μm.</li>
		<li>Wybierz głębię danych o 8-bitowej głębi danych i rozdzielczość obrazu 1 024 pikseli x 1 024 piksele.</li>
		<li>Obraz za pomocą sekwencyjnego skanowania liniowego z optymalnymi ustawieniami lasera i detektora (zachowaj minimalną energię lasera, aby uniknąć potencjalnego fotowybielania). 
		UWAGA: Optymalne ustawienie detektora zależy od końcowych sygnałów fluorescencyjnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbieranie "z-stosu" obrazów
	<ol>
		<li>Zgodnie z sygnałem kanału zielonego zdefiniuj górną i dolną pozycję matrycy komórka-żel, która ma być skanowana, skupiając się na próbce podczas ciągłego skanowania.</li>
		<li>Po określeniu górnej i dolnej części próbki wybierz żądaną ramkę skanowania. Rozpocznij skanowanie. Próbka zostanie zeskanowana od góry do dołu z wybranymi ustawieniami z kroku 4.2, generując galerię obrazów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Identyfikacja żywotności komórek.
	<ol>
		<li>Wybierz jeden plasterek z kroku 4.3. Zielony i czerwony kanał wskazują odpowiednio żywe i martwe komórki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Identyfikacja dendrytów komórkowych.
	<ol>
		<li>Wybierz pojedynczy kanał zielony, aby wygenerować rekonstrukcje 3D za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazu. Informacje o głębi są wyświetlane jako seria tęczowych obrazów pseudokolorowych. Dendryty znajdujące się na dole żelu są wyświetlane na czerwono, podczas gdy te na górze są wyświetlane na niebiesko.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Identyfikacja wyglądu za pomocą stereomikroskopu
<ol>
	<li>W dniu 1, 7, 21 i 35 hodowli należy usunąć pożywkę hodowlaną i dwukrotnie umyć żele na płytce za pomocą D-PBS. Dodaj 0,5 ml 4% (v/v) paraformaldehydu w D-PBS do studzienki, aby utrwalić matrycę komórkowo-żelową w płytce przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń paraformaldehyd ze studzienki i umyj matrycę komórkowo-żelową jeszcze dwa razy za pomocą D-PBS w płytce. Pozostaw 0,5 ml D-PBS w każdym dołku do obrazowania.</li>
	<li>Umieść płytkę na stoliku i wybierz optymalną pozycję przez okular za pomocą obiektywu 0,5x. Zobrazuj widok całego pola matrycy komórkowo-żelowej w płytce indywidualnie, korzystając z "automatycznej ekspozycji" w jasnym polu.</li>
</ol>
6. Identyfikacja depozycji minerałów za pomocą testu XRF
<ol>
	<li>W 35 dniu hodowli sprawdź, czy ciekły azot jest wystarczający. Uruchom system XRF. Otwórz pomieszczenie z próbkami i przenieś żele za pomocą kleszczyków zakończonych łokciami z płytki na środek stolika na próbki instrumentu. Zamknij pomieszczenie na próbki i odczekaj 30 minut, aby przyrząd ostygł przed użyciem.</li>
	<li>Ustaw "Czas ekspozycji" na 35 ms, "Zakres widma" na 0-40 keV, a "Prąd elektryczny" na 770 μA w celu konfiguracji akwizycji.</li>
	<li>Wybierz od trzech do pięciu miejsc skanowania do analizy, przesuwając stolik z próbką.</li>
	<li>Wybierz elementy (Ca i P) do wykrycia. Rozpocznij wykrywanie i wyeksportuj wyniki. 
	UWAGA: Ca i P są pierwiastkami najobficiej występującymi w hydroksyapatycie.</li>
</ol>
7. Identyfikacja funkcjonalnej ekspresji genów
<ol>
	<li>W dniu 1, 7, 21, 28 i 35 dnia hodowli należy usunąć pożywkę hodowlaną i dwukrotnie przemyć matrycę komórkowo-żelową lodowatym D-PBS na płytce.</li>
	<li>Przenieść żele za pomocą kleszczyków zakończonych łokciem z płytki do probówki o pojemności 2,0 ml (w zależności od czasu hodowli, matryca komórka-żel będzie się stopniowo kurczyć do około 0,1 ml w dniu 35). Upewnij się, że jeden żel jest umieszczony w jednej tubce. Do każdej probówki dodać 1 ml chloroformu fenolowego i dwie sterylne kulki do ubijania ze stali nierdzewnej (4 mm, jako matrycę do lizy). Umieścić probówki symetrycznie w wstępnie schłodzonym otworze na próbkę w mechanicznym homogenizatorze ubijającym.</li>
	<li>Ustaw dudnienie na częstotliwość 55 Hz i amplitudę 1 cm na każdą 1 minutę mechanicznego dudnienia z 10-sekundową przerwą, w sumie z sześcioma cyklami. Rozpocznij ubijanie koralików.</li>
	<li>Wyekstrahować całkowite RNA z matrycy komórka-żel przy użyciu metody fenol-chloroform-izoamylachohol. Odwrotna transkrypcja 2 μg całkowitego RNA do cDNA za pomocą losowych starterów heksamerowych.</li>
	<li>Zaprojektuj startery ukierunkowane na β-aktynę, Pdpn, Dmp1, Sost i Fgf23 do PCR w czasie rzeczywistym (Tabela 2). β-aktyna jest genem porządkowym używanym do normalizacji. Geny Pdpn10 i Dmp111 ulegają ekspresji głównie w preosteocytach i zmineralizowanych osteocytach, podczas gdy Sost12 i Fgf2313 ulegają ekspresji głównie w dojrzałych osteocytach.</li>
	<li>Umieścić probówkę na termocyklerze z podgrzewaną pokrywką ustawioną na 105 °C i przeprowadzić amplifikację PCR przy użyciu następujących ustawień cyklicznych PCR: 95 °C przez 5 s i 60 °C przez 30 s przez 35 cykli z początkowym etapem denaturacji w temperaturze 95 °C przez 5 minut i końcowym krokiem przedłużania w temperaturze 60 °C przez 30 s. Analizować zmiany krotności za pomocą metody ΔΔCt.</li>
</ol>

<ol><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amazing+osteocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">The amazing osteocyte.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).</li>
<li>Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+osteocyte%3A+An+endocrine+cell+...+and+more%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">The osteocyte: An endocrine cell ... and more.</a> Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).</li>
<li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+osteocyte+in+bone+and+nonbone+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology+and+Metabolism+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">The role of the osteocyte in bone and nonbone disease.</a> Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 46 (1), 1-18 (2017).</li>
<li>Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li>
<li>Wang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+osteocyte+dendrite+formation+by+Sp7+and+its+target+gene+osteocrin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Control of osteocyte dendrite formation by Sp7 and its target gene osteocrin.</a> Nature Communications. 12 (1), 6271(2021).</li>
<li>Chicatun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoid-mimicking+dense+collagen%2Fchitosan+hybrid+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Osteoid-mimicking dense collagen/chitosan hybrid gels.</a> Biomacromolecules. 12 (8), 2946-2956 (2011).</li>
<li>Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomineralization+in+humans%3A+making+the+hard+choices+in+life%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Biomineralization in humans: making the hard choices in life.</a> Annual Review of Genetics. 43, 119-142 (2009).</li>
<li>Bosman, F. T., Stamenkovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+structure+and+composition+of+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Functional structure and composition of the extracellular matrix.</a> Journal of Pathology. 200 (4), 423-428 (2003).</li>
<li>Papadopoulos, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+fluorescence+assay+for+the+determination+of+lymphocyte-mediated+cytotoxicity+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved fluorescence assay for the determination of lymphocyte-mediated cytotoxicity using flow cytometry.</a> Journal of Immunological Methods. 177 (1-2), 101-111 (1994).</li>
<li>Staines, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypomorphic+conditional+deletion+of+E11%2FPodoplanin+reveals+a+role+in+osteocyte+dendrite+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hypomorphic conditional deletion of E11/Podoplanin reveals a role in osteocyte dendrite elongation.</a> Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3006-3019 (2017).</li>
<li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+DMP1+causes+rickets+and+osteomalacia+and+identifies+a+role+for+osteocytes+in+mineral+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism.</a> Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).</li>
<li>Winkler, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocyte+control+of+bone+formation+via+sclerostin%2C+a+novel+BMP+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Osteocyte control of bone formation via sclerostin, a novel BMP antagonist.</a> EMBO Journal. 22 (23), 6267-6276 (2003).</li>
<li>Riminucci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-23+in+fibrous+dysplasia+of+bone+and+its+relationship+to+renal+phosphate+wasting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">FGF-23 in fibrous dysplasia of bone and its relationship to renal phosphate wasting.</a> Journal of Clinical Investigation. 112 (5), 683-692 (2003).</li>
<li>Dallas, S. L., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+transition+from+osteoblast+to+osteocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1192, 437-443 (2010).</li>
<li>Robin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+3D+osteoblast+migration+and+bone+apatite+during+in+vitro+early+osteocytogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Involvement of 3D osteoblast migration and bone apatite during in vitro early osteocytogenesis.</a> Bone. 88, 146-156 (2016).</li>
<li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+mineralization+capacity+of+IDG-SW3+cells+in+3D+collagen+hydrogel+for+bone+healing+in+estrogen-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High mineralization capacity of IDG-SW3 cells in 3D collagen hydrogel for bone healing in estrogen-deficient mice.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 864(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Krytycznym punktem tego protokołu jest to, że kroki 1 i 2 muszą być wykonywane na lodzie, aby zapobiec spontanicznej krzepnięciu. W tej metodzie końcowe stężenie kolagenu I wynosiło 1,2 mg/ml. W związku z tym należy obliczyć optymalną objętość ddH2O, aby dopasować ją do różnych kolagenów różnych producentów.
In vivo osteocytogeneza polega na polarnym przemieszczaniu się osteoblastów od powierzchni do wnętrza kości beleczkowej14. Protokół ten uwalnia ...

Osteocyty to kończnie zróżnicowane komórki pochodzące z osteoblastów1,2. Gdy osteoblast zostanie zakopany przez osteoid, ulega osteocytogenezie i ulega ekspresji genu Pdpn, tworząc preosteocyty, genu Dmp1do mineralizacji osteoidu oraz genów Sost i Fgf23, aby funkcjonować jako dojrzały osteocyt w tkance kostnej3. Tutaj wprowadzono system hodowli 3D w celu identyfikacji wydłużania dendrytów i ekspresji genów markerowych w procesie osteocytogenezy.
Komórki IDG-SW3 są nieśmiertelną pierwotną linią komórkową pochodzącą od transgenicznych myszy i mogą rozwijać lub replikować osteoblasty do późnego różnicowania osteocytów, gdy są hodowane w różnych podłożach4. W porównaniu z MLO-A5, MLO-Y4 i innymi liniami komórkowymi, profil ekspresji funkcjonalnych białek, zdolność do odkładania soli wapniowej i odpowiedzi na różne hormony w komórkach IDG-SW3 są bardziej prawdopodobne, że będą takie same jak w przypadku pierwotnych osteocytów w tkance kostnej4.
W porównaniu do systemów 2D, systemy hodowli 3D są bardziej zdolne do naśladowania środowiska wzrostu komórkowego in vivo, w tym gradientu składników odżywczych, niskiej sztywności mechanicznej i otaczającego zakresu mechanicznego (Tabela 1). Większość poprzednich metod hodowli komórek osteoblastycznych w systemie 3D wykorzystywała kolagen I jako unikalny składnik preparatów4,5,6, ponieważ włókna kolagenu I służą jako miejsce odkładania się wapnia i fosforu. Jednak niezbędny składnik osteoidu, macierz zewnątrzkomórkowa, zawiera dużą grupę czynników komórkowych, które promują wzrost, adhezję i migrację komórek7,8 i jest przezroczysty i wygodny do obserwacji obrazowej. W związku z tym protokół ten wykorzystuje Matrigel (zwany dalej macierzą błony podstawnej) jako drugorzędny składnik do badania osteocytogenezy.

<table><tbody><tr><td>0,25% Kwas trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowy</td><td>Hyklon</td><td>SH30042,01</td><td></td></tr><tr><td>probówki 15 ml</td><td>Corning, NY, USA</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>7,5% (w/v) Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>kwas askorbinowy</td><td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10483-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10099141</td> homogenizator BiHeng<td></td></tr><tr><td></td><td>&nbsp; Biotechnologia, Szanghaj, Chiny</td><td>SKSI</td><td></td></tr><tr><td>laserowa konfokalna mikroskopia fluorescencyjna</td><td>Carl&nbsp; Zeiss, Oberkochen, Niemcy</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do obrazowania żywych/martwych komórek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37601</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix</td><td>Corning, NY, USA</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>MEM (10X), bez glutaminy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21430079</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Hydronowy</td><td>SH30256. </td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td> FS <td>Carl&nbsp; Zeiss, Oberkochen, Niemcy</td><td>Zeiss Axio ZOOM. V16</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo Fisher Scientific 15596026</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fluorescencja rentgenowska</td><td>EDAX, USA</td><td>EAGLE III</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosforan</td><td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td><td>G9422</td><td></td></tr></tbody></table>

hodowla komórkowa idg-sw3 w trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej

IDG-SW3 Cell Culture in a Three-Dimensional Extracellular Matrix

Osteocyty są uważane za komórki nieproliferacyjne, które są ostatecznie zróżnicowane od osteoblastów. Osteoblasty osadzone w macierzy zewnątrzkomórkowej kości (osteoid) wyrażają gen Pdpn w celu utworzenia dendrytów komórkowych i przekształcenia się w preosteocyty. Później preosteocyty wyrażają gen Dmp1, aby promować mineralizację macierzy, a tym samym przekształcać się w dojrzałe osteocyty. Proces ten nazywa się osteocytogenezą. IDG-SW3 to dobrze znana linia komórkowa do badań in vitro osteocytogenezy. Wiele wcześniejszych metod wykorzystywało kolagen I jako główny lub jedyny składnik matrycy hodowlanej. Jednak oprócz kolagenu I, osteoid zawiera również substancję naziemną, która jest ważnym składnikiem w promowaniu wzrostu, adhezji i migracji komórek. Ponadto substancja matrycy jest przezroczysta, co zwiększa przezroczystość żelu uformowanego w kolagen I, a tym samym pomaga w badaniu tworzenia dendrytów za pomocą technik obrazowania. W związku z tym artykuł ten szczegółowo opisuje protokół tworzenia żelu 3D przy użyciu macierzy zewnątrzkomórkowej wraz z kolagenem I w celu przeżycia IDG-SW3. W niniejszej pracy analizowano tworzenie dendrytów i ekspresję genów podczas osteocytogenezy. Po 7 dniach hodowli osteogennej pod fluorescencyjnym mikroskopem konfokalnym wyraźnie zaobserwowano rozległą sieć dendrytów. PCR w czasie rzeczywistym wykazał, że poziomy mRNA Pdpn i Dmp1 stale rosły przez 3 tygodnie. W 4. tygodniu stereomikroskop ujawnił nieprzezroczysty żel wypełniony cząstkami mineralnymi, zgodny z testem fluorescencji rentgenowskiej (XRF). Wyniki te wskazują, że ta matryca hodowli skutecznie ułatwia przejście od osteoblastów do dojrzałych osteocytów.

Po barwieniu żywych i martwych komórek, komórki zwizualizowano za pomocą konfokalnego mikroskopu laserowego. Wszystkie komórki były pozytywne pod kątem calcein AM (kolor zielony), a w polu widzenia niemal nie występowały komórki pozytywne pod kątem EthD-1 (kolor czerwony), co wskazuje, że system żelowy wykonany tą metodą jest wysoce odpowiedni dla osteocytogenezy (Rycina 1A, lewa strona). Aby lepiej określić rozkład przestrzenny komórek, wybrano obraz w pseudokolorach, aby wyświetlić dendryt...

Tutaj prezentujemy protokół hodowli komórek IDG-SW3 w trójwymiarowej (3D) macierzy zewnątrzkomórkowej.

Hodowla komórkowa IDG-SW3 w trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej

Osteocytes are considered to be nonproliferative cells that are terminally differentiated from osteoblasts. Osteoblasts embedded in the bone extracellular ...

Szczegółowo opisaliśmy protokół tworzenia systemu 3D wykorzystującego metryki zewnątrzkomórkowe wraz z metryką kolagenową do analizy tworzenia i ekspresji genów poprzez osteogenezę. Metryki zewnątrzkomórkowe mogą zwiększyć przezroczystość kolagenu w jednej formie żelu i nadają się do badania tworzenia dendrytów w technikach obrazowania. Aby rozpocząć, powoli odpipetuj 0,9 mililitra macierzy membrany podstawnej do nowej 15-mililitrowej probówki wirówkowej na lodzie i odłóż ją na bok.Następnie należy usunąć z inkubatora nić dentystyczną T25 z hodowanych komórek IDG SW3 w czterech mililitrach kompletnego podłoża uzupełnionego interferonem gamma. Po usunięciu pożywki należy przemyć komórki PBS o pH 7,4 za pomocą pipety. Następnie trypsanizuj komórki 0,5 mililitra 0,25% trypsyny EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 sekund.Dezaktywuj trypsynę, dodając 3,5 mililitra kompletnego podłoża. Przenieś cztery mililitry emerytury Celsjusza do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Odkręcać zawiesinę komórkową o masie 300 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić paletę komórek w jednym mililitrze kompletnego podłoża na lodzie. Policz komórki za pomocą hemocytometru i dostosuj końcową gęstość komórek za pomocą kompletnej pożywki do czterech razy 10 do piątych komórek na mililitr. Dodaj 0,1 mililitra przygotowanej zawiesiny komórkowej do 0,9 mililitra macierzy zewnątrzkomórkowej trzymanej na lodzie.Dobrze wymieszaj, delikatnie pipetując w górę i w dół. Delikatnie wymieszaj jeden mililitr mieszaniny macierzy komórkowej i jeden mililitr wcześniej przygotowanego kolagenu, pipetując w górę iw dół na lodzie. Odpipetować 0,5 mililitra końcowej mieszaniny do każdego dołka 24-dołkowej płytki i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, aby utworzyć mieszaninę żelu komórkowego.Po inkubacji dodaj 0,5 mililitra pożywki kostnej do mieszaniny żelu komórkowego w każdym dołku. Aby rozpocząć różnicowanie osteogenne w temperaturze 37 stopni Celsjusza, należy uznać to za dzień zerowy. Co dwa dni zastępuj połowę pożywki świeżą pożywką osteogenną i kontynuuj hodowlę przez 35 dni.Wyjmij z zamrażarki roztwory podstawowe wapnia AM i etydyny i pozwól im ogrzać się do temperatury pokojowej. Dodaj cztery mikrolitry dwóch milimolowych etydyny, jeden roztwór podstawowy i pięć mikrolitrów czteromilimolowego roztworu podstawowego wapnia AM do dwóch mililitrów DPBS i dobrze wymieszaj, aby uzyskać dwa mikromolowe roztwory wapnia AM i cztery mikromolowe etydy, jeden jako roztwór roboczy. Aby przeprowadzić barwienie komórek w pierwszym i siódmym dniu hodowli, należy odpipetować 0,5 mililitra roztworu roboczego do studzienek płytki 24-dołkowej i inkubować przez 30 do 45 minut w temperaturze pokojowej w celu wybarwienia matrycy żelu komórkowego.Dodaj około 0,5 mililitra świeżego DPBS do nowego naczynia hodowlanego ze szklanym dnem o średnicy 35 milimetrów i przykryj naczynie, aby zapobiec zanieczyszczeniu lub wysuszeniu próbek. Za pomocą kleszczyków z końcówką łokciową ostrożnie przenieś wybarwioną matrycę żelu komórkowego do naczynia hodowlanego zawierającego DPBS, nie uszkadzając ani nie ścinając matrycy żelu komórkowego. Zobacz oznakowane komórki pod laserowym konfokalnym mikroskopem fluorescencyjnym.Umieścić naczynie hodowlane zawierające wybarwioną matrycę żelową komórek na stoliku mikroskopu. Wybierz obszary matrycy żelu komórkowego, które mają być skanowane przez okular za pomocą obiektywu 10x. Aby ustawić skanowanie mikroskopem, wybierz filtry optyczne.Zobacz wapń jako zielony ze standardowym fluorescencyjnym filtrem pasmowym, a etydynowy jako czerwony z filtrami jodku propidyny lub czerwonego barwnika teksańskiego. Wybierz tryb liniowy skanowania, a następnie kliknij tryb akwizycji, aby ustawić jednostki airy na jedną au. Wybierz 8-bitową głębię danych i rozdzielczość obrazu 1024 na 1024 piksele.Następnie wybierz krok linii i ustaw prędkość skanowania na pięć. Aby zebrać stos obrazów Z, zdefiniuj górną i dolną pozycję matrycy żelu komórkowego, która ma być skanowana, skupiając się na próbce podczas ciągłego skanowania zgodnie z sygnałem kanału zielonego. Po określeniu górnej i dolnej części próbki wybierz żądaną ramkę skanowania i rozpocznij skanowanie.Próbka jest skanowana od góry do dołu z wybranymi ustawieniami, generując galerię obrazów. Aby zidentyfikować żywe komórki, zaznacz jeden wycinek obrazu. Zielony i czerwony kanał wskazują odpowiednio żywe i martwe komórki.Aby zidentyfikować dendryt komórki, wybierz pojedynczy zielony kanał, aby wygenerować rekonstrukcje 3D za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazu, seria tęczowych pseudokolorowych obrazów wskazuje informacje o głębi. Dendryty na dole są wyświetlane na czerwono, a te na górze są wyświetlane na niebiesko. W różnych dniach hodowli należy usunąć pożywkę hodowlaną i dwukrotnie umyć żele na płytce DPBS.Dodaj 0,5 mililitra lub 4% paraformaldehydu w DPBS do studzienki, aby utrwalić matrycę żelu komórkowego w płytce przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Usuń paraformaldehyd ze studzienki i umyj matrycę żelu komórkowego jeszcze dwa razy DPBS w płytce, jak pokazano wcześniej, i pozostaw 0,5 mililitra DPBS w każdym dołku do obrazowania. Umieść płytkę na stoliku mikroskopu stereoskopowego i wybierz optymalną pozycję przez okular za pomocą obiektywu 0,5x.Obraz, widok pełnego pola matrycy żelowej komórki w płytce indywidualnie przy użyciu automatycznej ekspozycji w jasnym polu. W 35 dniu hodowli należy sprawdzić poziom ciekłego azotu i uruchomić system XRF. Otwórz pomieszczenie na próbki i przenieś żele za pomocą kleszczyków zakończonych łokciami z płytki na środek stolika na próbki instrumentu.Zamknij pomieszczenie na próbki i odczekaj 30 minut, aby instrument ostygł przed użyciem. Ustaw czas naświetlania na 35 milisekund. Zakres widma od zera do 40 kilo elektronowoltów, a prąd elektryczny do 770 mikroamperów w celu konfiguracji akwizycji.Przesuwając etap próbkowania, wybierz od trzech do pięciu miejsc skanowania do analizy. Wybierz pierwiastki: wapń i fosfor. Rozpocznij wykrywanie i wyeksportuj wyniki.W różnych dniach hodowli. Dwukrotnie przemyć matrycę żelową z pożywki hodowlanej lodowatym DPBS, jak pokazano wcześniej. Ekstrahować całkowite RNA z matrycy żelu komórkowego za pomocą metody alkoholu izoamylowego fenolowo-chloroformowego.Następnie odwrotną transkrypcję dwóch mikrogramów całkowitego RNA na CDNA za pomocą losowych starterów heksameru. Umieść probówkę na termocyklerze i wykonaj amplifikację PCR. Po PCR przeanalizuj zmiany fałdowania metodą dwóch delta CT.Barwienie żywych martwych komórek uwidocznione pod konfokalnym mikroskopem laserowym wykazało, że wszystkie komórki były dodatnie pod względem wapnia AM i prawie nie miały komórek dodatnich pod względem etydyny, co wskazuje, że system żelowy jest wysoce odpowiedni do osteocytogenezy. Dendryty komórkowe stopniowo rozszerzały się w sieć w pożywce kościopochodnej do siódmego dnia. Pseudokolorowy obraz kultury siódmego dnia przedstawia androidy komórkowe na różnych głębokościach na dole i na górze żelu.Obrazowane są obrazy pełnego pola żelu z komórkami i żelu bez komórek w płytce 24-dołkowej we wskazanych momentach. Przezroczystość matrycy żelowej nadal spadała, aż stała się nieprzezroczysta w 35 dniu, w przeciwieństwie do bezkomórkowej matrycy żelowej. Widmo XRF nieprzezroczystego żelu w 35 dniu wskazywało, że żel był całkowicie wypełniony złogami wapnia i fosforu.Ekspresja kilku genów markerowych analizowanych metodą real-time PCR wykazała, że poziomy mRNA podoplaniny i białka macierzy zębiny jeden stale rosły od pierwszego dnia do 21 dnia, a poziom mRNA zmniejszył się po 21 dniu. Poziomy mRNA czynnika wzrostu fibroblastów 23 i sklerostyny stale wzrastały na wszystkich etapach. Kolagen jeden i błona podstawna metrics żelują szybko i w temperaturze pokojowej.Dlatego wszystkie używane końcówki i rurki muszą być wstępnie schłodzone, chyba że wskazano inaczej. Interesujące wydarzenia zachodzące w trakcie osteogenezy można obserwować za pomocą technik obrazowych. Łatwiej jest zlokalizować działanie cząsteczki podczas tworzenia i wydłużania dendrytów.

idg-sw3-cell-culture-in-a-three-dimensional-extracellular-matrix

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy prostą i szybką metodę generowania trójwymiarowych sferoid tkankopodobnych oraz ich potencjalne zastosowanie w ilościowym określaniu różnic w oddziaływaniach międzykomórkowych.

Prosty protokół hodowli komórkowej metodą wiszącej kropli do generowania sferoidów 3D

Ten manuskrypt opisuje technikę opartą na miękkiej litografii, polegającą na inżynierii jednolitych układów trójwymiarowych (3D) tkanek nabłonkowych o określonej geometrii otoczonych macierzą zewnątrzkomórkową. Metoda ta jest dostosowana do szerokiej gamy typów komórek i kontekstów eksperymentalnych oraz pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe identycznych kontrprób.

Inżynieria trójwymiarowych tkanek nabłonkowych osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej

Komórki rakowe są umieszczane w żelu kolagenowym, a następnie umieszczane w bezkomórkowym żelu fibrynowym w celu wygenerowania systemu hodowli 3D, w którym można monitorować inwazyjność i powstawanie nowotworów satelitarnych.

Trójwymiarowy test hodowli w celu zbadania inwazyjności komórek rakowych i tworzenia guzów satelitarnych

To jest metoda tworzenia trójwymiarowego rusztowania do hodowli komórkowych z zewnątrzkomórkowej macierzy płucnej. Nienaruszone płuca są przetwarzane na hydrożele, które mogą wspierać wzrost komórek w trzech wymiarach.

Przestrajalne hydrożele z macierzy zewnątrzkomórkowej płuc do hodowli komórek 3D

Tkankowa matryca zewnątrzkomórkowa (ECM) jest kluczowym mediatorem funkcji komórki. W artykule opisano metody syntezy czystych pianek i mikronośników pochodzących z ECM, które są stabilne w hodowli bez konieczności sieciowania chemicznego do zastosowań w zaawansowanych modelach hodowli komórkowych 3D in vitro lub jako proregeneracyjne biorusztowania.

Wytwarzanie pianek i mikronośników pochodzących z macierzy zewnątrzkomórkowej jako specyficznych tkankowo platform do hodowli i dostarczania komórek

Celem tego protokołu jest ocena wpływu czynników pro- i antymigracyjnych na migrację komórek w trójwymiarowej matrycy fibryny.

Charakterystyka migracji komórek w trójwymiarowym środowisku ran in vitro

Tutaj prezentujemy protokół uzyskiwania systemów hodowli 3D w samoorganizujących się rusztowaniach peptydowych, aby promować różnicowanie odróżnicowanych ludzkich chondrocytów stawowych w tkankę podobną do chrząstki.

Hodowla komórek ssaków w trójwymiarowych rusztowaniach peptydowych

Opisujemy metodę konstruowania urządzeń do hodowli 3D i eksperymentowania z komórkami i organoidami wielokomórkowymi. Urządzenie to umożliwia analizę odpowiedzi komórkowych na sygnały rozpuszczalne w mikrośrodowiskach 3D ze zdefiniowanymi gradientami chemoatraktantu. Organoidy są lepsze niż pojedyncze komórki w wykrywaniu słabych hałaśliwych sygnałów.

Analiza 3D wielokomórkowych odpowiedzi na gradienty chemoatraktantu

Inwazja jest głównym zjawiskiem biologicznym w rozwoju i postępie raka. Na proces ten mają wpływ komórki nienowotworowe i składniki mikrośrodowiska guza. Celem pracy jest opisanie alternatywnej metody analizy inwazji komórek nowotworowych in vitro z wykorzystaniem kultur trójwymiarowych (3D).

Alternatywna strategia analizy inwazji komórek in vitro w kulturach 3D

Tutaj pokazujemy, jak komórki nabłonkowe hodowane z fibroblastami w dwuwarstwowym systemie opartym na błonie nanowłóknistej mogą stabilnie przylegać do błony i rosnąć na niej.

Stworzenie trójwymiarowego modułu kokultury komórek nabłonkowych z wykorzystaniem błon nanowłóknistych

Poznaj protokół hodowli komórek IDG-SW3 w trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej do badań osteogenezy i formowania się dendrytów. Ta metoda umożliwia zaawansowaną analizę obrazową.

Hodowla komórkowa IDG-SW3 w trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej

Przeglądaj więcej filmów