Name: Ex vivo Analiza mechanicznie aktywowanych stanów nieustalonychCa2+ w komórkach urotelialnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Poznaj metodę badania mechanicznie wywołanych zdarzeń wapniowych w komórkach urotelialnych myszy z wykorzystaniem sensora GCaMP5G. Protokół umożliwia wizualizację dynamiki jonów Ca²⁺ w odpowiedzi na stymulację mechaniczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty NIH R01DK119183 (dla G.A. i M.D.C.) i S10OD028596 (dla G.A.) oraz przez Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores z Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307).

Opieka nad zwierzętami i obchodzenie się z nimi odbywało się zgodnie z Komisją ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Pittsburghu. Do niniejszego badania wykorzystano samice, 2-4-miesięczne myszy C57Bl/6J. Myszy uzyskano komercyjnie (patrz tabela materiałów).
1. Montaż i konfiguracja sprzętu
<ol>
	<li>Wykonaj obrazowanie Ca2+ za pomocą mikroskopu pionowego wyposażonego w kamerę o wysokiej rozdzielczości i stabilne źródło światła (patrz tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Obrazy można rejestrować za pomocą oprogramowania kompatybilnego z mikroskopem, które umożliwia bezpośrednie sterowanie kamerą, źródłem światła i siłownikiem piezoelektrycznym za pośrednictwem cyfrowego urządzenia I/O USB (patrz tabela materiałów). 
		UWAGA: Rysunek 1 przedstawia schemat konfiguracji. GCaMP5G ma szczytową długość fali wzbudzenia 470 nm i szczytową długość fali emisji 497 nm28. Użyj kostki filtrującej odpowiedniej do obrazowania GCaMP5G.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do stymulacji poszczególnych komórek urotelialnych w preparacie błony śluzowej pęcherza moczowego (patrz krok 2) należy użyć siłownika piezoelektrycznego sterowanego przez jednokanałowy sterownik piezoelektryczny z otwartą pętlą (patrz tabela materiałów). Zamontuj siłownik piezoelektryczny w mikromanipulatorze.
	<ol>
		<li>Zamontuj szklane mikropipety w uchwycie na pipety przymocowanym do siłownika piezoelektrycznego (<klasa silna="xfig">Rysunek 1). Zdalnie steruj regulatorem piezoelektrycznym za pomocą przetwornika analogowo-cyfrowego sterowanego za pomocą programu do akwizycji i analizy danych elektrofizjologicznych (patrz tabela materiałów). 
		UWAGA: Zewnętrzny wyzwalacz w postaci sygnału logicznego tranzystor-tranzystor (TTL) inicjowany przez oprogramowanie do obrazowania jest używany do wyzwalania protokołu stymulacji w oprogramowaniu do akwizycji i analizy danych elektrofizjologicznych, które porusza siłownikiem piezoelektrycznym (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Upewnij się, że oprogramowanie do obrazowania (patrz tabela materiałów) łączy się z cyfrowym urządzeniem we/wy. Skonfiguruj cyfrowy kanał wyjściowy w cyfrowym urządzeniu I/O USB, aby dostarczyć sygnał TTL do przetwornika analogowo-cyfrowego, który zainicjuje protokół w oprogramowaniu elektrofizjologicznym, które porusza siłownikiem piezoelektrycznym.
	<ol>
		<li>Za pomocą podłącz port Start BNC w przetworniku analogowo-cyfrowym do masy (GND) oraz zacisk śrubowy w cyfrowym urządzeniu I/O USB.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skonfiguruj protokół nagrywania w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu. 
	UWAGA: Poniższe kroki opisują, jak wygenerować protokół, który wyśle sygnał TTL i rozpocznie zbieranie obrazów w określonych odstępach czasu.
	<ol>
		<li>Skonfiguruj protokół akwizycji w oprogramowaniu do obrazowania, klikając Menedżer eksperymentów i wybierając Nowy eksperyment. Otworzy się nowe okno.</li>
		<li>Wybierz ikonę Pętla poklatkowa i przeciągnij ją do nowo otwartego okna; ustaw liczbę cykli na 2, a interwał na najszybsze ustawienie dozwolone w konfiguracji.</li>
		<li>Z ikony Migawka przesyłana/Migawka ręczna wybierz ikonę NI USB-6501 i przeciągnij ją do okna Pętla poklatkowa, a następnie ustaw NI USB-6501 jako zamknięty. Przeciągnij dodatkowy NI USB-6501 z migawki przesyłanej/migawki ręcznej do okna pętli poklatkowej i ustaw je jako otwarte. Aby połączyć dwie ikony NI USB-6501, przeciągnij grot strzałki z boku zamkniętej ikony NI USB-6501 i pociągnij, aż dotknie ikony otwarcia NI USB-6501. Pojawi się linia łącząca obie ikony.</li>
		<li>Przeciągnij kolejną pętlę poklatkową do okna Experiment Manager i połącz ją z pierwszą, pociągając za grot strzałki. Ustaw parametry nagrywania. Ustaw liczbę cykli nowej pętli poklatkowej na 2400.</li>
		<li>Z ikony Image Acquisition (Akwizycja obrazu) przeciągnij filtr GFP do ostatnio otwartej pętli poklatkowej i ustaw czas ekspozycji na 100 ms.</li>
		<li>Ustaw typ obrazu z kamery na 8-bitowy, rozdzielczość na 576 x 576 (Binning 4 x 4), zegar pikseli na 480 MHz i korekcję pikseli na gorąco na standardowy. 
		UWAGA: Parametry można regulować w zależności od poziomu ekspresji czujnika fluorescencyjnego, czułości kamery i konfiguracji konfiguracji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skonfiguruj stanowisko laboratoryjne w oprogramowaniu do elektrofizjologii (patrz tabela materiałów). 
	UWAGA: Spowoduje to zdefiniowanie sygnału wyjściowego w mV przetwornika analogowo-cyfrowego.
	<ol>
		<li>Przejdź do menu Configure w oprogramowaniu do elektrofizjologii i wybierz Lab Bench. W wyświetlonym oknie Sygnały wyjściowe wybierz Wyjście analogowe #1, naciśnij Dodaj sygnał i nazwij go (np. "Piezo"). Ustaw jednostkę sygnału na mV, a współczynnik skali (mV/V) na 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wygeneruj protokół stymulacji w oprogramowaniu do elektrofizjologii, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Aby wygenerować nowy protokół stymulacji w oprogramowaniu do elektrofizjologii, przejdź do punktu menu Zdobądź i wybierz Nowy protokół.</li>
		<li>Ustaw Tryb/Szybkość na Stymulację epizodyczną, Bieg/Próba na 1, Przemiatanie/Bieg na 1 i Czas trwania przemiatania (s) na 150.</li>
		<li>W menu Outputs (Wyjścia) wybierz kanał #1 Piezo jako Analog out (Wyjście analogowe).</li>
		<li>W menu Trigger (Wyzwalacz) ustaw wyzwalacz na Digitizer Start Input (Wejście startowe digitizera) i Internal Timer (Wewnętrzny timer).</li>
		<li>W menu Waveform (Kształt fali) wybierz kanał #1 i Analog Waveform with Epochs (Przebieg analogowy z epokami). Ustaw Krok A na Krok, Pierwszy poziom na 0, Poziom Delta na 0, Pierwszy czas trwania na 10000 i Czas trwania Delta na 0.</li>
		<li>Ustaw Krok B na Krok, Pierwszy poziom na 10, Poziom Delta na 0, Pierwszy czas trwania na 1000 i Czas trwania delty na 0. Ustaw Krok C na Krok, Pierwszy poziom na 0, Poziom Delta na 0, Pierwszy czas trwania na 130000, a Czas trwania Delta na 0.</li>
		<li>Zapisz protokół i nadaj mu nazwę Protokół stymulacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj BNC, aby podłączyć wyjście analogowe #1 w przetworniku analogowo-cyfrowym do WEJŚCIA ZEWNĘTRZNEGO z przodu jednokanałowego kontrolera piezoelektrycznego z otwartą pętlą (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Wytwarzaj szklane mikropipety do mechanicznej stymulacji komórek parasolowych z rurki ze szkła kapilarnego, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
	<ol>
		<li>Umieść szklankę kapilarną w ściągaczu (patrz Tabela materiałów) i wyreguluj ją za pomocą pokręteł ustalających kapilary.</li>
		<li>Ustaw nagrzewnicę na pełnej wysokości. Ustaw suwak pozycji zakończenia pierwszego pociągnięcia ściągacza na 5.</li>
		<li>Ustaw pierwsze pokrętło grzałki na 76.7, a drugie pokrętło na 52.7.</li>
		<li>Pociągnij szklaną kapilarnę w dwóch krokach, naciskając przycisk start.</li>
		<li>Zamknij końcówkę mikropipety za pomocą mikrokuźni (patrz Tabela materiałów) z pokrętłem regulacji grzałki ustawionym na 60. 
		UWAGA: W niniejszym protokole ostateczna średnica końcówki mikropipety używanej do nakłuwania pojedynczych komórek wynosi ~1-3 μm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprawdzić, czy mikropipeta stymulująca porusza się na odległość określoną w protokole stymulacji. 
	UWAGA: Poniższe kroki mają na celu zapewnienie, że po 12,5 s od zainicjowania protokołu stymulacji w oprogramowaniu do elektrofizjologii generowany jest impuls napięciowy o czasie trwania 1 s, który powoduje ruch siłownika piezoelektrycznego o 20 μm.
	<ol>
		<li>Zamontuj mikropipetę w uchwycie i przymocuj ją do siłownika piezoelektrycznego.</li>
		<li>Umieść siłownik piezoelektryczny i dołączoną mikropipetę równolegle do środka stolika mikroskopu i w obszarze view.</li>
		<li>Skoncentruj się na końcówce pipety i unieruchom piezoelektryczny pręt montażowy (patrz Tabela materiałów) za pomocą taśmy. Przy jasnym oświetleniu wyreguluj parametry kamery, aby uzyskać wyraźny obraz końcówki pipety.</li>
		<li>Otwórz protokół stymulacji w oprogramowaniu do elektrofizjologii i ustaw go na odtwarzanie. 
		UWAGA: Protokół elektrofizjologii nie zostanie uruchomiony, dopóki nie zostanie odebrany sygnał TTL wysłany z oprogramowania do obrazowania.</li>
		<li>W Experiment Manager w oprogramowaniu do obrazowania naciśnij Start, aby rozpocząć pobieranie danych. 
		UWAGA: Spowoduje to wyzwolenie protokołu w oprogramowaniu do elektrofizjologii, który będzie sterował siłownikiem piezoelektrycznym. Protokół w oprogramowaniu do obrazowania wygeneruje plik z obrazami eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprawdź odległość przebytą przez pipetę, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Aby zmierzyć odległość przebytą przez pipetę podczas protokołu stymulacji, wybierz pozycję Count and Measure (Policz i zmierz) w oprogramowaniu do obrazowania.</li>
		<li>Z menu Measure (Miara) wybierz opcję Measurement and ROI (Pomiar i zwrot z inwestycji), a pod oknem filmu pojawi się nowe okno.</li>
		<li>Z menu Miara wybierz opcję Dowolny wiersz.</li>
		<li>W oknie filmu narysuj dowolną linię, zaczynając od końcówki pipety. Należy pamiętać, że koniec dowolnej linii zostanie dostosowany później.</li>
		<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy dowolną linię, aby przekształcić ją w obszar zainteresowania (ROI), który będzie widoczny we wszystkich klatkach filmu.</li>
		<li>Obejrzyj film i ustaw koniec dowolnej linii (ROI) w końcowej pozycji, po której porusza się pipeta w odpowiedzi na bodziec. 
		UWAGA: Odległość przebyta przez pipetę w μm pojawi się w oknie Measurement and ROI (Pomiar i zwrot z inwestycji). Protokół stymulacji może być modyfikowany w zależności od potrzeb użytkownika.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Transdukcja in situ i izolacja błony śluzowej pęcherza moczowego
<ol>
	<li>Transdukcja pęcherzy myszy u samic in situ za pomocą adenowirusa kodującego cDNA CGaMP5G zgodnie z procedurą opisaną w protokole transdukcji wirusa31.
	<ol>
		<li>Podczas transdukcji komórek urotelialnych do eksperymentów obrazowania Ca2+ należy wkroplić do pęcherzy 50 μl roztworu zawierającego 2 x 107 zakaźnych cząstek wirusowych (IVP). 
		UWAGA: Ta technika ma tendencję do ograniczania ekspresji CGaMP5G do warstwy komórek parasolowych. Alternatywnie, eksperymenty można przeprowadzić na pęcherzach moczowych pobranych od transgenicznych myszy eksprymujących CGaMP5G w komórkach urotelialnych (tj. Ekspresja GCaMP5G napędzana przez promotor uroplakiny-2) lub dowolnym innym typie komórek będących przedmiotem zainteresowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>24-72 godziny po transdukcji należy poddać myszy eutanazji przez uduszenie CO2 i wykonać torakotomię, otwierając jamę klatki piersiowej nożyczkami, aby spowodować zapadnięcie się płuc.</li>
	<li>Kanonuluj cewkę moczową za pomocą cewnika 24 G. Odsłoń pęcherz moczowy przez nacięcie brzuszne o długości ~1,5 cm przez skórę i mięśnie, a następnie użyj szwu 6,0 (patrz Tabela materiałów), aby przymocować cewnik do cewki moczowej.</li>
	<li>Zbierz pęcherz moczowy i cewkę moczową32 i przymocuj do podkładki z gumy silikonowej (patrz Tabela Materiałów) skąpanych w roztworze rejestrującym zawierającym (w mM): 135 NaCl, 5,0 KCl, 1 MgCl2, 2,5 CaCl2, 10 HEPES, pH 7,4 i bąbelkuje 100% O2 (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Oddziel błonę śluzową pęcherza moczowego od leżącej pod nią warstwy mięśniowej za pomocą cienkich kleszczy zgodnie z wcześniej opublikowanymi raportami32 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Rozetnij błonę śluzową pęcherza moczowego i przypnij ją nabłonkiem dróg moczowych skierowanym do góry do wkładki z elastomeru silikonowego na dnie naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2C).</li>
</ol>
3. Mechaniczna stymulacja pojedynczych komórek urotelialnych i obrazowanie Ca2+
<ol>
	<li>Zamontuj naczynie z hodowlą tkankową z przypiętą błoną śluzową pęcherza moczowego na stoliku mikroskopowym wyposażonym w inkubator do hodowli z rezystancyjnymi elementami grzejnymi (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2E). Wykonuj perfaktorkę (zgodnie z instrukcjami producenta, patrz Tabela materiałów) w naczyniu do hodowli komórkowych w sposób ciągły z szybkością 1,7 ml / min z roztworem zapisującym podgrzanym do temperatury ~37 °C za pomocą grzałki liniowej.</li>
	<li>Utrzymywać temperaturę inkubatora do naczyń tkankowych i roztworów na poziomie ~37 °C za pomocą dwukanałowego bipolarnego regulatora temperatury (patrz tabela materiałów). Równoważyć tkankę w komorze ciągłą perfuzją przez co najmniej 15 minut przed przeprowadzeniem dalszych procedur doświadczalnych.</li>
	<li>Aby zarejestrować mechanicznie indukowane stany przejścioweCa2+, zanurz mikropipetę w roztworze, kąpiąc przygwożdżoną błonę śluzową pęcherza moczowego w naczyniu na tkanki. Przesuń mikropipetę na środek pola za pomocą obiektywu skanującego o małym powiększeniu (4x) przy jasnym oświetleniu pola.
	<ol>
		<li>Przesunąć mikropipetę w pobliże powierzchni tkanki urotelialnej, koordynująco przesuwając mikromanipulator w płaszczyźnie pionowej i regulując ostrość.</li>
		<li>Zmień obiektyw na taki o większym powiększeniu (20x), odpowiedni do immunofluorescencji z dużym otworem numerycznym (NA).</li>
		<li>Ustaw mikromanipulator w pozycji Fine i przesuń mikropipetę w pobliże górnej części celi docelowej.</li>
		<li>Zmień pole widzenia na kamerę i naciśnij Live w oprogramowaniu do obrazowania. 
		UWAGA: Musi to włączyć odbitą migawkę i umożliwić obserwację sygnału fluorescencyjnego emitowanego przez tkankę w komputerze.</li>
		<li>Dostosuj ostrość, aby uwidocznić górną część kuwety i w razie potrzeby dostosuj położenie pipety.</li>
		<li>Otwórz protokół stymulacji w oprogramowaniu do elektrofizjologii i ustaw go na odtwarzanie. 
		UWAGA: Protokół w oprogramowaniu do elektrofizjologii nie zostanie uruchomiony, dopóki nie zostanie odebrany sygnał TTL wysłany z oprogramowania do obrazowania.</li>
		<li>W Experiment Manager w oprogramowaniu do obrazowania naciśnij Start, aby rozpocząć pobieranie danych. Spowoduje to uruchomienie protokołu w oprogramowaniu do elektrofizjologii, które będzie sterować siłownikiem piezoelektrycznym i wygeneruje plik z obrazami eksperymentu. Protokół stymulacji może być modyfikowany w zależności od potrzeb użytkownika.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Określ ilościowo intensywność fluorescencji w czasie, wykonując poniższe czynności.
	<ol>
		<li>Otwórz plik obrazu w oprogramowaniu do obrazowania i wybierz okno Count and Measure (Zlicz i zmierz). Wybierz narzędzie wielokąta i narysuj ROI na granicach komórki, która została szturchnięta.</li>
		<li>Przejdź do okna Pomiar, wybierz opcję Profil intensywności, ustaw pomiar na Z czasem, Wyniki na Średnia, Odejmowanie tła na Brak, a następnie naciśnij przycisk Wykonaj. Średnia intensywność fluorescencji zostanie obliczona w czasie (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
		<li>Aby wyeksportować dane profilu intensywności, kliknij ikonę Excela w oknie Wyniki profilu intensywności . Umożliwi to użytkownikowi wybranie folderu docelowego i nazwy pliku oraz zapisanie danych w formacie .xlsx.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzaj analizę danych za pomocą oprogramowania do tworzenia wykresów naukowych i analizy danych (patrz tabela materiałów). 
	UWAGA: Amplituda piku Ca2+ wywołana szturchaniem jest wyrażona jako zmiana intensywności fluorescencji (ΔF/F), gdzie F jest intensywnością fluorescencji GCaMP5G w czasie 0, a ΔF jest różnicą między maksimami intensywności fluorescencji a bazową w czasie 0. Można również obliczyć zanik odpowiedzi Ca2+ (nie pokazano).</li>
</ol>

<ol><li>Kunau, R. T., Webb, H. L., Borman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+the+relationship+between+the+flow+rate+of+tubular+fluid+and+potassium+transport+in+the+distal+tubule+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Characteristics of the relationship between the flow rate of tubular fluid and potassium transport in the distal tubule of the rat.</a> Journal of Clinical Investigation. 54 (6), 1488-1495 (1974).</li>
<li>Engbretson, B. G., Stoner, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-dependent+potassium+secretion+by+rabbit+cortical+collecting+tubule+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Flow-dependent potassium secretion by rabbit cortical collecting tubule in vitro.</a> American Journal of Physiology. 253 (5), 896-903 (1987).</li>
<li>Satlin, L. M., Sheng, S., Woda, C. B., Kleyman, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+Na%28%2B%29+channels+are+regulated+by+flow%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Epithelial Na(+) channels are regulated by flow.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 280 (6), 1010-1018 (2001).</li>
<li>Woda, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+flow-stimulated+potassium+secretion+in+rabbit+cortical+collecting+duct%3A+functional+and+molecular+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of flow-stimulated potassium secretion in rabbit cortical collecting duct: functional and molecular aspects.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 285 (4), 629-639 (2003).</li>
<li>Malnic, G., Berliner, R. W., Giebisch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+dependence+of+K%2B+secretion+in+cortical+distal+tubules+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Flow dependence of K+ secretion in cortical distal tubules of the rat.</a> American Journal of Physiology. 256 (5), 932-941 (1989).</li>
<li>Khuri, R. N., Strieder, W. N., Giebisch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+flow+rate+and+potassium+intake+on+distal+tubular+potassium+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of flow rate and potassium intake on distal tubular potassium transfer.</a> American Journal of Physiology. 228 (4), 1249-1261 (1975).</li>
<li>Good, D. W., Wright, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminal+influences+on+potassium+secretion%3A+sodium+concentration+and+fluid+flow+rate%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Luminal influences on potassium secretion: sodium concentration and fluid flow rate.</a> American Journal of Physiology. 236 (2), 192-205 (1979).</li>
<li>Wong, K. R., Berry, C. A., Cogan, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+dependence+of+chloride+transport+in+rat+S1+proximal+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Flow dependence of chloride transport in rat S1 proximal tubules.</a> American Journal of Physiology. 269 (6), 870-875 (1995).</li>
<li>Garvin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+absorption+by+isolated+perfused+rat+proximal+straight+tubules%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Glucose absorption by isolated perfused rat proximal straight tubules.</a> American Journal of Physiology. 259 (4), 580-586 (1990).</li>
<li>Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropuncture+study+of+renal+potassium+excretion+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Micropuncture study of renal potassium excretion in the rat.</a> American Journal of Physiology. 206 (4), 674-686 (1964).</li>
<li>Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropuncture+study+of+distal+tubular+potassium+and+sodium+transport+in+rat+nephron%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Micropuncture study of distal tubular potassium and sodium transport in rat nephron.</a> American Journal of Physiology. 211 (3), 529-547 (1966).</li>
<li>Cabral, P. D., Garvin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminal+flow+regulates+NO+and+O2%28-%29+along+the+nephron%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Luminal flow regulates NO and O2(-) along the nephron.</a> American Journal of Physiology. 300 (5), 1047-1053 (2011).</li>
<li>Raghavan, V., Rbaibi, Y., Pastor-Soler, N. M., Carattino, M. D., Weisz, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress-dependent+regulation+of+apical+endocytosis+in+renal+proximal+tubule+cells+mediated+by+primary+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Shear stress-dependent regulation of apical endocytosis in renal proximal tubule cells mediated by primary cilia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8506-8511 (2014).</li>
<li>Lewis, S. A., de Moura, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+membrane+area+of+rabbit+urinary+bladder+increases+by+fusion+of+intracellular+vesicles%3A+an+electrophysiological+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Apical membrane area of rabbit urinary bladder increases by fusion of intracellular vesicles: an electrophysiological study.</a> The Journal of Membrane Biology. 82 (2), 123-136 (1984).</li>
<li>Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+control+of+micturition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The neural control of micturition.</a> Nature Reviews Neuroscience. 9 (6), 453-466 (2008).</li>
<li>Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+urothelium%3A+life+in+a+liquid+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The urothelium: life in a liquid environment.</a> Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).</li>
<li>Khandelwal, P., Abraham, S. N., Apodaca, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+and+physiology+of+the+uroepithelium%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell biology and physiology of the uroepithelium.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 297 (6), 1477-1501 (2009).</li>
<li>Sachs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-activated+ion+channels%3A+what+are+they%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Stretch-activated ion channels: what are they.</a> Physiology. 25 (1), 50-56 (2010).</li>
<li>Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+ion+channels%3A+molecules+of+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction.</a> Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).</li>
<li>Ranade, S. S., Syeda, R., Patapoutian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+activated+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mechanically activated ion channels.</a> Neuron. 87 (6), 1162-1179 (2015).</li>
<li>Cox, C. D., Bavi, N., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+principles+of+ion-channel-mediated+mechanosensory+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Biophysical principles of ion-channel-mediated mechanosensory transduction.</a> Cell Reports. 29 (1), 1-12 (2019).</li>
<li>Carattino, M. D., Sheng, S., Kleyman, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+Na%2B+channels+are+activated+by+laminar+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Epithelial Na+ channels are activated by laminar shear stress.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (6), 4120-4126 (2004).</li>
<li>Ross, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+in+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrins in mechanotransduction.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 613-618 (2013).</li>
<li>Dieterle, M. P., Husari, A., Rolauffs, B., Steinberg, T., Tomakidi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins%2C+cadherins+and+channels+in+cartilage+mechanotransduction%3A+perspectives+for+future+regeneration+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Reviews+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Integrins, cadherins and channels in cartilage mechanotransduction: perspectives for future regeneration strategies.</a> Expert Reviews in Molecular Medicine. 23, 14(2021).</li>
<li>Huveneers, S., de Rooij, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+systems+at+the+cadherin-F-actin+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive systems at the cadherin-F-actin interface.</a> Journal of Cell Science. 126, 403-413 (2013).</li>
<li>Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-mediated+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrin-mediated mechanotransduction.</a> Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches.+Pfl%C3%BCgers+Archiv%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv.</a> European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2(2013).</li>
<li>Sun, X. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+GCaMPs+for+improved+tracking+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Fast GCaMPs for improved tracking of neuronal activity.</a> Nature Communications. 4, 2170(2013).</li>
<li>Dalghi, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+for+PIEZO1+and+PIEZO2+in+urothelial+mechanotransduction+and+lower+urinary+tract+interoception%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception.</a> JCI Insight. 6 (19), 152984(2021).</li>
<li>Durnin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+bladder+model+with+detrusor+smooth+muscle+removed+to+analyse+biologically+active+mediators+released+from+the+suburothelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium.</a> The Journal of Physiology. 597 (6), 1467-1485 (2019).</li>
<li>Delmas, P., Coste, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechano-gated+ion+channels+in+sensory+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechano-gated ion channels in sensory systems.</a> Cell. 155 (2), 278-284 (2013).</li>
<li>Tavernarakis, N., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degenerins.+At+the+core+of+the+metazoan+mechanotransducer%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Degenerins. At the core of the metazoan mechanotransducer.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 940 (1), 28-41 (2001).</li>
<li>Peyronnet, R., Tran, D., Girault, T., Frachisse, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+channels%3A+feeling+tension+in+a+world+under+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive channels: feeling tension in a world under pressure.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 558(2014).</li>
<li>Blount, P., Iscla, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+with+bacterial+mechanosensitive+channels%2C+from+discovery+to+physiology+to+pharmacological+target%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Life with bacterial mechanosensitive channels, from discovery to physiology to pharmacological target.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 84 (1), 00055(2020).</li>
<li>Booth, I. R., Miller, S., Müller, A., Lehtovirta-Morley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+bacterial+mechanosensitive+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The evolution of bacterial mechanosensitive channels.</a> Cell Calcium. 57 (3), 140-150 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wszystkie organizmy i pozornie większość typów komórek wyrażają kanały jonowe, które reagują na bodźce mechaniczne 20,33,34,35,36,37. Funkcja tych mechanicznie aktywowanych kanałów została oceniona głównie za pomocą techniki patch-clamp. Jednak ze względu na problemy z dostępnością, badania patch-clamp mechanicznie aktywowany...

Komórki nabłonkowe w drogach moczowych są poddawane siłom mechanicznym, gdy filtrat moczowy przemieszcza się przez nefrony, a mocz jest wypompowywany z miedniczki nerkowej i przechodzi przez moczowody, aby być przechowywanym w pęcherzu moczowym. Od dawna wiadomo, że siły mechaniczne (np. naprężenie ścinające i rozciąganie) wywierane przez płyny na komórki nabłonka wyściełające drogi moczowe regulują reabsorpcję białka w kanaliku proksymalnym i substancji rozpuszczonych w dystalnym nefronie1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13, a także magazynowanie moczu w pęcherzu moczowym i oddawanie moczu14,15,16,17.
Konwersja bodźców mechanicznych na sygnały elektryczne i biochemiczne, proces określany jako mechanotransdukcja, odbywa się za pośrednictwem białek, które reagują na deformację struktur komórkowych lub związanej z nimi macierzy zewnątrzkomórkowej18,19,20,21. Mechanicznie aktywowane kanały jonowe są wyjątkowe w tym sensie, że przechodzą ze stanu zamkniętego do otwartego stanu przepuszczalnego w odpowiedzi na zmiany napięcia membrany, ciśnienia lub naprężenia ścinającego18,19,20,21,22. Ponadto stany przejściowe Ca2+ mogą być inicjowane przez mechanotransdukcję za pośrednictwem integryny lub przez aktywację mechanoreaktywnych systemów adhezyjnych na połączeniach komórka-komórka23,24,25,26. Funkcja kanału jonowego jest zwykle oceniana za pomocą techniki patch-clamp, która polega na utworzeniu gigaomowego uszczelnienia między błoną komórkową a pipetą krosową27. Jednak komórki znajdujące się w głębokich warstwach tkanek z gęstą macierzą zewnątrzkomórkową (np. kanaliki nerkowe) lub otoczone barierą fizyczną (np. glikokaliksem) są trudno dostępne za pomocą szklanej mikropipety. Podobnie, komórki osadzone lub będące integralnymi częściami tkanek o słabej stabilności mechanicznej (np. nabłonek dróg moczowych) nie mogą być łatwo badane za pomocą techniki patch-clamp. Ponieważ wiele mechanicznie aktywowanych kanałów jonowych jest przepuszczalnych dlaCa2+, alternatywnym podejściem jest ocena ich aktywności za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu barwnika wrażliwego na Ca2+ lub genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (GECI), takich jak GCaMP. Ostatnie wysiłki w dziedzinie inżynierii białek znacznie zwiększyły zakres dynamiki, czułość i odpowiedź GECIs28,29,30, a postępy w genetyce umożliwiły ich ekspresję w określonych populacjach komórek, dzięki czemu idealnie nadają się do badania mechanotransdukcji.
Nabłonek dróg moczowych, warstwowy nabłonek, który pokrywa wnętrze pęcherza moczowego, funkcjonuje jako bariera, zapobiegając dyfuzji substancji rozpuszczonych w moczu do śródmiąższu pęcherza, ale także działa jako przetwornik, wykrywając wypełnienie pęcherza moczowego i komunikując te zdarzenia do leżących poniżej nerwów i mięśni16. Wcześniejsze badania wykazały, że komunikacja między nabłonkiem dróg moczowych a leżącymi pod nim tkankami wymaga mechanicznie aktywowanych kanałów jonowych Piezo1 i Piezo231. Aby ocenić mechanicznie indukowane stany przejścioweCa2+ w komórkach urotelialnych, opracowano nową technikę, która wykorzystuje transfer genów adenowirusa do ekspresji czujnika Ca2+ GCaMP5G w komórkach urotelialnych. Technika ta wykorzystuje przygotowanie arkusza błony śluzowej, który zapewnia łatwy dostęp do najbardziej zewnętrznej warstwy komórek parasolowych oraz system wspomagany komputerowo do jednoczesnej mechanicznej stymulacji pojedynczych komórek za pomocą zamkniętej szklanej mikropipety i rejestrowania zmian fluorescencji w czasie.

<table><tbody><tr><td>20x Obiektyw</td><td>Olympus</td><td>UMPlanFL N</td><td></td></tr><tr><td>24 G &frac34; &rdquo; cewnik</td><td>Medline&nbsp;</td><td>Prowadnica Suresite IV&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>4x Obiektyw</td><td>Olympus</td><td>UPlanFL N</td><td></td></tr><tr><td>Przetwornik analogowo-cyfrowy</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Digidata 1440A Przeciwciało</td><td></td></tr><tr><td>anty-GFP</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>Ab6556</td><td></td></tr><tr><td>Rozdzielacz wiązki</td><td>Chroma</td><td>T495lpxr</td><td></td></tr><tr><td>Bipolarny regulator temperatury&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fluka</td><td>21114-1L</td><td>1 M solution</td></tr><tr><td>cellSens software</td><td>Olympus</td><td></td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Kamera CMOS</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA fusion</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anty-rabbit skoniugowany z Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-545-152</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtr&nbsp;</td><td>Chroma&nbsp;</td><td>ET470/40X</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary szklane Szkło Corning 8250</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td>G85150T-4</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Nagrzewnica liniowa&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>793590</td><td></td></tr><tr><td>Źródło światła</td><td>Sutter Instruments</td><td>Lambda XL&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Przewody pompy kolektora</td><td>Fisherbrand</td><td>14-190-510</td><td>ID 1,52 mm</td></tr><tr><td>Przewody pompy kolektora</td><td>Fisherbrand</td><td>14-190-533</td><td>ID 2,79 mm</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Myszy&nbsp;</td><td>Jackson Lab</td><td>664</td><td>2-4 miesięczna suczka C57BL/6J</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige&nbsp;</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51W</td><td></td></tr><tr><td>Nośnik montażowy z DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>S36964&nbsp;</td><td>Slowfade Diamond Antifade z DAPI</td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Oprogramowanie pClamp Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Molecular Devices</td><td>Wersja 10.4</td><td>Oprogramowanie do akwizycji i analizy danych elektrofizjologicznych</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Gilson</td><td>Minipuls 3</td><td></td></tr><tr><td>Siłownik piezoelektryczny</td><td>Thorlabs</td><td>PAS005</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na pipety</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do pipet</td><td>Narishige</td><td>PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewana podstawa szybkiej wymiany z zestawem pierścieni perfuzyjnych i adaptera</td><td>Warner Instruments</td><td>QE-1</td><td>Platforma szybkiej wymiany pasuje do czaszy 35 mm&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Rodamina-falloidyna&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Plot</td><td>Systat Software Inc</td><td>Wersja 14.0</td><td>Oprogramowanie do tworzenia wykresów naukowych i analizy danych&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Elastomer</td><td>silikonowy Dow</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Jednokanałowy kontroler piezoelektryczny z otwartą pętlą</td><td>Thorlabs</td><td>MDT694B</td><td></td></tr><tr><td>Kwadratowa podkładka na siatkę</td><td>Ted Pella</td><td>10520</td><td></td></tr><tr><td>Szew</td><td>AD Chirurgiczny</td><td>S-S618R13</td><td>6-0</td></tr><tr><td>Sylk Teflonowy pręt montażowy</td><td>Wykonane</td><td></td> na zamówienie <td>Służy do montażu siłownika piezoelektrycznego w mikromanipulatorze</td></tr><tr><td>Rurka</td><td>Fisher Scientific</td><td>14171129</td><td>Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN</td></tr><tr><td>USB Digital I/O device&nbsp;</td><td>National Instruments</td><td>NI USB-6501</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo analiza mechanicznie aktywowanych stanów nieustalonychca2+ w komórkach urotelialnych

Ex Vivo Analysis of Mechanically Activated Ca2+ Transients in Urothelial Cells

Mechanicznie aktywowane kanały jonowe to biologiczne przetworniki, które przekształcają bodźce mechaniczne, takie jak siły rozciągające lub ścinające, na sygnały elektryczne i biochemiczne. U ssaków kanały aktywowane mechanicznie są niezbędne do wykrywania bodźców zewnętrznych i wewnętrznych w procesach tak różnych, jak czucie dotyku, słuch, regulacja objętości czerwonych krwinek, regulacja podstawowego ciśnienia krwi i uczucie pełności pęcherza moczowego. Podczas gdy funkcja mechanicznie aktywowanych kanałów jonowych została szeroko zbadana w warunkach in vitro przy użyciu techniki patch-clamp, ocena ich funkcji w ich naturalnym środowisku pozostaje trudnym zadaniem, często z powodu ograniczonego dostępu do miejsc ekspresji tych kanałów (np. końcówek aferentnych, komórek Merkla, baroreceptorów i kanalików nerkowych) lub trudności w zastosowaniu techniki patch-clamp (np. wierzchołkowe powierzchnie urotelialnych komórek parasolowych). Protokół ten opisuje procedurę oceny mechanicznie wywołanych stanów przejściowych Ca2 + przy użyciu czujnika fluorescencyjnego GCaMP5G w preparacie urotelialnym ex vivo, technice, którą można łatwo dostosować do badania mechanicznie wywołanych zdarzeń Ca2 + w innych natywnych preparatach tkankowych.

Niniejszy protokół opisuje technikę oceny mechanicznie wywołanych przejściowych wzrostów stężenia Ca2+ w komórkach parasolowatych przy użyciu fluorescencyjnego sensora Ca2+ GCaMP5G. Do ekspresji GCaMP5G w komórkach urothelium wykorzystano transdukcję adenowirusową ze względu na jej wysoką wydajność oraz zdolność do uzyskania wysokiego poziomu ekspresji. Obrazy fluorescencyjne barwionych krioprzecięć z transdukowanego pęcherza przedstawiono na Rysunku 2D. W tych eksperym...

Ten protokół opisuje metodologię oceny funkcji mechanicznie aktywowanych kanałów jonowych w natywnych komórkach urotelialnych za pomocą fluorescencyjnego czujnika Ca2+ GCaMP5G.

Ex vivo Analiza mechanicznie aktywowanych stanów nieustalonychCa2+ w komórkach urotelialnych

Mechanically activated ion channels are biological transducers that convert mechanical stimuli such as stretch or shear forces into electrical and ...

Protokół ten opisuje technikę badania mechanicznie wywołanego zdarzenia wapniowego w preparacie urotelialnym ex vivo. Technika ta jest stosunkowo łatwa do wykonania i może być zaadaptowana do badania mechanicznie wywołanego zdarzenia wapniowego w innych natywnych preparatach tkankowych. Wykonaj mikropipety, umieszczając szklaną kapilę w ściągaczu i regulując ją za pomocą pokręteł przytrzymujących kapilary.Pociągnij szklaną kapilarnę w dwóch krokach zgodnie z instrukcjami producenta. Zamknij końcówkę mikropipet za pomocą mikrokuźni z pokrętłem regulacji grzałki ustawionym na 60. Po odsłonięciu pęcherza moczowego i kości miednicy myszy poddanej eutanazji, rozbij kość miednicy, aby odsłonić cewkę moczową i kaniulować cewkę moczową za pomocą cewnika o rozmiarze 24.Użyj szwu 6-0, aby przymocować cewnik do cewki moczowej. Pobrać pęcherz moczowy i cewkę moczową i przymocować je do podkładki z gumy silikonowej skąpanej w roztworze do nagrywania. Oddziel błonę śluzową pęcherza moczowego od leżącej pod nią warstwy mięśniowej za pomocą cienkich kleszczy.Rozetnij błonę śluzową pęcherza moczowego i przypnij ją błoną dróg moczowych skierowaną do góry do wkładki z elastomeru silikonowego na dnie naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 35 milimetrów. Zamontuj naczynie do hodowli tkankowej z przypiętą błoną śluzową pęcherza moczowego w stoliku mikroskopowym wyposażonym w inkubator do hodowli z rezystancyjnymi elementami grzejnymi. Napełniać naczynie do hodowli komórkowych w sposób ciągły z szybkością 1,7 mililitra na minutę z roztworem nagrywającym podgrzanym do 37 stopni Celsjusza za pomocą wbudowanej grzałki.Utrzymuj temperaturę inkubatora do naczyń tkankowych i roztworów na poziomie około 37 stopni Celsjusza za pomocą dwukanałowego bipolarnego regulatora temperatury. Aby zarejestrować mechanicznie indukowane stany przejściowe jonów wapnia, należy zanurzyć mikropipetę w roztworze rejestrującym. Przy jasnym oświetleniu, przy użyciu obiektywu skanującego o małym powiększeniu, przesuń mikropipetę do środka pola.Przesuń mikromanipulator w płaszczyźnie pionowej i wyreguluj ostrość, aby przesunąć pipetę w pobliże powierzchni tkanki urotelialnej. Przełącz się na obiektyw o większym powiększeniu i aperturze numerycznej odpowiedniej do immunofluorescencji. Ustaw mikromanipulator na drobny i przesuń pipetę w pobliże górnej części celi docelowej.W razie potrzeby wyreguluj ostrość i położenie pipety. Otwórz protokół stymulacji w oprogramowaniu do elektrofizjologii i ustaw go na odtwarzanie. Dostosuj fokus i naciśnij start w menedżerze eksperymentów, aby rozpocząć pobieranie danych.To napędza siłownik piezoelektryczny i generuje plik z obrazami eksperymentu. Kiedy komórka jest stymulowana, obserwuje się wzrost fluorescencji. Aby określić ilościowo intensywność fluorescencji, otwórz plik obrazu w oprogramowaniu do obrazowania i wybierz okno zliczania i mierzenia.Odtwórz film, aby zidentyfikować stymulowaną komórkę. Wybierz narzędzie wielokąta i narysuj ROI na granicach komórki, która została szturchnięta. Przejdź do okna pomiaru, wybierz profil intensywności, ustaw pomiar na nadgodziny, wyniki na średnią, odejmowanie tła na brak, a następnie naciśnij wykonaj.Średnia intensywność fluorescencji zostanie obliczona w czasie. Aby wyeksportować dane profilu intensywności, kliknij ikonę Excel w oknie wyników profilu intensywności i przeprowadź analizę danych za pomocą oprogramowania do tworzenia wykresów naukowych i analizy danych. W tym badaniu komórka parasolowa została szturchana w celu oceny mechanicznie wywołanych stanów przejściowych wapnia.Obraz uchwycony po 10 sekundach pokazuje fluorescencyjny widok stymulującej pipety umieszczonej na górze komórki parasolowej, wyrażającej fluorescencyjny czujnik wapnia GCaMP5G. Mechaniczna stymulacja komórki parasolowej wyrażającej wapń powoduje deformację, po której następuje gwałtowny wzrost emisji fluorescencji. Wykres przedstawia zmianę intensywności fluorescencji wykreśloną w funkcji czasu dla kilku komórek.Szturchanie wywołuje reakcję wapnia w większości komórek parasolowych transdukowanych za pomocą fluorescencyjnego czujnika wapnia. Najważniejszym krokiem jest pobranie pęcherza moczowego i cewki moczowej, a następnie przymocowanie ich do podkładki z gumy silikonowej. Unikaj uszkodzenia tkanek podczas oddzielania błony śluzowej pęcherza moczowego od leżącej poniżej warstwy mięśniowej.Metody obrazowania, takie jak ta opisana tutaj, mogą dostarczyć unikalnego wglądu w to, w jaki sposób kanały aktywowane mechanicznie wysyłają zmiany w swoim naturalnym środowisku i generują reakcje fizjologiczne.

ex-vivo-analysis-mechanically-activated-ca2-transients-urothelial

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Szczegółowe metody obrazowania Ca2+ o wysokiej rozdzielczości w mięśniach gładkich w obrębie izolowanych organów, obejmujące: przygotowanie tkanki, akwizycję obrazu oraz analizę danych.

Wykrywanie ogniskowych przejściowych zmian stężenia Ca2+ w mięśniach gładkich

Ten film demonstruje charakterystykę prądów kationowych z kanałów jonowych melastatyny typu 4 (TRPM4) o potencjale przejściowym w komórkach mięśni gładkich detruzja za pośrednictwem amfoterycyny-B. Technika ta pomaga ocenić właściwości biofizyczne i farmakologiczne kanałów jonowych.

Analiza perforowanego zacisku krosowego za pośrednictwem amfoterycyny-B: elektrofizjologiczna technika badania prądów jonowych w komórkach pęcherza moczowego

Międzykomórkowe fale Ca2+ są napędzane przez kanały połączeń szczelinowych i półkanały. W tym miejscu opisujemy metodę pomiaru międzykomórkowych fal Ca2 + w monowarstwach komórkowych w odpowiedzi na lokalny bodziec mechaniczny pojedynczej komórki oraz jej zastosowanie do badania właściwości i regulacji kanałów połączeń szczelinowych i półkanałów.

Propagacja fal wapniowych indukowana stymulacją mechaniczną w monowarstwach komórkowych: przykład komórek śródbłonka rogówki bydła

Genetycznie kodowane wskaźniki Ca2+ (GECI) radykalnie zmieniły sposób wykonywania obrazowania in situ Ca2+. Aby zmaksymalizować odzysk danych z takich nagrań, wymagana jest odpowiednia analiza sygnałów Ca2+. Protokoły przedstawione w tym artykule ułatwiają kwantyfikację sygnałów Ca2+ zarejestrowanych in situ przy użyciu mapowania czasoprzestrzennego i analizy opartej na cząstkach.

Zastosowania technik mapowania czasoprzestrzennego i analizy cząstek do ilościowego określania wewnątrzkomórkowej sygnalizacji Ca2+ in situ

Opisujemy metodę przygotowania pojedynczych, świeżo wyizolowanych komórek mięśni gładkich wypieracza z próbek ludzkiego pęcherza moczowego, stosując dwuetapową procedurę enzymatyczną. Uzyskane żywotne komórki DSM można badać za pomocą różnych technik jednokomórkowych, w tym opisanej elektrofizjologii amfoterycyny-B patch-clamp, w celu ujawnienia właściwości fizjologicznych i farmakologicznych.

Przygotowanie i wykorzystanie świeżo wyizolowanych ludzkich komórek mięśni gładkich wypieracza do charakterystyki 9-fenantrolowych prądów kationowych

Model pęcherza bez detrusorów umożliwia bezpośredni dostęp do błony podmoczowej w celu zbadania lokalnych mechanizmów regulacji dostępności biologicznie aktywnego mediatora w suburotelium/blaszce właściwej podczas przechowywania i oddawania moczu. Preparat bardzo przypomina napełnianie nienaruszonego pęcherza moczowego i pozwala na wykonanie badań ciśnienia i objętości bez wpływów ogólnoustrojowych.

Zdecentralizowany (ex vivo) mysi model pęcherza moczowego z usuniętym mięśniem wypierającym w celu uzyskania bezpośredniego dostępu do błony dróg moczowych podczas napełniania pęcherza

Pokazano mysi model przezcewkowej inokulacji uropatogennej E. coli (UPEC) w celu stworzenia utajonych wewnątrzkomórkowych zbiorników pęcherza moczowego, a następnie ekspozycji pęcherza moczowego na G. vaginalis w celu wywołania nawrotu UPEC UTI. Zademonstrowano również liczenie bakterii, cytologię moczu oraz utrwalanie i przetwarzanie pęcherza moczowego in situ w skaningowej mikroskopii elektronowej.

Nawracające zakażenie dróg moczowych Escherichia coli wywołane ekspozycją pęcherza moczowego Gardnerella vaginalis u myszy

Ten protokół opisuje procedurę pomiaru stężenia ATP w świetle pęcherza moczowego u znieczulonego gryzonia.

In vivo (in vivo) Pomiar luminalny wywołanego rozdęciem urotelialnego uwalniania ATP u gryzoni

Opisano metody generowania dużych ilości rekombinowanych adenowirusów, które następnie mogą być użyte do transdukcji rodzimego nabłonka dróg moczowych gryzoni, co pozwala na ekspresję transgenów lub regulację w dół produktów genów endogennych.

Ekspresja transgenów w natywnym nabłonku dróg moczowych pęcherza moczowego za pomocą transdukcji za pośrednictwem adenowirusa

Ten protokół przedstawia zoptymalizowaną metodę izolacji nabłonka żeńskiej moczowodu myszy do analiz wtórnych, w tym cytometrii przepływowej, immunobarwienia i hodowli organoidalnej. Metody dały wzbogacone, żywe komórki nabłonkowe cewki moczowej, co potwierdzono za pomocą analizy cytometrii przepływowej, pełnego obrazowania i wydajnego tworzenia organoidów.

Zoptymalizowana metoda izolacji nabłonka cewki moczowej żeńskiej myszy do analizy pojedynczych komórek i immunofluorescencji

Poznaj metodę badania mechanicznie wywołanych zdarzeń wapniowych w komórkach urotelialnych myszy z wykorzystaniem sensora GCaMP5G. Protokół umożliwia wizualizację dynamiki jonów Ca²⁺ w odpowiedzi na stymulację mechaniczną.

Ex vivo Analiza mechanicznie aktywowanych stanów nieustalonych^Ca2+ w komórkach urotelialnych

Przeglądaj więcej filmów