Test pustej przestrzeni w czasie rzeczywistym

Metoda opisana w tym raporcie może być wykorzystana do zrozumienia fizjologicznych i neurobehawioralnych aspektów dobrowolnego oddawania moczu w stanach zdrowotnych i chorobowych. Ta technika pozwala nam monitorować zachowanie głośności myszy w jasnych i ciemnych fazach dnia oraz dostarcza informacji czasowych, przestrzennych i wolumetrycznych na temat zdarzeń mikcji. Aby przygotować test pustej przestrzeni w czasie rzeczywistym lub komorę rejestracyjną RT-VSA, umieść cienką lub grubą bibułę filtracyjną, w zależności od pory dnia, na dnie klatki rejestrującej RT-VSA.

Na bibule filtracyjnej umieść plastikowe igloo jako miejsce do spania; sterylna probówka do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml do celów wzbogacenia; oraz plastikowe naczynie o wymiarach 60 mm x 15 mm zawierające dwa lub trzy kawałki suszonej karmy dla myszy; i od 14 do 16 gramów wody w postaci żelowego okładu. Gdy komora zapisu będzie gotowa, delikatnie umieść mysz na bibule filtracyjnej. Upewnij się, że przeniesienie myszy z klatki obudowy do klatki nagrywającej odbywa się przy minimalnym naprężeniu.

Gdy mysz znajdzie się w klatce nagrywającej, umieść pokrywę i przykryj górną część pokrywy chłonną niebieską podkładką, aby zminimalizować bezpośrednie odbicia światła otoczenia na powierzchni pokrywy z pleksiglasu. Włącz światła ultrafioletowe w dolnej komorze. Aby nagrywać wideo RT-VSA z górnej i dolnej kamery, użyj oprogramowania do nagrywania wideo skonfigurowanego do jednoczesnego nagrywania z wielu kamer internetowych lub kamer sieciowych.

Rozpocznij nagrywanie, naciskając Cmd R w oknie programu. Wykonuj nagrania wideo z prędkością jednej klatki na sekundę. Natychmiast po rozpoczęciu nagrywania wyjdź z pomieszczenia i delikatnie zamknij drzwi.

Upewnij się, że w pomieszczeniu panuje cisza przez cały czas trwania eksperymentu. Zatrzymaj nagrywanie, naciskając Cmd T. Wyłącz światła ultrafioletowe. Po zatrzymaniu nagrywania, oprogramowanie automatycznie generuje plik filmowy w formacie m4v dla każdej kamery i zapisuje go pod nazwą kamery w wybranym wcześniej folderze docelowym.

Sprawdź, czy w folderze każdej kamery eksperymenty są uporządkowane w folderach według daty. Sprawdź, czy w każdym folderze z datą lub eksperymentem znajduje się jeden plik m4v i wszystkie poszczególne pliki jpeg odpowiadające każdej klatce filmu. Utwórz folder na pulpicie z nazwą i datą eksperymentu i przenieś pliki m4v do tego folderu.

Skopiuj folder z filmem na dysk flash w celu analizy na komputerze zewnętrznym. Otwórz plik filmowy zebrany przez dolną kamerę w fazie światła lub górną kamerę w fazie ciemnej w celu analizy. Po ocenie jakości filmu przeanalizuj eksperymenty, przechodząc do odpowiedniego okna czasu za pomocą polecenia szybkiego przewijania do przodu lub suwaka paska czasu.

Aktywność mikcji w fazie światła jest rejestrowana między godziną 11:00 a 17:00, a w fazie ciemnej między północą a 6:00. Odtwórz film w trybie szybkiego przewijania do przodu, klikając ikonę szybkiego przewijania do przodu lub ręcznie przewijaj film, szukając dowodów na to, że mysz jest puszona. Zwróć uwagę na nagłe pojawienie się jasnych plam moczu na bibule filtracyjnej lub zmiany w zachowaniu, w tym ruch do rogów klatki i krótki okres bezczynności, gdy mysz oddaje moc. Zarejestruj czas, w którym występuje każde puste miejsce.

Zgodnie z konwencją, czas pustki jest rejestrowany przy pierwszych oznakach wykrycia moczu. Aby wykonać pomiary pustki, najpierw użyj paska przewijania, aby poruszać się do przodu lub do tyłu w czasie, szukając punktu, w którym nastąpiła maksymalna dyfuzja plamki moczu. Zatrzymaj film w tym momencie i umieść strzałkę myszy komputerowej w analizowanym miejscu, aby zaznaczyć interesujące Cię miejsce na zrzucie ekranu.

Nazwij plik zrzutu ekranu, używając liczb korelacyjnych, aby uwzględnić kolejność pojawiania się w filmie. Po przeanalizowaniu wszystkich pustych przestrzeni zmierz całkowitą powierzchnię bibuły filtracyjnej, wykonując zrzut ekranu i wyznaczając granicę bibuły filtracyjnej. Oblicz procentową powierzchnię każdej z plam moczu.

Przekształć wartości procentowej powierzchni w objętość moczu dla każdego pustego miejsca za pomocą krzywych kalibracyjnych i funkcji interpolacji w oprogramowaniu do tworzenia wykresów. Zachowanie mikcji samic i samców myszy Piezo1, 2, nokautujących i kontrolnych zarejestrowano w ciemnej i jasnej fazie dnia. Podczas ich nieaktywnej fazy świetlnej nie zaobserwowano istotnych różnic w żadnych parametrach analizowanych dla samic lub samców myszy z nokautem w porównaniu z kontrolą.

Jednak w aktywnej ciemnej fazie samice i samce myszy z nokautem wykazywały zmieniony fenotyp mikcji, charakteryzujący się znacznym wzrostem liczby i całkowitej objętości małych pustych plamek. Nie stwierdzono istotnych różnic w pierwotnych pustkach lub liczbie PVS, średniej objętości na PVS lub całkowitej objętości PVS u samic lub samców myszy z nokautem w porównaniu z myszami kontrolnymi. Zachowanie mikcji samic myszy testowano w warunkach podstawowych i po leczeniu cyklofosfamidem.

W porównaniu z warunkami podstawowymi, ilość uwalnianego moczu na puste miejsce jest mniejsza po leczeniu cyklofosfamidem, a zdarzenia mikcji są znacznie częstsze. Jednym z kluczowych aspektów odtwarzalności testu jest jak najdelikatniejsze manipulowanie zwierzętami i utrzymywanie ich w minimalnym stresie przez cały okres badania. Ponieważ jest to test nieinwazyjny, można później wykonać dodatkowe procedury, w tym cytometrię i elektromiografię, aby ocenić odpowiednio funkcje pęcherza moczowego i zewnętrznego zwieracza cewki moczowej.

Wdrożenie tej techniki pozwoli naukowcom określić udział określonych ścieżek w zachowaniach związanych z oddawaniem moczu w stanach zdrowotnych i chorobowych.