Name: Opracowanie i wdrożenie szczurzego modelu perfuzji płuc ex vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 38 s
Description: Poznaj metodę budowy modułowego, niedrogiego modelu perfuzji płuc ex vivo u szczurów. Technika umożliwia badanie fizjologii płuc w kontrolowanych warunkach i uzupełnia badania in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie zostało częściowo zapewnione przez Merit Review Award (101 BX003482) od U.S. Department of Veteran Affairs Biomedical Laboratory R&D Service, grant NIH (5R01 HL123227), Transformative Project Award (962204) od American Heart Association, oraz przez fundusze instytucjonalne przyznane dr Riessowi. Dr Balzer otrzymał niezwiązane z tym finansowanie z Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecka Fundacja Badawcza), numer projektu BA 6287/1-1. Autorzy chcieliby podziękować Matthew D. Olsenowi, Chun Zhou, Zhu Li i Rebecce C. Riess za ich cenny wkład w badanie.

Część eksperymentów in vivo (od znieczulenia ogólnego do eutanazji) wymaga uprzedniej zgody odpowiedniego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt (IACUC). Wszystkie procedury opisane w niniejszym dokumencie zostały zatwierdzone (numer protokołu M1700168) przez IACUC w Vanderbilt University Medical Center, Nashville, Tennessee i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ARRIVE14. Przed eksperymentami wszystkie szczury były trzymane w ośrodku opieki nad zwierzętami instytutu, z bezpłatnym dostępem do wody i jedzenia. Uwzględniając różne badania wykraczające poza zakres tego manuskryptu, wykorzystaliśmy do tej pory łącznie 148 samców szczurów Sprague Dawley w wieku 7-10 tygodni o wadze od 250 g do 400 g.
1. Budowa aparatury
UWAGA: Wszystkie części, w tym odpowiedni producenci, są wymienione w Tabeli Materiałów.
<ol>
	<li>Aby utrzymać każdy element wyposażenia na miejscu, zbuduj specjalnie zbudowaną siatkę, która pozwoli na łatwą konfigurację i włączenie nowych urządzeń (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Przymocuj aluminiowe słupki (o długości od 1 do 2 stóp, średnicy 1 cm, dostępne w każdym sklepie z narzędziami) za pomocą zacisków krzyżowych, aby utworzyć siatkę 3D i umieść na plastikowej tacy (30 cali x 21 cali), aby zapobiec rozlaniu płynów.</li>
	<li>Zamontuj przetworniki ciśnienia na równej wysokości do płuc i podłącz je do przewodów tętnicy płucnej (PA), żyły płucnej (PV) oraz do rurki wentylacyjnej. 
	UWAGA: Przetworniki te przesyłają dane do odpowiednich biowzmacniaczy podłączonych do systemu akwizycji danych (DAQ) i jego oprogramowania.</li>
	<li>Zamiast używać dostępnych na rynku kaniul, twórz niestandardowe kaniule (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2) z segmentów twardej plastikowej rurki o szerokości 2 mm, które są rozszerzane na końcu, przy użyciu otwartego ognia, aby umożliwić bezpieczne wiązanie szwów. Zegnij je w kształt litery U, aby zmniejszyć obciążenie płuc podczas zwisania i zmieścić się w komorze płuc.</li>
	<li>Aby przygotować komorę, płuca mają być wentylowane i perfundowane, umieść zlewkę o pojemności 1 000 ml w zlewce o pojemności 1 500 ml z łaźnią wodną między nimi i wewnątrz zlewki o pojemności 1 000 ml, tworząc podwójny kocioł. Umieść te zlewki na płycie grzewczej ustawionej na 48 °C, tworząc komorę dla płuc, która jest zarówno wilgotna, jak i odporna na wahania temperatury.</li>
	<li>Przechowywać bufor do eksperymentu w kolbie miarowej o pojemności 150 ml umieszczonej na płycie grzewczej ustawionej na 37 °C. Za pomocą mieszadła magnetycznego wprowadzić bufor do cyrkulacji wewnątrz zlewki. Ustawić łąkotkę bufora na takiej wysokości, aby znajdowała się 4 cm nad płucem, aby wytworzyć wrodzone ciśnienie 4cmH 2O na PV. Podczas operacji należy upewnić się, że płuca zwierzęcia znajdują się na tej samej wysokości co bufor, aby zmniejszyć powstawanie obrzęku hydrostatycznego. 
	UWAGA: Użycie kolby minimalizuje powierzchnię stykającą się z powietrzem w pomieszczeniu, co minimalizuje dyfuzję gazów.</li>
	<li>Za pomocą pompy rolkowej przesunąć bufor przez obwód składający się z wężownicy grzewczej i syfonu powietrza przed przeprowadzeniem fuzji płuc. Ścieki z fotowoltaiki należy zawracać z powrotem do kolby miarowej. Podłączyć zarówno wężownicę grzewczą, jak i syfonat do łaźni obiegowej również ustawionej na 37 °C. Wyregulować temperaturę łaźni wodnej zgodnie z prędkością pompy, tak aby perfuzat miał stałą temperaturę 37 °C.</li>
</ol>
2. Procedura
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem eksperymentu przygotuj konfigurację.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że oprogramowanie jest uruchomione (patrz poniżej) i prawidłowo zbiera dane.</li>
		<li>Codziennie kalibruj wszystkie przetworniki ciśnienia, aby upewnić się, że nie dryfują.</li>
		<li>Przygotować bufor (patrz Tabela 1 dla składników roztworu soli fizjologicznej z 4% albuminą surowicy bydlęcej [BSA]) i upewnić się, że pH wynosi 7,4, stosując HCl w celu odpowiedniego dostosowania. Ustawić system perfuzyjny z podgrzanym buforem (Tabela 1) krążącym przez cały czas, upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Dodać BSA co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem doświadczenia, aby dać mu wystarczająco dużo czasu na rozpuszczenie. W przypadku braku natleniacza, przed dodaniem BSA do buforu perfuzyjnego należy wprowadzić gaz bąbelkowy o składzie gazowym 65% N2, 30 % O2 i 5% CO2 w celu naśladowania poziomów CO2 w płucach in vivo. Zapobiega to pienieniu się roztworu po dodaniu BSA.</li>
		<li>Przygotuj obszar operacyjny za pomocą wszystkich niezbędnych narzędzi chirurgicznych, szwów i taśmy. Nachyl tablicę operacyjną pod kątem 15°, tak aby znieczulony szczur mógł być umieszczony z głową uniesioną ponad resztę ciała, a tchawica i blok płuco-serce mogły być łatwo manipulowane.</li>
		<li>Nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej, zważyć szczura i wykonać dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu (65 mg/kg-1). Po 10 minutach za pomocą szczypania palca u nogi upewnij się, że osiągnięto płaszczyznę chirurgiczną znieczulenia ogólnego. W razie potrzeby podać więcej środka znieczulającego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś szczura na obszar operacyjny i przymocuj go do tablicy operacyjnej, sklejając osobno jego przednie nogi, a następnie tylne nogi razem, upewniając się, że przednie nogi są wystarczająco luźno przyklejone, aby umożliwić wizualizację odruchu bólowego, jeśli znieczulenie nie jest wystarczająco głębokie (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3A).</li>
	<li>Zabezpiecz głowę szczura, przyklejając pysk długim, cienkim paskiem za przednimi zębami, nie ograniczając języka ani przepływu powietrza dla wciąż spontanicznie oddychającego szczura (<silna klasa="xfig">Ryc. 3B).</li>
	<li>Wykonaj tracheostomię, ściskając skórę nad tchawicą za pomocą kleszczy i przecinając nożyczkami chirurgicznymi. Za pomocą zakrzywionych kleszczy tępo wypreparuj mięsień i tkankę, aby dotrzeć do tchawicy. Upewnij się, że na tym etapie nie ma krwawienia.
	<ol>
		<li>Przełóż zakrzywione kleszcze pod tchawicą i otwórz je, aby umożliwić przejście szwów 3-0 pod spodem, które można następnie wstępnie zawiązać w węzeł pudełkowy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3B). Wykonaj małe nacięcie między pierścieniami chrząstki tchawicy i włóż kaniulę tchawicy (zmodyfikowaną igłę 18 G z rurką o średnicy 1 mm przyklejoną wokół końcówki, aby utworzyć wcięcie). Zawiąż szew, upewniając się, że powietrze nie może wydostać się z nacięcia tchawicy i że kaniula nie obciąża tchawicy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustawić wentylator tak, aby działał z mieszaniną gazów o stężeniu 30%O2, 5% CO2 i 65% N2 , o objętości oddechowej (VT) 10 ml / kg, dodatnim końcowym ciśnieniu wydechowym (PEEP) 0 cmH2O i szybkości 60 oddechów/min.</li>
	<li>Gdy kaniula tchawicy zostanie zabezpieczona szwem, rozpocznij wentylację szczura zgodnie z powyższymi ustawieniami. 
	UWAGA: Zastosowana metoda chirurgiczna została zaadaptowana z Nelson et al.9 i jest opisana krok po kroku.</li>
	<li>Usuń sierść z brzucha szczura za pomocą dużych nożyczek chirurgicznych i kleszczy. 
	UWAGA: Maści do depilacji można również stosować przed rozpoczęciem eksperymentu.</li>
	<li>Trzymając wyrostek mieczykowaty kleszczami, wykonaj małe poziome nacięcie poniżej żeber, upewniając się, że przepona pozostaje nienaruszona. Gdy narządy wewnętrzne będą mogły być bezpiecznie uwidocznione, poszerz poziome cięcie, aby odsłonić całą przeponę.</li>
	<li>Zachowując szczególną ostrożność, aby uniknąć przebicia płuc, wstrzyknąć heparynę (3 000 U/kg-1) do żyły głównej dolnej (IVC) za pomocą strzykawki 22 G.</li>
	<li>Ponownie przytrzymaj wyrostek mieczykowaty kleszczami i przetnij czaszkę wzdłuż mostka, stale wizualizując płuca, aby zapobiec ich przecięciu.</li>
	<li>Aby prawidłowo zobaczyć blok płuco-serce, rozsuń klatkę piersiową za pomocą dwóch dużych kleszczy i pamiętaj, aby uniknąć złamania żeber, co może spowodować przebicie płuca przez ostry fragment kości (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C). 
	UWAGA: Po otwarciu klatki piersiowej należy użyć PEEP o wartości 2-3 cmH2O, ustawionego przez śluzę wodną przymocowaną do kończyny wydechowej respiratora, aby uniknąć niedodmy.</li>
	<li>W tym czasie przeciąć IVC, aby poddać szczura eutanazji przez wykrwawienie. Ostrożnie upewnić się, że od wstrzyknięcia heparyny upłynęła co najmniej 1 minuta (patrz krok 2.9), aby dać jej wystarczająco dużo czasu na krążenie i zapobiec mikrozakrzepom w płucach.</li>
	<li>Podczas zakładania kaniul perfuzyjnych należy stale sprawdzać ciśnienie, aby upewnić się, że nie wystąpią nagłe zmiany. 
	UWAGA: Nagły skok ciśnienia, gdy pompa pracuje ze stałą prędkością, wskazuje na powstawanie blokady, podczas gdy nagły spadek może wskazywać na wyciek.</li>
	<li>Przytnij nadmiar grasicy, aby umożliwić łatwiejszą wizualizację układu naczyniowego płuc. Zlokalizuj PA, przełóż małe, zakrzywione kleszcze pod spodem i ponownie przełóż szew 3-0 pod spodem i wstępnie zawiąż w węzeł pudełkowy.</li>
	<li>Wykonaj małe nacięcie w prawej komorze serca i włóż kaniulę PA (wykonaną z plastikowej rurki o średnicy 2 mm, rozszerzonej na końcu za pomocą otwartego ognia, aby umożliwić zawiązanie szwów), delikatnie mówiąc, aby uniknąć pęknięcia sąsiedniej tętnicy. Zabezpiecz kaniulę za pomocą szwu i perfuzji, zaczynając od 1,5 ml/min-1 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3D).</li>
	<li>Natychmiast wyciąć wierzchołek serca, aby uniknąć wzrostu ciśnienia w płucach. Za pomocą małych, zakrzywionych kleszczyków rozerwij zastawkę mitralną i wizualnie upewnij się, że kleszcze są w stanie wejść do lewego przedsionka bez ograniczeń.</li>
	<li>Umieść wstępnie zawiązany szew 3-0 wokół serca poniżej przedsionka (<silna klasa = "xfig">Ryc. 3E).</li>
	<li>Włóż kaniulę PV (podobną konstrukcję do kaniuli PA) do lewego przedsionka i upewnij się, że bufor może z niej wypłynąć przed zawiązaniem szwu. 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby kaniula PV była umieszczona za zastawką mitralną, aby zapewnić jej prawidłowe wiązanie, a jednocześnie nie była umieszczona zbyt głęboko, aby uszkodzić PV lub utrudnić przepływ (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3E). Zachowaj szczególną ostrożność przy wiązaniu szwu, ponieważ zbyt luźne wiązanie powoduje utratę przepływu, podczas gdy zbyt mocne wiązanie może uszkodzić serce, osłabiając umiejscowienie kaniuli i potencjalnie powodując przecieki.</li>
	<li>Przyciąć nadmiar tkanki między jamą klatki piersiowej a nacięciem tracheostomii za pomocą nożyczek, aby uniknąć uszkodzenia tchawicy. Upewnij się, że cała tchawica poniżej kaniuli tchawicy i cały blok płuco-serce są widoczne.</li>
	<li>Usuń blok płuco-serce i tchawicę, przytrzymując kaniulę tchawicy i wycinając tkankę łączną za tchawicą za pomocą pary zakrzywionych nożyczek z końcówkami, pozostawiając przełyk przymocowany dla dodatkowego wsparcia strukturalnego (<silna klasa = "xfig">Ryc. 3F).</li>
	<li>Stopniowo zwiększaj natężenie przepływu do maksymalnego przepływu 40 ml/kg-1/min-1. Pozwól, aby pierwsze 50 ml buforu wypłynęło z systemu, aby usunąć wszelkie cytokiny zapalne, które mogą zostać uwolnione (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3G).</li>
	<li>Delikatnie przenieś izolowane płuca do podwójnej komory kotła utworzonej z dwóch zlewek. Upewnij się, że PA, PV lub kaniula tchawicy nie zostaną skręcone w żadnym momencie podczas poruszania płucami lub ich zawieszania. 
	UWAGA: Zapobieganie niedodmie podczas pobierania płuc i podłączenia do zestawu jest ważne, zwłaszcza gdy EVLP jest stosowany w przypadku już uszkodzonych płuc lub gdy planowane są interwencje przed EVLP. Można to osiągnąć na przykład poprzez mały klips na tchawicy po wdechu przed przeniesieniem do respiratora15.</li>
</ol>
3. Akwizycja danych
<ol>
	<li>Do zbierania danych należy użyć dowolnego dostępnego na rynku przetwornika analogowo-cyfrowego i systemu DAQ.</li>
	<li>Zwróć uwagę, że częstotliwość próbkowania jest wystarczająca dla danego celu (tutaj 200 Hz) i że wszystkie istotne parametry zależne z biowzmacniaczy i innych urządzeń wejściowych są zbierane jednocześnie (ciśnienie w drogach oddechowych, ciśnienie PA i PV wybrane dla tego protokołu)16.</li>
	<li>Rejestruj niezależne parametry (np. prędkość perfuzji, szybkość wentylacji, skład wentylowanego gazu, skład elektrolitu buforowego i masę płuc).</li>
</ol>

<ol><li>Uhlig, S., Taylor, A. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aUhlig%2C+S+%22Methods+in+Pulmonary+Research%22">Methods in Pulmonary Research</a>. , Birkhäuser. (1998).</li>
<li>Ghaidan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+year+follow-up+of+lung+transplantations+using+initially+rejected+donor+lungs+after+reconditioning+using+ex+vivo+lung+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiothoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Ten year follow-up of lung transplantations using initially rejected donor lungs after reconditioning using ex vivo lung perfusion.</a> Journal of Cardiothoracic Surgery. 14 (1), 125(2019).</li>
<li>Stone, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+perfusion+with+adenosine+A2A+receptor+agonist+enhances+rehabilitation+of+murine+donor+lungs+after+circulatory+death%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Ex vivo perfusion with adenosine A2A receptor agonist enhances rehabilitation of murine donor lungs after circulatory death.</a> Transplantation. 99 (12), 2494-2503 (2015).</li>
<li>Valenza, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+consumption+of+glucose+during+ex+vivo+lung+perfusion+correlates+with+lung+edema%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">The consumption of glucose during ex vivo lung perfusion correlates with lung edema.</a> Transplantation Proceedings. 43 (4), 993-996 (2011).</li>
<li>Sayner, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+cAMP-induced+lung+endothelial+hyperpermeability+revealed+by+Pseudomonas+aeruginosa+ExoY%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Paradoxical cAMP-induced lung endothelial hyperpermeability revealed by Pseudomonas aeruginosa ExoY.</a> Circulation Research. 95 (2), 196-203 (2004).</li>
<li>McAuley, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+grade+allogeneic+human+mesenchymal+stem+cells+restore+alveolar+fluid+clearance+in+human+lungs+rejected+for+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Clinical grade allogeneic human mesenchymal stem cells restore alveolar fluid clearance in human lungs rejected for transplantation.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (9), L809-L815 (2014).</li>
<li>Pego-Fernandes, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+model+of+isolated+lung+perfusion+in+rats%3A+first+Brazilian+experience+using+the+IL-2+isolated+perfused+rat+or+guinea+pig+lung+system%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Experimental model of isolated lung perfusion in rats: first Brazilian experience using the IL-2 isolated perfused rat or guinea pig lung system.</a> Transplantation Proceedings. 42 (2), 444-447 (2010).</li>
<li>Noda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+prolonged+ex+vivo+lung+perfusion+for+graft+preservation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cardio-Thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Successful prolonged ex vivo lung perfusion for graft preservation in rats.</a> European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 45 (3), e54-e60 (2014).</li>
<li>Nelson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+of+isolated+ex+vivo+lung+perfusion+in+a+rat+model%3A+lessons+learned+from+developing+a+rat+EVLP+program%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), e52309(2015).</li>
<li>Bassani, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+lung+perfusion+in+the+rat%3A+detailed+procedure+and+videos%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Ex vivo lung perfusion in the rat: detailed procedure and videos.</a> PLoS One. 11 (12), e0167898(2016).</li>
<li>Watson, K. E., Segal, G. S., Conhaim, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+pressure+ventilation+enhances+acinar+perfusion+in+isolated+rat+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Pulmonary+Circulation%22%5BJournal%5D)">Negative pressure ventilation enhances acinar perfusion in isolated rat lungs.</a> Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217753596(2018).</li>
<li>Ohsumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+translational+rat+ex+vivo+lung+perfusion+experimentation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">A method for translational rat ex vivo lung perfusion experimentation.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 319 (1), L61-L70 (2020).</li>
<li>Hozain, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiday+maintenance+of+extracorporeal+lungs+using+cross-circulation+with+conscious+swine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Multiday maintenance of extracorporeal lungs using cross-circulation with conscious swine.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 159 (4), 1640-1653 (2020).</li>
<li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+bioscience+research+reporting%3A+the+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> PLoS Biology. 8 (6), e1000412(2010).</li>
<li>van Zanden, J. E., Leuvenink, H. G. D., Verschuuren, E. A. M., Erasmus, M. E., Hottenrott, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+translational+rat+model+for+ex+vivo+lung+perfusion+of+pre-injured+lungs+after+brain+death%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A translational rat model for ex vivo lung perfusion of pre-injured lungs after brain death.</a> PLoS One. 16 (12), e0260705(2021).</li>
<li>Cleveland, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+LabVIEW+as+a+virtual+instrument+in+a+cost-effective+isolated+lung+setup%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Implementation of LabVIEW as a virtual instrument in a cost-effective isolated lung setup.</a> The FASEB Journal. 33 (1), 846(2019).</li>
<li>Jamieson, S. W., Stinson, E. B., Oyer, P. E., Baldwin, J. C., Shumway, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Operative+technique+for+heart-lung+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Operative technique for heart-lung transplantation.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 87 (6), 930-935 (1984).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+of+nitric+oxide+synthase+expression+and+activity+during+rat+lung+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Alterations of nitric oxide synthase expression and activity during rat lung transplantation.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 278 (5), L1071-L1081 (2000).</li>
<li>Riess, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+measurements+in+blood-free+balanced+salt+solutions+with+three+devices+%28i-STAT%C2%AE%2C+glucose+test+strips+and+ACCU-CHEK%C2%AE+Aviva%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesia+and+Analgesia%22%5BJournal%5D)">Glucose measurements in blood-free balanced salt solutions with three devices (i-STAT®, glucose test strips and ACCU-CHEK® Aviva).</a> Anesthesia and Analgesia. 128 (5), 924(2019).</li>
<li>Menezes, A. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Celsior+and+Perfadex+lung+preservation+solutions+in+rat+lungs+subjected+to+6+and+12+hours+of+ischemia+using+an+ex-vivo+lung+perfusion+system%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics%22%5BJournal%5D)">Comparison of Celsior and Perfadex lung preservation solutions in rat lungs subjected to 6 and 12 hours of ischemia using an ex-vivo lung perfusion system.</a> Clinics. 67 (11), 1309-1314 (2012).</li>
<li>Riess, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrolyte+measurements+in+blood-free+balanced+salt+solutions+-+comparison+of+i-STAT%C2%AE+with+ABL80%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesia+and+Analgesia%22%5BJournal%5D)">Electrolyte measurements in blood-free balanced salt solutions - comparison of i-STAT® with ABL80.</a> Anesthesia and Analgesia. 130 (5), 984(2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktów interesów, finansowych lub innych.

W naszym laboratorium udało się przeprowadzić ponad 100 eksperymentów przy użyciu tej konfiguracji. Modułowa konstrukcja tej niestandardowej konfiguracji zapewniła dużą elastyczność w zakresie potencjalnych zmian w wymaganiach eksperymentalnych. Podczas gdy inne konfiguracje wykorzystują odtleniacz18 do naśladowania stałego zużycia tlenu i produkcji CO2 przez narządy końcowe, ten uproszczony model nie wykorzystywał tej funkcji, ze względu na skupienie się na badaniu wpływu różnych skład...

Techniki perfuzji płuc ex vivo (EVLP)1 odnotowały wzrost użycia w ciągu ostatniej dekady jako metoda badania przeszczepów płuc2, niedokrwienie/reperfuzja3, metabolizm płuc4, oraz odpowiedzi immunologiczne5. Izolowane, ale nienaruszone, wentylowane i perfundowane płuca oferują krytycznie ważną zdolność do bezpośredniej oceny odpowiedzi płuc, w tym układu naczyniowego płuc, na potencjalne interwencje i/lub terapie bez potencjalnych czynników zakłócających, takich jak bodźce neuronalne i hormonalne lub zmiana hemodynamiki in vivo. Jednocześnie utrzymują fizjologiczne wzajemne oddziaływanie wentylacji i perfuzji, w przeciwieństwie do warunków in vitro. Na przykład propozycja dotycząca odpowiedzi immunologicznej w płucach5 wymaga takiej samej jakości danych, jak badanie skoncentrowane na zwiększeniu wielkości puli dawców6 dla przeszczepów płuc. EVLP może być używany u różnych gatunków, w tym myszy3, rats7,8,9,10,11,12, pigs13 oraz people2. W związku z tym konieczne jest ustanowienie modelu, który może generować wiarygodne dane z wielu różnych parametrów eksperymentalnych. Znaczenie kliniczne zostanie wygenerowane w kolejnych badaniach z wykorzystaniem modelu EVLP jako narzędzia.
Chociaż komercyjne zestawy są dostępne do zakupu dla większości gatunków, często mogą być zbyt kosztowne i ograniczać badaczy do określonej marki sprzętu i zastrzeżonego oprogramowania. Wszelkie odstępstwa od gotowej konfiguracji (np. przejście z jednego gatunku na drugi) wymagają przewidywania i obejścia dostarczonej konfiguracji, co może okazać się trudne lub niemożliwe. Poniżej opisano konfigurację DIY (zrób to sam) dla izolowanych płuc szczurów, która jest zarówno modułowa, jak i opłacalna, a także procedurę chirurgiczną izolacji płuc.

<table><tbody><tr><td>1,000 mL Szklana zlewka</td><td>Pyrex, Chicago, IL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,500 ml Szklana zlewka</td><td>Pyrex, Chicago, IL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora zgodności pułapki powietrznej</td><td>Radnoti</td><td>130149</td><td></td></tr><tr><td>Biowzmacniacze</td><td>CWE Inc</td><td>BPM-832</td><td></td></tr><tr><td>Zaciski</td><td>Fisher Scientific</td><td>S02626</td><td></td></tr><tr><td>DAQ (Akwizycja danych)</td><td>National Instrumenty, Austin, TX</td><td>NI USB-6343</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik gazów</td><td>CWE Inc, Ardmore, PA</td> Cewka grzewcza <td>GSM-4</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Radnoti, Covina, CA</td><td>158822</td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzewcza</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>11-100-49SH</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Pfizer</td><td>W63422</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW Pełny system rozwoju 2014</td><td>Instrumenty krajowe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Diamondback Drugs</td><td>G2270-0235-50</td><td></td></tr><tr><td>Sonda pH700</td><td>OAKTON, Vernon Hills, IL&nbsp;</td><td>EW-35419-10</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna Polystat</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-12121-02</td><td></td></tr><tr><td>Wentylator gryzoni</td><td>Aparat Harvard, Holliston, MA</td><td>Model 683</td><td></td></tr><tr><td>Pompa rolkowa</td><td>Cole-Parmer, Wertheim, Niemcy&nbsp;</td><td>Ismatec REGLO Digital MS 2/8</td><td></td></tr><tr><td>Sprague Dawley Rat</td><td>Charles River, Wilmington, MA</td><td>Kod szczepu 001</td><td></td></tr><tr><td>VetScan i-STAT</td><td>Abraxis, Chicago, IL</td><td>i-STAT 1</td><td></td></tr></tbody></table>

opracowanie i wdrożenie szczurzego modelu perfuzji płuc ex vivo

Design and Implementation of a Rat Ex Vivo Lung Perfusion Model

Preparaty płuc ex vivo są użytecznym modelem, który można przełożyć na wiele różnych dziedzin badań, uzupełniając odpowiadające mu modele in vivo i in vitro. Laboratoria, które chcą korzystać z izolowanych płuc, muszą zdawać sobie sprawę z ważnych kroków i nieodłącznych wyzwań, aby stworzyć konfigurację, która jest przystępna cenowo, niezawodna i którą można łatwo dostosować do interesującego tematu. W artykule opisano model DIY (zrób to sam) do wentylacji i perfuzji płuc szczurów ex vivo w celu zbadania wpływu leków i gazów na napięcie naczyniowe płuc, niezależnie od zmian pojemności minutowej serca. Stworzenie tego modelu obejmuje a) projekt i budowę aparatu oraz b) procedurę izolacji płuc. Model ten skutkuje konfiguracją, która jest bardziej opłacalna niż komercyjne alternatywy, a jednocześnie wystarczająco modułowa, aby dostosować się do zmian w konkretnych pytaniach badawczych. Trzeba było usunąć różne przeszkody, aby zapewnić spójny model, który można wykorzystać do wielu różnych tematów badawczych. Po ustaleniu model ten okazał się wysoce elastyczny do różnych pytań i można go łatwo dostosować do różnych kierunków studiów.

Po 10 min stabilizacji i odczytach bazowych, pierwszą grupę 10 samców szczurów Sprague Dawley podzielono losowo na pięć małych grup: globalne niedokrwienie z brakiem przepływu przez 5, 7,5, 8, 9 lub 10 min (n = 2 na grupę), a następnie reperfuzję; te ograniczone wstępne eksperymenty określające dawkę przeprowadzono w celu zidentyfikowania najdłuższego możliwego czasu niedokrwienia, który wciąż pozwala na wystarczającą wentylację i reperfuzję przed ostatecznym wystąpieniem gwałtownego i nieodwracalnego wzrostu ciśnienia w...

Płuca ex vivo są przydatne do różnych eksperymentów do zbierania danych fizjologicznych, jednocześnie wykluczając zmienne zakłócające eksperymentów in vivo. Konfiguracje komercyjne są często drogie i mają ograniczone rodzaje danych, które mogą gromadzić. Opisujemy metodę budowania w pełni modułowej konfiguracji, którą można dostosować do różnych projektów badań.

Opracowanie i wdrożenie szczurzego modelu perfuzji płuc ex vivo

Ex vivo lung preparations are a useful model that can be translated to many different fields of research, complementing corresponding in vivo and in vitro ...

Pokazujemy prostą metodę tworzenia i wdrażania od podstaw konfiguracji płuc ex vivo. Pozwala to na przystępną cenowo i modułową konfigurację, którą można wdrożyć dla różnych konfiguracji. Przedstawiona tutaj technika jest przystępna cenowo, modułowa i można ją dostosować do laboratoriów konfigurujących protokół.Operacja ex vivo może być wykorzystana do uzupełnienia modeli in vivo, aby pomóc w wyjaśnieniu nowych mechanizmów. Ten zestaw do majsterkowania jest przeznaczony do badania płuc w kontrolowanym środowisku. Jest to zgodne z głównym celem badawczym naszego laboratorium, którym jest badanie różnych podejść w celu poprawy wyników po RKO.Jednak konfigurację można dostosować do różnych celów badawczych, dzięki czemu jest bardzo wszechstronna, Operacja wymaga podstawowej wiedzy z zakresu anatomii i fizjologii układu oddechowego i można ją szybko opanować, postępując zgodnie z protokołem. Niemniej jednak ważne jest, aby sumiennie postępować zgodnie z krokami opisanymi w naszym protokole, a przede wszystkim chronić płuca, zwłaszcza podczas usuwania żeber. Aby wykonać tracheostomię, uszczypnij skórę znieczulonego szczura powyżej tchawicy kleszczami i przetnij skórę.Tępo wypreparuj mięsień i tkankę, aby dotrzeć do tchawicy, upewniając się, że nie ma krwawienia. Następnie przełóż zakrzywione kleszcze pod tchawicą i otwórz je, aby umożliwić przejście szwów 3-0 pod spodem. Następnie wstępnie zawiąż szwy w węzeł pudełkowy.Wykonaj małe nacięcie między pierścieniami chrząstki tchawicy i włóż kaniulę tchawicy. Zawiąż szew, aby zapobiec ucieczce powietrza z nacięcia tchawicy i upewnić się, że kaniula nie obciąża tchawicy. Po zabezpieczeniu kaniuli tchawicy rozpocznij wentylację szczura.Za pomocą dużych nożyczek chirurgicznych i kleszczy usuń sierść z brzucha szczura. Chwyć wyrostek mieczykowaty kleszczami i wykonaj małe poziome nacięcie poniżej żeber, uważając, aby przepona pozostała nienaruszona. Poszerz poziome cięcie, aby odsłonić całą membranę.Za pomocą strzykawki o rozmiarze 22 wstrzyknij heparynę do żyły głównej dolnej, uważając, aby nie przebić płuc. Chwyć wyrostek mieczykowaty kleszczami i przetnij czaszkę wzdłuż mostka, stale wizualizując płuca, aby zapobiec ich przecięciu. Rozsuń klatkę piersiową za pomocą dwóch dużych kleszczy i przetnij żyłę główną dolną, aby poddać szczura eutanazji przez wykrwawienie.Przytnij nadmiar grasicy, aby umożliwić łatwiejszą wizualizację układu naczyniowego płuc. Zlokalizuj tętnicę płucną i przełóż pod nią małe zakrzywione kleszcze. Ponownie przełóż szew 3-0 pod spodem i wstępnie zawiąż węzeł pudełkowy.Następnie wykonaj małe nacięcie w prawej komorze serca i wprowadź kaniulę PA. Zabezpiecz kaniulę za pomocą szwu i rozpocznij perfuzję z prędkością 1,5 mililitra na minutę. Natychmiast wyciąć wierzchołek serca, aby zapobiec wzrostowi ciśnienia w płucach.Za pomocą małych zakrzywionych kleszczyków rozerwij zastawkę mitralną i wizualnie potwierdź, że kleszcze mogą wejść do lewego przedsionka bez przeszkód. Szczelnie owiń szew 3-0 wokół serca poniżej przedsionka i włóż kaniulę PV do lewego przedsionka, upewniając się, że bufor może z niego wypłynąć przed zawiązaniem szwu. Następnie za pomocą nożyczek z końcówką odetnij nadmiar tkanki między jamą piersiową a nacięciem tracheostomii, aby uniknąć uszkodzenia tchawicy.Upewnij się, że tchawica poniżej kaniuli tchawicy i cały blok płuco-serce są widoczne. Aby usunąć blok płuco-serce i tchawicę, przytrzymaj kaniulę tchawicy i użyj zakrzywionych nożyczek z końcówką, aby wyciąć tkankę łączną za tchawicą. Przedstawiono żywotność płuc po niedokrwieniu i reperfuzji.Najdłuższy czas niedokrwienia, który pozwalał na 150 minut reperfuzji, wynosił osiem minut. Kluczowe znaczenie ma prawidłowa kannuacja układu krwionośnego, aby izolowane płuca pozostały żywotne przez cały czas trwania eksperymentu. Płuca pozostają nienaruszone po zabiegu, co pozwala na przeprowadzenie podstawowych pomiarów, takich jak mokra lub sucha masa lub histologia po eksperymencie.

design-and-implementation-of-a-rat-ex-vivo-lung-perfusion-model

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film pokazuje technikę ex vivo izolowanej perfuzji płuc. Jest to narzędzie do badań płuc, które pomoże w badaniach nad różnymi mechanizmami fizjologicznymi i patologicznymi związanymi z procedurami przeszczepiania płuc.

Perfuzja płuc ex vivo: technika badań płuc na modelu królika

Izolowany preparat płucny z perfuzją krwi umożliwia wizualizację sieci mikronaczyń na powierzchni płuc. W tym miejscu opisujemy podejście do ilościowego określania przepuszczalności pojedynczych mikronaczyń w izolowanych płucach za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w czasie rzeczywistym.

Kwantyfikacja przepuszczalności pojedynczych mikronaczyń w izolowanym preparacie płuc szczura z perfuzją krwi

Perfuzja płuc Ex-Vivo (EVLP) umożliwiła przeszczep płuc u ludzi dzięki umożliwieniu oceny narządów i rozszerzeniu puli dawców. W tym miejscu opisujemy rozwój programu EVLP dla szczurów i udoskonalenia, które pozwalają na stworzenie powtarzalnego modelu do przyszłej rozbudowy.

Metoda izolowanej perfuzji płuc ex vivo w modelu szczurzym: wnioski wyciągnięte z opracowania programu EVLP dla szczurów

Tutaj prezentujemy optymalizacje modelu przeszczepu płuc szczurów, które służą poprawie wyników. Zapewniamy przewodnik po rozmiarach mankietów w oparciu o masę ciała, strategię pomiaru w celu ustalenia 4. przestrzeni międzyżebrowej oraz metody zamykania ran i pobierania płynu BAL (płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe) i tkanek.

Model przeszczepu płuc szczura uszkodzenia cieplnego niedokrwienia/reperfuzji: optymalizacje w celu poprawy wyników

Preparat z izolowanych płuc królika jest złotym standardem w badaniach płuc. Niniejsza publikacja ma na celu opisanie techniki opracowanej do badania fizjologicznych i patologicznych mechanizmów związanych z reaktywnością dróg oddechowych, zachowaniem płuc oraz badaniami przedklinicznymi w zakresie transplantacji płuc i obrzęku płuc.

Izolowany system perfuzji płuc w modelu królika

Tutaj opisujemy niezbędne kroki do ustanowienia modelu EVLP u szczurów oraz pokazujemy profil zapalny związany z przekroczonymi płucami. Celem jest propagowanie wiedzy i doświadczeń na temat modelu EVLP szczurów, umożliwiając integralne zrozumienie biologicznych odpowiedzi związanych z tą rewolucyjną techniką.

Ustanowienie modelu szczura perfuzyjnego płuc ex vivo dla wglądów translacyjnych w transplantację płuc

Tutaj opisujemy zastosowanie nośnika tlenu na bazie spolimeryzowanej ludzkiej hemoglobiny (PolyhHb) jako perfuzatu oraz protokół, w którym ten roztwór perfuzyjny może być testowany na modelu perfuzji płuc ex vivo u szczurów.

Poszukiwanie alternatywnych rozwiązań perfuzyjnych z wykorzystaniem spolimeryzowanych nośników tlenu na bazie hemoglobiny nowej generacji w modelu perfuzji płuc ex vivo u szczurów

Opisano szczegółową metodologię tworzenia minimalnie inwazyjnego szczurzego modelu zatorowości płucnej przy użyciu autologicznych skrzepów krwi. Podano również dodatkowe metody ilościowego określania obszaru zawału i wizualizacji drzewa tętnicy płucnej.

Opracowanie małoinwazyjnego szczurzego modelu zatorowości płucnej przy użyciu autologicznych skrzepów krwi

Celem jest opracowanie nowego modelu perfuzji płuc ex vivo (EVLP) u szczurów, który może utrzymać stałą czynność płuc przez 4 godziny przez cały czas trwania EVLP i dostarczyć branży specyfiki implementacji, która zapewni solidną metodę stosowania EVLP na modelach gryzoni.

Opracowanie nowatorskiego systemu perfuzji płuc ex vivo dla płuc szczurów po śmierci krążeniowej

Tutaj przedstawiono metodę wywoływania tętniczego nadciśnienia płucnego związanego ze zwłóknieniem płuc (PF-PH) model szczurzy poprzez wstrzykiwanie bleomycyny do dróg oddechowych. Zapewniamy również podejście krok po kroku do walidacji tego modelu zwierzęcego.

Ustalenie i walidacja szczurzego modelu tętniczego nadciśnienia płucnego związanego ze zwłóknieniem płuc

Protokół ten prezentuje model perfuzji płuc ex vivo szczura, który uwzględnia przejściową ekspozycję na skalibrowane obciążenie termiczne, promując endogenne mechanizmy ochronne dla terapeutycznego odnowienia uszkodzonych przeszczepów płuc. Podejście to jest skalowalne i powtarzalne oraz wspiera rozwój terapii niefarmakologicznych, które poprawiają skuteczność przeszczepów płuc.

Prekondycjonowanie termiczne podczas perfuzji płuc ex vivo w celu rehabilitacji uszkodzonych przeszczepów płuc przed przeszczepem

Poznaj metodę budowy modułowego, niedrogiego modelu perfuzji płuc ex vivo u szczurów. Technika umożliwia badanie fizjologii płuc w kontrolowanych warunkach i uzupełnia badania in vivo.

Opracowanie i wdrożenie szczurzego modelu perfuzji płuc ex vivo

Przeglądaj więcej filmów