Name: Synteza hydrożeli macierzy zewnątrzkomórkowej chrząstki bezkomórkowej ze zdecelulonizowanych komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-21T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Poznaj metodę syntezy hydrożeli DC-ECM z chrząstki zdecelularyzowanej przy użyciu obróbki cieplnej i enzymatycznej. Technika ta zapewnia niską immunogenność i zachowanie struktury macierzy zewnątrzkomórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była sponsorowana przez Plan Medycyny i Technologii Medycznych Prowincji Zhejiang (2019KY050), Plan Nauki i Technologii Tradycyjnej Medycyny Chińskiej Prowincji Zhejiang (2019ZA026), Kluczowy Plan Badań i Rozwoju w Prowincji Zhejiang (Grant nr 2020C03043), Plan Nauki i Technologii Tradycyjnej Medycyny Chińskiej Prowincji Zhejiang (2021ZQ021) oraz Chińską Fundację Nauk Przyrodniczych Prowincji Zhejiang (LQ22H060007).

To badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Szpitala Tongde w prowincji Zhejiang.
1. Przygotowanie hydrożelu DC-ECM
UWAGA: W tym badaniu, chrząstka została uzyskana ze stawów kolanowych 12-miesięcznych miniaturowych świń Bama, unikając gromadzenia tkanki kostnej.
<ol>
	<li>Weź zebraną chrząstkę, zablokuj ją i posiekaj na 1-2 mm3 kawałki skalpelem.</li>
	<li>Umieść 20 g mielonej chrząstki w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i dodaj 20 ml hipotonicznego buforu Tris-HCl (10 mM Tris-HCl, pH 8,0), aby całkowicie zanurzyć tkankę. Umieścić probówkę wirówkową w zamrażarce w temperaturze −80 °C na 3 godziny, a następnie w piekarniku o temperaturze 37 °C na 3 godziny. Powtórz etap zamrażania i podgrzewania sześć razy. Na tym etapie hipotoniczny bufor Tris-HCl nie wymaga wymiany.</li>
	<li>Potrząsaj probówką wirówkową przez 30 sekund za pomocą mieszalnika wirowego z prędkością 1 000 obr./min. Umieść sito ze stali nierdzewnej (wielkość porów: ~250 μm) na nowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Powoli zdekantuj zdecelularowaną chrząstkę na sito ze stali nierdzewnej, umyj tkankę trzykrotnie sterylnym PBS i zbierz chrząstkę.</li>
	<li>Dodać 10 ml roztworu trypsyny (0,25% trypsyny w PBS) i umieścić probówkę na wytrząsarce w temperaturze 37 °C na 24 godziny. W tym okresie trypsynę należy wymieniać co 4 godziny. Przefiltrować zawiesinę za pomocą sita ze stali nierdzewnej i zachować tkankę. Trypsyna może być poddawana działaniu przez noc podczas jednego z procesów trawienia, co nie wpłynie na końcowe trawienie.</li>
	<li>Umyj trypsynizowaną tkankę buforem hipertonicznym (1,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,6).</li>
	<li>Dodać 10 ml roztworu nukleazy (50 j./ml dezoksyrybonukleazy i 1 μ/ml rybonukleazy w 10 mM Tris-HCl, pH 7,5) i umieścić probówkę na wytrząsarce w temperaturze 37 °C na 4 godziny.</li>
	<li>Usuń roztwór nukleazy, umyj chrząstkę trzykrotnie sterylnym PBS i dodaj hipotoniczny roztwór Tris-HCl. Umieść probówkę wirówkową na shakerze i płucz przez 20 godzin w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Usuń hipotoniczny roztwór Tris-HCl, umyj chrząstkę trzykrotnie sterylnym PBS i dodaj 1% roztwór Triton X-100, aby zanurzyć tkankę na 24 godziny.</li>
	<li>Usuń roztwór Triton X-100 i dokładnie płucz pozbawioną komórek chrząstkę wodą destylowaną przez 3 dni, zmieniając wodę destylowaną co 12 godzin.</li>
	<li>Namocz chrząstkę w roztworze kwasu nadoctowego (0,1% PAA w 4% etanolu) przez 4 godziny. Usuń roztwór kwasu nadoctowego i umyj chrząstkę trzykrotnie sterylną wodą destylowaną.</li>
	<li>Umieść sito ze stali nierdzewnej (wielkość porów: ~250 μm) na probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Powoli zdekantuj zdecelularowaną chrząstkę na sito ze stali nierdzewnej i zbierz chrząstkę. Przetestuj stopień decelularyzacji i retencję macierzy chrząstki, szacując zawartość DNA, kolagenu i glikozaminoglikanu (GAG).</li>
	<li>Umieść zdecelularowaną chrząstkę do miski mielącej, dodaj ciekły azot i zmiel zdecelularowaną chrząstkę, aby uzyskać proszek. Weź 2 g decelularizowanego proszku chrząstki, dodaj 80 ml 0,5 M kwasu octowego i 20 mg pepsyny i traw przez 24 godziny. Wirować przy 400 x g przez 10 min; Usunąć osad i zebrać roztwór supernatantu (roztwór DC-ECM).</li>
	<li>Zdekantować 1 ml roztworu DC-ECM na dołek do płytek 6-dołkowych. Umieść 6-dołkowe płytki w liofilizarze. Zamrozić roztwór DC-ECM. Gdy temperatura w liofilizatorze spadnie do -40 °C, włącz pompę próżniową i utrzymuj stopień próżni na poziomie 10 Pa przez 22 godziny.</li>
	<li>Wyjąć liofilizowany roztwór DC-ECM, umieścić go w probówkach wirówkowych i przechowywać w temperaturze -20 °C. Minimalny okres przechowywania liofilizowanego roztworu DC-ECM przekracza pół roku.</li>
	<li>Dodać 1 ml sterylnej wody destylowanej, aby rozpuścić 20 mg liofilizowanego roztworu DC-ECM w probówce wirówkowej. Wstrząsać przez 1 minutę za pomocą mieszalnika wirowego z prędkością 1 000 obr./min przy suchej smotylacji. Dodać 1 mg witaminy B2 (0,1% w/v) do roztworu DC-ECM, inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut i naświetlać światłem UV (370 nm, 3,5 mW/cm2) przez 3 minuty, aby utworzyć hydrożel (hydrożel DC-ECM).</li>
</ol>
2. Wykrywanie chrząstki pozbawionej komórek
<ol>
	<li>Wykrywanie zawartości DNA w chrząstce pozbawionej komórek 
	UWAGA: Wyodrębnij DNA za pomocą zestawu DNEasy Blood & Tissue Kit.
	<ol>
		<li>Najpierw należy pobrać 20 mg chrząstki DC-ECM do probówki wirówkowej. Dodać 180 μl buforu GTL i 20 μl proteinazy K przez oscylację wirową i inkubować chrząstkę w temperaturze 56 °C przez 4 godziny, aż do całkowitego rozpuszczenia.</li>
		<li>Potrząsać probówką wirówkową przez 15 sekund za pomocą mieszalnika wirowego z prędkością 1 000 obr./min przy temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 200 μl buforu GL i bezwodnego etanolu i dokładnie wymieszaj za pomocą wibracji wirowych. Odwirowywać próbki przez 1 minutę z prędkością 6 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Dodać 500 μl buforu GW1 do kolumny adsorpcyjnej i odwirować próbki przez 1 minutę z prędkością 12 000 x g w temperaturze 4 °C. Dodać 500 μl buforu GW2 do kolumny adsorpcyjnej i odwirować przy 20 000 x g w temperaturze 4 °C przez 1 minutę. Na koniec dodać 50 μl wysterylizowanej wody do kolumny adsorpcyjnej i odwirować przez 1 minutę z prędkością 6 000 x g w temperaturze 4 °C w celu zebrania roztworu DNA. Oznaczyć zawartość DNA za pomocą spektrofotometru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykrywanie zawartości kolagenu w chrząstce pozbawionej komórek
	<ol>
		<li>Aby wykryć zawartość kolagenu w chrząstce pozbawionej komórek, użyj hydroksyproliny jako markera aminokwasów kolagenu. Zakwasić 5 mg pozbawionej komórek chrząstki 5 ml 6 M kwasu solnego w temperaturze 100 °C przez 20 minut, a następnie zneutralizować ją 5 ml 6 M roztworu wodorotlenku sodu.</li>
		<li>Obliczyć zawartość hydroksyproliny, mierząc absorbancję próbki przy długości fali 570 nm za pomocą spektrofotometru. Uzyskać regresję liniową stężenie-absorpcja przy użyciu standardowej próbki hydroksyproliny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykrywanie zawartości GAG w chrząstce zdecelularizowanej 
	UWAGA: Zawartość GAG w chrząstce DC-ECM została wykryta przy użyciu zestawu do ilościowego wykrywania kolorymetrycznego GAG w tkankach. Wszystkie poniższe odczynniki są dostępne w zestawie.
	<ol>
		<li>Weź 200 mg proszku chrząstki DC-ECM i dodaj 500 μl odczynnika A przez oscylację wirową. Inkubować próbkę w temperaturze 4 °C przez 16 godzin, a następnie wirować przy 14 000 x g przez 10 minut.</li>
		<li>Weź 50 ml roztworu próbki i dodaj 50 μl roztworu o wysokiej zawartości soli (odczynnik B) i 50 μl roztworu kwasu (odczynnik C) przez oscylację wirową. Inkubować próbkę przez 10 minut.</li>
		<li>Dodać 750 μl roztworu barwnika (odczynnika D) przez oscylację wirową i inkubować próbkę przez 30 minut w ciemnych warunkach. Odwirować próbkę o masie 14 000 x g przez 10 minut, a następnie odrzucić supernatant.</li>
		<li>Dodać 1 μl roztworu czyszczącego (odczynnik E) i dobrze wymieszać. Odwirować próbkę o masie 14 000 x g przez 10 minut i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Dodać 1 μl roztworu dysocjacyjnego (odczynnika F) do próbki i dobrze wymieszać. Inkubować próbkę przez 30 minut w ciemnych warunkach. Na koniec oznacz zawartość GAG za pomocą spektrofotometru o długości fali 600 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza chrząstki pozbawionej komórek za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) i transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM)
	<ol>
		<li>Porównaj chrząstkę pozbawioną komórek i normalną tkankę chrzęstną. Umieścić próbkę w 2,5% roztworze aldehydu glutarowego, inkubować w temperaturze 4 °C przez noc, a następnie trzykrotnie przemyć PBS.</li>
		<li>Utrwalić próbkę w 1% OsO4 na 1 godzinę, a następnie przemyć trzykrotnie PBS.</li>
		<li>Odwodnić próbkę przez sekwencyjne zanurzenie w 50%, 70%, 90% i 100% etanolu, a także 100% acetonie przez 15 minut każde. Umieścić próbkę w zmieszanym roztworze heksametylodilazanu i etanolu (1:1) na 15 minut, a następnie zanurzyć w czystym heksametylodilazanie na 15 minut.</li>
		<li>Umieścić próbkę w suszarce HCP-2, a następnie wysuszyć przy użyciu ciekłego azotu. Następnie pokryj całkowicie wysuszoną próbkę cienką warstwą złota-palladu za pomocą napylania i zobrazuj za pomocą SEM. Napylanie napylania wykonywano z mocą 120 W przez 5 min. Doświadczenie przeprowadzono w następujących warunkach: napięcie robocze 15 kV i stopień podciśnienia niższy niż 5 x 10−5 Pa.</li>
		<li>Do analizy TEM umieścić próbkę w mieszaninie bezwodnego acetonu i żywicy (1:1) na 1 godzinę, a następnie w mieszaninie bezwodnego acetonu i żywicy (1:3) na 3 godziny. Następnie umieść próbkę na noc w żywicy.
		<ol>
			<li>Umieścić próbkę w kapsułkach wypełnionych pożywką i ogrzewać w temperaturze 70 °C przez 9 godzin.</li>
			<li>Po zatopieniu pokrój próbkę na cienkie plasterki o długości 70 nm za pomocą ultradrobnego mikrotomu i umieść na miedzianej siatce.</li>
			<li>Odmierzyć pipetą 20 μl roztworu barwiącego octan uranylu na siatkę miedzianą i barwić przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć roztwór barwiący, delikatnie myjąc siatkę dwukrotnie wodą destylowaną.</li>
			<li>Następnie odpipetować 20 μl roztworu barwiącego cytrynian ołowiu na siatkę miedzianą i barwić przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Umyć siatkę trzykrotnie wodą destylowaną.</li>
			<li>Umieść miedzianą siatkę na czystej szalce Petriego wyłożonej bibułą filtracyjną. Po wysuszeniu na powietrzu sfotografuj sekcje za pomocą TEM. Sonda została przyłożona z siłą skierowaną w dół 500 nN, skanowana z częstotliwością 1 Hz i miała stałą sprężystości (wartość k) 40 Nm-1. Zmierzono promień końcówki sondy na 8 nm.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Vega, S. L., Kwon, M. Y., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+hydrogels+for+cartilage+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cells+%26+Materials%22%5BJournal%5D)">Recent advances in hydrogels for cartilage tissue engineering.</a> European Cells & Materials. 33, 59-75 (2017).</li>
<li>Yang, J., Zhang, Y. S., Yue, K., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-laden+hydrogels+for+osteochondral+and+cartilage+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Cell-laden hydrogels for osteochondral and cartilage tissue engineering.</a> Acta Biomaterialia. 57, 1-25 (2017).</li>
<li>Bejleri, D., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+extracellular+matrix+materials+for+cardiac+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Decellularized extracellular matrix materials for cardiac repair and regeneration.</a> Advanced Healthcare Materials. 8 (5), e1801217(2019).</li>
<li>Brown, M., Li, J., Moraes, C., Tabrizian, M., Li-Jessen, N. Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+extracellular+matrix%3A+New+promising+and+challenging+biomaterials+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularized extracellular matrix: New promising and challenging biomaterials for regenerative medicine.</a> Biomaterials. 289, 121786(2022).</li>
<li>Barbulescu, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+extracellular+matrix+scaffolds+for+cardiovascular+tissue+engineering%3A+Current+techniques+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Decellularized extracellular matrix scaffolds for cardiovascular tissue engineering: Current techniques and challenges.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (21), 13040(2022).</li>
<li>Zhang, W., Du, A., Liu, S., Lv, M., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+progress+in+decellularized+extracellular+matrix-derived+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Therapy%22%5BJournal%5D)">Research progress in decellularized extracellular matrix-derived hydrogels.</a> Regenerative Therapy. 18, 88-96 (2021).</li>
<li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-derived+decellularized+extracellular+matrix+scaffolds+for+articular+cartilage+repair%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Artificial+Organs%22%5BJournal%5D)">Cell-derived decellularized extracellular matrix scaffolds for articular cartilage repair.</a> International Journal of Artificial Organs. 44 (4), 269-281 (2021).</li>
<li>Li, T., Javed, R., Ao, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenogeneic+decellularized+extracellular+matrix-based+biomaterials+for+peripheral+nerve+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Xenogeneic decellularized extracellular matrix-based biomaterials for peripheral nerve repair and regeneration.</a> Current Neuropharmacology. 19 (12), 2152-2163 (2021).</li>
<li>Xia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+cartilage+as+a+prospective+scaffold+for+cartilage+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+%26+Engineering+C-Materials+for+Biological+Applications%22%5BJournal%5D)">Decellularized cartilage as a prospective scaffold for cartilage repair.</a> Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 101, 588-595 (2019).</li>
<li>Chen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desktop-stereolithography+3D+printing+of+a+radially+oriented+extracellular+matrix%2Fmesenchymal+stem+cell+exosome+bioink+for+osteochondral+defect+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Desktop-stereolithography 3D printing of a radially oriented extracellular matrix/mesenchymal stem cell exosome bioink for osteochondral defect regeneration.</a> Theranostics. 9 (9), 2439-2459 (2019).</li>
<li>Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+hydrogels+from+decellularized+tissues%3A+Structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function.</a> Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).</li>
<li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+delivery+in+tissue-specific+hydrogel+enabled+meniscal+repair+in+an+orthotopic+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Stem cell delivery in tissue-specific hydrogel enabled meniscal repair in an orthotopic rat model.</a> Biomaterials. 132, 59-71 (2017).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensified+stiffness+and+photodynamic+provocation+in+a+collagen-based+composite+hydrogel+drive+chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Intensified stiffness and photodynamic provocation in a collagen-based composite hydrogel drive chondrogenesis.</a> Advanced Science. 6 (16), 1900099(2019).</li>
<li>Young, J. L., Holle, A. W., Spatz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P.Nanoscale+and+mechanical+properties+of+the+physiological+cell-ECM+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">P.Nanoscale and mechanical properties of the physiological cell-ECM microenvironment.</a> Experimental Cell Research. 343 (1), 3-6 (2016).</li>
<li>Abdolghafoorian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+heart+valve+decellularization+on+xenograft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Clinical+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Effect of heart valve decellularization on xenograft rejection.</a> Experimental and Clinical Transplantation. 15 (3), 329-336 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten zapewnia systematyczne podejście do przygotowania bezkomórkowych hydrożeli macierzy zewnątrzkomórkowej chrząstki bez komórek, które ściśle naśladują natywne ECM tkanki chrzęstnej. Protokół obejmuje połączenie fizycznych, chemicznych i enzymatycznych zakłóceń w celu usunięcia materiału komórkowego przy jednoczesnym zachowaniu struktury i składu ECM. Krytyczne kroki protokołu obejmują dostosowanie czasu i metod decelularyzacji oraz zapewnienie całkowitej decelularyzacji.
W porównani...

Inżynieria tkanki chrzęstnej to szybko rozwijająca się dziedzina, która ma na celu regenerację uszkodzonej lub chorej tkanki chrzęstnej1. Jednym z kluczowych wyzwań w tej dziedzinie jest opracowanie biomimetycznych rusztowań, które mogą wspierać wzrost i różnicowanie chondrocytów, komórek odpowiedzialnych za produkcję chrząstki2. ECM tkanki chrzęstnej odgrywa kluczową rolę w regulacji zachowania chondrocytów. DC-ECM to skuteczne rusztowanie do zastosowań w inżynierii tkankowej3.
Opracowano szereg technik wytwarzania DC-ECM z tkanki chrzęstnej, w tym metody chemiczne, enzymatyczne i fizyczne. Jednak metody te często prowadzą do generowania hydrożeli ECM, które są niewystarczająco biomimetyczne, co ogranicza ich potencjał do wykorzystania w zastosowaniach inżynierii tkankowej4,5. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na bardziej efektywną metodę produkcji hydrożeli DC-ECM.
Rozwój tej techniki jest ważny, ponieważ może ona przyczynić się do postępu w dziedzinie inżynierii tkankowej, dostarczając nowego podejścia do tworzenia biomimetycznych rusztowań, które mogą wspierać regenerację i naprawę tkanek. Co więcej, technikę tę można łatwo zaadaptować do produkcji hydrożeli ECM z innych tkanek, rozszerzając tym samym jej potencjalne zastosowania.
W szerszej literaturze rośnie zainteresowanie wykorzystaniem DC-ECM jako rusztowania dla zastosowań inżynierii tkankowej6. Liczne badania wykazały skuteczność hydrożeli DC-ECM w promowaniu wzrostu i różnicowania komórek w różnych tkankach, w tym w chrząstce7,8. Dlatego opracowanie protokołu produkcji hydrożeli DC-ECM, które ściśle naśladują naturalny ECM tkanki chrzęstnej, jest znaczącym wkładem w tę dziedzinę.
Protokół przedstawiony w tym artykule odpowiada na tę potrzebę, dostarczając nowatorską metodę produkcji hydrożeli DC-ECM, które ściśle naśladują naturalny ECM tkanki chrzęstnej. Protokół obejmuje decelularyzację tkanki chrzęstnej, wyizolowanie powstałego ECM i wytworzenie hydrożelu poprzez usieciowanie ECM za pomocą biokompatybilnego polimeru. Uzyskany w ten sposób hydrożel wykazał obiecujące wyniki we wspieraniu wzrostu i różnicowania chondrocytów.

<table><tbody><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7,6</td><td>Beyotime</td><td>ST776-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 8,0</td><td>Beyotime</td><td>ST780-500 mL-80</td><td></td></tr> <tr><td>&deg; C Zamrażarka</td><td>Eppendorf</td><td>F440340034</td><td></td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza</td><td>Aladyn</td><td>D128600-80KU</td><td></td></tr><tr><td>DNEasy Krew i Zestaw tkanek</td><td>Qiagen</td><td>nr 69506</td><td></td></tr><tr><td>Kolorymetryczny zestaw do wykrywania ilościowego GAG</td><td>Suszarka Shanghai Haling</td><td>HL19236.2</td><td></td></tr><tr><td>HCP-2&nbsp;</td><td>Hitachi</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop8000</td><td>Thermo Fisher</td><td>N/A</td><td>Spektrofotometr</td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Rybonukleaza</td><td>Aladdin</td><td>R341325-100 mg</td><td></td></tr><tr><td>Sigma500</td><td>ZIESS</td><td>N/A</td><td>Skaningowy mikroskop elektronowy</td></tr><tr><td>Spectra S</td><td>Thermo Fisher</td><td>N/A</td><td>Transmisyjny mikroskop elektronowy</td></tr><tr><td>Sito ze stali nierdzewnej</td><td>SHXB-Z-1</td><td>Shanghai Xinbu</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Beyotime</td><td>P0096-500 mL</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15050065</td><td></td></tr><tr><td>Lampa ultrafioletowa</td><td>Omnicure 2000</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Witamina B2</td><td>Gibco</td><td>R4500-5G</td><td></td></tr><tr><td>Mikser wirowy</td><td>Shanghai Qiasen</td><td>78HW-1&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

synteza hydrożeli macierzy zewnątrzkomórkowej chrząstki bezkomórkowej ze zdecelulonizowanych komórek

Synthesis of Decellularized Cartilage Extracellular Matrix Hydrogels

Hydrożele z bezkomórkową matrycą zewnątrzkomórkową (DC-ECM) są obiecującymi biomateriałami dla inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej ze względu na ich biokompatybilność i zdolność do naśladowania naturalnych właściwości tkanek. Protokół ten ma na celu wytworzenie hydrożeli DC-ECM, które ściśle naśladują natywny ECM tkanki chrzęstnej. Protokół obejmuje połączenie fizycznego i chemicznego zakłócenia oraz trawienia enzymatycznego w celu usunięcia materiału komórkowego przy jednoczesnym zachowaniu struktury i składu ECM. DC-ECM jest sieciowany za pomocą środka chemicznego w celu utworzenia stabilnego i biologicznie aktywnego hydrożelu. Hydrożel DC-ECM charakteryzuje się doskonałą aktywnością biologiczną, strukturą przestrzenną i funkcją indukcji biologicznej, a także niską immunogennością. Cechy te są korzystne w promowaniu adhezji, proliferacji, różnicowania i migracji komórek oraz w tworzeniu doskonałego mikrośrodowiska dla wzrostu komórek. Protokół ten stanowi cenne źródło informacji dla badaczy i klinicystów w dziedzinie inżynierii tkankowej. Hydrożele biomimetyczne mogą potencjalnie przyczynić się do opracowania skutecznych strategii inżynierii tkankowej w zakresie naprawy i regeneracji chrząstki.

Aby przygotować lepszy hydrożel chrzęstny DC-ECM, przeanalizowano i przejrzano dotychczasową literaturę oraz porównano różne protokoły decelularyzacji pod kątem stopnia decelularyzacji, immunogenności oraz funkcjonalności mechanicznej9.
Na tej podstawie przygotowaliśmy hydrożel chrząstkowy DC-ECM i zbadaliśmy wpływ radialnie zorientowanego biotuszu składającego się z macierzy ekstrakcyjnej i egzosomów mezenchymalnych komórek macierzystych w leczeniu ubytków chrzęstno-ko...

Ten artykuł przedstawia nową metodę syntezy hydrożeli decelularnej chrząstki zewnątrzkomórkowej (DC-ECM). Hydrożele DC-ECM mają doskonałą biokompatybilność i zapewniają doskonałe mikrośrodowisko do wzrostu komórek. Dlatego mogą być idealnymi rusztowaniami komórkowymi i biologicznymi systemami dostarczania.

Synteza hydrożeli macierzy zewnątrzkomórkowej chrząstki bezkomórkowej ze zdecelulonizowanych komórek

Decellularized cartilage extracellular matrix (DC-ECM) hydrogels are promising biomaterials for tissue engineering and regenerative medicine due to their ...

Nasz protokół jest istotny, ponieważ umożliwia tworzenie chorób w hydrożelach, które bardzo przypominają charakter tkanki chrzęstnej. Główną zaletą tej techniki jest zdolność do wytwarzania chorób w hydrożelach o wyraźnej aktywności biologicznej w strukturze przestrzennej, niskiej immunogenności i biologicznej funkcji przemysłowej. Na początek posiekaj zebraną chrząstkę za pomocą skalpela na kawałki o wielkości od jednego do dwóch milimetrów sześciennych.W 50-milimetrowej probówce wirówkowej zanurz 20 gramów mielonej chrząstki w 20 mililitrach hipotonicznego buforu Tris-chlorowodorku. Umieść rurkę w temperaturze 80 stopni Celsjusza na trzy godziny, a następnie wstaw do piekarnika w temperaturze 37 stopni Celsjusza na trzy godziny. Wirować probówkę wirówkową przez 30 sekund przy 1000 obr./min.Następnie przefiltruj zdecelularowaną chrząstkę za pomocą plastikowego sitka umieszczonego na 50-mililitrowej probówce wirówkowej. Umyj chrząstkę trzykrotnie sterylnym PBS przed jej pobraniem. Dodaj 10 mililitrów roztworu trypsyny do pobranej chrząstki i inkubuj ją na wytrząsarce w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny, wymieniając trypsynę co cztery godziny.Po przefiltrowaniu zawiesiny przemyć trypsynizowaną chrząstkę buforem hipertonicznym. Gdy chrząstka zostanie zachowana, dodaj 10 mililitrów roztworu nukleazy i umieść go na wytrząsarce w temperaturze 37 stopni Celsjusza na cztery godziny. Po umyciu sterylnym PBS, dodać hipertoniczny roztwór chlorowodorku trisu do chrząstki i umieścić go na wytrząsarce, jak pokazano.Po umyciu sterylnym PBS zanurz tkankę w 1% roztworze Triton X-100 na 24 godziny. Po wyjęciu Triton X-100 płucz zdecelularowaną chrząstkę wodą destylowaną przez trzy dni, zmieniając wodę co 12 godzin. Po trzech dniach dodaj roztwór kwasu nadoctowego do chrząstki i moczyć go przez cztery godziny.Po umyciu PBS chrząstkę należy zebrać za pomocą plastikowego sitka, jak pokazano wcześniej. Używając ciekłego azotu, przygotuj bezkomórkowy proszek chrząstki. Dodaj 80 mililitrów 0,5 molowego kwasu octowego i 20 miligramów pepsyny do dwóch gramów proszku chrząstki i traw mieszaninę przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po roztrawieniu odwirować zawiesinę o stężeniu 400 G przez 10 minut i zebrać supernatant, który obecnie nazywa się roztworem DC-ECM Do przechowywania roztworu DC-ECM dodaj jeden mililitr roztworu do każdej studzienki płytki sześciodołkowej i umieść ją w liofilizatorze. Po wysuszeniu roztworu liofilizowanego przenieś go do probówki wirówkowej. Aby utworzyć hydrożel, rozpuść 20 miligramów liofilizowanego roztworu DC-ECM w jednym mililitrze sterylnej wody destylowanej.Po zawirowaniu dodaj jeden miligram witaminy B2 do roztworu DC-ECM. Po inkubacji naświetlać go światłem UV przez trzy minuty. Dodaj bufor GTL i proteinazę K do 20 miligramów proszku chrząstki DC-ECM i dokładnie wymieszaj za pomocą oscylacji wirowej.Aby całkowicie rozpuścić chrząstkę, inkubuj mieszaninę w temperaturze 56 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Po zawirowaniu dodaj 200 mikrolitrów buforu GTL, a następnie bezwodny etanol. Po wirowaniu odwirować próbkę o sile 6000 G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie zbierz i określ ilościowo DNA zgodnie z opisem w manuskrypcie. Aby przeanalizować kolagen, zakwasz pięć miligramów proszku DC-ECM w kwasie solnym w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 20 minut. Następnie zneutralizuj go pięcioma mililitrami sześciomolowego roztworu wodorotlenku sodu.Obliczyć zawartość hydroksyproliny w zobojętnionej próbce, stosując absorbancję przy 570 nanometrach w stosunku do wzorca hydroksyproliny. Po wymieszaniu dodać 500 mikrolitrów odczynnika A do 200 miligramów proszku DC-ECM. Inkubować próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 16 godzin.Po odwirowaniu zebrać 50 mikrolitrów roztworu próbki i dodać 50 mikrolitrów odczynnika B, a następnie odczynnika C. Po inkubacji próbki przez 10 minut dodać 750 mikrolitrów odczynnika D i inkubować przez 30 minut w ciemności. Po odwirowaniu dodaj jeden mikrolitr odczynnika E do osadu i dobrze wymieszaj przed odwirowaniem. Następnie oddziel próbkę przed pomiarem zawartości GAG.W przygotowanej chrząstce DC-ECM zawartość DNA została istotnie wyeliminowana. Jednak zawartość kolagenu i GAG została zachowana w porównaniu z natywną chrząstką. Analiza SEM i TEM wykazała ultrastrukturę przygotowanego DC-ECM.Przygotowany hydrożel w odwróconej rurce nie spływał na dno, wykazując w ten sposób żelowanie. Ponadto, w porównaniu z roztworem zawierającym wyłącznie DC-ECM, dodanie witaminy B2 skróciło czas żelowania ze względu na indukowane sieciowanie podczas tworzenia hydrożelu DC-ECM. Lepkość hydrożelu DC-ECM była wyższa niż lepkość roztworu, a zwiększona szybkość ścinania zmniejszała lepkość roztworu.Co więcej, wysoki moduł magazynowania roztworu DC-ECM i hydrożelu wskazywał, że oba mają właściwości żelowe, a nie płynne. Analiza SEM wykazała, że wielkość porów roztworu DC-ECM została znacznie zmniejszona w postaci hydrożelu po sieciowaniu i liofilizacji. Protokół obejmuje połączenie fizycznego i chemicznego zakłócenia oraz trawienia enzymatycznego w celu usunięcia materiału komórkowego przy jednoczesnym zachowaniu struktury i rozmowy ECM.

synthesis-of-decellularized-cartilage-extracellular-matrix-hydrogels

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Biosynteza chrzęstnej macierzy pozakomórkowej przez chondrocyty może ulegać zmianom pod wpływem bodźców mechanicznych. Niniejsza metoda opisuje technikę aplikowania dynamicznych odkształceń ściskających do chondrocytów zamkniętych w konstrukcjach 3D oraz ocenę indukowanych zmian w metabolizmie chondrocytów.

Mechaniczna stymulacja hydrożeli z chondrocytów i agarozy

Bioprinter został użyty do stworzenia wzorzystych hydrożeli na bazie formy ofiarnej.  Formę poloksamerową zasypano drugim hydrożelem, a następnie wymywano, pozostawiając puste przestrzenie, które wypełniono trzecim hydrożelem. Metoda ta wykorzystuje szybką elucję i dobrą drukowność poloksamera do generowania złożonych architektur z biopolimerów.

Drukowanie termoczułych form odwróconych do tworzenia wzorzystych dwuskładnikowych hydrożeli do hodowli komórkowych 3D

Naprawa chrząstki stanowi niespełnione wyzwanie medyczne, a oparte na komórkach podejścia do inżynierii ludzkiej chrząstki stawowej są obiecującym rozwiązaniem. W tym miejscu opisujemy trójwymiarowe (3D) hydrożele biomimetyczne jako idealne narzędzie do ekspansji i dojrzewania chondrocytów stawowych człowieka.

Rusztowania hydrożelowe 3D do hodowli chondrocytów stawowych i wytwarzania chrząstek

To jest metoda tworzenia trójwymiarowego rusztowania do hodowli komórkowych z zewnątrzkomórkowej macierzy płucnej. Nienaruszone płuca są przetwarzane na hydrożele, które mogą wspierać wzrost komórek w trzech wymiarach.

Przestrajalne hydrożele z macierzy zewnątrzkomórkowej płuc do hodowli komórek 3D

Ten protokół opisuje całkowitą decelularyzację ludzkiego mięśnia sercowego przy jednoczesnym zachowaniu jego składników macierzy zewnątrzkomórkowej. Dalsze przetwarzanie macierzy zewnątrzkomórkowej powoduje produkcję mikrocząstek i cytoprotekcyjnego hydrożelu samoorganizującego się.

Przetwarzanie ludzkiej tkanki serca w kierunku samoorganizującego się hydrożelu macierzy zewnątrzkomórkowej do zastosowań in vitro i in vivo

Tutaj prezentujemy protokół wytwarzania hydrożelu pochodzącego z macierzy zewnątrzkomórkowej kory nerki, aby zachować naturalny skład strukturalny i biochemiczny macierzy zewnątrzkomórkowej nerki (ECM). Opisano proces wytwarzania i jego zastosowania. Na koniec omówiono perspektywę wykorzystania tego hydrożelu do wspomagania specyficznej dla nerek regeneracji komórek i tkanek oraz bioinżynierii.

Wytwarzanie hydrożelu pochodzącego z macierzy zewnątrzkomórkowej kory nerkowej

Bezkomórkowe rusztowania pochodzące z chrząstki mogą być używane jako rusztowanie do naprawy chrząstki i jako środek do regeneracji tkanki kostno-chrzęstnej. W artykule szczegółowo opisano proces decelularyzacji i przedstawiono sugestie dotyczące wykorzystania tych rusztowań w warunkach in vitro.

Wytwarzanie bezkomórkowych rusztowań matrycowych pochodzących z chrząstki

Celem tego protokołu jest produkcja całych włókien macierzy zewnątrzkomórkowej przeznaczonych do gojenia ran, które są odpowiednie do oceny przedklinicznej jako część regeneracyjnego implantu rusztowania. Włókna te są wytwarzane przez hodowlę fibroblastów na membranach z pustych włókien i ekstrahowane przez rozpuszczenie błon.

Produkcja włókien macierzy zewnątrzkomórkowej poprzez protektorową hodowlę komórek z pustych włókien

Terapia kości poprzez kostnienie śródchrzęstne poprzez wszczepienie sztucznej tkanki chrzęstnej wyprodukowanej z mezenchymalnych komórek macierzystych ma potencjał do obejścia wad konwencjonalnych terapii. Hydrożele kwasu hialuronowego są skuteczne w zwiększaniu skali jednolicie zróżnicowanych przeszczepów chrząstki, a także w tworzeniu zintegrowanej kości z unaczynieniem między zrośniętymi przeszczepami in vivo.

Zintegrowane tworzenie kości poprzez kostnienie endochrzęstne in vivo przy użyciu mezenchymalnych komórek macierzystych

Protokół wyjaśnia dwie różne metodologie decelularyzacji stosowane do rodzimych tkanek płucnych bydła, dostarczając wyczerpującego opisu ich charakterystyki.

Opracowanie i charakterystyka bezkomórkowych hydrożeli do bezkomórkowych płuc

Poznaj metodę syntezy hydrożeli DC-ECM z chrząstki zdecelularyzowanej przy użyciu obróbki cieplnej i enzymatycznej. Technika ta zapewnia niską immunogenność i zachowanie struktury macierzy zewnątrzkomórkowej.

Synteza hydrożeli macierzy zewnątrzkomórkowej chrząstki bezkomórkowej ze zdecelulonizowanych komórek

Przeglądaj więcej filmów