Name: Ocena in vitro i in vivo fotokontrolowanych związków biologicznie czynnych - potencjalni kandydaci na leki w fotofarmakologii nowotworów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-29T13:10:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: Poznaj metody oceny fotoprzełączalnych peptydów przeciwnowotworowych in vitro i in vivo. Protokoły obejmują badania cytotoksyczności w kulturach 2D i 3D oraz ocenę efektywności fotoizomeryzacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za finansowanie UE przez program H2020-MSCA-RISE poprzez projekty PELICO (#690973) i ALISE (#101007256). Prace te były wspierane przez DFG-GRK 2039 (SA, TS i ASU), program NACIP Towarzystwa Helmholtza (SA i ASU) oraz VIP+ BMBF (OB i ASU). Wyrażamy uznanie dla dr Serhiia Koniewa z Instytutu Technologii w Karlsruhe, który zsyntetyzował związek LMB002, oczyścił go i uprzejmie dostarczył związek do badania. Autorzy dziękują również Chuprynie Maksym, która nakręciła i zmontowała film na Ukrainie, a także wszystkim odważnym obrońcom Ukrainy, którzy umożliwili eksperymentalną pracę, napisanie i sfilmowanie tej publikacji.

<ol><li>Fuchter, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+promise+of+photopharmacology+using+photoswitches%3A+a+medicinal+chemist%27s+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">On the promise of photopharmacology using photoswitches: a medicinal chemist's perspective.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 63 (20), 11436-11447 (2020).</li>
<li>Volarić, J., Szymanski, W., Simeth, N. A., Feringa, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+photoswitches+in+aqueous+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Molecular photoswitches in aqueous environments.</a> Chemical Society Reviews. 50, 12377-12449 (2021).</li>
<li>Paoletti, P., Ellis-Davies, G. C. R., Mourot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+neuronal+ion+channels+and+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optical control of neuronal ion channels and receptors.</a> Nature Reviews Neuroscience. 20, 514-532 (2019).</li>
<li>Hüll, K., Morstein, J., Trauner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Photopharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">In Vivo Photopharmacology.</a> Chemical Reviews. 118 (21), 10710-10747 (2018).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+photopharmacology+with+a+caged+mu+opioid+receptor+agonist+drives+rapid+changes+in+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo photopharmacology with a caged mu opioid receptor agonist drives rapid changes in behavior.</a> Nature Methods. 20, 682-685 (2023).</li>
<li>Sarabando, S. N., Palmeira, A., Sousa, M. E., Faustino, M. A. F., Monteiro, C. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photomodulation+Approaches+to+Overcome+Antimicrobial+Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals%22%5BJournal%5D)">Photomodulation Approaches to Overcome Antimicrobial Resistance.</a> Pharmaceuticals. 16 (5), 682(2023).</li>
<li>Kolarski, D., Szymanski, W., Feringa, B. L. Chronophotopharmacology: Methodology for high spatiotemporal control over the circadian rhythm with light. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKolarski%2C+D+%22Neuromethods%22">Neuromethods</a>. Hirota, T., Hatori, M., Panda, S. 186, Humana, New York, NY. (2022).</li>
<li>Babii, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+drugs+for+photopharmacology%3A+how+much+of+a+safety+advantage+can+be+gained+by+photocontrol%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Peptide drugs for photopharmacology: how much of a safety advantage can be gained by photocontrol.</a> Future Drug Discovery. 2 (1), FDD28(2020).</li>
<li>Davis, A. M., Keeling, D. J., Steele, J., Tomkinson, N. P., Tinker, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Components+of+successful+lead+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Components of successful lead generation.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 5 (4), 421-439 (2005).</li>
<li>Balani, S. K., Miwa, G. T., Gan, L., Wu, J., Lee, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategy+of+utilizing+in+vitro+and+in+vivo+adme+tools+for+lead+optimization+and+drug+candidate+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Strategy of utilizing in vitro and in vivo adme tools for lead optimization and drug candidate selection.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 5 (11), 1033-1038 (2005).</li>
<li>Kleijn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Systematic+comparison+identifies+an+ATP-based+viability+assay+as+most+suitable+read-out+for+drug+screening+in+glioma+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">A Systematic comparison identifies an ATP-based viability assay as most suitable read-out for drug screening in glioma stem-like cells.</a> Stem Cells International. 2016, (2016).</li>
<li>Rodrigues, J., Heinrich, M. A., Teixeira, L. M., Prakash, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+in+vitro+model+revolution%3A+unveiling+tumor-stroma+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">3D in vitro model revolution: unveiling tumor-stroma interactions.</a> Trends in Cancer. 7 (3), 249-264 (2021).</li>
<li>Sittinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+and+autologous+transplant+formation%3A+practical+approaches+with+resorbable+biomaterials+and+new+cell+culture+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering and autologous transplant formation: practical approaches with resorbable biomaterials and new cell culture techniques.</a> Biomaterials. 17 (3), 237-242 (1996).</li>
<li>Matai, I., Kaur, G., Seyedsalehi, A., McClinton, A., Laurencin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+3D+bioprinting+technology+for+tissue%2Forgan+regenerative+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Progress in 3D bioprinting technology for tissue/organ regenerative engineering.</a> Biomaterials. 226, 119536(2020).</li>
<li>Babii, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+photocontrol+of+peptidomimetics%3A+an+alternative+to+oxygen-dependent+photodynamic+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Direct photocontrol of peptidomimetics: an alternative to oxygen-dependent photodynamic cancer therapy.</a> Angewandte Chemie International Edition. 55 (18), 5493-5496 (2016).</li>
<li>De Ridder, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+3D+lung+tumor+spheroids+for+oncoimmunological+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+NanoBiomed+Research%22%5BJournal%5D)">Novel 3D lung tumor spheroids for oncoimmunological assays.</a> Advanced NanoBiomed Research. 2 (4), 2100124(2022).</li>
<li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+in+vitro+and+in+vivo+cancer+models+to+guide+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine.</a> Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li>
<li>Van Straten, D., Mashayekhi, V., De Bruijn, H. S., Oliveira, S., Robinson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncologic+photodynamic+therapy%3A+basic+principles%2C+current+clinical+status+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Oncologic photodynamic therapy: basic principles, current clinical status and future directions.</a> Cancers. 9 (2), 19(2017).</li>
<li>Li, X., Kwon, N., Guo, T., Liu, Z., Yoon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+strategies+for+hypoxic-tumor+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Innovative strategies for hypoxic-tumor photodynamic therapy.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (36), 11522-11531 (2018).</li>
<li>Hull, K., Morstein, J., Trauner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+photopharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">In vivo photopharmacology.</a> Chemical Reviews. 118 (21), 10710-10747 (2018).</li>
<li>Babii, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+relationships+of+photoswitchable+diarylethene-based+%CE%B2-hairpin+peptides+as+membranolytic+antimicrobial+and+anticancer+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structure-activity relationships of photoswitchable diarylethene-based β-hairpin peptides as membranolytic antimicrobial and anticancer agents.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 61 (23), 10793-10813 (2018).</li>
<li>Heckl, C., Aumiller, M., Rühm, A., Sroka, R., Stepp, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+and+treatment+light+monitoring+for+interstitial+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence and treatment light monitoring for interstitial photodynamic therapy.</a> Photochemistry and Photobiology. 96 (2), 388-396 (2020).</li>
</ol>

IVK, OB, SA i ASU są wynalazcami w wydanej rodzinie patentów: "Peptydomimetyki posiadające fotokontrolowaną aktywność biologiczną" (WO2014127919 [A1], EP2958934 [B1], US9481712 [B2], UA113685 [C2]) licencjonowanych przez Lumobiotics GmbH. IVK, OB, TS i SA są założycielami i udziałowcami Lumobiotics GmbH. IVK jest doradcą naukowym, HK, TM, IP i PB są pracownikami Enamine LLC. Autorzy nie mają żadnych innych istotnych powiązań ani powiązań finansowych z żadną organizacją lub podmiotem mającym interes finansowy lub konflikt finansowy z tematyką lub materiałami omawianymi w publikacji, poza tymi, które zostały ujawnione.

Związki kontrolowane w świetle nie mają precedensu w opracowywaniu leków; Nie ustalono jednak metod ich oceny przedklinicznej i klinicznej. Najbliższa analogia monoterapii, terapia fotodynamiczna (PDT), jest metodą leczenia raka do użytku klinicznego przyjętą przez wiele krajów i jest w trakcie opracowywania dla innych wskazań19,20. Podobnie jak fotofarmakologia, PDT również opiera się na wykorzystaniu światła do aktywacji substancji bioaktywnej (tlenu singletowego). W związku z tym niektóre metody eksperymentalne stosowane w badaniach przedklinicznych i klinicznych w PDT można zastosować w fotofarmakologii. Na przykład źródła światła, podejścia do dostarczania światła i urządzenia medyczne są dobrze opracowane i zatwierdzone do PDT; Mogą być bezpośrednio wykorzystywane do oceny leków kontrolowanych w świetle reflektorów. Jednak PDT i fotofarmakologia mają wiele różnic między sobą4, co uzasadnia konieczność ustalenia konkretnych metod dla tej ostatniej.
Po pierwsze, nieaktywowana substancja w PDT (tlenie) jest zawsze obecna w żywych tkankach w nietoksycznych stężeniach. Natomiast nieaktywowane fotokontrolowane związki biologicznie czynne mogą mieć aktywność resztkową i niepożądaną toksyczność. Dlatego idealne leki fotofarmakologiczne powinny mieć zminimalizowaną aktywność biologiczną w podawanej postaci i muszą być wysoce aktywne w postaci generowanej światłem, a "okno fototerapeutyczne"21 musi być jak największe. Znalezienie trafienia i przeprowadzenie optymalizacji typu hit-to-lead wymaga identyfikacji odpowiednich związków i badań przesiewowych stosunkowo dużych bibliotek, już na wczesnych etapach rozwoju leku. W tym przypadku zaproponowaliśmy zautomatyzowaną, wysokoprzepustową konfokalną mikroskopię fluorescencyjną w celu zidentyfikowania wydajnych związków fotoprzełączających.
Wybrana metoda oceny cytotoksyczności pozwala na łatwą realizację najbardziej krytycznego wymogu - utrzymania PSS lub stabilności światłoczułego fotoizomeru światłoczułego na światło widzialne. Dzieje się tak dlatego, że po jego wdrożeniu ekspozycja na światło jest zminimalizowana. Dlatego przy wyborze metod alternatywnych należy preferować metody automatyczne. Takie podejście jest wiarygodne i pouczające. Zastosowanie hodowli komórkowych 3D (sferoidów) na tym etapie zapewnia całościowe zrozumienie reakcji komórki na leczenie w bardziej realistycznym mikrośrodowisku przypominającym tkankę. Ponadto cenne informacje na temat mechanizmu działania związków można uzyskać przy użyciu mikroskopii jako metody bezpośredniej. Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna z odpowiednim protokołem barwienia pozwala na wizualną ocenę morfologii komórek i sferoid; Można również wykryć ważne szczegóły dotyczące śmierci komórki i zmian wewnątrz komórek.
Po drugie, lekka aplikacja wymaga starannego doboru dawki światła. W PDT przedawkowanie światła jest niezwykle szkodliwe dla tkanek22. Terapia fotofarmakologiczna może być korzystna przy nadmiernym napromieniowaniu światłem. Górna granica substancji aktywowanej jest określona przez podaną dawkę substancji nieaktywowanej i jej farmakokinetykę. Jednak dawkowanie światła jest nadal problemem w fotofarmakologii. Należy dołożyć starań, aby gęstość mocy napromieniowania i czas ekspozycji nie były mniejsze niż wymagane dla terapii. Zasadniczo wytwarzanie substancji aktywowanej może być monitorowane in vivo. Jednak ze względów bioetycznych zaproponowaliśmy eksperyment z tkanką modelową (świeże mięso mielone) zmieszaną z nieaktywowanym związkiem15. Ten eksperyment jest prosty i można go zmodyfikować tak, aby używał różnych źródeł światła. Można go również dostosować do fotofizycznego szacowania dawki światła i pomiaru wpływów termicznych. Również w tym przypadku, dzięki zastosowaniu tkanek modelowych, możliwe jest zminimalizowanie ekspozycji na światło, w porównaniu na przykład z dokładniejszym określeniem wydajności fotoprzełączania w warunkach in vivo , co jest alternatywą, która zawsze może być interesująca do rozważenia.
Wreszcie, związki, które wykazują lepsze właściwości w badaniach przesiewowych toksyczności in vitro i skutecznie fotoprzełączają się na głębokość co najmniej 1-1,5 cm w tkance modelowej, mogą być wybrane do kosztownych, pracochłonnych i długotrwałych badań in vivo . W tym protokole użyliśmy tej samej linii komórkowej (LLC), co w ocenie in vitro , do wygenerowania modelu raka przeszczepu allogenicznego. Dynamika wzrostu guza, śmiertelność i liczba przerzutów są parametrami najbardziej odpowiednimi do oceny skuteczności przeciwnowotworowej. W porównaniu z konwencjonalną chemioterapią, w leczeniu fotofarmakologicznym stosuje się dodatkowy czynnik - światło. W związku z tym potrzebne są dwie grupy zwierząt kontrolnych: jedna, która otrzymuje tylko nośnik, a druga, która otrzymuje nośnik i napromienianie. Taki układ umożliwia ocenę wpływu światła na mierzone parametry. W naszym eksperymencie zwierzęta z dwóch grup eksperymentalnych otrzymały nieaktywowany związek, a guzy myszy w jednej grupie zostały napromieniowane. Reżim napromieniania był identyczny dla grupy kontrolnej i leczonej. Porównanie z wzorcową chemioterapią nie jest konieczne na tym etapie, ponieważ głównym celem eksperymentu jest wykazanie połączonego efektu stosowania światła i związku. Związki wykazujące najlepsze wyniki w tym zakresie mogą być następnie wybrane do dalszych badań nad ich toksycznością in vivo i porównane z punktami odniesienia przy podejmowaniu ważnych decyzji dotyczących ich rozwoju. Technicznie rzecz biorąc, opisywany przez nas eksperyment in vivo można łatwo dostosować do badań farmakokinetycznych lub farmakodynamicznych, na przykład związku, który jest już wybrany jako główny lek.

W ostatnich dziesięcioleciach fotokontrolowane związki biologicznie czynne stały się obiecującym elementem bezpiecznych chemioterapii chorób ludzkich oraz swoistej eradykacji złośliwych guzów litych1. Związki te zawierają odwracalnie fotoizomeryzowalne fragmenty (molekularne przełączniki światła) i mogą przełączać się między nieaktywnymi a aktywnymi fotoizomerami po naświetleniu światłem o różnych długościach fal.
W porównaniu z ich analogami niepodlegającymi fotokontroli, leki fotokontrolowane mogą być bezpieczniejsze, ponieważ mogą być wprowadzane systemowo do organizmu pacjenta w formach mniej aktywnych i zasadniczo nietoksycznych, a następnie aktywowane światłem tylko tam, gdzie jest to konieczne, np. w guzach, owrzodzeniach i ranach. Choć w ostatnich pracach akademickich można znaleźć wiele interesujących demonstracji takich prototypowych cząsteczek leków2,3,4,5,6,7, dziedzina farmakologii światła (fotofarmakologii) w ujęciu klinicznym – czyli zastosowanie zatwierdzonych kombinacji leków, wyrobów medycznych i jednostek chorobowych – jeszcze nie istnieje. Fotofarmakologia znajduje się obecnie na etapie odkrywania leków, a systematyczne badania przedkliniczne nie są znane.
Dopiero niedawno wykazaliśmy przewagę bezpieczeństwa in vivo w przypadku niektórych fotokontrolowanych peptydów przeciwnowotworowych, a mianowicie analogów peptydowego antybiotyku gramicydyny S8. Te fotokontrolowane pochodne zawierają fotoprzełącznik diaryletenowy (DAE), który ulega odwracalnym transformacjom wywołanym światłem pomiędzy tzw. formą „otwartego pierścienia” generowaną przez światło czerwone a formą „zamkniętego pierścienia” generowaną przez promieniowanie UV (zilustrowano to na Rysunku 1 dla jednej z pochodnych, związku LMB002).
<img alt="Schemat reakcji fotochemicznej, formy LMB002 DAE, indukowane światłem UV i czerwonym, zmiana strukturalna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Fotokontrolowany peptyd cytotoksyczny LMB002 i jego fotoizomeryzacja. Fragment diaryletenu zaznaczono na czerwono. Skrót: DAE = diaryleten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Wyszukiwanie trafień oraz przeprowadzanie optymalizacji hit-to-lead często wymagają przesiewania odpowiednich bibliotek związków in vitro oraz in vivo9,10. W niniejszej pracy przedstawiamy metodologię odpowiednią do systematycznego wysokoprzepustowego badania cytotoksyczności związków sterowanych światłem. Określamy również efektywność fotoizomeryzacji, szacujemy dawkę światła w tkankach modelowych oraz oceniamy skuteczność in vivo najlepiej działających kandydatów. Podejście to jest zgodne z zasadami bioetyki i opieki nad zwierzętami.
W niniejszej pracy tradycyjne metody przedkliniczne zostały zmodyfikowane, aby zapobiec niekontrolowanej fotoizomeryzacji badanych związków. Ogólnym celem zastosowania tych zmodyfikowanych metod jest opracowanie ogólnej strategii, która jest prosta i szybka oraz dostarcza statystycznie istotnych danych, pozwalających na wiarygodne porównanie aktywności in vitro i uzasadnienie testowania skuteczności in vivo związków fotoprzełączalnych w celu identyfikacji wiodących struktur i ich dalszego rozwoju.
Strategia składa się z trzech kolejnych etapów. Pierwszy etap obejmuje wyznaczenie IC50 (pozorną 50% przeżywalność komórek) w rozcieńczeniach seryjnych dla aktywnych i nieaktywnych fotoform wybranych fotokontrolowanych związków biologicznie czynnych, z wykorzystaniem dwuwymiarowych (2D, monowarstwa) i trójwymiarowych (3D, sferoidy) kultur komórkowych oraz konfokalnej, wysokoprzepustowej zautomatyzowanej mikroskopii fluorescencyjnej. Okna fototerapeutyczne są porównywane pod kątem różnicy wartości IC50 między dwiema fotoformami, a następnie wybierane są najlepiej rokujące kandydaty. Zastosowanie zautomatyzowanej mikroskopii oraz innych platform przesiewowych cytotoksyczności (testów) nie daje specyficznej przewagi w ocenie toksyczności11; na tym etapie można by łatwo wdrożyć bardziej złożone komórkowe modele nowotworów12.
W przypadku związków wybranych w kroku 1, drugim etapem jest realistyczna ocena ich wydajności fotoprzełączania wewnątrz tkanek w zależności od głębokości od powierzchni napromieniowanej tkanki poprzez ilościowe określenie wydajności fotoprzełączania mniej aktywnych fotoform w substytucie tkanki z wykorzystaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z detekcją UV ekstraktów z napromieniowanych próbek. Wydajność fotoprzełączania mogłaby być badana in vivo, jednak proponujemy zastosowanie prostego substytutu tkanki – siekanego mięsa wieprzowego. Sprawdziliśmy zasadność tego podejścia. Zmierzyliśmy konwersję naszych związków fotoprzełączalnych in vivo na modelu raka u myszy i zaobserwowaliśmy zbliżoną fotokonwersję na głębokościach zmierzonych w poprzednich eksperymentach z myszami8. Można by użyć dowolnej odpowiedniej alternatywnej sztucznej tkanki13, tkanki/organu wydrukowanego biologicznie w 3D14, materiałów z biopsji lub innego zwolnionego z ograniczeń materiału zwierzęcego. Jednakże ten układ stanowi dobry kompromis, ponieważ jest ekonomiczny, szybki i etyczny.
Trzecim krokiem jest oznaczenie skuteczności przeciwnowotworowej in vivo w mysim modelu raka. Do tego eksperymentu wybiera się związki, które wykazały lepsze właściwości w badaniach in vitro oraz efektywnie przełączają się pod wpływem światła na głębokości co najmniej 1-1,5 cm w tkankach modelowych.
Niniejszy protokół można zastosować do związków posiadających różne rodzaje przełączników fotochemicznych, pod warunkiem, że ich fotoformy (lub ich stanu fotostacjonarnego, PSS) są stabilne przez odpowiednio długi czas (kilka dni lub dłużej). W celach ilustracyjnych wykorzystano wcześniej opisany LMB002 pochodny od DAE15. Fotoformy LMB002 są stabilne termicznie i mogą być przechowywane w temperaturze −20 °C przez co najmniej rok bez znaczącej degradacji. Do demonstracji in vitro oraz in vivo wybrano komórki raka płuc Lewisa (LLC), jednak nie wprowadzono żadnych ograniczeń co do typu komórek. Komórki LLC są adhezyjne, łatwo hodowane w 3D i wykorzystywane do generowania tumoroiderów (zgodnie z opisem w literaturze16). Komórki LLC in vivo są wykorzystywane do modelowania procesów przerzutowych i mogą łatwo tworzyć guzy lite u myszy z zachowaną odpornością immunologiczną po wstrzyknięciu podskórnym. Tę metodologię in vivo można uniwersalnie zastosować do innych modeli nowotworowych17,18. Szczegółowa implementacja tej strategii została opisana poniżej.

<table><tbody><tr><td>Kapilarny system LC serii Agilent 1100</td><td>ALSI-Chrom (dystrybutor Agilent)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>ATCC CRL-1642, LL/2 (LLC1) Linia komórkowa raka płuc</td><td>Lewisa ECACC</td><td>90020104</td><td></td></tr><tr><td>myszy C57BL/6NCrl, samice, wsobne</td><td>Charles River</td><td>Kod szczepu: 027</td><td></td></tr><tr><td>CelCulture, inkubator CO2</td><td>Esco Micro</td><td>CCL-170B</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Macierz błony podstawnej</td><td>Merck</td><td>CLS354234</td><td></td></tr><tr><td>Corning, 384-dołkowe mikropłytki sferoidalne</td><td>Merck</td><td>CLS3830</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Merck</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Gibco, DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21600044</td><td></td></tr><tr><td>Gramicidin S</td><td>Lumobiotyki</td><td></td><td>Niestandardowa synteza</td></tr><tr><td>Hyklon, DMEM/wysoka glukoza</td><td>Cytiva</td><td>SH30003.04</td><td></td></tr><tr><td>IN Cell Analyzer 6500HS, system obrazowania</td><td>Cytiva</td><td>29240358</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen, Calcein AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>Aparat do znieczulenia izofluranem</td><td>ASA</td><td>S/N ASA 1305</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina, roztwór 200 mM</td><td>Merck</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>LIKA-chirurg, laser</td> <td>do chirurgii diodowejFotonika</td><td></td> plus-LMB002 <td></td></tr><tr><td></td><td>Lumobiotics</td><td></td><td>Niestandardowa synteza</td></tr><tr><td>Penicyliny&ndash; Streptomycyna, stabilizowana roztworem</td><td>Merck</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>PhenoPlate, płytki 96-dołkowe</td><td>Fotometr PerkinElmer</td><td>6055302</td><td></td></tr><tr><td>Instrumenty PCE-LED 20</td><td>PCE PCE-LED 20</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific, Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific, Jodek propidyny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J66764-MC</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy, roztwór 0,4%</td><td>Merck</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna&ndash; EDTA, 10 x roztwór</td><td>Merck</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>UltraCruz Kolby do hodowli komórkowych z wentylowanymi nakrętkami, 75 cm2</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-200263</td><td></td></tr><tr><td>- UltraCruz, filtry butelkowe, PES, 0,22 &mu; m</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-360882</td><td></td></tr><tr><td>Vydac 218TP, C18 Kolumna HPLC (4,6 mm i razy; 250 mm, 5 &mikro; m)</td> <td>Altmann Analytik (dystrybutor Avantor)</td><td>GR5103827</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena in vitro i in vivo fotokontrolowanych związków biologicznie czynnych - potencjalni kandydaci na leki w fotofarmakologii nowotworów

In Vitro and In Vivo Evaluation of Photocontrolled Biologically Active Compounds - Potential Drug Candidates for Cancer Photopharmacology

Fotokontrolowane, biologicznie aktywne związki to wyłaniająca się klasa "inteligentnych" kandydatów na leki. Zapewniają one dodatkowe bezpieczeństwo w chemioterapii ogólnoustrojowej ze względu na ich precyzyjną aktywację czasoprzestrzenną poprzez skierowanie łagodnego, niejonizującego światła w określone miejsce w ciele pacjenta. W pracy przedstawiono zestaw metod oceny siły działania i skuteczności ex vivo fotoaktywacji fotokontrolowanych, biologicznie czynnych związków in vitro oraz skuteczności in vivo we wczesnych stadiach rozwoju leku. Metodologię tę stosuje się do przeciwnowotworowych peptydów cytotoksycznych, a mianowicie zawierających diaryleten analogów znanego antybiotyku, gramicydyny S. Eksperymenty przeprowadza się przy użyciu hodowli komórkowych 2D (komórki adherentne) i 3D (sferoidy) linii komórek nowotworowych (rak płuc Lewisa, LLC), żywych substytutów tkanek (mięso mielone wieprzowe) oraz modelu raka alloprzeszczepu (podskórna LLC) u myszy immunokompetentnych. Dobór najskuteczniejszych związków i oszacowanie realistycznych okien fototerapeutycznych odbywa się za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii fluorescencyjnej. Skuteczność fotoaktywacji przy różnych schematach oświetlenia jest określana na różnych głębokościach w tkance modelowej, a optymalna dawka światła jest stosowana w końcowym eksperymencie terapeutycznym in vivo.

W niniejszej pracy przeprowadzono eksperymenty komórkowe 2D i 3D w celu wyznaczenia wartości IC50 dla form „ring-closed” (zamknięty pierścień) i „ring-open” (otwarty pierścień) LMB002 (patrz Rycina 1) przy różnych czasach inkubacji. Wartości te porównano z wynikami uzyskanymi dla peptydu prototypowego, gramicydyny S (użytej jako kontrola pozytywna). Typowy zestaw obrazów inkubacji w hodowli LLC w 2D po barwieniu przedstawiono na Rycynie 5. Podwójne barwienie Hoechst 33342 (niebieski) i jodkiem propidyny (czerwony), skutkujące różnymi odcieniami fioletu w większej frakcji komórek w przypadku zastosowania formy „ring-open” w porównaniu do formy „ring-closed”, wskazuje na zauważalną różnicę w cytotoksyczności między dwiema formami, którą można łatwo ilościowo określić. Przedstawiony przykład udanego eksperymentu oparto na danych zebranych przy użyciu płytek 96-dołkowych, do których dodano warianty peptydów w różnych stężeniach, jak pokazano na Rycynie 2. Podobne dane można uzyskać za pomocą płytek 384-dołkowych i płytek o wysokiej gęstości. Jednak ze względu na mniejsze objętości w każdym dołku, błędy techniczne i systematyczne, a w konsekwencji dokładność wyznaczania IC50, będą maleć wraz ze wzrostem gęstości dołków.
<img alt="Wyniki testu żywotności komórek, mikroskopia fluorescencyjna, działanie LMB002 i Gramicydyny S w czasie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Reprezentatywne obrazy z testu cytotoksyczności w monowarstwie LLC. Komórki barwiono Hoechst 33342 (niebieski) oraz jodkiem propidyniowym (czerwony). Wskazane czasy: 10 min, 60 min, 24 h i 72 h to czasy inkubacji z związkami. Paski skali = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Fotokonwersję LMB002 pod wpływem naświetlania laserowego w tkance modelowej – świeżym mielonym mięsie wieprzowym – określono przy użyciu próbki składającej się z mielonego mięsa zmieszanego z LMB002 w formie „zamkniętego pierścienia” (nieaktywnej) rozpuszczonej w PBS, a następnie mierząc konwersję tej nieaktywnej formy w formę „otwartego pierścienia” (aktywną) LMB002 w kierunku propagacji promieniowania. Próbkę umieszczono w strzykawce i naświetlono z jednej strony płaską wiązką promieniowania laserowego przez czas ekspozycji wynoszący ~10 min (zazwyczaj stosowany w eksperymentach in vivo ), jak pokazano na Rycine 3. Po ekspozycji walec z próbką podzielono na części, naciskając tłok strzykawki i wycinając plasterki o tej samej wysokości za pomocą skalpela. Stężenie LMB002 w formie „otwartego pierścienia” w ekstraktach z plasterków oznaczono metodą RP HPLC.
Rysunek 6 przedstawia krzywe dawka-efekt Rysunek 6A-D uzyskane z analizy danych. Aby określić procent martwych komórek z jednoczesnym barwieniem jąder barwnikami Hoechst 33342 i PI, zastosowano wbudowane narzędzie klasyfikujące, które ustawia progi numeryczne dla wybranych mierzonych parametrów w celu podzielenia wszystkich zliczeń komórek na kilka kategorii. Na przykład, gdy sygnał w kanale czerwonym (jodek propidyny) w kontroli znajdował się na poziomie progu (około 110-130 jednostek), komórki mogły zostać zaklasyfikowane jako PI-dodatnie, uznane za martwe, lub PI-ujemne, uznane za niepodatne na działanie związków. W przypadku LMB002 widoczne są sigmoidalne zależności procentu komórek dodatnich pod względem jodku propidyny od stężenia związku. Na podstawie tych danych można wyznaczyć wartości IC50.
<img alt="Analiza żywotności komórek, krzywe dawka-odpowiedź, wykres, związki LMB002, komórki PI-dodatnie, stężenie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Analiza cytotoksyczności w hodowli 2D. Dopasowania sigmoidalne otrzymane dla hodowli LLC w przedziałach czasowych inkubacji ze związkami wynoszących (A) 10 min, (B) 60 min, (C) 24 h oraz (D) 72 h. Dopasowanie pozwala na dokładne wyznaczenie wartości IC50 (nie pokazano). Słupki błędów oznaczają SEM. Skróty: LLC = rak płuca Lewisa; PI = jodek propidyny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Biorąc pod uwagę uzyskane wartości IC50, można wywnioskować, że toksyczność wszystkich trzech związków wzrastała wraz z czasem inkubacji. Nasz eksperyment wykazał, że forma „otwartego pierścienia” LMB002 jest mniej toksyczna o około jeden stopień rozcieńczenia niż peptyd prototypowy, gramicydyna S. Natomiast forma „zamkniętego pierścienia” wykazuje toksyczność niższą o trzy do czterech stopni rozcieńczenia, co zwiększa się wraz z czasem inkubacji. Różnica między tymi dwoma stopniami rozcieńczenia nie jest zależna od wydłużenia czasu inkubacji i może być stosowana numerycznie jako eksperymentalnie wyznaczone okno fototerapeutyczne6 do porównania z innymi związkami w potencjalnym skriningu biblioteki. Wartość IC50 dla gramicydyny S została przyjęta jako punkt odniesienia w celu korekty błędów eksperymentalnych lub zróżnicowanych wyników w biologicznych powtórzeniach.
Eksperymenty na komórkach 3D dostarczyły tego samego rodzaju surowych danych – obrazów sferoidów z rozdzielczością pojedynczych komórek, z jednym obrazem na każdą studzienkę. Zastosowanie kalceiny jako trzeciego barwnika umożliwia ilościowe oznaczenie frakcji komórek metabolicznie aktywnych (obserwowanych w kanale zielonym). Dzięki zastosowaniu płytek 384-dołkowych, zwiększeniu liczby powtórzeń technicznych, wykluczeniu nadmiarowych punktów czasowych wspólnej inkubacji oraz zmianie stopnia rozcieńczenia, byliśmy w stanie bezpośrednio porównać kilka związków w ramach jednego przebiegu testowego (przy użyciu jednej płytki), co zilustrowano na mapie płytki na Rysunku 7.
<img alt="Wykres testu żywotności komórek w zależności od czasu; stężenia leków, od 10 min do 72 h, dane oznaczone kolorami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Mapa płytki dla eksperymentu z hodowlą 3D z wykorzystaniem dwóch związków. Podano kody kolorystyczne dla związków oraz kontroli. Liczby w dołkach oznaczają stężenia w µM. 10 min, 24 h oraz 72 h to czasy inkubacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig07large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
Rycina 8 przedstawia obrazy wybranych powtórzeń technicznych sferoidów LLC hodowanych w gęstości 1 sferoidu/studzienkę w obecności testowanych związków oraz sferoidów kontrolnych zarejestrowane po barwieniu.
<img alt="Analiza immunofluorescencyjna; odpowiedź komórkowa na LMB002 i gramicydynę S; poklatkowe obrazy mikroskopowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8: Reprezentatywne obrazy z analizy cytotoksyczności w kulturze 3D. Obrazy przedstawiają 48-godzinne sferoidy LLC barwione Hoechst 33342 (niebieski), calceiną AM (zielony) i jodkiem propidyny (czerwony) po 10 min, 24 h i 72 h wspólnej inkubacji z fotoformami LMB002 oraz gramicydyną S. Paski skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Przy użyciu oprogramowania instrumentu uzyskano krzywe dawka-efekt, analogiczne do tych z eksperymentu 2D, na podstawie stosów obrazów z serii z-stack (Rysunek 9A). Dodatkowo, zwarte i nienaruszone sferoidy w hodowlach 3D można było scharakteryzować za pomocą średnicy całego sferoidu (Rysunek 9B). Zauważono również, że całkowita średnica sferoidów zmienia się w zależności od stężenia związku.
<img alt="Wykresy żywotności komórek i wielkości sferoidów w zależności od stężenia; test PI; analiza danych time-lapse." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig09.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 9"> 
Rysunek 9: Ocena cytotoksyczności w hodowlach 3D. (A) Krzywe dopasowania cytotoksyczności zależnej od stężenia oraz (B) wykresy średnicy sferoidów zależnej od stężenia, uzyskane w hodowlach 3D LLC inkubowanych wspólnie z gramicydyną S przez 10 min, 24 h i 72 h i zarejestrowane przed barwieniem. Słupki błędów oznaczają SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig09large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Eksperyment z Kroku 2 umożliwia oznaczenie stężeń LMB002 dla obu fotoform z wykorzystaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detekcją UV. Wydajność fotokonwersji w tkankach modelowych została łatwo oceniona i ilościowo określona przy użyciu tego układu (Rysunek 3). Dane uzyskano z analizy ilościowej chromatogramów ekstraktów z próbek. W tych eksperymentach testowych chromatogramy LMB002 wykrywano spektroskopowo przy 270 nm i 570 nm. Przy 270 nm zaobserwowano wiele dodatkowych sygnałów, które przypisano związkom współekstrahowanym z tkanki modelowej (zweryfikowano na podstawie ekstraktu kontrolnego bez związku). Obie fotoformy różniły się znacząco czasami retencji i absorbancją. Jednakże sygnał formy „otwartej” LMB002 był oddzielony od sygnałów tła do linii bazowej (patrz reprezentatywny chromatogram na Rysunku 10A). W związku z tym sygnał ten można bez problemu zintegrować. Przy 570 nm chromatogramy zawierały jedynie sygnał formy „zamkniętej” LMB002 (Rysunek 10B). Tutaj wykonaliśmy oznaczenie stężenia za pomocą RP HPLC. Niemniej jednak, stosując LC/MS jako metodę analityczną, można uzyskać jeszcze wyższą dokładność i niższe granice detekcji.
<img alt="Wyniki chromatografii; wykresy widm UV-VIS pokazujące piki rozdzielenia związków w funkcji czasu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig10.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 10"> 
Rycina 10: Reprezentatywne chromatogramy LMB002 wyekstrahowanego z tkanek modelowych. (A) Próbka w odległości 2 mm od naświetlonej powierzchni, rejestrowana przy 270 nm (obliczony całkowy obszar piku dla formy „otwartej” LMB002); (B) próbka w odległości 38 mm od naświetlonej powierzchni, rejestrowana przy 570 nm (obliczony całkowy obszar piku dla formy „zamkniętej” LMB002). Wartości czasu retencji (podane na wykresach) dodatkowo potwierdziły tożsamość związku. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig10large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Dane uzyskane po zintegrowaniu odpowiednich sygnałów ze wszystkich zebranych próbek wykorzystano do sporządzenia wykresów zależności stężenia od głębokości, przedstawionych na Rysunku 11. Na podstawie tych wykresów łatwo oceniono wydajność fotokonwersji na różnych głębokościach tkanki modelowej. Potwierdza to, że nasze źródło czerwonego światła indukuje fotokonwersję LMB002 do formy „zamkniętego pierścienia” na głębokości do 1 c w substytucie tkanki, jakim jest mielone mięso (przy mocy około 103 mW/cm2).
<img alt="Wykres stężenia substancji aktywowanych i nieaktywowanych A (mg/kg) w funkcji odległości L (mm)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig11.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 11"> 
Rycina 11: Ocena wydajności fotokonwersji. Stężenie (A, mg/kg) form „zamkniętego pierścienia” (nieaktywowana, niebieskie kropki) oraz „otwartego pierścienia” (aktywowana, pomarańczowe kropki) LMB002 w różnych odległościach od naświetlonej powierzchni modelowej tkanki (L, mm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig11large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Wyniki eksperymentu in vivo – krok 3 naszej metodologii, przeprowadzonego zgodnie z harmonogramem przedstawionym na Rysunku 4 – przedstawiono na wykresach obrazujących wzrost guza w funkcji czasu (Rysunek 12) oraz krzywych przeżycia Kaplana-Meiera (Rysunek 13).
<img alt="Wykres wzrostu guza; porównanie grup naświetlanych z placebo i LMB002 w ciągu 20 dni; objętość względem czasu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig12.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 12"> 
Rycina 12: Dynamika wzrostu guza u zwierząt. Zwierzęta leczone LMB002 w porównaniu do zwierząt leczonych placebo (podskórny model allograftu LLC u myszy C57BL/6NCrl, dawka związku 7 mg/kg, IV, inkubacja przez 2 h 40 min, następnie naświetlanie przy 650 nm, 100 mW/cm2, 20 min). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig12large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres przeżywalności Kaplana-Meiera; grupa kontrolna (vehicle) naświetlona vs. leczenie LMB002, dni po zastosowaniu leczenia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64902/64902fig13.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 13"> 
Rysunek 13: Krzywe śmiertelności zwierząt. Zwierzęta leczone LMB002 w porównaniu do zwierząt leczonych placebo (model allograftu LLC podskórnego u myszy C57BL/6NCrl, dawka związku 7 mg/kg, IV, inkubacja przez 2 h 40 min, następnie naświetlanie falą o długości 650 nm, 100 mW/cm2, 20 min). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64902/64902fig13large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół przedstawia zestaw eksperymentów przyjętych do oceny fotoprzełączalnych peptydów przeciwnowotworowych, które mogą być użyte w przedklinicznych badaniach przesiewowych takich związków. Obejmuje to ocenę cytotoksyczności w hodowlach komórkowych 2D i 3D, ocenę skuteczności fotoizomeryzacji ex vivo (tkanki modelowej) oraz skuteczności in vivo.

Ocena in vitro i in vivo fotokontrolowanych związków biologicznie czynnych - potencjalni kandydaci na leki w fotofarmakologii nowotworów

Photocontrolled, biologically active compounds are an emerging class of &#34;smart&#34; drug candidates. They provide additional safety in systemic ...

Fotokontrolowane, biologicznie aktywne związki zawierają odwracalnie fotoizomeryzowane fragmenty, fotoprzełączniki w swoich cząsteczkach. Związki są cyklicznymi peptydami modyfikowanymi przez fragment diarylantenu, który ulega odwracalnym przemianom elektrocyklicznym wywołanym światłem. Mogą fotoprzełączać, to znaczy przełączać się między generowaną przez promieniowanie UV, biologicznie nieaktywną formą a generowaną przez czerwone światło, biologicznie aktywną formą.Uważa się, że leki fotoprzełączalne są bezpieczniejsze niż leki niefotoprzełączalne. Dzieje się tak dlatego, że możesz podać nietoksyczną, dezaktywowaną formę do ludzkiego ciała i miejscowo aktywować ją światłem tylko tam, gdzie jest to potrzebne, czyli na przykład w guzach, świdrach lub ranach. Nie ma standardowych metod ani protokołów dla przedklinicznego lub klinicznego rozwoju takich leków fotofarmakologicznych, dlatego tutaj chcemy pokazać Państwu eksperymenty, które można wykorzystać do tych wczesnych badań przedklinicznych.Kateryna Horbatok i Tetiana Makhnii zademonstrują procedury. Opieka nad zwierzętami i procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komisję Bioetyczną firmy Bienta. Rozpocznij od przygotowania przy użyciu standardowych procedur.Alternatywnie można skorzystać z dostępnych na rynku rozwiązań. Przygotować roztwory podstawowe związków. Dla każdego związku należy zważyć dwie partie po 5,12 miligrama związku w fotoformie z zamkniętym pierścieniem do dwóch 1,5-mililitrowych probówek Eppendorfa, jednej z przezroczystymi, a drugą z czarnymi, nieprzezroczystymi ściankami.Jako kontrolę pozytywną należy zważyć 2,28 miligrama peptydu macierzystego, nie kontrolowanego foto, w dodatkowej probówce. Dodaj 100 mikrolitrów czystego DMSO do każdej próbki i wiruj przez 30 sekund. Fotoizomeryzuj roztwór podstawowy w probówce o przezroczystych ściankach, napromieniowując roztwór laserem 650 nanometrów, gęstość mocy światła 6 watów na centymetr kwadratowy, z wirowaniem w celu zapewnienia mieszania.Kontynuuj, aż kolor zmieni się z ciemnofioletowego na jasnobrązowy. Chronić przed światłem folią aluminiową. Zasiej od 5 000 do 10 000 komórek na dołek.Użyliśmy około 8 000 komórek raka płuc Lewisa w 200 mikrolitrach DMEM w centralnych 60 dołkach 96-dołkowej sterylnej płytki z przezroczystym dnem i czarnymi, nieprzezroczystymi ściankami. Napełnij pozostałe 36 dołków czystym DMEM. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5% CO2 przez noc.Następnego dnia przygotować seryjne rozcieńczenia związków i kontrolę pozytywną na przezroczystych płytkach autoklawizowanych w autoklawie polipropylenowym. Zacznij od zapasów w DMSO i rozcieńcz DMEM, ale nie przekraczaj 1% objętości DMSO w końcowym najwyższym stężeniu. Aby zapobiec niekontrolowanej fotoizomeryzacji badanych związków, należy wyłączyć światła w sterylnej szafce.Przenieść 100 mikrolitrów rozcieńczeń do 56 dołków ze 100 mikrolitrami wcześniej dodanego DMEM, aby osiągnąć wymagane końcowe stężenie związków w studzienkach, zwykle w zakresie od pięciu do 150 mikromolowych. Następnie dodaj 100 mikrolitrów DMEM do czterech studzienek, które służą jako kontrola ujemna. Przykryj płyty folią aluminiową lub plastikową, nieprzezroczystą osłoną, aby zapobiec niekontrolowanemu przełączaniu zdjęć.Umieść płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza na wybrany czas inkubacji. Po inkubacji dodać do płytek 50 mikrolitrów roztworu barwiącego na studzienkę. Użyj pięciomikromolowego jodku Hoechst 33342 i jednomikromolowego jodku propidyny jako końcowych roztworów barwiących w tym eksperymencie.Ponownie inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Wykonaj automatyczne obrazowanie fluorescencyjne za pomocą soczewki obiektywowej o 20-krotnym powiększeniu. Czynności laboratoryjne dla tej części metody są identyczne z opisanymi dla eksperymentu 2D: przygotowanie hodowli komórkowej, inkubacja z badanymi związkami i obrazowanie.Jednak w tym przypadku komórki są przygotowywane jako zwarte, dojrzałe sferoidy w 384-dołkowej płytce dolnej w kształcie litery U o bardzo niskiej przyczepności z czarnymi, nieprzezroczystymi ściankami. Użycie płytki tej wielkości pozwala na porównanie dwóch związków w jednym eksperymencie. W tym eksperymencie użyliśmy dodatkowo kalceiny AM jako trzeciego składnika wielokolorowego roztworu barwiącego.Obrazy uzyskane zarówno w eksperymentach 2D, jak i 3D są analizowane za pomocą oprogramowania do automatycznej analizy obrazu. Komórki barwione barwnikami Hoechst i jodkiem propidium uważa się za nekrotycznie martwe, a ich frakcja w funkcji stężenia służy do obliczenia wartości IC50. Zmontować pociąg optyczny do napromieniania próbki.Składa się z optycznego z laserowego źródła światła, soczewki o zmiennej ogniskowej, strzykawki z nieprzezroczystą osłoną i płaskiego ściętego końca. Wszystkie kolejne operacje muszą być wykonywane w zaciemnionym pomieszczeniu przy minimalnym oświetleniu miejsca pracy. Przygotować modelową próbkę tkanki wypełnioną nieaktywnymi związkami fotoformalnymi.W typowym przebiegu pięć gramów świeżego mielonego mięsa wieprzowego jest mechanicznie mieszane z roztworem PBS związku, aby osiągnąć końcowe stężenie 50 miligramów na kilogram. Napełnić strzykawkę załadowaną próbką. Napromienić próbkę w pociągu optycznym przez wymagany czas ekspozycji i dawkowania światła.Po ekspozycji należy wykonać plastry próbki o grubości czterech milimetrów, odpychając masę od strzykawki za pomocą tłoka i przecinając ją skalpelem. Zważyć i wyekstrahować związek za pomocą mieszaniny acetonitrylu, wody, TFA, 70% acetonitrylu i 01% kwasu trifluorooctowego w 1,5-mililitrowej probówce Eppendorfa. Wirować przy 20XG przez 30 minut dwa razy, aby usunąć nierozpuszczalny materiał i zebrać supernatant.Rejestruj chromatogramy z detekcją UV przy 570-nanometrowej detekcji ich zamkniętej formy i 270-nanometrowej detekcji formy otwartej. Nienapromienione i napromieniowane próbki kontrolne przygotowane podobnie do roztworów podstawowych w doświadczeniach z komórkami należy wykorzystać do określenia określonych czasów retencji i skalibrowania metody. Powtórz eksperyment trzy razy i nanieś znormalizowany procent każdej fotoformy na wykresie, procent w funkcji odległości od napromieniowanej powierzchni tkanki.W dniu zerowym zaszczepić podskórnie dorosłe samice 6 czarnych myszy C57 o wadze około 20 gramów każda zawiesiną około pół miliona komórek raka płuc Lewisa w około 100 mikrolitrach mieszanki DMEM i Matrigel w prawej tylnej nodze. Procedura ta jest wykonywana w 5% sedacji izofluranem. Zwierzęta są gotowe do leczenia w dniach od piątego do ósmego, kiedy guzy są wyczuwalne palpacyjnie.Wszystkie operacje związane z badaniem powinny być wykonywane w półmroku. Warunek ten występuje również w przypadku leczenia zwierząt po otrzymaniu dawki złożonej przez okres dwóch dni. Zbierz losowo cztery grupy po osiem zwierząt i usuń futro z obszaru guza.Dwie grupy kontrolne otrzymują dożylne wstrzyknięcie nośnika. 100 mikrolitrów soli fizjologicznej na 20 gramowe zwierzę, a zwierzęta w dwóch grupach eksperymentalnych otrzymały badany związek w nieaktywnej fotoformie w roztworze jednego miligrama na mililitr soli fizjologicznej. Podaj bolus złożony do żyły ogonowej w ilości pięciu mililitrów na kilogram.Dwie godziny, 45 minut po wstrzyknięciu związku, naświetlać obszar guza przez 20 minut w znieczuleniu izofluranowym laserem o długości 650 nanometrów, używając gęstości mocy światła 100 miliwatów na centymetr kwadratowy. Uważnie obserwuj warunki zwierząt przez następne 30 minut. Obserwuj zwierzęta codziennie i mierz ich wagę oraz wymiary ich guzów.Zmierz objętość guza i zwróć uwagę na postęp martwicy. Określić wskaźnik przeżycia przy użyciu standardowej procedury. Wyniki naszego protokołu dla kroku pierwszego w przypadku eksperymentów z hodowlą komórkową 2D można przedstawić w postaci obrazów, jak pokazano tutaj na reprezentatywnym obrazie dla komórek raka płuc Lewisa inkubowanych z LMB002 w różnych stężeniach i dla różnych okresów inkubacji.Barwienie za pomocą Hoechst i jodku propidyny pozwala na wizualizację jąder komórkowych w kanale niebieskim, uzyskując w ten sposób całkowitą liczbę komórek. Komórki z naruszoną integralnością błony plazmatycznej obserwowano w kanale czerwonym. Zakładając, że te ostatnie są nekrotycznie martwe, pozorną cytotoksyczność badanego związku można określić ilościowo jako procent komórek dodatnich pod względem jodku propidyny.Wyniki kwantyfikacji danych uzyskane za pomocą automatycznej analizy obrazu przedstawiono tutaj. W przypadku LMB002 można zaobserwować sigmoidalne zależności procentu komórek dodatnich w jodku propidyny w stężeniu związku. Na podstawie tych danych można określić wartości IC50.Nasz eksperyment wykazał, że otwarta forma LMB002 jest o około jeden stopień rozcieńczenia mniej toksyczna niż prototypowy peptyd, Gramicidin S, podczas gdy forma zamknięta wykazuje o trzy do czterech stopni rozcieńczenia niższą toksyczność, która wzrasta wraz z czasem inkubacji. Eksperymenty z komórkami 3D przyniosły ten sam rodzaj surowych danych, obrazy sferoidalne z pojedynczą komórką w rozdzielczości jednej na ścianę. Włączenie kalceiny jako trzeciego barwnika barwiącego umożliwia ilościowe określenie frakcji metabolicznie aktywnych komórek obserwowanych w zielonym kanale.Krzywe efektu dawki, podobnie jak te w eksperymencie 2D, uzyskano ze stosów obrazów ze stosu Z. Panel A ilustruje takie krzywe, potwierdzając wyniki 2D. Jak pokazano na panelu B, całkowita średnica sferoidy zmienia się w zależności od stężenia związku.Eksperyment dla kroku drugiego pozwala na określenie stężeń LMB002 w obu fotoformach za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej wykrywanej przez promieniowanie UV. Obie fotoformy różniły się wystarczająco pod względem czasów retencji i absorbancji, pokazanych zintegrowanych na panelach A i B rysunku. Uzyskane dane podsumowano na rysunku, potwierdzając, że nasze źródło światła czerwonego indukuje fotokonwersję LMB002 z zamkniętym pierścieniem na głębokości do jednego centymetra w surogatce tkanki, mięsie mielonym o mocy około 103 miliwatów na centymetr kwadratowy.Wyniki eksperymentu in vivo, trzeciego kroku naszej metodologii, zostały przedstawione za pomocą wykresów przedstawiających wzrost guza w funkcji czasu w krzywych przeżycia Kaplana-Meiera. Przedstawiona tutaj strategia oceny kandydatów na leki fotoprzełączalne jest praktyczna i odpowiednia dla związków z fotoprzełącznikami typu diaryleten. Krok pierwszy, kwantyfikacja cytotoksyczności może być wykorzystana do wstępnego badania przesiewowego bibliotek związków kontrolowanych przez światło.Krok drugi, ocena wydajności fotoprzełączania jest zarówno łatwa w konfiguracji, jak i etyczna. Nie wymaga żywych zwierząt. Krok trzeci, modele fotofarmakologiczne in vivo, terapia może być stosowana u małych zwierząt.

in-vitro-vivo-evaluation-photocontrolled-biologically-active

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

W niniejszej pracy opisujemy metody konstruowania, wizualizacji i kwantyfikacji reakcji bioluminescencyjnych enzymów lucyferazy świetlikowej oraz renilla, wykazujących ekspresję w komórkach przerzutowego raka piersi podczas ich wzrostu i przerzutowania in vivo.

In vivo dwusubstratowe obrazowanie bioluminescencyjne

Terapia fotodynamiczna (PDT) jest nieinwazyjną i niechirurgiczną metodą leczenia raka płuc. Fotouczulacze selektywnie kumulują się w tkance nowotworowej i prowadzą do śmierci komórek nowotworowych w obecności tlenu i odpowiedniej długości fali światła. Ten film opisuje analizę skuteczności przeciwnowotworowej in vivo przy użyciu fotouczulacza zawierającego nanocząstki u myszy z nowotworem, w celu określenia potencjału fototoksycznego fotouczulacza.

Analiza skuteczności przeciwnowotworowej PDT in vivo: technika określania potencjału fototoksycznego fotouczulacza u myszy z nowotworem

Opisujemy metodę obrazowania odpowiedzi na leczenie przeciwnowotworowe in vivo i w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Obrazowanie na żywo odpowiedzi na leki w mikrośrodowisku guza w mysich modelach raka piersi

Opisany tutaj protokół pozwala na ocenę skuteczności terapii fotodynamicznej (PDT) w liniach komórkowych i optymalizację ustawień PDT przed zastosowaniem terapii na modelach zwierzęcych.

Cytotoksyczna skuteczność terapii fotodynamicznej w komórkach kostniakomięsaka in vitro

Tutaj, monitorowanie metabolizmu komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym, w połączeniu z modelem przerzutów in vivo błony kosmówkowo-omocznikowej (CAM) zarodka kurczaka, są wykorzystywane do oceny nowych celów/środków przeciwnowotworowych pod kątem ich zdolności do uwrażliwiania komórek nowotworowych na chemoterapeutyki uszkadzające DNA.

Ocena skuteczności uczulenia na leki przeciwnowotworowe in vitro i in vivo

Terapia fotodynamiczna (PDT) to procedura medyczna, która polega na inkubacji egzogennie zastosowanego fotouczulacza (PS), a następnie fotoaktywacji światłem widzialnym w celu wywołania apoptozy. Przedstawiamy protokół PDT in vitro przeznaczony do symulacji PDT, który może być wykorzystany do badania różnic w inkubacji PS i parametrach leczenia światłem.

Podejście in vitro do terapii fotodynamicznej

Tutaj opisujemy nowatorskie, proste i tanie urządzenie do skutecznego przeprowadzania testów terapii fotodynamicznej in vitro (PDT) przy użyciu dwuwymiarowej hodowli komórek HeLa i werteporfiny jako fotosensybilizatora.

Zbudowane przez nas urządzenie do terapii fotodynamicznej oparte na diodach elektroluminescencyjnych do zwiększania cytotoksyczności werteporfiny w modelu hodowli komórkowej 2D

Protokół tutaj opisuje szczegółowe kroki do przeprowadzenia badań skuteczności leków w bioluminescencyjnym modelu zakażenia Trypanosoma cruzi, z naciskiem na pozyskiwanie, analizę i interpretację danych. Dostępne są również procedury rozwiązywania problemów i kontroli jakości w celu zminimalizowania problemów technicznych.

Demistyczne obrazowanie bioluminescencyjne in vivo mysiego modelu choroby Chagasa do badań skuteczności leków

Ten protokół opisuje prostą i ekonomiczną metodę oceny skuteczności potencjalnych fotosensybilizatorów w antybakteryjnej inaktywacji fotodynamicznej (aPDI), przy użyciu formatu 96-dołkowej płytki w połączeniu ze źródłem światła na panelu LED. Takie podejście umożliwia jednoczesne testowanie wielu warunków eksperymentalnych, w tym różnych stężeń, związków i szczepów bakterii.

Badania przesiewowe in vitro oparte na diodach LED do oceny fotoaktywowanych cząsteczek w inaktywacji fotodynamicznej bakterii

Manuskrypt ten przedstawia nowatorskie, innowacyjne urządzenie oświetleniowe wydrukowane w 3D do badania terapii fotodynamicznej za pośrednictwem Rose Bengal in vitro.

Opracowanie innowacyjnego urządzenia oświetleniowego opartego na diodach LED do zastosowania terapii fotodynamicznej in vitro z użyciem róży bengalskiej

Poznaj metody oceny fotoprzełączalnych peptydów przeciwnowotworowych in vitro i in vivo. Protokoły obejmują badania cytotoksyczności w kulturach 2D i 3D oraz ocenę efektywności fotoizomeryzacji.

Ocena in vitro i in vivo fotokontrolowanych związków biologicznie czynnych - potencjalni kandydaci na leki w fotofarmakologii nowotworów (Wideo) | JoVE Journal

Ocena in vitro i in vivo fotokontrolowanych związków biologicznie czynnych - potencjalni kandydaci na leki w fotofarmakologii nowotworów

Przeglądaj więcej filmów