Name: Preparat wektora lentiwirusowego do skutecznej modulacji genów i mikroRNA makrofagów rezydujących w tkankach jamy otrzewnej in vivo u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Poznaj metodę przygotowania wektorów lentiwirusowych do modulacji genów makrofagów rezydujących w tkankach jamy otrzewnej u myszy. Technika ta umożliwia stabilną integrację transgenów i badanie immunometabolizmu in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane, w całości lub w części, przez Wellcome Trust Investigator Award [107964/Z/15/Z]. PRT jest również wspierany przez brytyjski Instytut Badań nad Demencją. Magister nauk biologicznych jest wspierany przez Radę ds. Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych Discovery Fellowship (BB/T009543/1). Dla celów otwartego dostępu autor zastosował publiczną licencję praw autorskich CC BY do każdej wersji manuskryptu zaakceptowanej przez autora powstałej w wyniku tego zgłoszenia. L.C.D jest wykładowcą na Uniwersytecie w Swansea i honorowym pracownikiem naukowym Uniwersytetu w Cardiff. Praca ta jest wspierana przez prace przeprowadzone przez Ipseiz et al. 202018.

Lentiviral Vector Preparation for In Vivo Gene Modulation 

<ol><li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+biology+in+development%2C+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li>
<li>Jantsch, J., Binger, K. J., Muller, D. N., Titze, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+homeostatic+immune+function%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Macrophages in homeostatic immune function.</a> Front Physiol. 5, 146(2014).</li>
<li>Wynn, T. A., Vannella, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+tissue+repair%2C+regeneration%2C+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophages in tissue repair, regeneration, and fibrosis.</a> Immunity. 44 (3), 450-462 (2016).</li>
<li>Ginhoux, F., Guilliams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophage+ontogeny+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis.</a> Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).</li>
<li>Epelman, S., Lavine, K. J., Randolph, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+functions+of+tissue+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Origin and functions of tissue macrophages.</a> Immunity. 41 (1), 21-35 (2014).</li>
<li>Amit, I., Winter, D. R., Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+local+environment+and+epigenetics+in+shaping+macrophage+identity+and+their+effect+on+tissue+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of the local environment and epigenetics in shaping macrophage identity and their effect on tissue homeostasis.</a> Nat Immunol. 17 (1), 18-25 (2016).</li>
<li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environment+drives+selection+and+function+of+enhancers+controlling+tissue-specific+macrophage+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Environment drives selection and function of enhancers controlling tissue-specific macrophage identities.</a> Cell. 159 (6), 1327-1340 (2014).</li>
<li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophage+enhancer+landscapes+are+shaped+by+the+local+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment.</a> Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).</li>
<li>Davies, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peritoneal+tissue-resident+macrophages+are+metabolically+poised+to+engage+microbes+using+tissue-niche+fuels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Peritoneal tissue-resident macrophages are metabolically poised to engage microbes using tissue-niche fuels.</a> Nat Commun. 8 (1), 2047(2017).</li>
<li>Shi, J., Hua, L., Harmer, D., Li, P., Ren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+driver+mice+targeting+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cre driver mice targeting macrophages.</a> Methods Mol Biol. 1784, 263-275 (2018).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+lentiviral+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+China+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Recent advances in lentiviral vectors for gene therapy.</a> Sci China Life Sci. 64 (11), 1842-1857 (2021).</li>
<li>Kosaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus-based+gene+delivery+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Artif+Organs%22%5BJournal%5D)">Lentivirus-based gene delivery in mouse embryonic stem cells.</a> Artif Organs. 28 (3), 271-277 (2004).</li>
<li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272 (5259), 263-267 (1996).</li>
<li>Yamashita, M., Emerman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsid+is+a+dominant+determinant+of+retrovirus+infectivity+in+nondividing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Capsid is a dominant determinant of retrovirus infectivity in nondividing cells.</a> J Virol. 78 (11), 5670-5678 (2004).</li>
<li>Wilson, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+delivery+of+RNAi+for+in+vivo+lineage-specific+modulation+of+gene+expression+in+mouse+lung+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Lentiviral delivery of RNAi for in vivo lineage-specific modulation of gene expression in mouse lung macrophages.</a> Mol Ther. 21 (4), 825-833 (2013).</li>
<li>Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+stomatitis+virus+G+glycoprotein+pseudotyped+retroviral+vectors%3A+concentration+to+very+high+titer+and+efficient+gene+transfer+into+mammalian+and+nonmammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).</li>
<li>Finkelshtein, D., Werman, A., Novick, D., Barak, S., Rubinstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LDL+receptor+and+its+family+members+serve+as+the+cellular+receptors+for+vesicular+stomatitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">LDL receptor and its family members serve as the cellular receptors for vesicular stomatitis virus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (18), 7306-7311 (2013).</li>
<li>Ipseiz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+in+vivo+gene+modification+in+mouse+tissue-resident+peritoneal+macrophages+by+intraperitoneal+delivery+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Effective in vivo gene modification in mouse tissue-resident peritoneal macrophages by intraperitoneal delivery of lentiviral vectors.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 21-31 (2020).</li>
<li>Rosas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Gata6+links+tissue+macrophage+phenotype+and+proliferative+renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal.</a> Science. 344 (6184), 645-648 (2014).</li>
<li>BeckmanCoulter. , https://www.mybeckman.uk/resources/technologies/centrifugation/principles/rotor-balancing (2023).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Rodent+Handling+and+Restraint+Techniques%22">Rodent Handling and Restraint Techniques</a>. , JoVE, Cambridge, MA. (2023).</li>
<li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nat Biotechnol. 15 (9), 871-875 (1997).</li>
<li>Nasri, M., Karimi, A., Allahbakhshian Farsani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+purification+and+titration+of+a+lentivirus-based+vector+for+gene+delivery+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Production, purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes.</a> Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).</li>
<li>Optimized production and concentration of lentiviral vectors containing large inserts. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22J+Gene+Med%22">J Gene Med</a>. al Yacoub, N., Romanowska, M., Haritonova, N., Foerster, J. 9 (7), 579-584 (2007).</li>
<li>Malim, M. H., Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+restriction+factors+and+mechanisms+of+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">HIV restriction factors and mechanisms of evasion.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006940(2012).</li>
<li>Sonza, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+of+human+monocytes+to+HIV+type+1+infection+in+vitro+is+not+dependent+on+their+level+of+CD4+expression%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res+Hum+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Susceptibility of human monocytes to HIV type 1 infection in vitro is not dependent on their level of CD4 expression.</a> AIDS Res Hum Retroviruses. 11 (7), 769-776 (1995).</li>
<li>Kingston, R. E., Chen, C. A., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+phosphate+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium phosphate transfection.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 9, Unit 9.1(2003).</li>
<li>Brown, L. Y., Dong, W., Kantor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Improved+protocol+for+the+production+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">An Improved protocol for the production of lentiviral vectors.</a> STAR Protoc. 1 (3), 100152(2020).</li>
<li>Moce-Llivina, L., Jofre, J., Muniesa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+polyvinylidene+fluoride+and+polyether+sulfone+membranes+in+filtering+viral+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of polyvinylidene fluoride and polyether sulfone membranes in filtering viral suspensions.</a> J Virol Methods. 109 (1), 99-101 (2003).</li>
<li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+high-titer+lentivirus+preparations+without+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation.</a> Sci Rep. 5, 13875(2015).</li>
<li>Czubala, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta+induces+a+SAMHD1-independent+post-entry+restriction+to+HIV-1+infection+of+human+epithelial+langerhans+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">TGFbeta induces a SAMHD1-independent post-entry restriction to HIV-1 infection of human epithelial langerhans cells.</a> J Invest Dermatol. 136 (10), 1981-1989 (2016).</li>
<li>Bouabe, H., Okkenhaug, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+in+mice%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene targeting in mice: a review.</a> Methods Mol Biol. 1064, 315-336 (2013).</li>
<li>Kim, J. M., Rasmussen, J. P., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+prevent+catastrophic+autoimmunity+throughout+the+lifespan+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells prevent catastrophic autoimmunity throughout the lifespan of mice.</a> Nat Immunol. 8 (2), 191-197 (2007).</li>
<li>Decalf, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+of+HIV-1+entry+triggers+a+Type+I+Interferon+response+in+human+primary+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Sensing of HIV-1 entry triggers a Type I Interferon response in human primary macrophages.</a> J Virol. 91 (15), e00147-e00217 (2017).</li>
<li>Wilson, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+emphysema+in+mice+through+lentiviral+transduction+of+long-lived+pulmonary+alveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Amelioration of emphysema in mice through lentiviral transduction of long-lived pulmonary alveolar macrophages.</a> J Clin Invest. 120 (1), 379-389 (2010).</li>
<li>Markusic, D. M., van Til, N. P., Hiralall, J. K., Elferink, R. P., Seppen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+liver+macrophage+transduction+by+pseudotyping+lentiviral+vectors+with+a+fusion+envelope+from+Autographa+californica+GP64+and+Sendai+virus+F2+domain%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Reduction of liver macrophage transduction by pseudotyping lentiviral vectors with a fusion envelope from Autographa californica GP64 and Sendai virus F2 domain.</a> BMC Biotechnol. 9, 85(2009).</li>
<li>Burke, B., Sumner, S., Maitland, N., Lewis, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+gene+therapy%3A+cellular+delivery+vehicles+and+in+vivo+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Macrophages in gene therapy: cellular delivery vehicles and in vivo targets.</a> J Leukoc Biol. 72 (3), 417-428 (2002).</li>
<li>Bain, C. C., Jenkins, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+serous+cavity+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">The biology of serous cavity macrophages.</a> Cell Immunol. 330, 126-135 (2018).</li>
<li>Milone, M. C., O'Doherty, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+use+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Clinical use of lentiviral vectors.</a> Leukemia. 32 (7), 1529-1541 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Makrofagi rezydujące w tkankach pełnią szereg funkcji homeostatycznych i zapalnych specyficznych dla tkanek 1,2 podyktowanych ich środowiskiem fizjologicznym 6,7,8,9. W protokole tym wprowadzono skuteczną metodę18 manipulacji makrofagami rezydującymi w otrzewnej in vivo przy użyciu cząstek lentiwirusa w celu zbadania funkcji makrofagów w ich biologicznym mikrośrodowisku.
Dla powodzenia protokołu niezbędne jest wykorzystanie zdrowych komórek HEK293T. Najlepszą praktyką jest rozmrażanie komórek co najmniej tydzień przed rozpoczęciem tego protokołu, aby zapewnić regenerację komórek i dobrą liczbę. Komórki powinny być wysiane w odpowiedniej objętości pożywki na jeden dzień przed planowaną transfekcją i powinny osiągnąć około 80% zbiegu w dniu transfekcji. Niedostatecznie lub nadmiernie zlewające się preparaty komórkowe spowodują zmniejszenie wydajności lentiwirusa. W celu uzyskania najlepszych rezultatów zalecamy transfekcję HEK293T komórek odczynnikiem do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta. Podstawowe etapy transfekcji obejmują odpowiednie wymieszanie plazmidów i odczynników oraz kroplowe dodawanie mieszaniny bezpośrednio do monowarstwy komórek HEK293T. W tym protokole można zastosować transfekcję fosforanu wapnia komórek HEK293T27,28. Użytkownik powinien jednak mieć świadomość, że skuteczność tej metody może się różnić i może skutkować zmniejszoną wydajnością transfekcji.
Środki ostrożności powinny być uwzględnione w protokole od dnia transfekcji komórek HEK293T. Obejmują one pracę w komorze bezpieczeństwa kategorii II, noszenie podwójnych rękawic podczas pracy z zanieczyszczonym materiałem oraz odpowiednie wybielanie skażonego materiału (roztworem odkażającym, na przykład roztworem wybielającym o stężeniu 2 000 ppm) przez co najmniej 4 godziny. Użytkownicy powinni zapoznać się ze swoimi regulacjami instytucjonalnymi dotyczącymi pracy z patogenami i odpadami kategorii II.
W tym protokole preparat lentiwirusa jest najpierw oczyszczany za pomocą filtra 0,45 μm w celu usunięcia HEK293T resztek komórek. Należy unikać stosowania mniejszych filtrów (0,22 μm) i membran z estrów celulozy, ponieważ spowoduje to utratę cząsteczek lentiwirusa. Zaleca się stosowanie filtrów polieterosulfonowych lub fluorku winylidenu o niskiej zdolności wiązania białek29. Drugi etap oczyszczania przeprowadza się na pojedynczej 20% warstwie sacharozy w ultrawirówce w celu usunięcia pozostałych zanieczyszczeń, co jest szczególnie ważne dla późniejszego podawania in vivo preparatu lentiwirusa. W instytucjach, w których ultrawirówka nie jest dostępna, inne30 opisało oczyszczanie lentiwirusa na bazie sacharozy przy użyciu standardowej wirówki laboratoryjnej. Można to zaimplementować w tym protokole jako alternatywę. Preparat lentiwirusa jest miareczkowany w limfocytach T Jurkat na podstawie ekspresji sygnału markerowego (np. GFP stosowanego w tym protokole). W przypadku konstruktów bez markerów, fizyczne cząstki lentiwirusa można ocenić poprzez kwantyfikację białka p24gag HIV-1 za pomocą zestawu ELISA31, analizę cytometrii przepływowej antygenu rdzeniowegoHIV-1 18 lub pomiar zmian w docelowym genie (preferencyjnie przy użyciu metod umożliwiających pomiar zmian w poszczególnych komórkach, np. cytometrii przepływowej lub mikroskopii). Jeżeli miareczkowanie kontroli i lentiwirusa różni się znacznie w limfocytach T Jurkat, objętości wykorzystane w badaniach in vivo można dostosować tak, aby osiągnąć najbardziej porównywalne zakażenie między preparatami lentiwirusa.
Głównym ograniczeniem protokołu jest obserwowany zanik Mφ otrzewnej rezydenta GFP+ w ciągu 14 dni od wstrzyknięcia lentiwirusa ip. W przypadku badań długoterminowych należy wziąć pod uwagę linie myszy ze stabilnymi zmianami genetycznymi w określonym typie komórek lub tkanek32. Na przykład, ponieważ makrofagi otrzewnowe nie wyrażają Foxp3 (białka T-Reg), wykorzystaliśmy myszy Foxp3-DTR-eGFP33 i potwierdziliśmy, że ekspresja GFP utrzymuje się w otrzewnowym Mφ po 21 dniach od infekcji (Figura 3F). Należy jednak zauważyć, że lentiwirusy zawierają inne obce składniki, a to wydłużenie trwałości zakażonych komórek u myszy Foxp3-DTR-GFP może nie być trwałe. Dodatkowym słabym punktem tej metody jest niski poziom stanu zapalnego, który można zaobserwować w jamie otrzewnej po wstrzyknięciu lentiwirusa, czego dowodem jest napływ neutrofili po 4 godzinach od wstrzyknięcia (ryc. 5D), co może oznaczać, że powtarzające się infekcje przyspieszyłyby związaną ze stanem zapalnym utratę Mφ rezydenta otrzewnej wyrażającego GFP. Chociaż nie wykryliśmy interferonów typu I (IFN) w jamie otrzewnej, wcześniej wykazano, że cząstki lentiwirusa pseudotypowane VSV-G indukują niektóre geny stymulowane przez IFN w ludzkim Mφ przy braku wykrywalnych IFN34. Należy to wziąć pod uwagę przy stosowaniu tego protokołu do eksperymentów badających przeciwwirusowe odpowiedzi immunologiczne. Wystąpienie ostrego i utrzymującego się stanu zapalnego po wstrzyknięciu doiniegdzie preparatu lentiwirusa może wskazywać na zanieczyszczenie preparatu.
Obszary rozwiązywania problemów obejmują: 1) w przypadku niskiego miana lentiwirusa należy zapewnić zdrowie komórek HEK293T i skuteczną transfekcję (np. ekspresję markera, jeśli jest obecny, w komórkach HEK293T). Jeśli wskaźnik infekcji pozostaje niski, należy wziąć pod uwagę rozmiar konstrukcji. Konstrukty z większymi wstawkami lub bardziej złożonymi strukturami drugorzędowymi mogą wpływać na końcowe miano lentiwirusa i zakaźność24. Dlatego każdy konstrukt powinien być testowany niezależnie i równolegle do odpowiedniego wektora kontrolnego; 2) Jeśli wymagana jest duża ilość lentiwirusa, zaleca się przygotowanie wielu kolb T175 z komórkami HEK293T i odpowiednie zwiększenie produkcji. Aby uniknąć różnic w preparatach lentiwirusa, najlepszą praktyką jest łączenie końcowych kolekcji przed porcjowaniem i przechowywaniem. W przypadku tak dużej produkcji mieszanina plazmidów (sekcja 2) powinna być przygotowana w probówkach o pojemności 50 ml, aby zapewnić skuteczne wymieszanie składników.
Pomimo szerokiego tropizmu, pseudotypowane cząstki lentiwirusa VSV-G głównie celują w makrofagi tkankowe, jak wykazano wcześniej dla pęcherzyków płucnych35, a tutaj18 dla pMФ, gdy są podawane odpowiednimi drogami. Zmiany w otoczce na cząstkach lentiwirusa mogą w niektórych przypadkach powodować zmniejszoną transdukcję makrofagów in vivo36 i nie są konieczne dla tego protokołu. W porównaniu z innymi podejściami wirusowymi do manipulacji genami in vivo w makrofagach (omówionymi w37), zastosowanie wektorów lentiwirusowych zapewnia stabilną integrację transgenu w makrofagach tkankowych35, wydajną ekspresję transgenu i największy limit wielkości wektora (około 8 Kb).
Mφ otrzewnej odgrywają ważną rolę w zapobieganiu, powstawaniu, progresji i ustępowaniu różnych chorób, w tym raka jamy brzusznej, zapalenia trzustki i zapalenia otrzewnej38. Protokół ten opisuje skuteczne narzędzie do modyfikacji genów u myszy pMφ, umożliwiając badanie procesów biologicznych stojących za tymi patologiami w fizjologicznie istotnym mikrośrodowisku. Podczas gdy wektory lentiwirusowe same w sobie stają się narzędziem zainteresowania w interwencjach klinicznych39, ze względu na pochodzenie od wirusa niedoboru odporności i stabilną integrację genomu, obawy dotyczące bezpieczeństwa utrudniają ich terapeutyczne wdrażanie. Pogłębienie wiedzy na temat odpowiedzi makrofagów na modulację genów lentiwirusa może przyczynić się do rozwoju tego wysoce skutecznego narzędzia w warunkach klinicznych.

Makrofagi rezydujące w tkankach (Mφ) to niejednorodna populacja fagocytarnych komórek odpornościowych, które wyczuwają i reagują na atakujące patogeny1,2. Ponadto odgrywają istotną rolę w rozwoju, przebudowie i utrzymaniu homeostazy tkanek1,3. Wiele tkanek Mφ pochodzi od komórek progenitorowych woreczka żółtkowego podczas embriogenezy i utrzymuje się w tkance przez całe życie4,5. Fenotyp i funkcje tych komórek są podyktowane wspólnymi i hierarchicznymi interakcjami określonych czynników transkrypcyjnych oraz lokalnego mikrośrodowiska6,7,8,9. Coraz lepsze zrozumienie tej zależności zwiększa zapotrzebowanie na skuteczne metody manipulacji genami Mφ in vivo w ich fizjologicznie istotnej niszy.
wektory lentiwirusowe są często wykorzystywanym narzędziem do manipulowania kwasami nukleinowymi w określonych populacjach komórek in vivo10,11,12, szczególnie ze względu na ich zdolność do infekowania zarówno dzielących się, jak i niedzielących się komórek oraz do stabilnej integracji z genomem gospodarza13,14. W ciągu ostatnich dwóch dekad technologia dostarczania lentiwirusa została zoptymalizowana, a alternatywne koperty i syntetyczne promotory zostały zbadane w celu zwiększenia celowania specyficznego dla linii8,15. Ze względu na szeroki tropizm komórkowy, wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej otacza glikoproteinę (VSV-G)16,17 stał się "złotym standardem" otoczki stosowanej w technologii lentiwirusów.
W tym protokole18, pseudotypowane cząstki lentiwirusowe VSV-G są wykorzystywane do demonstracji ukierunkowanego i skutecznego dostarczania krótkiego RNA spinki do włosów (shRNA) i mikroRNA (miR) do mysiego Mφ (pMφ) in vivo, w stanie ustalonym19. Ekspresja transgenu była napędzana przez promotor wirusa tworzącego ognisko śledziony (SFFV). Produktywne zakażenie komórek zdefiniowano na podstawie ekspresji wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (GFP) pochodzącego z lentiwirusa. Zastosowanie tego podejścia umożliwiło łatwy odczyt na potrzeby eksperymentów in vivo lentiwirusa w celu określenia optymalnej dawki i ram czasowych eksperymentu. Wreszcie, prowokacja lentiwirusowa in vivo myszy podczas zapalenia wywołanego tioglikolanem ujawniła naturalną skłonność do selektywnego zakażenia pMφ.

<table><tbody><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA (1x) (Trypsyna 500 mg/L lub 0,02 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mu; m sterylny filtr millex GP</td><td>Merck</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mu; m sterylny filtr millex GP</td><td>Merck</td><td>SLHP033RS</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml strzykawka insulinowa U-100 z igłą, 0,33 mm x 12,7 mm (29 G)</td><td>BD</td><td>324892</td><td></td></tr><tr><td>1 litrowy pojemnik na ostre</td> przedmioty <td>Nie</td><td></td><td></td></tr> dotyczy <tr><td>Przeciwciało 2,4G2 (TruStain FcX anti-mouse CD16/32)</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m sitko</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>AimV medium (klasa badawcza), AlbuMax Suplement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31035025</td><td></td></tr><tr><td>Bufor blokujący</td><td>przygotowany we własnym zakresie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pożywka z tioglikolanu browarniczego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2551</td><td>4% roztwór podstawowy przygotowany w wodzie, autoklawowany i przechowywany w stanie zamrożonym.</td></tr><tr><td>CD11b</td><td>Biolegend</td><td>101222</td><td>Patrz Tabela 1 dla rozcieńczenia i stężenia</td></tr><tr><td>CD11b</td><td>BD</td><td>550993</td><td>Patrz Tabela 1 dla rozcieńczenia i stężenia</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117317</td><td>Patrz Tabela 1 dla rozcieńczenia i stężenia</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117333</td><td>Patrz Tabela 1 dla rozcieńczenia i stężenia</td></tr><tr><td>CD19</td><td>BD</td><td>560375</td><td>Patrz tabela 1 w celu uzyskania informacji na temat rozcieńczenia i stężenia</td></tr><tr><td>CD19</td><td>Biolegend</td><td>152410</td> Patrz <td>tabela 1 w celu sprawdzenia rozcieńczenia i stężenia</td></tr><tr><td>CD226</td><td>Biolegend</td><td>128808</td> Patrz tabela 1 w celu zapoznania się z <td>rozcieńczeniem i stężeniem</td></tr><tr><td>CD3e</td><td>BD</td><td>560527</td><td>Patrz tabela 1 w celu zapoznania się z rozcieńczeniem i stężeniem</td></tr><tr><td>CD3e</td><td>Biolegend</td><td>152313</td><td>Patrz Tabela 1 dla rozcieńczenia i stężenia</td></tr><tr><td>CD4</td><td>Biolegend</td><td>100412</td><td>Patrz Tabela 1 dla rozcieńczenia i stężenia</td></tr><tr><td>CD73</td><td>eBioscience</td><td>16-0731-82</td><td>Patrz Tabela 1 dla rozcieńczenia i stężenia</td></tr><tr><td>CD8a</td><td>eBioscience</td><td>48-0081-82</td><td>Patrz Tabela 1 dla rozcieńczenia i stężenia</td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych (T175 fask 175, 175 cm2, 550 mL)</td><td>Greiner Bio One</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe, stożkowe probówki denne 25 mm x 89 mm</td><td>Wirówki do redlic Beckman Coulter</td><td>358126</td><td></td></tr><tr><td></td> Ultrawirówka <td>Beckman Coulter</td><td></td><td>i wirówka TC</td></tr><tr><td>Kolagenaza typ IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe (15 ml i 50 ml)</td><td>Greiner Bio One</td><td>11512303 & 11849650</td><td></td></tr><tr><td>Cryotubes</td><td>Greiner Bio One</td><td>123277</td><td>lub cryotubes</td></tr><tr><td>DMEM medium (1x) + 4,5g/L D-glukozy, 400 &mikro; M L-glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41965-062</td><td></td></tr><tr><td>Dnaza I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji Effectene</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>F4/80</td><td>Biolegend</td><td>123123</td><td>Patrz Tabela 1 dla rozcieńczenia i stężenia</td></tr><tr><td>F4/80</td><td>Biolegend</td><td>123133</td><td>Patrz Tabela 1 dla rozcieńczenia i stężenia</td></tr><tr><td>F4/80</td><td>Biolegend</td><td>123147</td><td>Patrz Tabela 1 w celu uzyskania informacji na temat rozcieńczenia i stężenia</td></tr><tr><td>FceR1</td><td>eBioscience</td><td>48-5898-80</td><td>Patrz Tabela 1 w celu rozcieńczenia i stężenia</td></tr><tr><td>Surowicy cielęcej płodu (FCS)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td>inaktywowany termicznie przez 30 min w temperaturze 56 stopni; C i sterylne przefiltrowane przez 0,22 &mu; m filtr</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; </td> Bufor do cytometrii przepływowej (FACS) Attune NxT <td></td></tr><tr><td></td><td>przygotowany we własnym zakresie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny mikroskop do hodowli tkanek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EVOS FL</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Preferencje użytkownika</td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>14175-053</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T linia</td><td></td> <td>komórkowa</td><td>uprawiane przez co najmniej tydzień przed transfekcją. Wolny od mykoplazmy</td></tr><tr><td>HIV-1 Antygen rdzeniowy</td><td>Beckman Coulter</td><td>6604667</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Peeling chirurgiczny Hydrex, glukonian chlorheksydu 4% w/v środek do mycia skóry</td><td>Ecolab</td><td>3037170</td><td></td></tr><tr><td>I-A/I-E</td><td>Biolegend</td><td>107625</td><td>Patrz tabela 1, aby zapoznać się z rozcieńczeniem i stężeniem</td></tr><tr><td>ICAM1</td><td>Becton Dickinson</td><td>554970</td><td>Patrz Tabela 1 w celu zapoznania się z rozcieńczeniem i stężeniem</td></tr><tr><td>linii</td><td></td><td></td> komórek T <td>Jurkat hodowanej przez co najmniej tydzień przed użyciem. Wolny od mykoplazmy</td></tr><tr><td>ŻYWY/MARTWY zestaw do barwienia martwych komórek w bliskiej podczerwieni</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L34975</td><td></td></tr><tr><td>Ly6G</td><td>Biolegend</td><td>127615</td><td>Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z rozcieńczeniem i stężeniem</td></tr><tr><td>Myszy</td><td></td><td></td><td>używały tutaj samic C57BL/6 w wieku 8-12 tygodni (Charles Rivers), chyba że określono inaczej</td></tr><tr><td>Pipety mikrokapilarne (zakres objętości 0,5-1,000 &mu; L)</td> <td>Fisher Scientific & Starlab</td><td>11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700</td><td></td></tr><tr><td>NK1.1</td><td>Biolegend</td><td>108724</td><td>Patrz Tabela 1 w celu zapoznania się z rozcieńczeniem i stężeniem</td></tr><tr><td>Paraformaldehydu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>przygotowanego do 2% w/v w PBS</td></tr><tr><td>pCMV-&Delta; Plazmid pakujący R8.91</td><td>Zuffrey, R., et al. 1997</td> koduje białko Gag-Pol HIV napędzane przez promotor wirusa cytomegalii.<td></td><td> Oporność na ampicilinę.</td></tr><tr><td>Penicylina / Streptomycyna (100x, 10 000 U / ml)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Greiner Bio One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>plazmid pHR'SIN-cPPT-SEW</td><td>Rosas, M. i in. 2014</td> zmodyfikowany do badań ekspresji shRNA i miR.<td></td><td> Koduje marker EGFP za promotorem SFFV i przed wzmacniaczem wirusa hepatitiv Woodchuck. Oporność na ampicilinę.</td></tr><tr>Plazmid <td></td><td>pMD2.G</td><td>Naldini, L. i wsp. 1996</td><td>koduje otoczkę g-glikoproteiny wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV-G). Oporność na ampicilinę.</td></tr><tr><td>Kontrola izotypu IgG1 szczura</td><td>Becton Dickinson</td><td>550617</td><td>Patrz Tabela 1 dla rozcieńczenia i stężenia</td></tr><tr><td>Surowica szczura</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9759-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy ACK z krwią czerwoną</td><td>przygotowany w domu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 pożywka (1x) + 400 uM L-glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21875-091</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4521</td><td></td></tr><tr><td>SiglecF</td><td>BD</td><td>562681</td><td>Patrz Tabela 1 w celu zapoznania się z rozcieńczeniem i stężeniem</td></tr><tr><td>Podchloryn sodu Tabletki (wybielacz, 2,000 ppm)</td><td>Guest Medical</td><td>H8818</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna 24-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>Greiner Bio One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny PBS (DPBS) firmy Dulbecco (1x) Mg++ i Ca2+ - bezpłatnie</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne jednorazowe pipety transferowe VWR (23,0 ml, 30 cm)</td><td>VWR</td><td>612-4515</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td></td> Nożyczki chirurgiczne <td>Thermo Fisher Scientific</td> 15503022 <td></td></tr><tr><td></td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>Preferencje użytkownika</td></tr><tr><td>Strzykawki (50 ml i 1 0 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10084450 & 768160</td><td></td></tr><tr><td>Tim4</td><td>Biolegend</td><td>130007</td><td>Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z rozcieńczeniem i zatężeniem</td></tr><tr><td>96-dołkowej płytki do hodowli komórkowej z dnem U</td><td>Greiner Bio One</td><td>650180</td><td></td></tr></tbody></table>

preparat wektora lentiwirusowego do skutecznej modulacji genów i mikrorna makrofagów rezydujących w tkankach jamy otrzewnej in vivo u myszy

Lentiviral Vector Preparation for Efficient Gene and MicroRNA Modulation of Peritoneal Cavity Tissue&#45;Resident Macrophages In Vivo in Mice

Makrofagi rezydujące w tkance otrzewnej pełnią szerokie funkcje w utrzymaniu homeostazy i biorą udział w patologiach w obrębie lokalnych i sąsiednich tkanek. Ich funkcje są podyktowane sygnałami mikrośrodowiskowymi; Dlatego konieczne jest zbadanie ich zachowania w niszy fizjologicznej in vivo. Obecnie specyficzne metodologie celowania w makrofagi otrzewnowej wykorzystują modele transgeniczne całych myszy. W tym miejscu opisano protokół skutecznej modulacji in vivo ekspresji mRNA i małych gatunków RNA (np. mikroRNA) w makrofagach otrzewnowych przy użyciu cząstek lentiwirusa. Preparaty lentiwirusowe wytwarzano w HEK293T komórkach i oczyszczano na pojedynczej warstwie sacharozy. Walidacja in vivo skuteczności lentiwirusa po wstrzyknięciu dootrzewnowym wykazała dominujące zakażenie makrofagów ograniczone do tkanki miejscowej. Celowanie w makrofagi otrzewnowe było skuteczne podczas homeostazy i zapalenia otrzewnej wywołanego tioglikolanem. Omówiono ograniczenia protokołu, w tym stan zapalny o niskim poziomie wywołany dootrzewnowym podawaniem lentiwirusa oraz ograniczenia czasowe dla potencjalnych eksperymentów. Ogólnie rzecz biorąc, badanie to przedstawia szybki i przystępny protokół szybkiej oceny funkcji genów w makrofagach otrzewnowych in vivo.

Pokazujemy krok po kroku protokół badania funkcji genów w makrofagach rezydujących w tkance otrzewnej in vivo, przy użyciu wektorów lentiwirusowych.

Preparat wektora lentiwirusowego do skutecznej modulacji genów i mikroRNA makrofagów rezydujących w tkankach jamy otrzewnej in vivo u myszy

Peritoneal tissue-resident macrophages have broad functions in the maintenance of homeostasis and are involved in pathologies within local and neighboring ...

W porównaniu z innymi podejściami wirusowymi do manipulacji genami in vivo w makrofagach, zastosowanie wektorów lentiwirusowych zapewnia stabilną integrację makrofagów tkankowych transgenicznych, wydajną ekspresję transgenu i największy limit wielkości wektora. Stosując manipulację enzymami metabolicznymi lentiwirusami in vivo, odkryliśmy znaczące zmiany funkcjonalne w makrofagach rezydujących w tkankach. Dlatego obecnie badamy immunometabolizm i jego rolę w zachowaniu funkcji specyficznych dla tkanek, w tym epigenetyki i funkcji immunologicznej.W przyszłości chcielibyśmy skupić się na określeniu, w jaki sposób makrofagi tkankowe wpływają na inne lokalne populacje komórek podczas homeostazy i w modelach chorób oraz jak te interakcje można wykorzystać do zapobiegania chorobom i ich rozwiązywania. Na początek dodaj składniki lentiwirusowe do 15-mililitrowej probówki i zwiększ objętość do 600 mikrolitrów z buforem EC. Dodać 36 mikrolitrów roztworu wzmacniacza i za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra kilkakrotnie mieszać, pobierając i uwalniając część płynu z powrotem do roztworu.Po pięciu minutach dodać 120 mikrolitrów odczynnika do transfekcji i wymieszać około 20 razy, jak pokazano wcześniej. Pozostaw probówkę w temperaturze pokojowej na 10 minut. Następnie dodaj 5,2 mililitra cDMEM do probówki.Za pomocą jednorazowej pipety transferowej kroplami dodaj mieszaninę transfekcji na monowarstwę komórek HEK293T, hodowaną w kolbie T175. Rozprowadzić plazmid równomiernie, delikatnie kołysząc kolby na boki. Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 48 godzin.Po inkubacji, pod mikroskopem fluorescencyjnym, potwierdź skuteczną transfekcję HEK293T komórek, obserwując fluorescencję GFP. Teraz przechylić kolbę i za pomocą 25-mililitrowego paska serologicznego zebrać pożywkę, nie naruszając monowarstwy komórek. Przenieś pożywkę do wstępnie oznakowanej 50-mililitrowej probówki i zamknij pokrywkę.Dodać 25 mililitrów ciepłego cDMEM wzdłuż ścianek kolby, nie naruszając monowarstwy, i wrzucić kolbę z powrotem do inkubatora. Po 24 godzinach zebrać pożywkę, dodać roztwór odkażający do kolby i umieścić ją poziomo na następne 24 godziny. Aby rozpocząć, wyjmij tłok z 50-mililitrowej strzykawki i włóż do końcówki strzykawki sterylny filtr z polietersulfonu lub polifluorku winylidenu o grubości 0,45 mikrometra wiążący o niskiej zawartości białka.Używając 25-mililitrowego paska serologicznego, dodaj transfekowaną zawiesinę komórek HEK293T lentiwirusa do strzykawki i delikatnie wciśnij tłok. Powoli wcisnąć tłok i zebrać filtrat do nowej 50-mililitrowej probówki. Po zakończeniu wyjmij filtr ze strzykawki i wyrzuć go do roztworu odkażającego.Dodaj trzy mililitry 20% roztworu sacharozy na dno probówki ultrawirówki. Następnie ustaw PIPETBOY na najniższą prędkość. Trzymaj probówkę ultrawirówki pod kątem około 45 stopni i powoli dodaj przefiltrowaną pożywkę zawierającą lentiwirusa na ściankę probówki.Zwróć uwagę na wyraźne oddzielenie warstw od rurki. Jeśli całkowita objętość rurki jest mniejsza niż 29 mililitrów, dodaj świeży cDMEM, aby uniknąć zapadania się rurki podczas wirowania. Przetrzyj wiadro ultrawirówki 70% alkoholem i umieść adapter rurki na dnie wiadra.Następnie umieść probówkę ultrawirówki w wiadrze. Zamknij wiadro i umieść je w stojaku. Wstępnie schłodzić ultrawirówkę do czterech stopni Celsjusza.Ostrożnie umieść wiadro w wirniku i włącz podciśnienie. Dostosuj szybkość przyspieszania i zwalniania do najniższego ustawienia i wiruj z prędkością 26 000 obr./min przez 90 minut w czterech stopniach Celsjusza. Po odwirowaniu wyłącz próżnię i ostrożnie wyjmij wirnik, nie naruszając próbek.Obserwuj ultrawirówkę, aby upewnić się, że nie ma wycieków i wycieków z wiader. Wlej zawartość probówki ultrawirówkowej jednym płynnym ruchem do pojemnika na odpady. Odwróć probówkę na dwuwarstwową bibułkę na 10 minut.W międzyczasie przetrzyj wnętrze wiadra bibułką nasączoną 70% etanolem i wysusz je na powietrzu do góry nogami. Za pomocą bibułki ostrożnie osusz pozostały płyn z krawędzi probówki ultrawirówki. Zawiesić granulkę w jednym mililitrze odpowiedniego podłoża bez surowicy i pozostawić na 15 minut.Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra delikatnie wymieszaj preparaty lentiwirusa i podziel je na 1,5-mililitrowe zakręcane tubki. Preparaty lentiwirusowe należy przechowywać w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Skuteczny preparat lentiwirusa osiągnął wskaźnik infekcji wynoszący ponad 95% przy dawce pięciu mikrolitrów.Średnia intensywność fluorescencji zakażonych komórek wzrasta wraz ze wzrostem dawek. Dootrzewnowe wstrzyknięcie 100 mikrolitrów preparatu lentiwirusa dało najwyższy procent i intensywność sygnału GFP w komórkach otrzewnej myszy. Eksperymenty z wstrzyknięciem lentiwirusa o objętości 100 mikrolitrów wykazały znaczny odsetek komórek rezydentnych wykazujących ekspresję GFP w trzecim i siódmym dniu, a następnie zniknięcie zakażonej populacji w 14 dniu.

lentiviral-vector-preparation-for-efficient-gene-microrna-modulation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

MikroRNA odgrywają znaczącą rolę w strukturze i funkcjonowaniu mózgu. Tutaj opisujemy metodę wymuszania nadmiernej ekspresji miRNA w hipokampie za pomocą stereotaktycznego wstrzykiwania zmodyfikowanego lentiwirusa wykazującego ekspresję miRNA. Podejście to może służyć jako stosunkowo szybki sposób oceny skutków in vivo nadmiernej ekspresji miRNA w określonych regionach mózgu.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie lentiwirusów eksprymujących mikroRNA do regionu CA1 hipokampa myszy i ocena wyniku behawioralnego

W tym protokole opisujemy metody efektywnej transfekcji linii komórkowych mysich makrofagów za pomocą siRNA za pomocą 96-dołkowego systemu Amaxa Nucleofector Shuttle System, stymulacji makrofagów lipopolisacharydem i monitorowania wpływu na produkcję cytokin zapalnych.

Wykorzystanie interferencji RNA do zbadania wrodzonej odpowiedzi immunologicznej u makrofagów myszy

Opisujemy tutaj prosty protokół izolacji mysich makrofagów otrzewnowych. Po tej procedurze następuje ekstrakcja RNA w celu przeprowadzenia analizy ekspresji genów po stymulacji receptorów Toll-podobnych.

Izolacja mysich makrofagów otrzewnowej w celu przeprowadzenia analizy ekspresji genów po stymulacji receptorów toll-podobnych

Hydrodynamiczne wstrzykiwanie wektorów integracji opartych na transpozonach do żyły ogonowej umożliwia stabilną transfekcję mysich hepatocytów in vivo. W tym miejscu przedstawiamy praktyczny protokół dla systemów transfekcji, który umożliwia długotrwałą konstytutywną ekspresję pojedynczego transgenu lub połączoną konstytutywną i indukowaną doksycykliną ekspresję transgenu lub miR-shRNA w wątrobie.

Konstytutywne i indukowalne systemy do genetycznej modyfikacji in vivo mysich hepatocytów za pomocą hydrodynamicznej iniekcji żyły ogonowej

Tutaj prezentujemy protokół promujący integrację transgenów i produkcję założycielskich myszy transgenicznych z wysoką skutecznością poprzez proste wstrzyknięcie wektora lentiwirusowego w przestrzeń okołobrewą zapłodnionego oocytu.

Produkcja transgenicznych myszy za pośrednictwem lentiwirusa: prosta i wysoce skuteczna metoda bezpośredniego badania założycieli

W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół ekspresji białek fuzyjnych fluorescencyjnych w komórkach dendrytycznych i makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Metoda opiera się na transdukcji komórek progenitorowych szpiku kostnego za pomocą konstruktów retrowirusowych, a następnie różnicowaniu do makrofagów i komórek dendrytycznych in vitro.

Ekspresja fluorescencyjnych białek fuzyjnych w mysich komórkach dendrytycznych i makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego

Opisujemy metodę użycia superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza pokrytych polietylenoiminą (PEI) do transfekcji makrofagów za pomocą siRNA. Te nanocząstki mogą skutecznie dostarczać siRNA do makrofagów in vitro i in vivo oraz wyciszać ekspresję docelowych genów.

Nanocząstki tlenku żelaza pokryte polietylenopiną jako nośnik do dostarczania małych interferujących RNA do makrofagów in vitro i in vivo

Ukierunkowana edycja epigenomu DNA reprezentuje potężne podejście terapeutyczne. Protokół ten opisuje produkcję, oczyszczanie i koncentrację wektorów lentiwirusowych typu "wszystko w jednym" zawierających transgen CRISPR-dCas9-DNMT3A do zastosowań w edycji epigenomu w neuronach pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC).

Platforma wektorów lentiwirusowych do efektywnego dostarczania narzędzi do edycji epigenomu do modeli chorób pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Makrofagi, zwłaszcza makrofagi pierwotne, są trudne do transfekcji, ponieważ specjalizują się w wykrywaniu cząsteczek pochodzenia niewłasnego. Opisujemy protokół, który umożliwia wysoce wydajną transfekcję pierwotnych makrofagów za pomocą mRNA generowanego z matryc DNA, takich jak plazmidy.

Wysoce wydajna transfekcja pierwotnych makrofagów za pomocą mRNA transkrybowanego in vitro

Ten protokół ma na celu przedstawienie metody produkcji i oczyszczania biomimetyków pochodzących od mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) dla terapii genowej. Nanowezykul jest ograniczony MSC-pochodnymi dwuwarstwowami lipidowymi i zawiera rekombinowane AAV przenoszące gen interesujący się w świetle. Ta nanowezykul oferuje ulepszony wektor dla in vivo dostarczania genów.

Opracowanie nanowezykuł otoczonych błoną komórek macierzystych mezenchymalnych w celu zwiększenia wydajności dostarczania genów

Poznaj metodę przygotowania wektorów lentiwirusowych do modulacji genów makrofagów rezydujących w tkankach jamy otrzewnej u myszy. Technika ta umożliwia stabilną integrację transgenów i badanie immunometabolizmu in vivo.

Preparat wektora lentiwirusowego do skutecznej modulacji genów i mikroRNA makrofagów rezydujących w tkankach jamy otrzewnej in vivo u myszy (Wideo) | JoVE Journal

Preparat wektora lentiwirusowego do skutecznej modulacji genów i mikroRNA makrofagów rezydujących w tkankach jamy otrzewnej in vivo u myszy

Przeglądaj więcej filmów