Preparat wektora lentiwirusowego do skutecznej modulacji genów i mikroRNA makrofagów rezydujących w tkankach jamy otrzewnej in vivo u myszy

W porównaniu z innymi podejściami wirusowymi do manipulacji genami in vivo w makrofagach, zastosowanie wektorów lentiwirusowych zapewnia stabilną integrację makrofagów tkankowych transgenicznych, wydajną ekspresję transgenu i największy limit wielkości wektora. Stosując manipulację enzymami metabolicznymi lentiwirusami in vivo, odkryliśmy znaczące zmiany funkcjonalne w makrofagach rezydujących w tkankach. Dlatego obecnie badamy immunometabolizm i jego rolę w zachowaniu funkcji specyficznych dla tkanek, w tym epigenetyki i funkcji immunologicznej.

W przyszłości chcielibyśmy skupić się na określeniu, w jaki sposób makrofagi tkankowe wpływają na inne lokalne populacje komórek podczas homeostazy i w modelach chorób oraz jak te interakcje można wykorzystać do zapobiegania chorobom i ich rozwiązywania. Na początek dodaj składniki lentiwirusowe do 15-mililitrowej probówki i zwiększ objętość do 600 mikrolitrów z buforem EC. Dodać 36 mikrolitrów roztworu wzmacniacza i za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra kilkakrotnie mieszać, pobierając i uwalniając część płynu z powrotem do roztworu.

Po pięciu minutach dodać 120 mikrolitrów odczynnika do transfekcji i wymieszać około 20 razy, jak pokazano wcześniej. Pozostaw probówkę w temperaturze pokojowej na 10 minut. Następnie dodaj 5,2 mililitra cDMEM do probówki.

Za pomocą jednorazowej pipety transferowej kroplami dodaj mieszaninę transfekcji na monowarstwę komórek HEK293T, hodowaną w kolbie T175. Rozprowadzić plazmid równomiernie, delikatnie kołysząc kolby na boki. Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 48 godzin.

Po inkubacji, pod mikroskopem fluorescencyjnym, potwierdź skuteczną transfekcję HEK293T komórek, obserwując fluorescencję GFP. Teraz przechylić kolbę i za pomocą 25-mililitrowego paska serologicznego zebrać pożywkę, nie naruszając monowarstwy komórek. Przenieś pożywkę do wstępnie oznakowanej 50-mililitrowej probówki i zamknij pokrywkę.

Dodać 25 mililitrów ciepłego cDMEM wzdłuż ścianek kolby, nie naruszając monowarstwy, i wrzucić kolbę z powrotem do inkubatora. Po 24 godzinach zebrać pożywkę, dodać roztwór odkażający do kolby i umieścić ją poziomo na następne 24 godziny. Aby rozpocząć, wyjmij tłok z 50-mililitrowej strzykawki i włóż do końcówki strzykawki sterylny filtr z polietersulfonu lub polifluorku winylidenu o grubości 0,45 mikrometra wiążący o niskiej zawartości białka.

Używając 25-mililitrowego paska serologicznego, dodaj transfekowaną zawiesinę komórek HEK293T lentiwirusa do strzykawki i delikatnie wciśnij tłok. Powoli wcisnąć tłok i zebrać filtrat do nowej 50-mililitrowej probówki. Po zakończeniu wyjmij filtr ze strzykawki i wyrzuć go do roztworu odkażającego.

Dodaj trzy mililitry 20% roztworu sacharozy na dno probówki ultrawirówki. Następnie ustaw PIPETBOY na najniższą prędkość. Trzymaj probówkę ultrawirówki pod kątem około 45 stopni i powoli dodaj przefiltrowaną pożywkę zawierającą lentiwirusa na ściankę probówki.

Zwróć uwagę na wyraźne oddzielenie warstw od rurki. Jeśli całkowita objętość rurki jest mniejsza niż 29 mililitrów, dodaj świeży cDMEM, aby uniknąć zapadania się rurki podczas wirowania. Przetrzyj wiadro ultrawirówki 70% alkoholem i umieść adapter rurki na dnie wiadra.

Następnie umieść probówkę ultrawirówki w wiadrze. Zamknij wiadro i umieść je w stojaku. Wstępnie schłodzić ultrawirówkę do czterech stopni Celsjusza.

Ostrożnie umieść wiadro w wirniku i włącz podciśnienie. Dostosuj szybkość przyspieszania i zwalniania do najniższego ustawienia i wiruj z prędkością 26 000 obr./min przez 90 minut w czterech stopniach Celsjusza. Po odwirowaniu wyłącz próżnię i ostrożnie wyjmij wirnik, nie naruszając próbek.

Obserwuj ultrawirówkę, aby upewnić się, że nie ma wycieków i wycieków z wiader. Wlej zawartość probówki ultrawirówkowej jednym płynnym ruchem do pojemnika na odpady. Odwróć probówkę na dwuwarstwową bibułkę na 10 minut.

W międzyczasie przetrzyj wnętrze wiadra bibułką nasączoną 70% etanolem i wysusz je na powietrzu do góry nogami. Za pomocą bibułki ostrożnie osusz pozostały płyn z krawędzi probówki ultrawirówki. Zawiesić granulkę w jednym mililitrze odpowiedniego podłoża bez surowicy i pozostawić na 15 minut.

Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra delikatnie wymieszaj preparaty lentiwirusa i podziel je na 1,5-mililitrowe zakręcane tubki. Preparaty lentiwirusowe należy przechowywać w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Skuteczny preparat lentiwirusa osiągnął wskaźnik infekcji wynoszący ponad 95% przy dawce pięciu mikrolitrów.

Średnia intensywność fluorescencji zakażonych komórek wzrasta wraz ze wzrostem dawek. Dootrzewnowe wstrzyknięcie 100 mikrolitrów preparatu lentiwirusa dało najwyższy procent i intensywność sygnału GFP w komórkach otrzewnej myszy. Eksperymenty z wstrzyknięciem lentiwirusa o objętości 100 mikrolitrów wykazały znaczny odsetek komórek rezydentnych wykazujących ekspresję GFP w trzecim i siódmym dniu, a następnie zniknięcie zakażonej populacji w 14 dniu.