Obecny protokół opisuje całą procedurę analizy transportu aksonalnego. W szczególności przedstawiono tutaj obliczanie prędkości transportu bez pauzy, oraz metodę wizualizacji za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania "KYMOMAKER".
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obecny protokół opisuje całą procedurę analizy transportu aksonalnego. W szczególności przedstawiono tutaj obliczanie prędkości transportu bez pauzy, oraz metodę wizualizacji za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania "KYMOMAKER".
Komórki neuronalne to wysoce spolaryzowane komórki, które stereotypowo zawierają kilka dendrytów i akson. Długość aksonu wymaga wydajnego dwukierunkowego transportu przez białka motoryczne. Różne doniesienia sugerują, że defekty transportu aksonalnego są związane z chorobami neurodegeneracyjnymi. Również mechanizm koordynacji wielu białek motorycznych jest atrakcyjnym tematem. Ponieważ akson ma jednokierunkowe mikrotubule, łatwiej jest określić, które białka motoryczne są zaangażowane w ruch. Dlatego zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw transportu ładunku aksonalnego ma kluczowe znaczenie dla odkrycia molekularnego mechanizmu chorób neurodegeneracyjnych i regulacji białek motorycznych. W tym miejscu przedstawiamy cały proces analizy transportu aksonalnego, w tym hodowlę pierwotnych neuronów korowych myszy, transfekcję plazmidów kodujących białka ładunku oraz analizy kierunkowe i prędkości bez efektu pauz. Ponadto wprowadzono ogólnodostępne oprogramowanie "KYMOMAKER", które umożliwia generowanie kimografu w celu podświetlenia śladów transportu zgodnie z ich kierunkiem i umożliwia łatwiejszą wizualizację transportu aksonalnego.
Członkowie rodziny kinezyny i cytoplazmatyczna dyneina to białka motoryczne, które przemieszczają się wzdłuż mikrotubul w komórkach, aby transportować swój ładunek1. Większość kinezyn porusza się w kierunku końca dodatniego, podczas gdy dyneina porusza się w kierunku ujemnego końca mikrotubul. Funkcje i mechanizmy transportu ładunku w aksonie neuronalnym zostały szeroko zbadane. Ze względu na swoją długość, aksony wymagają stabilnego transportu na duże odległości, aby utrzymać zdrowie neuronów. Nieprawidłowości w transporcie mitochondriów, autofagosomów i pęcherzyków zawierających prekursor białka β amyloidu (APP) zostały zgłoszone jako przyczy....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komitet Badań nad Zwierzętami Uniwersytetu Hokkaido, zgodnie z wytycznymi ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments). W niniejszym badaniu wykorzystano samice myszy C57BL/6J (w ciąży, 15,5 dnia).
1. Przygotowanie pierwotnych neuronów korowych myszy
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Pierwotne hodowle neuronów z kory mózgu myszy w wieku zarodkowym E15.5 prowadzono w naczyniach z szklanym dnem zgodnie z opisem. Przykładowo, w pierwotnych neuronach korowych wykazano ekspresję APP-EGFP, Alcα-EGFP lub Alcβ-EGFP. Znane jest, że APP i Alcα są transportowane w aksonie przez kinezynę-1.2,17APP wiąże się z kinezyną-1 poprzez białko adapterowe JIP1 (JNK-interacting protein 1), podczas gdy Alcα wiąże się bezpośrednio poprzez jego podwó.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Opisano metodę analizy transportu aksonalnego, która obejmuje obliczanie prędkości segmentowej i generowanie kimografów. Kluczowym krokiem na etapie transfekcji jest utrzymanie zdrowia hodowanych neuronów. Metoda transfekcji opisana przez Jianga i Chena29 była stosowana z niewielkimi modyfikacjami. Delikatne zmieszanie roztworu DNA/CaCl2 i 2x HBS zwiększyło skuteczność transfekcji poprzez zmniejszenie wielkości wytrąceń. Aby zapobiec uszkodzeniu komórek przez wytrącenia, komórki przepłu.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Ta praca była wspierana przez KAKENHI (22K15270, Grant-in-Aid dla Młodych Naukowców) oraz Akiyama Life Science Foundation dla YS. Chcielibyśmy wyrazić naszą wdzięczność dr Masataka Kinjo i dr Akirze Kitamura z Laboratorium Molekularnej Dynamiki Komórek na Wydziale Zaawansowanych Nauk Przyrodniczych Uniwersytetu Hokkaido za dostarczenie krytycznego wkładu i wiedzy specjalistycznej, które znacznie pomogły w badaniach. Obserwację za pomocą mikroskopii TIRF przeprowadzono przy użyciu przyrządu zainstalowanego w Laboratorium Molekularnej Dynamiki Komórek na Wydziale Zaawansowanych Nauk Przyrodniczych Uniwersytetu Hokkaido. Instrument jest zarejestrowany w systemie Open Fac....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 5-Fluoro-2-deoksyurydyna | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| Apo TIRF 100x/1.49 OIL | Nikon | ||
| B-27 Suplement (50x), bez surowicy | Thermo fischer scientific | 17504044 | |
| Albumina surowicy bydlęcej | Wako | 013-25773 | |
| Zestaw do transfekcji ssaków CalPhos | Takara | 631312 | |
| Sitko do komórek 40 i mikro; m Nylon | Falcon | 352340 | |
| CoolSNAP HQ | Fotometria | ||
| Deoksyrybonukleaza I | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| D-Glucose | Wako | 041-00595 | |
| DMEM/Szynka' s F-12 | Wako | 042-30555 | |
| Dumont No. 7 kleszcze | Dumont | No.7 | |
| Ostrze chirurgiczne z pióra | Feather | No.11 | |
| Rękojeść ostrza chirurgicznego z pióra | Pióro | nr 3 | |
| Gentamycyna | Wako | 079-02973 | |
| Siarczan gentamycyny | Wako | 075-04913 | |
| GlutaMAX Suplement | Thermo fischer scientific | 35050061 | |
| HEPES | DOJINDO | 342-01375 | |
| Surowica dla koni, inaktywowana termicznie | Thermo fischer scientific | 26050088 | |
| KCl | Wako | 163-03545 | |
| KH2PO4 | Wako | 169-04245 | |
| KYMOMAKER | http://www.pharm.hokudai.ac.jp/shinkei/Kymomaker.html | ||
| L-15 Medium (Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L5520 | |
| MetaMorph wersja 6.2r1 | Metamorph | ||
| Na2HPO4 | Wako | 197-02865 | |
| NaCl | Wako | 197-01667 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | |
| Neurobasal Medium | Thermo fischer naukowy | 21103049 | |
| Nikon ECLIPSE TE 2000-E | Nikon | ||
| Nunc Lab-Tek 8-studniowa komorowa szklana nakrywka | Thermo fischer scientific | 155411 | |
| Papaina | Worthington | LS003126 | |
| Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Bromowodorek poli-L-lizyny | Sigma-Aldrich | P2636-500MG | |
| Baza Trizma | Merck | T1194-10PAK | rozpuszczony z wodą w celu uzyskania 0,1 M Tris-HCl (pH 8,5) |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Ten artykuł został opublikowany
Film wkrótce dostępny