10 marca 2023
Zakłócenie bariery krew-rdzeń kręgowy (BSCB) można z powodzeniem osiągnąć poprzez dożylne podawanie mikropęcherzyków i zastosowanie ultradźwięków o niskiej intensywności (LIFU). Protokół ten szczegółowo opisuje otwieranie BSCB za pomocą LIFU w modelu gryzoni, w tym konfigurację sprzętu, wstrzykiwanie mikropęcherzyków, lokalizację celu i wizualizację zakłóceń BSCB.
Bariera krew-rdzeń kręgowy jest ściśle związana i ma ograniczoną przepuszczalność. Protokół ten pozwala naukowcom bezpiecznie i przejściowo otworzyć barierę krew-rdzeń kręgowy za pomocą mikropęcherzyków i skoncentrowanych ultradźwięków. Technika ta pozwala na zlokalizowanie otworu bariery krew-rdzeń kręgowy w docelowym segmencie rdzenia kręgowego.
Dodatkowo zakłócenie można łatwo potwierdzić za pomocą obserwacji wizualnej lub mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten może być badany pod kątem jego potencjału w poprawie dostarczania terapii genowych lub leków do rdzenia kręgowego w leczeniu nowotworów, atrofii lub urazów. Procedurę zademonstruje Meghana Bhimreddy.
Znakomity student medycyny z mojego laboratorium, który na co dzień wypełnia lukę między inżynierią a medycyną. Na początek zaopatrz się w skoncentrowany system przetworników ultradźwiękowych o specyfikacjach wystarczających do osiągnięcia bariery krew-rdzeń kręgowy lub otworów BSCB u szczurów. Przymocuj wydrukowany w 3D uchwyt sondy i stożek wodny na przetworniku.
Upewnij się, że między stożkiem a przetwornikiem znajduje się wodoszczelne uszczelnienie. Przymocuj wysterylizowaną, akustycznie przezroczystą membranę poliestrową o grubości 50 mikronów do dna stożka wodnego za pomocą gumki. Napełnij stożek wodny odgazowaną i zdejonizowaną wodą za pomocą rurki wlotowej i wylotowej.
Unikaj pęcherzyków powietrza wewnątrz stożka, ponieważ mogą one zakłócić sprzężenie akustyczne między przetwornikiem a celem. Na tym etapie membrana Mylar powinna być lekko napompowana. Podłączyć urządzenie sterujące zawierające generator fal i wzmacniacz napędu częstotliwości radiowej do przetwornika.
Przymocuj ramię stereotaktyczne do płytki mocującej i przymocuj uchwyt sondy do ramienia. Zapisz wagę znieczulonej samicy szczura Sprague-Dawley i wykonaj test szczypania palców u nóg i ogona, aby potwierdzić znieczulenie. Umieść poduszkę grzewczą i sterylną wkładkę chłonną na płytce mocującej.
Umieść szczura na podkładce chłonnej. Nałóż maść do oczu i umieść termometr doodbytniczy, aby monitorować temperaturę ciała. Zbadaj palpacyjnie ostatnie żebro szczura, które jest przymocowane do kręgosłupa na 13. kręgu piersiowym.
Użyj elektrycznej maszynki do golenia, aby zgolić sierść z powierzchni grzbietowej między ostatnim żebrem a szyją. Przetrzyj odsłoniętą skórę gazą zamoczoną w 10% jodopowidonem. Wykonaj nacięcie w linii środkowej za pomocą nożyczek do tęczówki i przeprowadź sekcję przez powięź, aż zostaną odsłonięte wyrostki kolczyste i blaszka.
Usuń kość za pomocą przesuniętych szczypiec do kości i skośnych nożyczek do tęczówki, aż rdzeń kręgowy zostanie odsłonięty. Przymocuj szczura do płytki mocującej, zaciskając wyrostki kolczyste przylegające do laminektomii. Następnie lekko pociągnij za zaciski, aby kręgosłup był napięty.
Wyreguluj położenie przetwornika za pomocą ramienia stereotaktycznego, aż znajdzie się dokładnie nad laminektomią. Przymocuj urządzenie laserowe do dna stożka wodnego i opuść je, aż punkt lasera będzie widoczny. Następnie dostosuj boczne położenie przetwornika, aż punkt lasera znajdzie się nad docelowym miejscem zakłócenia BSCB.
Wyjmij aparat laserowy i wypełnij przestrzeń między stożkiem a rdzeniem kręgowym odgazowanym żelem ultradźwiękowym, nie wprowadzając pęcherzyków powietrza. Ustaw parametry sonikacji na mocy wyjściowej przetwornika. Przygotuj roztwór mikropęcherzyków zgodnie z instrukcjami producenta.
Aby zwiększyć szanse na pomyślne cewnikowanie żyły ogonowej, zanurz ogon w ciepłej wodzie i umieść opaskę uciskową u podstawy ogona, aby zwiększyć średnicę żył. Następnie włóż cewnik do żyły ogonowej o rozmiarze 22 i przepłucz 0,2 mililitra heparynizowanej soli fizjologicznej. Wstrzyknąć jeden mililitr na kilogram 3% niebieskiego barwnika Evansa lub EBD do cewnika.
Następnie przepłucz cewnik 0,2 mililitra heparynizowanej soli fizjologicznej. Potwierdź pomyślne cewnikowanie żyły ogonowej, sprawdzając, czy nie ma zmiany niebieskiego koloru skóry, oczu lub grzbietowej żyły rdzeniowej szczura. Wstrzyknąć 0,2 mililitra bolusa mikropęcherzyków do cewnika i przepłukać heparynizowaną solą fizjologiczną przed rozpoczęciem sonikacji.
Po eutanazji szczura usuń rdzeń kręgowy i umieść go w 4% paraformaldehydzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia zastąp paraformaldehyd PBS. Aby zobrazować zakłócenie BSCB, należy wyizolować dwucentymetrowy odcinek otaczający miejsce sonikacji za pomocą żyletki.
Podziel sekcję na sekcje o grubości 10 mikronów za pomocą mikrotomu i zabarwij barwnikiem hematoksylinowym eozyną. W przypadku mikroskopii fluorescencyjnej należy odparafinować szkiełko zawierające przekrój rdzenia kręgowego i przeciwbarwić 25 mikrolitrami DAPI rozpuszczonymi w podłożu montażowym. Inkubuj skrawki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut w ciemności, aby zapobiec bieleniu.
Po inkubacji użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby zobrazować wszystkie szkiełka. Zobrazuj szkiełko barwione hematoksyną i eozyną za pomocą mikroskopu świetlnego. Unaczynienie rdzenia kręgowego jest widoczne po laminektomii i pokazuje tylną żyłę rdzeniową, z wieloma mniejszymi naczyniami promieniście rozchodzącymi się promieniście.
Po dożylnym wstrzyknięciu EBD otaczające tkanki i układ naczyniowy rdzenia kręgowego stały się niebieskie. Po sonikacji nad docelowym miejscem widoczna staje się niebieska plamka, wskazująca na wynaczynienie EBD do miąższu białego z powodu przerwania BSCB. Wycięcie rdzenia kręgowego od szczurów za pomocą skoncentrowanych ultradźwięków o niskiej intensywności lub sonikacji LIFU potwierdziło pozorne wynaczynienie EBD do rdzenia kręgowego.
Podczas gdy szczury z grupą kontrolną ujemną bez leczenia LIFU nie wykazywały wynaczynienia EBD. Rdzenie kręgowe z sonikacją LIFU wykazywały znacznie większą intensywność autofluorescencji EBD niż rdzenie, które nie zostały poddane sonikacji. Z podobną intensywnością DAPI obecną w obu.
Analiza hematoksyliny i eozyny nie wykazała żadnych uszkodzeń neuronów, krwotoku ani zmian w jamie ustnej w miejscach poddanych sonikacji. Przykłady uszkodzonych rdzeni w wyniku niewłaściwej obsługi chirurgicznej i sonikacji o dużej mocy są pokazane jako porównanie. U szczurów, które otrzymały mikropęcherzyki i leczenie LIFU, nie zaobserwowano zmian w wynikach motorycznych, przed sonikacją, po sonikacji i podczas pięciodniowego okresu przeżycia.
Minimalne zmiany temperatury rdzenia kręgowego zaobserwowano przed, w trakcie i po analizie sonikacji. Ważne jest, aby ograniczyć chirurgiczne uszkodzenie rdzenia kręgowego podczas laminektomii. Wizualizacja wybarwionych skrawków H i E za pomocą mikroskopii wskaże, czy doszło do jakichkolwiek uszkodzeń.
Po przerwaniu bariery krew-rdzeń kręgowy, za pomocą ultradźwięków ogniskowych, zwierzętom można wstrzyknąć środki przeciwnowotworowe lub terapie genowe. Wynik określi, czy ta technika może poprawić dostarczanie leków i wydłużyć przeżycie w warunkach patologii rdzenia kręgowego.
Niniejszy protokół opisuje metodę przejściowego otwierania bariery krew-rdzeń kręgowy (BSCB) przy użyciu mikropęcherzyków i niskointensywnego ultradźwiękowego skupienia (LIFU) w modelu gryzoni. Technika ta umożliwia celowane dostarczanie terapii do rdzenia kręgowego, z potwierdzeniem przerwania BSCB za pomocą metod wizualnych.
Przejściowe i miejscowe przerwanie bariery krew-rdzeń kręgowy (BSCB) przy użyciu niskoenergetycznego ultradźwiękowego skupienia (LIFU) umożliwia celowane dostarczanie środków terapeutycznych do rdzenia kręgowego, rozwiązując krytyczny problem w rozwoju leków ukierunkowanych na OUN. Niniejszy protokół zapewnia powtarzalną i skalowalną metodę oceny modulacji przepuszczalności BSCB, wspierając przedkliniczną ocenę strategii dostarczania terapii genowych oraz leków biologicznych. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną programów translacyjnych ukierunkowanych na patologie rdzenia kręgowego.
Metoda ta integruje się z kontinuum od odkrywania do badań przedklinicznych w zakresie dostarczania leków do OUN, stanowiąc pomost między wczesnymi badaniami mechanistycznymi a walidacją translacyjną dostępu terapeutycznego do rdzenia kręgowego.