Name: Zogniskowana neuromodulacja ultradźwiękowa ludzkich kultur nerwowych in vitro w wielodołkowych układach mikroelektrod (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T12:40:00.000+00:00
Duration: 4 min
Description: Poznaj zogniskowaną neuromodulację ultradźwiękową ludzkich neuronów HiPSC in vitro w układach mikroelektrod. Ta metoda umożliwia systematyczne określanie parametrów stymulacji i badanie mechanizmów neuronalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Amir Manbachi i Nitish Thakor dziękują za wsparcie finansowe od Agencji Zaawansowanych Projektów Badawczych w Obronie, DARPA, Kontrakt o przyznanie nagrody: N660012024075. Ponadto Amir Manbachi dziękuje za wsparcie finansowe ze strony Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational Research (ICTR) Clinical Research Scholars Program (KL2), zarządzanego przez National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS), National Institutes of Health (NIH). Nitish Thakor dziękuje za wsparcie finansowe ze strony National Institutes of Health (NIH): R01 HL139158-01A1 i R01 HL071568-15.

1. Przygotowanie materiałów
<ol>
	<li>Odessać pożywkę hodowlaną i użyć jej do wypełnienia pojedynczego dołka w 24-dołkowej płytce do hodowli neuronów z osadzonym MEA (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A). Hodowla i indukcja neuronów zgodnie z opublikowanym protokołem przez Taga et al.13.</li>
	<li>Wysterylizuj interfejs parafilmu, gumkę i stożek FUS z gumową membraną przy użyciu 70% etanolu przez 10 minut i umieść je w dygestoriach w celu późniejszego montażu.</li>
	<li>Odgazuj 300 ml wody dejonizowanej i 50 ml żelu sprzęgającego. Odwirować wodę i żel o sile 160 x g przez 5 minut, aby uniknąć indukowania kawitacji w medium sprzęgającym. 
	UWAGA: Pierwotnym źródłem HiPSC są linie komórkowe GM01582 i CIPS. Średnio można osiągnąć gęstość 5 x 104 neuronów ruchowych i 2,5 x 104 astrocytów na studzienkę14.</li>
</ol>
2. Podłączenie i konfiguracja urządzeń peryferyjnych
<ol>
	<li>Przymocuj stożek FUS do przetwornika za pomocą i uszczelnij stożek elastyczną gumową membraną w wentylowanym, sterylnym kapturze. Napełnij stożek odgazowaną i zdejonizowaną (DG-DI) wodą z kroku 1.3 i upewnij się, że w stożku nie ma pęcherzyków, aby uniknąć kawitacji.</li>
	<li>Użyj niestandardowego pręta gwintowanego, aby przymocować uchwyt wydrukowany w 3D do ramy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B). Ustaw ramę tak, aby głowica przetwornika FUS znajdowała się nad studzienką, która będzie stymulowana.</li>
	<li>Za pomocą gumki przymocować parafilm do dołka na 24-dołkowej płytce MEA zawierającej pożywkę i HiPSC.</li>
	<li>Przygotuj system FUS, podłączając elektronikę sterownika końcowego przetwornika ultradźwiękowego, w tym przypadku moc wyjściową przetwornika (TPO; <silna klasa="xfig">Rysunek 3A), do gniazdka elektrycznego 100-240 V (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B, Połączenie 6) i podłączając pasującą sieć do TPO i przetwornika FUS (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B, odpowiednio Połączenie 1 i Połączenie 2). Dopasowana sieć zapewnia wydajne sprzężenie elektryczne między przetwornikiem a TPO.</li>
	<li>Podłącz system MEA do gniazdka elektrycznego (100-240 V) (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B, połączenie 5). Podłącz port synchronizacji systemu MEA do TPO (Rysunek 3B, Połączenie 3). To połączenie zsynchronizuje akwizycję danych przez system MEA ze stymulacją FUS.</li>
	<li>Umieść 24-dołkową płytkę MEA w systemie MEA i zdejmij pokrywę, aby umożliwić bezpośredni kontakt między przetwornikiem a studzienką. Umieść przetwornik 5-10 mm nad płytą studzienki, aby zrobić miejsce na odgazowany żel sprzęgający, jak opisano w kroku 3.2 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A i <silna klasa = "xfig" > Rysunek 2B).</li>
</ol>
3. Stymulacja i akwizycja sygnałów neuronalnych
<ol>
	<li>Ustaw parametry FUS na panelu sterowania TPO (Tabela 1).</li>
	<li>Nałóż żel sprzęgający na wierzch parafilmu i opuść przetwornik FUS do żelu sprzęgającego, zapewniając kontakt z żelem z minimalnymi pęcherzykami powietrza (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A).</li>
	<li>Rozpocznij nagrywanie systemu MEA, klikając przycisk Start w interfejsie użytkownika.</li>
	<li>Rozpocznij sonikację FUS, naciskając prawy dolny przycisk na TPO (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A, Etykieta 7) i odczekaj co najmniej 5 minut między każdą rundą sonikacji, aby umożliwić neuronom powrót do stanu wyjściowego.</li>
	<li>Użyj impulsu wyzwalającego generowanego przez system FUS, aby dostosować sekwencję stymulacji FUS do nagrania MEA (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3B, Połączenie 3).</li>
</ol>
4. Przetwarzanie i analiza danych
<ol>
	<li>Przenieś dane z systemu MEA do komputera za pomocą połączenia USB (Rysunek 3B, Połączenie 4). Rozpocznij to, klikając panel Konfiguracja eksperymentu. Następnie wybierz typ danych, które chcesz nagrać. W takim przypadku zalecane są surowe kolce. Na koniec nazwij plik i wybierz żądaną lokalizację na dysku, aby zakończyć transfer. 
	UWAGA: Poniższe kroki można wykonać, uruchamiając wydany skrypt języka Python w programie https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod.</li>
	<li>Odczytaj dane z każdej z 16 elektrod.</li>
	<li>Zastosuj filtr pasmowoprzepustowy Butterwortha o szerokości pasma od 5 Hz do 3 kHz o rzędzie Butterwortha 8, 
	UWAGA: Aby zoptymalizować te wartości, należy wziąć pod uwagę szybkość wypalania określonych komórek i liczbę zaangażowanych komórek. Mnożąc te 2 wartości, można oszacować ogólną szybkość wypalania populacji komórek w eksperymencie.</li>
	<li>Zastosuj filtr Gaussa o σ = 3, aby wygładzić sygnał. 
	UWAGA: Parametr można zoptymalizować w oparciu o zalecane wartości z systemu MEA, ponieważ nadmierne wygładzanie może spowodować zniekształcenia danych po akwizycji, a zbyt małe wygładzanie wprowadziłoby niepożądane szumy.</li>
	<li>Ustaw próg, aby wykryć potencjalne skoki jako 5-krotność odchylenia standardowego sygnału wygładzonego przez Gaussa.</li>
	<li>Oblicz szybkość wypalania, dzieląc liczbę impulsów zarejestrowanych w oknie 50 ms we wszystkich 16 kanałach przez długość okna (tj. 50 ms). Przesuń okno wzdłuż sygnału do następnej klatki i powtórz obliczanie szybkostrzelności (rysunek uzupełniający 1).</li>
	<li>Analizuj sygnał, odczytując czas sonikacji FUS z przesłanych danych w oparciu o zmianę szybkości wyzwalania związaną z FUS.</li>
</ol>
5. Czyszczenie i ponowne użycie płytek wielodołkowych MEA
<ol>
	<li>Po zakończeniu eksperymentów użyj pipety, aby ostrożnie usunąć pożywkę z dołków w płytce wielodołkowej, uważając, aby uniknąć powierzchni elektrody.</li>
	<li>Dodaj 2 ml wody DG-DI do studzienki. Zassać i powtórzyć raz.</li>
	<li>Aby usunąć wszelkie komórki i zanieczyszczenia, dodaj do płytki mieszaninę 1 g detergentu enzymatycznego Terg-A-Zyme z 10 ml sterylnej wody DG-DI (0,3 ml na studzienkę). Pozostaw do inkubacji na noc w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Następnego dnia usuń roztwór ze studzienek i przepłucz je 1 ml sterylnej wody DG-DI.</li>
	<li>Inkubować płytkę wielodołkową przez 5-7 minut i aspirować. Powtórz ten krok 5 razy.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml sterylnej wody DG-DI do studzienki. Zapisać linię bazową oczyszczonej płytki wielodołkowej, aby sprawdzić, czy płytka MEA jest czysta. Oczyszczona płyta powinna wykazywać wzorce szumów gaussowskich o niskich wartościach natężenia.</li>
	<li>Oczyszczoną płytkę wielodołkową przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie gotowa do ponownego użycia. Zmieniaj wodę, w której przechowywane są MEA, co najmniej raz w miesiącu.</li>
</ol>

<ol><li>Kamimura, H. A. S., Conti, A., Toschi, N., Konofagou, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+neuromodulation%3A+Mechanisms+and+the+potential+of+multimodal+stimulation+for+neuronal+function+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Ultrasound neuromodulation: Mechanisms and the potential of multimodal stimulation for neuronal function assessment.</a> Frontiers in Physics. 8, 150(2020).</li>
<li>Manbachi, A., Kempski, K. M., Curry, E. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManbachi%2C+A+%22The+Abundant+Promise+of+Ultrasound+in+Neurosurgery%3A+A+Broad+Overview+and+Thoughts+on+Ethical+Paths+to+Realizing+Its+Benefits%22">The Abundant Promise of Ultrasound in Neurosurgery: A Broad Overview and Thoughts on Ethical Paths to Realizing Its Benefits</a>. , SPIE PRESS. Bellingham. Washington, USA. (2022).</li>
<li>Manbachi, A. Handbook for Clinical Ultrasound.Beginner's Guide to Fundamental Physics & Medical Ultrasound Applications. Audible. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.audible.com/pd/Handbook-for-Clinical-Ultrasound-Audiobook/B0983XJY83">https://www.audible.com/pd/Handbook-for-Clinical-Ultrasound-Audiobook/B0983XJY83</a> (2021).</li>
<li>Yoo, S., Mittelstein, D. R., Hurt, R. C., Lacroix, J., Shapiro, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ultrasound+excites+cortical+neurons+via+mechanosensitive+calcium+accumulation+and+ion+channel+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Focused ultrasound excites cortical neurons via mechanosensitive calcium accumulation and ion channel amplification.</a> Nature Communications. 13 (1), 493(2022).</li>
<li>Szczot, M., Nickolls, A. R., Lam, R. M., Chesler, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+form+and+function+of+PIEZO2%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The form and function of PIEZO2.</a> Annual Review of Biochemistry. 90, 507-534 (2021).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniature+ultrasound+ring+array+transducers+for+transcranial+ultrasound+neuromodulation+of+freely-moving+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Stimulation%3A+Basic%2C+Translational%2C+and+Clinical+Research+in+Neuromodulation%22%5BJournal%5D)">Miniature ultrasound ring array transducers for transcranial ultrasound neuromodulation of freely-moving small animals.</a> Brain Stimulation: Basic, Translational, and Clinical Research in Neuromodulation. 12 (2), 251-255 (2019).</li>
<li>Hoffman, B. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ultrasound+excites+action+potentials+in+mammalian+peripheral+neurons+in+part+through+the+mechanically+gated+ion+channel+PIEZO2%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Focused ultrasound excites action potentials in mammalian peripheral neurons in part through the mechanically gated ion channel PIEZO2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (21), e2115821119(2022).</li>
<li>Tyler, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanobiology+of+brain+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The mechanobiology of brain function.</a> Nature Reviews Neuroscience. 13 (12), 867-878 (2012).</li>
<li>Collins, M. N., Legon, W., Mesce, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibitory+thermal+effects+of+focused+ultrasound+on+an+identified%2C+single+motoneuron%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">The inhibitory thermal effects of focused ultrasound on an identified, single motoneuron.</a> eNeuro. 8 (2), (2021).</li>
<li>Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosensory+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurosensory mechanotransduction.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (1), 44-52 (2009).</li>
<li>Launay, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPM4+Is+a+Ca2%2B-activated+nonselective+cation+channel+mediating+cell+membrane+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TRPM4 Is a Ca2+-activated nonselective cation channel mediating cell membrane depolarization.</a> Cell. 109 (3), 397-407 (2002).</li>
<li>Cain, S. M., Snutch, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+T-type+calcium+channel+isoforms+to+neuronal+firing%5BTitle%5D)+AND+%22Channels%22%5BJournal%5D)">Contributions of T-type calcium channel isoforms to neuronal firing.</a> Channels. 4 (6), 475-482 (2010).</li>
<li>Taga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+electrophysiological+platform+for+modeling+ALS+with+regionally-specific+human+pluripotent+stem+cell-derived+astrocytes+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishment of an electrophysiological platform for modeling ALS with regionally-specific human pluripotent stem cell-derived astrocytes and neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (174), e62726(2021).</li>
<li>Taga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+spinal+cord+astrocytes+in+the+functional+maturation+of+motor+neurons+in+a+multielectrode+array+system%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multielectrode array system.</a> Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).</li>
<li>Manuel, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+neuromodulation+depends+on+pulse+repetition+frequency+and+can+modulate+inhibitory+effects+of+TTX%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ultrasound neuromodulation depends on pulse repetition frequency and can modulate inhibitory effects of TTX.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15347(2020).</li>
<li>Treeby, B. E., Cox, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((k-wave%3A+Matlab+toolbox+for+the+simulation+and+reconstruction+of+photoacoustic+wave+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">k-wave: Matlab toolbox for the simulation and reconstruction of photoacoustic wave fields.</a> J. Biomed. Opt. 15 (2), 021314(2010).</li>
<li>Akhtar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+peripheral+focused+ultrasound+neuromodulation+of+the+celiac+plexus+ameliorates+symptoms+in+a+rat+model+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Noninvasive peripheral focused ultrasound neuromodulation of the celiac plexus ameliorates symptoms in a rat model of inflammatory bowel disease.</a> Experimental Physiology. 106 (4), 1038-1060 (2021).</li>
<li>Smirnova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+intelligence+%28OI%29%3A+The+new+frontier+in+biocomputing+and+intelligence-in-a-dish%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Science%22%5BJournal%5D)">Organoid intelligence (OI): The new frontier in biocomputing and intelligence-in-a-dish.</a> Frontiers in Science. 1, 1017235(2023).</li>
<li>Saccher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ultrasound+neuromodulation+on+a+multi-well+MEA%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectronic+Medicine%22%5BJournal%5D)">Focused ultrasound neuromodulation on a multi-well MEA.</a> Bioelectronic Medicine. 8 (1), 2(2022).</li>
<li>Yger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spike+sorting+toolbox+for+up+to+thousands+of+electrodes+validated+with+ground+truth+recordings+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A spike sorting toolbox for up to thousands of electrodes validated with ground truth recordings in vitro and in vivo.</a> eLife. 7, e34518(2018).</li>
<li>Babakhanian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+low+intensity+focused+ultrasound+on+liposomes+containing+channel+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Effects of low intensity focused ultrasound on liposomes containing channel proteins.</a> Scientific Reports. 8, 17250(2018).</li>
<li>Liang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+an+Accurate+Benchtop+Characterization+Device%3A+An+acoustic+measurement+platform+for+localizing+and+implementing+therapeutic+ultrasound+devices+and+equipment+%28amplitude%29%5BTitle%5D)+AND+%222022+Design+of+Medical+Devices+Conference%22%5BJournal%5D)">Designing an Accurate Benchtop Characterization Device: An acoustic measurement platform for localizing and implementing therapeutic ultrasound devices and equipment (amplitude).</a> 2022 Design of Medical Devices Conference. , Minneapolis, MN, USA. (2022).</li>
<li>Ko, H., Yoon, S. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+neuromodulation+with+gamma+oscillation+as+a+new+strategy+for+Alzheimer+disease%3A+A+narrative+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Yeungnam+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Optogenetic neuromodulation with gamma oscillation as a new strategy for Alzheimer disease: A narrative review.</a> Journal of Yeungnam Medical Science. 39 (4), 269-277 (2022).</li>
<li>White, M., Mackay, M., Whittaker, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+optogenetics+into+the+human+brain%3A+Opportunities+and+challenges+in+clinical+trial+design%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Access+Journal+of+Clinical+Trials%22%5BJournal%5D)">Taking optogenetics into the human brain: Opportunities and challenges in clinical trial design.</a> Open Access Journal of Clinical Trials. 2020, 33-41 (2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów. Amir Manbachi uczy i konsultuje dla BK Medical (GE Healthcare) i Neurosonics Medical oraz jest wynalazcą wielu zgłoszonych do opatentowania technologii FUS. Betty Tyler ma fundusze na badania z NIH i jest współwłaścicielką Accelerating Combination Therapies (w tym akcji lub opcji). Ashvattha Therapeutics Inc. uzyskała licencję na jeden z jej patentów i jest udziałowcem Peabody Pharmaceuticals.

W artykule opisano nowatorską metodę, która może być wykorzystana do rejestrowania aktywności neuronalnej w HiPSC podczas neuromodulacji FUS. Protokół ten można uogólnić na różne przetworniki FUS i systemy MEA. Aby powtórzyć wyniki zaobserwowane za pomocą opisanego protokołu, badacz powinien upewnić się, że punkt ogniskowy przetwornika jest większy niż obszar dna studni MEA. Ponadto, jeśli używane są różne linie komórek neuronalnych, parametry filtra muszą być dostrojone do oczekiwanej odpowiedzi częstotliwościowej dla komórek w studni. W przypadku braku możliwości uzyskania reprezentatywnych wyników należy rozważyć modyfikację wyżej wymienionych parametrów (np. długości impulsu, intensywności, cyklu pracy itp.).
Chociaż praca ta wykazała wzrost szybkości wypalania po stymulacji FUS, należy zebrać więcej danych, aby wykazać powtarzalność tego odkrycia, zanim zostaną wyciągnięte jakiekolwiek wnioski. Protokół ten dziedziczy ograniczenia systemów MEA, które zazwyczaj mają słabości wynikające z bezpośredniej rejestracji sygnału prądu mikroelektrody. Chociaż bezpośredni kontakt z neuronem zapewnia lepszą czułość, może zmienić komórkę i wpłynąć na dokładność pomiaru. Ponadto, ze względu na niewielkie rozmiary studzienek, nasz system nie obejmuje tkanki obwodowej, która również może odgrywać rolę w neuromodulacji17. Może to ograniczyć możliwość zastosowania wniosków wyciągniętych z tej konfiguracji do środowisk in vivo . Aby badać bardziej złożone odpowiedzi sieciowe, należy zaprojektować system MEA o większej gęstości kanałów, aby poprawić jego czułość18. Zidentyfikowano kilka przyszłych kierunków dla tego proponowanego systemu, w tym wykorzystanie suwnicy 3D do przytrzymania przetwornika i zapewnienia dokładnego umieszczenia19. Dodatkowe ulepszenia można wprowadzić w odniesieniu do algorytmu przetwarzania końcowego, w tym wykorzystanie algorytmu sortowania impulsowego20 do klasyfikowania poszczególnych neuronów. Proces ten byłby korzystny dla rozplątania odpowiedzi neuronów wielocząsteczkowych w przyszłych badaniach nad mechanizmami FUS. Co najważniejsze, konieczne jest włączenie dodatkowych modalności stymulacji, takich jak bodźce chemiczne, elektryczne i optyczne, aby wyjaśnić mechanizmy leżące u ich podstaw. Metody te mogą zmieniać właściwości i zachowania neuronów, na przykład poprzez hamowanie określonych kanałów jonowych15 lub modyfikację charakterystyki błony21. Modulując główne czynniki w obrębie hipotetycznego szlaku sygnałowego, naukowcy mogą zidentyfikować udział każdego czynnika w kontrolowanych środowiskach i ostatecznie rzucić światło na złożone interakcje w grze.
Stymulacja elektryczna22 jest jedną z najbardziej uznanych technik neuromodulacji, z długą historią udanych zastosowań w warunkach klinicznych i badawczych. Natomiast FUS i optogenetyka23 są stosunkowo nowymi modalnościami, które zyskały na popularności w ostatnich latach. Głównymi zaletami FUS jest jego nieinwazyjność i zdolność do stymulacji neuronów na głębokościach, które mogą być trudne do osiągnięcia za pomocą innych technik, w tym stymulacji elektrycznej i optogenetyki. Jednak, podobnie jak optogenetyka24, FUS ma pewne ograniczenia związane z modelowaniem propagacji fal i związanych z tym odpowiedzi neuronalnych. Uchwycenie złożoności heterogenicznych właściwości akustycznych tkanek in vivo może być trudne, co prowadzi do niepewności w polu ciśnienia, a w konsekwencji w odpowiedziach neuronalnych. Ta trudność w dokładnym modelowaniu tych właściwości stanowi wyzwanie podczas optymalizacji techniki pod kątem konkretnych zastosowań w świecie rzeczywistym. Nieodłączna złożoność podkreśla znaczenie systemów in vitro , takich jak ten w tym badaniu, ponieważ umożliwiają one bezpośrednie badanie reakcji w warunkach kontrolowanego natężenia akustycznego.
Podsumowując, system ten stanowi wysokowydajną platformę in vitro do badania neuromodulacyjnego wpływu FUS na ludzkie neurony. Dzięki temu systemowi można badać mechanizmy działania FUS, mierząc reakcje elektryczne ludzkich neuronów pod wpływem różnych poziomów i rodzajów stymulacji w kontrolowanym środowisku. W związku z tym stanowi cenne narzędzie uzupełniające do modeli ludzkich i zwierzęcych powszechnie stosowanych w tej dziedzinie.

Skoncentrowane ultradźwięki (FUS) to obiecująca metoda neuromodulacji, która umożliwia nieinwazyjną stymulację na głębokości centymetrowej z rozdzielczością poniżej milimetra1,2,3. Pomimo tych mocnych stron, wpływ kliniczny FUS jest ograniczony, częściowo z powodu braku wiedzy na temat jego mechanizmu działania. Bez solidnych podstaw teoretycznych badacze i klinicyści napotykają trudności w dostosowaniu terapii do specyficznych potrzeb poszczególnych pacjentów w różnych warunkach. Wybitna teoria zaproponowana przez Yoo et al.4 sugeruje, że mechanowrażliwe kanały jonowe są odpowiedzialne za aktywację neuronów. Jednak teoria ta nie wyjaśnia aktywacji FUS w neuronach ludzkiego mózgu, które nie mają tych kanałów5. Ta niejednoznaczność ogranicza wykorzystanie FUS w klinice, ponieważ uniemożliwia dostrojenie parametrów FUS w celu optymalizacji wyników leczenia.
Wcześniejsze podobne badania wykorzystywały szereg podejść do badania fizjologicznych mechanizmów leżących u podstaw FUS i określenia optymalnych parametrów stymulacji. Kluczowym krokiem w tym procesie jest monitorowanie odpowiedzi neuronalnych jako sprzężenia zwrotnego, co można osiągnąć za pomocą metod obejmujących monitorowanie bramek jonowych, takich jak obrazowanie jonów wapnia4, obrazowanie optyczne1 i zapis elektrofizjologiczny ex vivo (np. electromiography6 lub elektrofizjologia skórno-nerwowa7). Jednak większość z tych badań wykorzystuje neurony inne niż ludzkie lub podejścia in vivo, które mogą wprowadzać dodatkowe odchylenia z powodu nieoptymalnych kontroli. Z kolei użycie elektrod do pomiaru sygnałów neuronalnych w neuronach indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych (HiPSC) in vitro zapewnia bardziej czułe pomiary i większą kontrolę nad środowiskiem eksperymentalnym. W niniejszej pracy opracowano system in vitro wykorzystujący układy mikroelektrod (MEA) do pomiaru odpowiedzi elektrycznych neuronów HiPSC po stymulacji FUS, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1. System ten umożliwia naukowcom w społeczności monitorowanie odpowiedzi neuronalnych podczas zmiany parametrów ultradźwięków (np. częstotliwości, długości impulsu, intensywności). Dodatkowo, system ten umożliwia wysoki poziom kontroli wrażliwości neuronów na bodźce fizyczne (np. temperaturę, ciśnienie i kawitację)8,9, ponieważ funkcjonalność kanałów jonowych neuronów może być manipulowana genetycznie i farmaceutycznie (np. za pomocą gadolinu do hamowania kanałów jonowych)10,11,12. Ta kontrola na poziomie molekularnym może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów stojących za neuromodulacyjnym działaniem FUS.

<table><tbody><tr><td>MEA System</td><td>Axion Biosystem Inc.</td>Częstotliwość próbkowania <td>Maestro Edge</td><td>: 11500 Hz</td></tr><tr><td>MEA Plate</td><td>Axion Biosystem Inc.</td><td>CytoView MEA</td><td>Elektroda i studzienka: 16 elektrod w 24 dołkach</td></tr><tr><td>Interfejs płytki studziennej Amcor</td><td>Inc.</td><td>Parafilm PM996; P7793</td><td>Grubość: 127 i mikro; m</td></tr><tr><td>CO2 Zbiornik i reduktor do hodowli</td><td>AirGas Inc./ Harris Inc.</td><td>9296NC</td><td>Stężenie: 5%</td></tr><tr><td>Pożywka</td><td>hodowlana ThermoFisher Inc.</td><td>Laminina; 23017-015</td><td>Stężenie: 1 &mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Neurony HiPSC</td><td>Peprotech</td><td>CIPS i pochodne GM01582; 450-10</td><td>Stężenie: 10 ng / ml (patrz Taga i in. [2021]13)</td></tr><tr><td>Przetwornik</td><td>Sonic Concepts Inc.</td><td>CTX250; 008</td><td>Częstotliwość środkowa: 250 kHz</td></tr><tr><td>Dopasowanie do sieci</td><td>Sonic Concepts Inc.</td><td>CTX250; NFS102v2</td><td>Impedancja: 50 &Omega;</td></tr><tr><td>Moc wyjściowa przetwornika (TPO)</td><td>Sonic Concepts Inc.</td><td>Wersja 4.1; 020</td><td>Częstotliwość: od 250 kHz do 2,5 MHz</td></tr><tr><td>Membrana</td><td>McMaster Inc.</td><td>Guma silikonowa; 5542N115</td><td>Grubość: 0,0127 cm</td></tr><tr><td>Żel sprzęgający</td><td>Parker Laboratory Inc.</td><td>Aquasonic 100; B08DDWG GXB</td><td>Lepkość: 130 000&ndash; 185 000 policjantów</td></tr><tr><td>Połączenie z posiadaczem sondy</td><td>McMaster Inc.</td><td>Pręt gwintowany Steal; 90322A661</td><td>Długość: 1&ndash; </td></tr><tr><td>Długa wirówka</td> 1/2" <td>ThermoFisher Inc.</td><td>Sorvall Legend X1R; 75004261</td><td>Maksymalne przyspieszenie: 10&ndash; 25,830 x g</td></tr><tr><td>Hydrofon</td><td>Sonic Concepts Inc.</td><td>Y-104; 009</td><td>Zakres: 50 kHz&ndash; Zbiornik na wodę 1,9 MHz</td></tr><tr><td></td><td>Sonic Concepts Inc.</td><td>Rozmiar WT</td><td>: 30 cm x 30 cm x 30 cm</td></tr><tr><td>Jednostka klimatyzująca wodę</td><td>Sonic Concepts Inc.</td><td>WCU; SN006</td><td>Prędkość przepływu: maksymalnie 50 ml / s</td></tr><tr><td>oscyloskop</td><td>Rohde-Schwarz Inc.</td><td>RTC1002</td><td>Częstotliwość próbkowania: do 50 MHz</td></tr><tr><td>Stage</td><td>Sonic Concepts Inc.</td><td>MicroStage; 2</td><td>Dokładność: 1 &mikro; m</td></tr><tr><td>Blacha termochromowa</td><td>TIPTEMP Inc.</td><td>Blacha ciekłokrystaliczna; TLCSEN337</td><td>Zakres: 22&ndash; 24 &stopni; C</td></tr><tr><td>Komputer</td><td>Microsoft Surface</td><td>Surface Pro</td><td>CPU i5 1035G4: Oprogramowanie do przesyłania danych 3,7 GHz</td></tr><tr><td></td><td>Mathworks Inc.</td><td>Oprogramowanie do przetwarzania MATLAB</td><td>2021b</td></tr><tr><td></td><td>Python Software Foundation</td><td>Python</td><td>w wersji 3.7.10</td></tr></tbody></table>

zogniskowana neuromodulacja ultradźwiękowa ludzkich kultur nerwowych in vitro w wielodołkowych układach mikroelektrod

Focused Ultrasound Neuromodulation of Human In Vitro Neural Cultures in Multi-Well Microelectrode Arrays

Neuromodulacyjne efekty skoncentrowanych ultradźwięków (FUS) zostały zademonstrowane na modelach zwierzęcych, a FUS jest z powodzeniem stosowany w leczeniu zaburzeń ruchowych i psychiatrycznych u ludzi. Jednak pomimo sukcesu FUS, mechanizm leżący u podstaw jego wpływu na neurony pozostaje słabo poznany, co utrudnia optymalizację leczenia poprzez dostrojenie parametrów FUS. Aby wypełnić tę lukę w wiedzy, zbadaliśmy ludzkie neurony in vitro przy użyciu neuronów hodowanych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (HiPSC). Wykorzystanie HiPSC pozwala na badanie specyficznych dla człowieka zachowań neuronalnych zarówno w stanach fizjologicznych, jak i patologicznych. W niniejszym raporcie przedstawiono protokół stosowania systemu o wysokiej przepustowości, który umożliwia monitorowanie i kwantyfikację neuromodulacyjnego wpływu FUS na neurony HiPSC. Zmieniając parametry FUS i manipulując neuronami HiPSC poprzez modyfikacje farmaceutyczne i genetyczne, naukowcy mogą ocenić reakcje neuronalne i wyjaśnić neuromodulacyjny wpływ FUS na neurony HiPSC. Badania te mogą mieć znaczące implikacje dla rozwoju bezpiecznych i skutecznych terapii opartych na FUS dla szeregu zaburzeń neurologicznych i psychiatrycznych.

Podsumowując, przedstawiamy protokół umożliwiający monitorowanie neuromodulacji FUS in vitro z wykorzystaniem neuronów hodowanych z HiPSC. Ogólna platforma systemowa służąca do stymulacji neuronów pochodzących z HiPSC oraz rejestrowania odpowiadających im odpowiedzi elektrycznych do analizy została przedstawiona na Rysunku 1. Niniejsze badanie koncentruje się na stymulacji neuronów za pomocą FUS i rejestrowaniu odpowiedzi elektrycznych w systemie MEA, co pokazano na Rysunku 2. Komponenty peryferyjne systemów FUS i MEA oraz ich połączenia zostały zilustrowane na Rysunku 3.
Charakteryzację ogniska wykonuje się przed eksperymentami neuronalnymi, aby upewnić się, że dno dołka jest w pełni pokryte ogniskiem FUS. W celu oceny systemu FUS należy przeprowadzić wizualizację plamki ogniskowej na arkuszach termochromowych, jak pokazano na Ryc. 4. Po charakteryzacji plamki ogniskowej należy przeprowadzić etapy postprocessingu, w tym filtrowanie, progowanie i obliczanie częstotliwości wyładowań, które zostały podsumowane na Ryc. 5 oraz Ryc. 6. Kroki te są niezbędne do odzyskania użytecznych sygnałów poprzez odfiltrowanie szumów z otoczenia, a tym samym do uzyskania wglądu w zmiany aktywności neuronalnej wywołane przez FUS. Wykresy rastrowe na Ryc. 6A-B przedstawiają wykryte kolce w każdym kanale. Ponieważ całe dno dołka znajduje się w punkcie ogniskowym przetwornika FUS, oczekuje się, że FUS zmieni częstotliwość wyładowań we wszystkich elektrodach. Zmiana ta jest przedstawiona na wykresie częstotliwości wyładowań na Ryc. 6C, który pokazuje, że wybrane parametry stymulacji doprowadziły do zwiększenia częstotliwości wyładowań neuronalnych. Konkretnie, częstotliwość wyładowań przed FUS (tzn. bazowa) wynosiła 140 Hz ± 116,7 Hz, podczas gdy częstotliwość wyładowań po FUS przy zastosowaniu ciągłej fali FUS wynosiła 786 Hz ± 419,4 Hz. Dodatkowo Ryc. 6C pokazuje, w jaki sposób zmiana parametrów FUS (np. zastosowanie falowanej fali FUS zamiast ciągłej) może zmienić wielkość zmiany częstotliwości wyładowań, a także czas potrzebny na powrót neuronów do stanu bazowego. Niskointensywny ultradźwięk skupiony (LIFU) nie powoduje znaczącego ogrzewania kultur, szczególnie w porównaniu z wysokointensywnym ultradźwiękiem skupionym, którego celem jest uzyskanie zmiany termicznej. Brak klinicznie istotnej zmiany temperatury jest potwierdzony obliczeniami teoretycznymi i symulacjami (Ryc. uzupełniająca 2). Nawet w ekstremalnych przypadkach parametrów eksperymentalnych FUS wymienionych w Tabeli 1, można było zaobserwować jedynie minimalny wzrost temperatury o około 0,04 °C.
Zastosowanie wykresu częstości wyładowań pozwala na ilościowe określenie efektów neuromodulacyjnych FUS i może służyć do rozróżnienia odpowiedzi pobudzających od hamujących. Istotną zaletą wielodołkowej płytki MEA jest możliwość jej wielokrotnego wykorzystania do badania różnych stanów neuronalnych oraz parametrów stymulacji w sposób wysokoprzepustowy.
<img alt="Schemat stymulacji wiązką FUS neuronów, potok przetwarzania, rejestracja elektryczna, detekcja wzorca wyładowań." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65115/65115fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przegląd platformy in vitro do neuromodulacji neuronów w studience za pomocą skupionego ultradźwięku (FUS) oraz pomiaru ich aktywności neuronalnej z wykorzystaniem matrycy mikrolektrod. Każda elektroda (linie czerwona, zielona i niebieska) rejestruje sygnały z populacji neuronów w obrębie jednej studienki. Zaimplementowano potok przetwarzania w celu przekształcenia surowych rejestracji elektrycznych neuronów w detekcję wzorców wyładowań neuronalnych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/65115fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat układu skoncentrowanego ultradźwięku oraz zdjęcie urządzenia MEA do badania neurostymulacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65115/65115fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Neuromodulacja FUS z użyciem wielodołkowej macierzy mikroelektrod (MEA). (A) Schemat układu do neuromodulacji FUS z wielodołkową macierzą MEA. Fale akustyczne generowane przez przetwornik FUS rozprzestrzeniają się przez stożek FUS wypełniony odgazowaną wodą i są sprzęgane za pomocą żelu ultradźwiękowego. Parafilm jest przymocowany do dołka za pomocą gumki recepturki, aby zapobiec kontaminacji. Płytka MEA przesyła zapisy elektryczne z neuronów do systemu MEA. (B) Zdjęcie przetwornika FUS na płytce wielodołkowej umieszczonej w systemie MEA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/65115fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Konfiguracja systemu TPO i MEA dla eksperymentu z przetwornikiem, z zaznaczeniem połączeń i interfejsu sprzętowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65115/65115fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Konfiguracja platformy in vitro. (A) Widok z przodu konfiguracji platformy in vitro. Wyjście mocy przetwornika (TPO; po lewej) służy do programowania parametrów FUS. System MEA (po prawej) rejestruje aktywność elektryczną neuronów w płytce wielodołkowej, które są neuromodulowane przez przetwornik FUS. (B) Widok z tyłu konfiguracji platformy in vitro z połączeniami z sieci dopasowującej (1) do TPO oraz (2) do przetwornika. (3) Połączenie z systemu MEA do TPO synchronizuje akwizycję danych. (4) Połączenie z systemu MEA do komputera w celu przesyłania danych. (5) Połączenie zasilania systemu MEA. (6) Połączenie zasilania systemu FUS. (7) Przycisk sonikacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/65115fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat mapy ciepła i eksperyment optyczny pokazujący rozkład termiczny przed i po podgrzaniu w odległości 6 mm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65115/65115fig04v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Charakterystyka przetwornika FUS. (A) Mapa ciśnienia ogniska przy użyciu parametrów FUS szczegółowo opisanych w Tabeli 1, zmierzona za pomocą systemu AMPLITUDE15. (B) Stan przed i po sonikacji arkusza termochromowego umieszczonego na dnie dołka przy użyciu układu eksperymentalnego przedstawionego na Rycynie 3. Arkusz termochromowy zmienia kolor w odpowiedzi na zmiany temperatury, co zapewnia wizualną walidację skutecznej stymulacji w miejscu położenia neuronów. Maksymalna średnia intensywność impulsu w szczycie przestrzennym (ISPPA) wynosząca 30 W/cm2 oraz ciągła sonikacja przez 3 min zostały dobrane tak, aby drastycznie zmienić temperaturę lokalną w celu lepszej wizualizacji takiego punktu ogniskowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/65115fig04largev2.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Schemat procesu detekcji kolców z użyciem filtrów pasmowoprzepustowych i Gaussa; wykres amplitudy w funkcji czasu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65115/65115fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Potok przetwarzania. Krok 1: Surowe zapisy elektryczne są rejestrowane z N = 16 kanałów. Kolejne kroki przedstawiają proces z wykorzystaniem kanału 16 (obramowanego na czerwono). Krok 2: Dla każdego kanału stosowany jest filtr pasmowoprzepustowy Butterwortha (pasmo od 5 Hz do 3 kHz), a następnie filtr Gaussa (σ = 3). Próg jest ustawiany na pięciokrotność odchylenia standardowego sygnału w oknie 2 s wycentrowanym na początku sonikacji. Krok 3: Sygnały powyżej lub poniżej progu są klasyfikowane jako kolce. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/65115fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy rastrowe impulsów i wykres częstotliwości wyładowań pokazują efekty stymulacji FUS; schemat analizy aktywności neuronalnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65115/65115fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Wykresy rastrowe i częstotliwości wyładowań. (A) Wykres rastrowy wykrytych impulsów w każdym kanale w funkcji czasu sonikacji. Czas stymulacji FUS zaznaczono czerwoną linią. (B) Wykres rastrowy neuronów przy różnych ustawieniach FUS wraz z ciągłym FUS dla porównania. (C) Częstotliwość wyładowań obliczono przy użyciu przesuwnego okna o szerokości 50 ms. Średnie częstotliwości wyładowań przed i po neuromodulacjach FUS wynosiły odpowiednio 140 Hz i 786 Hz. Przy pulsacyjnym FUS średnie częstotliwości wyładowań wynosiły 230 Hz i 540 Hz. Zaobserwowano, że ten zestaw zmiennych stymulacji FUS indukuje krótszą aktywację i mniejszą zmianę częstotliwości. Proces obliczania częstotliwości wyładowań szczegółowo opisano na Rysunku uzupełniającym 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/65115fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Parametr</td>
			<td>Wartość</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maksymalna moc/kanał</td>
			<td>1,200 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przeczywisty</td>
			<td>0,749 W/kanał.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPPA</td>
			<td>10,79 W/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPTA</td>
			<td>0,05 W/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Długość serii</td>
			<td>0,100 ms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Częstotliwość</td>
			<td>250,00 kHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ogniskowanie</td>
			<td>39,800 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Okres</td>
			<td>20 000 ms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>minutnik</td>
			<td>60,000 s</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Parametry skupionej ultradźwiękowej stymulacji (FUS) ustawione na urządzeniu TPO dla badania przedstawionego na Rysunku 4.
Rysunek uzupełniający 1: Przetwarzanie wykresu rastrowego na częstotliwość wyładowań. Krok 1: Policz kolce we wszystkich kanałach, aby uzyskać liczbę zdarzeń w określonym przesuwnym oknie czasowym. Uwaga: W tym przypadku, dla lepszej ilustracji, wybrano większe okno przesuwne (ustawione na 0.1 s). Krok 2: Przelicz liczbę kolców na długość okna na liczbę kolców na sekundę (np. tutaj pomnożono liczbę zdarzeń przez 10, aby przeliczyć je na herce [Hz], a następnie podzielono przez 1 000, aby uzyskać wartość w kilohertcach [kHz]). Krok 3: Krzywa częstotliwości wyładowań uzyskana w wyniku tych działań. Otwarty zestaw narzędzi wraz z próbkami danych jest dostępny na GitHubie (https://github.com/Rxliang/FUSNeuromod). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/SupFig1.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 2: Profil temperatury z wyników symulacji K-wave dla LIFU16. Na podstawie mapy intensywności akustycznej przedstawionej na Rysunku 4, wynik symulacji K-wave sugeruje maksymalny wzrost temperatury o 0,04 °C w obszarze centralnym strefy ogniskowania (promień: 2 mm), przy zastosowaniu ekstremalnych parametrów eksperymentalnego FUS wymienionych w Tabeli 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65115/SupFig2.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Tutaj prezentujemy protokół korzystania z systemu o wysokiej przepustowości, który umożliwia monitorowanie i kwantyfikację neuromodulacyjnych efektów skoncentrowanych ultradźwięków na ludzkie neurony z pluripotencjalnych komórek macierzystych (HiPSC) indukowanych przez człowieka.

Zogniskowana neuromodulacja ultradźwiękowa ludzkich kultur nerwowych in vitro w wielodołkowych układach mikroelektrod

The neuromodulatory effects of focused ultrasound (FUS) have been demonstrated in animal models, and FUS has been used successfully to treat movement and ...

Zogniskowana neuromodulacja ultradźwiękowa. Ta rozwijająca się ekscytująca dziedzina jest tematem trwających badań W dziedzinie skoncentrowanych ultradźwięków optymalne parametry stymulacji dla konkretnego zastosowania są często nieznane. Niniejsze badanie ma na celu systematyczne określenie tych parametrów poprzez empiryczne testy in vitro na neuronach.Metoda ta może zbadać mechanizm neuronalny leżący u podstaw neuromodulacji dźwięku, umożliwiając badaczowi analizę odpowiedzi neuronów zmodyfikowanych genetycznie i farmaceutycznie. Aby rozpocząć aspirację pożywki hodowlanej, aby wypełnić pojedynczą studzienkę w 24-dołkowej płytce do hodowli neuronów, z osadzonymi układami mikroelektrod lub MEA. Po przygotowaniu 300 mililitrów odgazowanej i zdejonizowanej wody należy ostrożnie napełnić ją zogniskowanym stożkiem ultradźwięków lub przetwornika FUS.Za pomocą niestandardowego pręta gwintowanego przymocuj uchwyt wydrukowany w 3D do ramy. Ustaw ramę tak, aby głowica przetwornika FUS znajdowała się nad studzienką, która będzie stymulowana. Użyj gumki, aby zabezpieczyć paraformę nad studzienką na 24-dołkowej płytce MEA zawierającej pożywkę i ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste lub HIPSC.Ustaw parametry FUS na wyjściu mocy przetwornika lub panelu sterowania TPO. Wartości różnych parametrów są wyświetlane na ekranie. Następnie nałóż żel sprzęgający na wierzch paraformy nad studzienką i opuść przetwornik FUS do żelu sprzęgającego, zapewniając kontakt z żelem przy minimalnych pęcherzykach powietrza.Rozpocznij sonikację FUS, naciskając prawy dolny przycisk na TPO i odczekaj co najmniej pięć minut między każdą rundą sonikacji, aby umożliwić neuronom powrót do stanu wyjściowego. Jeśli połączenie jest odpowiednie, impuls wyzwalający generowany przez system FUS automatycznie wyrówna sekwencję stymulacji FUS z zapisem MEA. Analizuj sygnał, odczytując czas sonikacji FUS z danymi transferu w oparciu o zmianę szybkości wyzwalania związaną z FUS.Ognisko FUS scharakteryzowano zarówno poprzez jego wizualizację na arkuszach termochromatycznych, jak i poprzez hydrofon wodny. Etapy przetwarzania końcowego, w tym filtrowanie, progowanie i obliczanie szybkości wypalania, odfiltrowały szum z otoczenia, aby ujawnić zmiany aktywności neuronalnej spowodowane przez FUS. Wykresy rastrowe pokazywały wykryte skoki w każdym kanale.Wykres szybkości wypalania wykazał, że wybrane parametry stymulacji zwiększały szybkość wypalania neuronów. Szybkostrzelność przed FUS wynosiła 140 herców, podczas gdy szybkość wypalania po FUS wynosiła 786 Hz z ciągłą falą FUS. Zmiana trybu sonikacji FUS zmieniła również czas, po którym neurony powrócą do stanu wyjściowego.Bardzo ważne jest, aby dokładnie zminimalizować powstawanie pęcherzyków podczas umieszczania przetwornika na granicy faz paraform. Kolejną kwestią jest moc elektryczna dostarczana do przetwornika. Moc musi być wystarczająco wysoka, aby wywołać efekt, ale musi być wystarczająco niska, aby nie wywołać uszkodzenia przetwornika lub komórki.Technika ta może zidentyfikować optymalny parametr stymulacji w leczeniu choroby Parkinsona i innych zaburzeń neurologicznych, eliminując ryzyko związane z inwazyjną operacją, w tym nieodwracalne uszkodzenia, długą rekonwalescencję i czas rehabilitacji. Konieczne są dalsze wysiłki w celu odkrycia jego mechanizmu i kontroli optymalizacji przedklinicznej, aby zapewnić bezpieczeństwo w przyszłych badaniach, w tym badaniach klinicznych.

focused-ultrasound-neuromodulation-human-vitro-neural-cultures-multi

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten protokół dostarcza niezbędnych informacji do zakładania, pielęgnacji, rejestrowania i elektrycznego stymulowania kultur na MEA. Sieci in vitro dostarczają środków do zadawania fizjologicznie istotnych pytań na poziomie sieci i komórki, co prowadzi do lepszego zrozumienia funkcji i dysfunkcji mózgu.

Jak hodować, rejestrować i stymulować sieci neuronowe na matrycach mikroelektrod (MEA)

Wideo pokazuje, jak używać zestawu mikroelektrod (MEA) do rejestrowania aktywności elektrofizjologicznej neuronów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC). Aktywność elektrofizjologiczna z wielodołkowego MEA zawierającego kokulturę neuronów i astrocytów jest rejestrowana w celu wykrycia potencjałów czynnościowych z wielu neuronów w sieci, potwierdzając pomyślne różnicowanie hiPSC w neurony.

Pomiar aktywności elektrofizjologicznej sieci neuronalnych za pomocą układów mikroelektrod

Ten film demonstruje procedurę użycia matrycy wieloelektrodowej (MEA) do pomiaru fizjologii synaptycznej w sferach kokultury 3D. Metoda ta pozwala zrozumieć dynamikę sieci neuronowych i aktywność impulsów sieci synaptycznych w sferach 3D.

Wykorzystanie matryc wieloelektrodowych do pomiaru fizjologii synaptycznej w sferach kokultury 3D

Ten film demonstruje metodę indukowania modulacji aktywności neuronalnej w hodowanych ludzkich neuronach pochodzących z iPSC w wielodołkowym układzie mikroelektrod lub systemie MEA za pomocą skoncentrowanego przetwornika ultradźwiękowego.

Neuromodulacja indukowana ultradźwiękami za pomocą systemu mikroelektrod

W tej pracy nowatorski model eksperymentalny, w którym hodowle neuronów 3D są sprzężone z płaskimi matrycami mikroelektrod (MEAs), presented. 3D sieci są budowane przez umieszczanie neuronów w rusztowaniu wykonanym ze szklanych mikrokulek, na których neurony rosną i tworzą połączone ze sobą struktury 3D.

Łączenie kultur neuronalnych 3D z matrycami mikroelektrod: innowacyjny model eksperymentalny in vitro

Ilustrujemy, jak przeprowadzić rejestrację i elektryczną modulację aktywności padaczkowej indukowanej przez 4-aminopirydynę w wycinkach mózgu gryzoni za pomocą układów mikroelektrod. Niestandardowa komora rejestracyjna utrzymuje żywotność tkanek podczas długotrwałych sesji eksperymentalnych. Mapowanie elektrod na żywo i wybór par stymulujących odbywa się za pomocą niestandardowego graficznego interfejsu użytkownika.

Rejestracja i modulacja aktywności padaczkowej w wycinkach mózgu gryzoni sprzężonych z układami mikroelektrod

Ten protokół ma na celu pokazanie, jak połączyć układy mikroelektrod in vitro z urządzeniami mikroprzepływowymi do badania transmisji potencjału czynnościowego w kulturach neuronalnych. Analiza danych, a mianowicie wykrywanie i charakteryzacja rozchodzących się potencjałów czynnościowych, odbywa się za pomocą nowego, zaawansowanego, a jednocześnie przyjaznego dla użytkownika i ogólnodostępnego narzędzia obliczeniowego.

Łączenie mikrofluidyki z układami mikroelektrod do badania komunikacji neuronalnej i propagacji sygnałów aksonalnych

Tutaj używamy HD-MEA, aby zagłębić się w dynamikę obliczeniową dużych zespołów neuronalnych, szczególnie w hipokampie, obwodach opuszki węchowej i ludzkich sieciach neuronowych. Uchwycenie aktywności czasoprzestrzennej w połączeniu z narzędziami obliczeniowymi zapewnia wgląd w złożoność zespołu neuronalnego. Metoda ta pomaga lepiej zrozumieć funkcje mózgu, potencjalnie identyfikując biomarkery i metody leczenia zaburzeń neurologicznych.

Rejestrowanie i analizowanie multimodalnej dynamiki zespołów neuronalnych na zintegrowanej z CMOS matrycy mikroelektrod o dużej gęstości

Protokół obejmuje produkcję przetworników, raportowanie parametrów, zabieg chirurgiczny i rejestrację sygnału dla całego operacyjnego przepływu pracy jednoczesnej skoncentrowanej neuromodulacji ultradźwiękowej i rejestracji fotometrii światłowodowej u myszy o swobodnym ruchu.

Jednoczesna zogniskowana neuromodulacja ultradźwiękowa i zapis fotometrii światłowodowej w myszy swobodnej

Ten protokół ma na celu stabilne umieszczanie grzbietowo-brzusznych zrośniętych asembloidów na wieloelektrodowych układach do modelowania padaczki in vitro.

Wieloelektrodowa platforma matrycowa do modelowania padaczki przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych zespołów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do rejestracji mikro-elektrokortykografii o wysokiej gęstości (μEcoG) u szczurów i myszy, w tym metody chirurgiczne, implantacyjne i rejestracyjne. Zapisy μECoG są wykonywane w połączeniu z zapisem laminarnej politrody w korze słuchowej szczura lub z optogenetycznym manipulowaniem aktywnością neuronalną w korze somatosensorycznej myszy.

Wieloskalowe badania przetwarzania kory mózgowej poprzez integrację politrod laminarnych i optogenetyki z mikroelektrokortykografią u gryzoni

Poznaj zogniskowaną neuromodulację ultradźwiękową ludzkich neuronów HiPSC in vitro w układach mikroelektrod. Ta metoda umożliwia systematyczne określanie parametrów stymulacji i badanie mechanizmów neuronalnych.

Zogniskowana neuromodulacja ultradźwiękowa ludzkich kultur nerwowych in vitro w wielodołkowych układach mikroelektrod

Przeglądaj więcej filmów