Name: Pęseta magnetyczna o dużej prędkości do pomiarów nanomechanicznych na elementach wrażliwych na siłę (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Poznaj technikę pęset magnetycznych o dużej prędkości do nanomechanicznych pomiarów biomolekuł wrażliwych na siłę. Metoda umożliwia badanie dynamiki DNA i kompleksów białkowych z rozdzielczością milisekundową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez grant Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowany przez rząd koreański (MSIT) (NRF-2022R1C1C1012176, NRF-2021R1A4A1031754 i NRF- 2021R1A6A1A10042944). Projekt S.-H.R. otrzymał wsparcie z grantu NRF (2021R1C1C2009717).

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

W niniejszej pracy przedstawiliśmy układ spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek, który umożliwia obserwację zmian strukturalnych biomolekuł z wysoką precyzją czasowo-przestrzenną. Wykorzystana szybka kamera CMOS rejestruje 1 200 klatek s−1 przy rozdzielczości 1 280 x 1 024, co pozwala na śledzenie kulek z częstotliwością 1,2 kHz. Obecnie szybkość pomiarów jest jednak ograniczona przez oprogramowanie do śledzenia kulek, dlatego w pomiarach wysokiej częstotliwości obszar ROI jest zazwyczaj ograniczany do mnie...

Komórki aktywnie wyczuwają i reagują na bodźce mechaniczne. W ten sposób wiele biomolekuł wykazuje właściwości zależne od siły, które umożliwiają dynamiczne zmiany strukturalne. Cenionymi przykładami są mechanowrażliwe kanały jonowe i elementy cytoszkieletu, które dostarczają komórkom kluczowych informacji mechanicznych z otaczającego je środowiska.
Ponadto, cząsteczki, które wykazują unikalną naturę przenoszącą siłę, mogą być również uważane za mechanowrażliwe w szerszym sensie. Na przykład lokalne tworzenie i topnienie dupleksów kwasów nukleinowych, a także struktur wyższego rzędu, takich jak G-kwadrupleksy, odgrywają kluczową rolę w replikacji, transkrypcji, rekombinacji, a ostatnio w edycji genomu. Co więcej, niektóre białka neuronalne biorące udział w komunikacji synaptycznej pełnią swoje funkcje, generując siły fizyczne, które przekraczają poziomy typowych oddziaływań międzycząsteczkowych. Bez względu na to, który przykład badamy, badanie nanomechaniki zaangażowanych biomolekuł z wysoką precyzją czasoprzestrzenną okaże się bardzo przydatne w odkrywaniu mechanizmów molekularnych powiązanych procesów mechanobiologicznych1,2,3.
Metody spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek posłużyły jako potężne narzędzia do badania właściwości mechanicznych biomolekuł2,4,5,6. Mogą monitorować zmiany strukturalne w kwasach nukleinowych i białkach równocześnie z przyłożeniem siły, badając w ten sposób właściwości zależne od siły. Dwie dobrze znane konfiguracje to pęseta optyczna i pęseta magnetyczna (MT), które wykorzystują kulki o rozmiarach mikronów do manipulowania cząsteczkami5,6,7,8. W tych platformach polistyren (do pęsety optycznej) lub kulki magnetyczne (do MT) są przywiązane do docelowych cząsteczek (np. kwasów nukleinowych i białek) za pomocą molekularnych "uchwytów", zwykle wykonanych z krótkich fragmentów dwuniciowego DNA (dsDNA). Kulki są następnie przesuwane w celu wywierania siły i obrazowane w celu śledzenia ich lokalizacji, które informują o zmianach strukturalnych w cząsteczkach docelowych. Pęseta optyczna i magnetyczna są w dużej mierze wymienne w swoich zastosowaniach, ale istnieją istotne różnice w ich podejściu do kontrolowania siły. Pęseta optyczna to z natury przyrządy z zaciskiem pozycyjnym, które zatrzymują koraliki w miejscu, dzięki czemu przyłożona siła zmienia się, gdy docelowa konstrukcja ulega zmianom kształtu; Zwiększenie wydłużenia, na przykład z rozłożenia, rozluźnia więź i zmniejsza napięcie i odwrotnie. Chociaż aktywne sprzężenie zwrotne może być zaimplementowane do kontrolowania siły w pęsetach optycznych, MT w przeciwieństwie do nich naturalnie działają jako urządzenie zaciskowe, wykorzystując stabilne, dalekosiężne siły magnetyczne magnesów trwałych, które mogą również wytrzymać zakłócenia środowiskowe.
Pomimo swojej długiej historii i prostej konstrukcji, MT pozostają w tyle za pęsetami optycznymi w swoich zastosowaniach do precyzyjnych pomiarów, głównie z powodu technicznych wyzwań związanych z szybkim śledzeniem ściegów. Ostatnio jednak kilka grup wspólnie prowadziło wieloaspektowe ulepszenie zarówno sprzętu, jak i oprogramowania dla przyrządów MT2,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. W niniejszej pracy przedstawiamy przykład takiego układu działającego z częstotliwością 1,2 kHz i opisujemy, jak go używać do wykonywania pomiarów nanomechanicznych na biomolekułach wrażliwych na siłę. Jako systemy modelowe wykorzystujemy spinki do włosów DNA i neuronalne kompleksy SNARE i badamy ich szybkie, strukturalne zmiany w reżimie pikonewtonu. Spinki do włosów DNA wykazują proste dwustanowe przejścia w dobrze zdefiniowanym zakresie siły20,21, a zatem służą jako modele zabawek do weryfikacji wydajności zestawu pęsety. Ponieważ białka SNARE łączą się w wrażliwy na siłę kompleks, który napędza fuzję błonową22, były one również intensywnie badane za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek14,23,24,25. Przedstawiono standardowe podejścia do analizy danych i wydobywania przydatnych informacji z zakresu termodynamiki i kinetyki. Mamy nadzieję, że ten artykuł ułatwi zastosowanie precyzyjnych MT w badaniach mechanobiologicznych i zmotywuje czytelników do zbadania własnych systemów wrażliwych na siły.

pęseta magnetyczna o dużej prędkości do pomiarów nanomechanicznych na elementach wrażliwych na siłę

High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements

Jednocząsteczkowe pęsety magnetyczne (MT) służyły jako potężne narzędzia do przenikliwego badania biomolekuł, takich jak kwasy nukleinowe i białka, i dlatego są gotowe do wykorzystania w dziedzinie mechanobiologii. Ponieważ metoda ta powszechnie opiera się na obrazowym śledzeniu kulek magnetycznych, ograniczenie prędkości w rejestrowaniu i analizowaniu obrazów, a także fluktuacje termiczne kulek, od dawna utrudniają jej zastosowanie w obserwacji małych i szybkich zmian strukturalnych w cząsteczkach docelowych. W artykule opisano szczegółowe metody budowy i działania układu MT o wysokiej rozdzielczości, który może rozwiązać nanoskalową, milisekundową dynamikę biomolekuł i ich kompleksów. Jako przykłady zastosowań przedstawiono eksperymenty ze spinkami do włosów DNA i kompleksami SNARE (maszyneria fuzji błonowej), koncentrując się na tym, w jaki sposób można wykryć ich stany przejściowe i przejścia w obecności sił w skali Piconewtona. Oczekujemy, że szybkie MT będą nadal umożliwiać wysoce precyzyjne pomiary nanomechaniczne cząsteczek, które wyczuwają, przenoszą i generują siły w komórkach, a tym samym pogłębią nasze zrozumienie mechanobiologii na poziomie molekularnym.

Kalibracja siły 
Wyniki uzyskane za pomocą dwóch metod pomiaru siły (wariancji bocznego przemieszczenia kulek oraz analizy widma mocy) różniły się o 0-2 pN (Rycina 2G). Zgodnie z wynikami przedstawionymi na Rycinie 2F, przy użyciu zwykłych magnesów neodymowych możemy niezawodnie osiągnąć siłę do 30 pN.
Przejścia dwustanowe spinki DNA o długości 8 bp 
W pierwszej kolejności zbadaliśmy nanomechani...

Tutaj opisujemy szybki zestaw pęsety magnetycznej, który wykonuje nanomechaniczne pomiary na wrażliwych na siłę biomolekułach z maksymalną szybkością 1,2 kHz. Wprowadzamy jego zastosowanie do spinek do włosów DNA i kompleksów SNARE jako układów modelowych, ale będzie on miał również zastosowanie do innych cząsteczek biorących udział w zdarzeniach mechanobiologicznych.

Pęseta magnetyczna o dużej prędkości do pomiarów nanomechanicznych na elementach wrażliwych na siłę

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are ...

Biomolekuły ulegają małym i szybkim zmianom strukturalnym, często w odpowiedzi na siłę. Pęseta magnetyczna o wysokiej rozdzielczości może badać tę dynamikę pod wpływem fizjologicznie istotnych sił. Ponieważ metoda ta umożliwia pomiary w nanoskali z dokładnością do milisekund, możliwe jest monitorowanie subtelnych zmian w kwasach nukleinowych i białkach w czasie rzeczywistym.Nieprawidłowe działanie białek pierwszego łożyska i mechanowrażliwych może potencjalnie prowadzić do zaburzeń sercowo-naczyniowych i mięśniowo-szkieletowych. Pęseta magnetyczna może dostarczyć informacji na temat mechanizmów działania tych białek. Zestaw musi być odpowiednio wyrównany i skalibrowany, aby uzyskać dobre rozdzielczości.Należy również zachować ostrożność podczas przygotowywania i identyfikacji konstruktów molekularnych do pomiarów. Zacznij od ustawienia odwróconego mikroskopu na antywibracyjnym stole optycznym. Następnie zainstaluj szybką kamerę CMOS i chwytak klatek.Zamontuj pionowo zmotoryzowany stolik liniowy o długości skoku ponad 20 milimetrów na ręcznym stoliku XY, aby zbudować stolik translacyjny do manipulacji magnesami w 3D. Następnie zainstaluj obrotowy silnik krokowy oraz system pasa i ko

high-speed-magnetic-tweezers-for-nanomechanical-measurements-on-force

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszym artykule opisujemy zastosowanie pęset magnetycznych do badania wpływu siły na proteolizę enzymatyczną na poziomie pojedynczej cząsteczki w sposób wysoce równoległy.

Multipleksowe pomiary proteolizy pojedynczych cząsteczek siłowych przy użyciu pęset magnetycznych

Zmierzyliśmy spadek napięcia w aksonie, który został częściowo uszkodzony za pomocą laserowego dysektora, za pomocą jednoczesnego pomiaru spektroskopii siły wykonanego na optycznie uwięzionej sondzie przyklejonej do membrany aksonu. Opracowany protokół eksperymentalny ocenia adhezję aksonów do substratu hodowli.

Pomiar zwolnienia napięcia podczas uszkodzenia aksonu indukowanego laserem w celu oceny adhezji aksonów do podłoża z rozdzielczością pikontonów i milisekund

Pęseta magnetyczna, potężna technika manipulacji pojedynczymi cząsteczkami, może być dostosowana do bezpośrednich pomiarów skrętu (przy użyciu konfiguracji zwanej pęsetą magnetyczną swobodnie orbitującą) i momentu obrotowego (przy użyciu konfiguracji określanej jako pęseta magnetyczna) w makrocząsteczkach biologicznych. Podano wytyczne dotyczące wykonywania takich pomiarów, w tym zastosowania do badania DNA i związanych z nim włókien nukleotywo-białkowych.

Pęseta magnetyczna do pomiaru skrętu i momentu obrotowego

Zgłoszono platformę jednocząsteczkowych pęsety magnetycznej do manipulowania G-quadruplexami, która pozwala na badanie stabilności i regulacji G4 przez różne białka.

Manipulacja pojedynczymi cząsteczkami G-kwadrupleksów za pomocą pęsety magnetycznej

Tutaj prezentujemy protokół do badania wewnątrzkomórkowych właściwości mechanicznych izolowanych embrionalnych komórek zebrytanicznego danio pręgowanego w trójwymiarowym zamknięciu z bezpośrednim pomiarem siły przez pułapkę optyczną.

Bezpośrednie pomiary siły mechaniki subkomórkowej w zamknięciu za pomocą pęsety optycznej

Mikroskopia siły magnetycznej (MFM) wykorzystuje pionowo namagnesowaną sondę mikroskopową sił atomowych do pomiaru topografii próbki i lokalnego natężenia pola magnetycznego z rozdzielczością nanoskali. Optymalizacja rozdzielczości przestrzennej i czułości MFM wymaga zrównoważenia zmniejszającej się wysokości podnoszenia ze zwiększającą się amplitudą napędu (oscylacji) i korzyści płynących z pracy w komorze rękawicowej w atmosferze obojętnej.

Optymalizacja rozdzielczości i czułości mikroskopii sił magnetycznych w celu wizualizacji domen magnetycznych w nanoskali

Ten protokół demonstruje użycie pęsety magnetycznej do badania interakcji między telomerowymi białkami wiążącymi DNA (Telomer Repeat-binding Factor 1 [TRF1] i TRF2) a długimi telomerami ekstrahowanymi z komórek ludzkich. Opisano w nim etapy przygotowawcze do telomerów i telomerowych czynników wiążących powtórzenia, wykonywanie eksperymentów na pojedynczych cząsteczkach oraz metody gromadzenia i analizy danych.

Analiza telomerowych oddziaływań białko-DNA za pomocą jednocząsteczkowej pęsety magnetycznej

Elastyczność konformacyjna odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu białek. W tym artykule opisujemy zastosowanie czasowo-rozdzielczej spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą sprzężoną z wymianą wodorowo-deuterową do badania szybkich zmian strukturalnych, które napędzają funkcję w uporządkowanych i nieuporządkowanych białkach.

Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

Tutaj opisujemy prosty protokół szybkiego wytwarzania setek pożywek hodowlanych dla nicieni, 96-dołkowych płytek hodowlanych ze stałą liczbą Caenorhhabditis elegans na studzienkę. Kultury te są przydatne do fenotypowych badań przesiewowych całych organizmów. Skupiamy się tutaj na wykorzystaniu tych kultur do badań przesiewowych substancji chemicznych pod kątem efektów sprzyjających długowieczności.

Prosta metoda wysokoprzepustowych badań przesiewowych w kierunku Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy protokół eksperymentów elektrochemicznych na całych komórkach, aby zbadać wpływ transportu protonów na szybkość pozakomórkowego transportu elektronów przez kompleks cytochromów błony zewnętrznej w Shewanella oneidensis MR-1.

Elektrochemiczne wykrywanie wpływu kinetycznego izotopu deuteru na zewnątrzkomórkowy transport elektronów w Shewanella oneidensis MR-1

Poznaj technikę pęset magnetycznych o dużej prędkości do nanomechanicznych pomiarów biomolekuł wrażliwych na siłę. Metoda umożliwia badanie dynamiki DNA i kompleksów białkowych z rozdzielczością milisekundową.

Pęseta magnetyczna o dużej prędkości do pomiarów nanomechanicznych na elementach wrażliwych na siłę

Przeglądaj więcej filmów