Obrazowanie in situ grasicy myszej z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej

Obrazowanie dwufotonowe jest użyteczne w immunologii, ponieważ pozwala śledzić migrację pojedynczej komórki w trakcie interakcji z jej otoczeniem. Śledząc migrację w obrębie grasicy przy użyciu mikroskopii dwufotonowej, możemy scharakteryzować mechanizm selekcji pozytywnej i negatywnej.

Cześć, jestem Ina Lottie z laboratorium dr Ellen Roby na Uniwersytecie Kalifornijskim w Berkeley. A ja jestem Paul Herzmark, również z laboratorium Ellen Roby. Dzisiaj pokażemy wam, jak przeprowadzamy obrazowanie in situ tkanki grasicy, a ja zaprezentuję, jak możemy wykorzystać nasz mikroskop dwufotonowy do obrazowania grasicy.

Przedstawię kroki poprzedzające obrazowanie dwufotonowe. Obejmują one następujące procedury: izolację hematopoetycznych komórek macierzystych z szpiku kostnego, adoptywny transfer komórek szpiku kostnego do noworodków, wycięcie i przekrojenie grasicy oraz przygotowanie tkanki do obrazowania za pomocą dwufotonowej skaningowej mikroskopii laserowej. Zacznijmy zatem.

Zanim przygotujemy grasiczkę do obrazowania, musimy najpierw dokonać adoptywnego transferu komórek szpiku kostnego do noworodka myszy. Komórki szpiku kostnego zostały wyizolowane z tylnych kończyn myszy transgenicznych wykazujących powszechną ekspresję GFP. Jest to strzykawka insulinowa zawierająca 50 µL szpiku kostnego.

Wykonujemy od dwóch do czterech iniekcji u biorców w wieku od trzech do siedmiu dni, wykorzystując szpik kostny od jednego dawcy dla każdego wstrzykniętego szczenięcia. Tutaj mamy pięciodniowe szczenię; odciągamy skórę, aby zapobiec ruchom zwierzęcia podczas iniekcji i utrzymać skórę w napięciu. Miejsce iniekcji powinno znajdować się poniżej płuc i klatki piersiowej, ale powyżej jelit i żołądka.

Podczas wstrzykiwania rozluźnij uchwyt skóry, aby umożliwić jej rozszerzenie. Na koniec powoli wyjmij strzykawkę, aby ograniczyć utratę szpiku kostnego. Myszy te będą rozwijać się od czterech do sześciu tygodni, po czym grasiczkę będzie można usunąć do obrazowania.

Po czterech do sześciu tygodniach można usunąć grasicę. Do obrazowania będę używać zestawu dużych kleszczyków i nożyczek, a także zestawu małych kleszczyków i nożyczek. Myszy tej uśmiercono zgodnie z naszym protokołem korzystania ze zwierząt i spryskano etanolem.

Użyję dużych pęset, aby uchwycić skórę i wykonać nacięcie w linii środkowej. Teraz mogę albo użyć nożyczek, aby przeciąć wzdłuż linii środkowej, albo oddzielić skórę od otrzewnej; przypnę skórę, aby odsłonić jamę klatki piersiowej. Będę podtrzymywać mostek podczas przecinania otrzewnej, a następnie wprowadzę się do jamy klatki piersiowej przez przeponę i wykonam nacięcia wzdłuż boków klatki piersiowej.

Można zauważyć grasicę znajdującą się bezpośrednio nad sercem. Odłożę je z powrotem. Oto jest grasica.

Będę unikać dotykania tego miejsca. Użyj mniejszych pęset, nadal trzymając tkankę wokół grasicy. Dobrze, teraz spłukam to roztworem PBS i zacznę usuwać nadmiar tkanki.

Użyję tkanki wokół grasicy, aby ją przytrzymać. Podczas oczyszczania grasicy będę usuwać nadmiar tkanki, ostrożnie ją wycinając. W grasicy znajdują się dwa płaty, które również musimy oddzielić podczas procesu oczyszczania.

Najpierw usunę wszystkie te dodatkowe naczynia krwionośne znajdujące się na powierzchni grasicy. Robię to bardzo ostrożnie, aby nie naruszyć architektury grasicy, którą będziemy obrazować. Dlatego usuwam jedynie tkankę znajdującą się bezpośrednio na powierzchni.

Teraz będę delikatnie oddzielać dwa płaty. Są to płat brzuszny oraz grzbietowy, które będziemy rozdzielać, ostrożnie rozcinając tkankę i rozsuwając ją. Nie chcemy, aby tkanka wyschła, więc wstrzyknę na nią niewielką ilość PBS.

Teraz oddzieliłem oba płaty. To jest płat grzbietowy, który ma charakterystyczny kształt gitary. A tutaj znajduje się płat brzuszny.

Usunę nadmiar tkanki z każdego z tych płatów, aby obszar obrazowania był wolny od zbędnych tkanek. Zostawię jednak niewielką ilość tkanki, abyśmy mogli trzymać preparat. Podczas obrazowania będziemy prześwietlać tę nadmiarową tkankę, co nie jest konieczne, a jej usunięcie poprawi jakość otrzymanego obrazu.

Mamy teraz dwa przecięte płaty, które są gotowe do zamontowania na szkiełku nakrywnym w celu obrazowania. Aby przygotować przecięty grasiczkę do obrazowania, będą Państwo potrzebować weterynaryjnego kleju tkankowego oraz szkiełek nakrywnych o wymiarach 18 na 18. Ja preferuję użycie pipety, aby nanieść ułamek mikrolitra kleju na szkiełko nakrywne.

Nałożę kroplę kleju o długości odpowiadającej wielkości grasicy, którą będziemy obrazować. Następnie rozmażę go. Jeśli szerokość odpowiada szerokości grasicy, oba płaty umieszczę na tym samym szkiełku nakrywkowym.

Teraz położę kolejny fragment tutaj. Pobiorę zatem płatek z nadmiaru tkanki i po prostu położę go na szkiełku nakrywce, a następnie przesunę w obszar, w którym znajduje się klej. Postąpię tak samo z drugim płatkiem; ponownie dotknę szkiełka nakrywki w miejscu, gdzie nie ma kleju, aby ustabilizować rękę, a następnie położę drugi płatek grasicy na szkiełku nakrywce.

Po przymocowaniu obu grudek grasicy do szkiełka nakrywki przekazujemy je Paulowi do obrazowania. Dziękuję, Ina. Weźmy tę próbkę i umieśćmy ją w medium DME, którego użyjemy do obrazowania.

Oto konfiguracja naszego mikroskopu dwufotonowego. Mikroskopia dwufotonowa jest bardzo przydatna do obrazowania komórek odpornościowych, ponieważ pozwala na głęboką obserwację grasicy i śledzenie przemieszczania się fluorescencyjnych komórek. Urządzenie wykorzystuje impulsowy laser podczerwony, aby wywołać fluorescencję komórek.

W naszym mikroskopie mamy cztery różne kamery, które pozwalają nam na jednoczesną wizualizację czterech różnych kolorów i wykorzystują specjalny obiektyw o powiększeniu 20x. Jest to specjalna soczewka zanurzana w medium DMEM, w którym zanurzony jest tymus; pozwala ona na uzyskanie na 0,95, co jest bardzo korzystne i sprawi, że nasze komórki będą bardzo jasne. Aby utrzymać tkankę w dobrym stanie, przez medium DMEM przepuszczamy mieszankę 95% oxygen i 5% CO2.

Następnie jest ono pompowane do komory perfuzyjnej, gdzie zostaje podgrzane do 37°C; to właśnie tam zanurzone są płaty grasicy. Dzięki temu systemowi możemy utrzymać komórki w grasicy w stanie zdrowym przez cztery godziny obrazowania. W ten sposób zaprezentowałem, jak przygotować obrazowanie dla mikroskopu dwufotonowego.

Przejdźmy teraz do analizy niektórych z naszych wyników w tym zapętlonym filmie. Możemy tutaj zobaczyć obraz grasicy przedstawionej w czterech różnych kolorach. Kolor czerwony oznacza naczynia krwionośne grasicy, natomiast kolor żółty to komórki dendrytyczne gospodarza, które wykazują ekspresję żółtego białka fluorescencyjnego pod kontrolą promotora specyficznego dla komórek dendrytycznych.

Niebieskie i zielone tymocyty, które tutaj widzicie, pochodzą od dwóch różnych dawców, których wykorzystujemy do stworzenia chimery noworodkowej przy użyciu techniki transferu adopcyjnego, którą wcześniej pokazała wam Ena. Zielone komórki to tymocyty wykazujące ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego, a niebieskie komórki to tymocyty od dawcy wykazującego ekspresję cyjanowego białka fluorescencyjnego. Jest to ten sam zapętlony film, który pokazałem wam wcześniej, ale chcę wam zaprezentować trójwymiarowość zestawów danych, które gromadzimy w celu uzyskania tych filmów.

Koncentrujemy się na jednej płaszczyźnie i wykonujemy obraz, następnie przesuwamy ostrzenie nieco głębiej i wykonujemy kolejny obraz, a potem jeszcze głębiej, wykonując następne zdjęcie. W przypadku tego filmu przeszliśmy w głąb o około 60 µm, a następnie powtarzaliśmy ten zestaw obrazów w objętości mniej więcej co 30 s, aby uzyskać dynamiczną objętość. Film ten był nagrywany przez około 20 minut.

Dzięki temu możemy śledzić komórki w trzech wymiarach w czasie. Właśnie pokazaliśmy, w jaki sposób obrazujemy grasicę przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Najważniejszymi aspektami tej procedury są: po pierwsze, wstrzyknięcie noworodkom szpiku kostnego od dawców.

Po drugie, wypreparowanie grasicy bez uszkodzenia jej struktury. Po trzecie, mocne przymocowanie grasicy do szkiełka nakrywkowego w celu obrazowania za pomocą mikroskopu dwufotonowego. Obrazowanie grasicy pozwala odpowiedzieć na wiele pytań dotyczących rozwoju tymocytów oraz generowania zróżnicowanego repertuaru limfocytów T.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w Państwa eksperymentach.