Name: Obrazowanie in situ grasicy myszy za pomocą mikroskopii 2-fotonowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-01-25T19:52:00.000+00:00
Duration: 15 min
Description: Poznaj metodę obrazowania grasicy myszy in situ za pomocą mikroskopii 2-fotonowej. Technika umożliwia obserwację migracji pojedynczych komórek T i badanie mechanizmów selekcji w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Mattowi Paulowi i Jimmy'emu Wu za pomoc techniczną.

Transfer adopcyjny
Wstrzyknij noworodkom 50-100ul szpiku kostnego za pomocą strzykawki insulinowej 2-4 razy w ciągu pierwszych 3-7 dni życia, zachowując końcowy stosunek dawcy do biorcy 1:1. Wybierz miejsce wstrzyknięcia poniżej mostka i klatki piersiowej, lecz powyżej jelit i żołądka. Wprowadź igłę na taką głębokość, aby przebić otrzewną, uważając, by nie przebić przepony. Często zdarza się, że część szpiku kostnego zostaje utracona podczas wstrzykiwania. Można zmniejszyć te straty, rozluźniając chwyt pupila podczas iniekcji, aby umożliwić rozciągnięcie skóry, a następnie powoli wyjmując igłę.
Disekcja grasicy
Wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej i odetnij lub oderwij skórę, aby odsłonić klatkę piersiową. Chwyć mostek i przetnij otrzewną oraz przeponę. Przetnij boki klatki piersiowej, aby odsłonić jamę klatki piersiowej. Grudmorucz znajduje się nad sercem. Aby zachować strukturę grasicy, podczas jej preparowania przytrzymuj otaczające tkanki. Płucz grasicę roztworem PBS, aby zapobiec jej wysychaniu podczas sekcji. Delikatnie usuń nadmiar tkanki z powierzchni torebki grasicy i przedziel oba płaty.
Przygotowanie tkanki do obrazowania
Użyj weterynaryjnego kleju tkankowego, aby przykleić grasicę do kwadratowego szkiełka nakrywkowego. Za pomocą pipety automatycznej nanieś ułamek mikrolitra kleju. Rozprowadź klej na powierzchni odpowiadającej w przybliżeniu długości i szerokości grasicy. Unieruchom grasicę przy szkiełku nakrywkowym i przesuń ją na odpowiednią pozycję.
Obrazowanie dwufotonowe
Tkanka jest zanurzona w DMEM bez czerwieni fenolowej, który jest napowietrzony mieszanką 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla oraz podgrzany do 37°C. Wzbudzenie dwufotonowe osiągnięto za pomocą lasera Spectra-Physics MaiTai nastrojonego na 900nm, a światło emisji CFP, GFP, YFP oraz Texas Red oddzielano za pomocą luster dichroicznych 495, 515, 560 i zbierano za pomocą detektorów PMT.

<ol><li>Kyewski, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeding+of+thymic+microenvironments+defined+by+distinct+thymocyte-stromal+cell+interactions+is+developmentally+controlled%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Seeding of thymic microenvironments defined by distinct thymocyte-stromal cell interactions is developmentally controlled.</a> J Exp Med. 166, 520-538 (1987).</li>
<li>Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+microenvironments+for+T+cell+differentiation+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection.</a> Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).</li>
<li>Witt, C. M., Raychaudhuri, S., Schaefer, B., Chakraborty, A. K., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Migration+of+Positively+Selected+Thymocytes+Visualized+in+Real+Time%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed Migration of Positively Selected Thymocytes Visualized in Real Time.</a> PLoS Biol. 3, (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Obrazowanie dwufotonowe w grasicy pozwala na badanie w żywych, nienaruszonych organach interakcji i migracji, które leżą u podstaw procesów selekcji wewnątrz grasicy.

obrazowanie in situ grasicy myszej z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

Mikroskopia dwufotonowa (TPM) umożliwia obrazowanie głębokich warstw grasicy i dokumentowanie zdarzeń istotnych dla rozwoju tymocytów. Aby śledzić migrację pojedynczych komórek w skupiskach tymocytów, tworzymy chimery noworodkowe, w których mniej niż jeden procent tymocytów pochodzi od dawcy transgenicznego pod kątem powszechnie ekspresowanego białka fluorescencyjnego. W celu wytworzenia tych częściowych chimer hematopoetycznych, noworodkowe biorniki otrzymują wstrzyknięcia szpiku kostnego w wieku od 3 do 7 dni. Po 4-6 tygodniach mysz jest uśmiercana, a grasica zostaje starannie wypreparowana i przecięta na pół w sposób zachowujący architekturę tkanki przeznaczonej do obrazowania. Grasica zostaje przyklejona do szkiełka nakrywki w celu przygotowania do obrazowania ex vivo za pomocą TPM. Podczas obrazowania grasicę utrzymuje się w pożywce DMEM bez czerwieni fenolowej, nasyconej 95% tlenem i 5% dwutlenkiem węgla i ogrzanej do 37°C. Stosując to podejście, możemy badać zdarzenia niezbędne do wytworzenia zróżnicowanego repertuaru limfocytów T.

Przedstawiamy szczegółowe instrukcje dotyczące generowania chimer noworodkowych, a także sekcji i przygotowania grasicy do obrazowania ex vivo za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Obrazowanie in situ grasicy myszej z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej

Mikroskopia dwufotonowa (TPM) umożliwia obrazowanie głębokich warstw grasicy oraz dokumentowanie zdarzeń istotnych dla rozwoju tymocytów. Aby śledzić...

Obrazowanie dwufotonowe jest użyteczne w immunologii, ponieważ pozwala śledzić migrację pojedynczej komórki w trakcie interakcji z jej otoczeniem. Śledząc migrację w obrębie grasicy przy użyciu mikroskopii dwufotonowej, możemy scharakteryzować mechanizm selekcji pozytywnej i negatywnej.Cześć, jestem Ina Lottie z laboratorium dr Ellen Roby na Uniwersytecie Kalifornijskim w Berkeley. A ja jestem Paul Herzmark, również z laboratorium Ellen Roby. Dzisiaj pokażemy wam, jak przeprowadzamy obrazowanie in situ tkanki grasicy, a ja zaprezentuję, jak możemy wykorzystać nasz mikroskop dwufotonowy do obrazowania grasicy.Przedstawię kroki poprzedzające obrazowanie dwufotonowe. Obejmują one następujące procedury: izolację hematopoetycznych komórek macierzystych z szpiku kostnego, adoptywny transfer komórek szpiku kostnego do noworodków, wycięcie i przekrojenie grasicy oraz przygotowanie tkanki do obrazowania za pomocą dwufotonowej skaningowej mikroskopii laserowej. Zacznijmy zatem.Zanim przygotujemy grasiczkę do obrazowania, musimy najpierw dokonać adoptywnego transferu komórek szpiku kostnego do noworodka myszy. Komórki szpiku kostnego zostały wyizolowane z tylnych kończyn myszy transgenicznych wykazujących powszechną ekspresję GFP. Jest to strzykawka insulinowa zawierająca 50 µL szpiku kostnego.Wykonujemy od dwóch do czterech iniekcji u biorców w wieku od trzech do siedmiu dni, wykorzystując szpik kostny od jednego dawcy dla każdego wstrzykniętego szczenięcia. Tutaj mamy pięciodniowe szczenię; odciągamy skórę, aby zapobiec ruchom zwierzęcia podczas iniekcji i utrzymać skórę w napięciu. Miejsce iniekcji powinno znajdować się poniżej płuc i klatki piersiowej, ale powyżej jelit i żołądka.Podczas wstrzykiwania rozluźnij uchwyt skóry, aby umożliwić jej rozszerzenie. Na koniec powoli wyjmij strzykawkę, aby ograniczyć utratę szpiku kostnego. Myszy te będą rozwijać się od czterech do sześciu tygodni, po czym grasiczkę będzie można usunąć do obrazowania.Po czterech do sześciu tygodniach można usunąć grasicę. Do obrazowania będę używać zestawu dużych kleszczyków i nożyczek, a także zestawu małych kleszczyków i nożyczek. Myszy tej uśmiercono zgodnie z naszym protokołem korzystania ze zwierząt i spryskano etanolem.Użyję dużych pęset, aby uchwycić skórę i wykonać nacięcie w linii środkowej. Teraz mogę albo użyć nożyczek, aby przeciąć wzdłuż linii środkowej, albo oddzielić skórę od otrzewnej; przypnę skórę, aby odsłonić jamę klatki piersiowej. Będę podtrzymywać mostek podczas przecinania otrzewnej, a następnie wprowadzę się do jamy klatki piersiowej przez przeponę i wykonam nacięcia wzdłuż boków klatki piersiowej.Można zauważyć grasicę znajdującą się bezpośrednio nad sercem. Odłożę je z powrotem. Oto jest grasica.Będę unikać dotykania tego miejsca. Użyj mniejszych pęset, nadal trzymając tkankę wokół grasicy. Dobrze, teraz spłukam to roztworem PBS i zacznę usuwać nadmiar tkanki.Użyję tkanki wokół grasicy, aby ją przytrzymać. Podczas oczyszczania grasicy będę usuwać nadmiar tkanki, ostrożnie ją wycinając. W grasicy znajdują się dwa płaty, które również musimy oddzielić podczas procesu oczyszczania.Najpierw usunę wszystkie te dodatkowe naczynia krwionośne znajdujące się na powierzchni grasicy. Robię to bardzo ostrożnie, aby nie naruszyć architektury grasicy, którą będziemy obrazować. Dlatego usuwam jedynie tkankę znajdującą się bezpośrednio na powierzchni.Teraz będę delikatnie oddzielać dwa płaty. Są to płat brzuszny oraz grzbietowy, które będziemy rozdzielać, ostrożnie rozcinając tkankę i rozsuwając ją. Nie chcemy, aby tkanka wyschła, więc wstrzyknę na nią niewielką ilość PBS.Teraz oddzieliłem oba płaty. To jest płat grzbietowy, który ma charakterystyczny kształt gitary. A tutaj znajduje się płat brzuszny.Usunę nadmiar tkanki z każdego z tych płatów, aby obszar obrazowania był wolny od zbędnych tkanek. Zostawię jednak niewielką ilość tkanki, abyśmy mogli trzymać preparat. Podczas obrazowania będziemy prześwietlać tę nadmiarową tkankę, co nie jest konieczne, a jej usunięcie poprawi jakość otrzymanego obrazu.Mamy teraz dwa przecięte płaty, które są gotowe do zamontowania na szkiełku nakrywnym w celu obrazowania. Aby przygotować przecięty grasiczkę do obrazowania, będą Państwo potrzebować weterynaryjnego kleju tkankowego oraz szkiełek nakrywnych o wymiarach 18 na 18. Ja preferuję użycie pipety, aby nanieść ułamek mikrolitra kleju na szkiełko nakrywne.Nałożę kroplę kleju o długości odpowiadającej wielkości grasicy, którą będziemy obrazować. Następnie rozmażę go. Jeśli szerokość odpowiada szerokości grasicy, oba płaty umieszczę na tym samym szkiełku nakrywkowym.Teraz położę kolejny fragment tutaj. Pobiorę zatem płatek z nadmiaru tkanki i po prostu położę go na szkiełku nakrywce, a następnie przesunę w obszar, w którym znajduje się klej. Postąpię tak samo z drugim płatkiem; ponownie dotknę szkiełka nakrywki w miejscu, gdzie nie ma kleju, aby ustabilizować rękę, a następnie położę drugi płatek grasicy na szkiełku nakrywce.Po przymocowaniu obu grudek grasicy do szkiełka nakrywki przekazujemy je Paulowi do obrazowania. Dziękuję, Ina. Weźmy tę próbkę i umieśćmy ją w medium DME, którego użyjemy do obrazowania.Oto konfiguracja naszego mikroskopu dwufotonowego. Mikroskopia dwufotonowa jest bardzo przydatna do obrazowania komórek odpornościowych, ponieważ pozwala na głęboką obserwację grasicy i śledzenie przemieszczania się fluorescencyjnych komórek. Urządzenie wykorzystuje impulsowy laser podczerwony, aby wywołać fluorescencję komórek.W naszym mikroskopie mamy cztery różne kamery, które pozwalają nam na jednoczesną wizualizację czterech różnych kolorów i wykorzystują specjalny obiektyw o powiększeniu 20x. Jest to specjalna soczewka zanurzana w medium DMEM, w którym zanurzony jest tymus; pozwala ona na uzyskanie na 0,95, co jest bardzo korzystne i sprawi, że nasze komórki będą bardzo jasne. Aby utrzymać tkankę w dobrym stanie, przez medium DMEM przepuszczamy mieszankę 95% oxygen i 5% CO2.Następnie jest ono pompowane do komory perfuzyjnej, gdzie zostaje podgrzane do 37°C; to właśnie tam zanurzone są płaty grasicy. Dzięki temu systemowi możemy utrzymać komórki w grasicy w stanie zdrowym przez cztery godziny obrazowania. W ten sposób zaprezentowałem, jak przygotować obrazowanie dla mikroskopu dwufotonowego.Przejdźmy teraz do analizy niektórych z naszych wyników w tym zapętlonym filmie. Możemy tutaj zobaczyć obraz grasicy przedstawionej w czterech różnych kolorach. Kolor czerwony oznacza naczynia krwionośne grasicy, natomiast kolor żółty to komórki dendrytyczne gospodarza, które wykazują ekspresję żółtego białka fluorescencyjnego pod kontrolą promotora specyficznego dla komórek dendrytycznych.Niebieskie i zielone tymocyty, które tutaj widzicie, pochodzą od dwóch różnych dawców, których wykorzystujemy do stworzenia chimery noworodkowej przy użyciu techniki transferu adopcyjnego, którą wcześniej pokazała wam Ena. Zielone komórki to tymocyty wykazujące ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego, a niebieskie komórki to tymocyty od dawcy wykazującego ekspresję cyjanowego białka fluorescencyjnego. Jest to ten sam zapętlony film, który pokazałem wam wcześniej, ale chcę wam zaprezentować trójwymiarowość zestawów danych, które gromadzimy w celu uzyskania tych filmów.Koncentrujemy się na jednej płaszczyźnie i wykonujemy obraz, następnie przesuwamy ostrzenie nieco głębiej i wykonujemy kolejny obraz, a potem jeszcze głębiej, wykonując następne zdjęcie. W przypadku tego filmu przeszliśmy w głąb o około 60 µm, a następnie powtarzaliśmy ten zestaw obrazów w objętości mniej więcej co 30 s, aby uzyskać dynamiczną objętość. Film ten był nagrywany przez około 20 minut.Dzięki temu możemy śledzić komórki w trzech wymiarach w czasie. Właśnie pokazaliśmy, w jaki sposób obrazujemy grasicę przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Najważniejszymi aspektami tej procedury są: po pierwsze, wstrzyknięcie noworodkom szpiku kostnego od dawców.Po drugie, wypreparowanie grasicy bez uszkodzenia jej struktury. Po trzecie, mocne przymocowanie grasicy do szkiełka nakrywkowego w celu obrazowania za pomocą mikroskopu dwufotonowego. Obrazowanie grasicy pozwala odpowiedzieć na wiele pytań dotyczących rozwoju tymocytów oraz generowania zróżnicowanego repertuaru limfocytów T.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w Państwa eksperymentach.

in-situ-imaging-of-the-mouse-thymus-using-2-photon-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie in situ grasicy myszy za pomocą mikroskopii 2-fotonowej

Obrazowanie dwufotonowe pozwoliło na odkrycie ruchomości limfocytów oraz oddziaływań komórkowych w obrębie węzła chłonnego w warunkach podstawowych oraz podczas odpowiedzi immunologicznej 1. W niniejszej pracy demonstrujemy adoptywny transfer limfocytów T, izolację węzłów chłonnych oraz obrazowanie ruchomości limfocytów T CD4+ w wypreparowanym węźle chłonnym.

Disekcja i obrazowanie dwufotonowe obwodowych węzłów chłonnych u myszy

Opisujemy metodę wielokrotnej wizualizacji mikrogleju mysiego oraz monocytów krążących in vivo w czasie liczonym w godzinach, dniach lub tygodniach, z wykorzystaniem transkranialnej mikroskopii dwufotonowej. Demonstrujemy sposób przygotowania okna z cienkiej czaszki, które umożliwia przerywaną obserwację spoczywającego mikrogleju, który może zostać aktywowany poprzez sąsiednią stereotaktyczną iniekcję białka regulatorowego Tat wirusa HIV-1.

Technika cienkiej okienkowej czaszki do przewlekłego obrazowania dwufotonowego in vivo mikrogleju mysiego w modelach neurozapalenia

Opracowaliśmy nowe narzędzia laboratoryjne i protokoły do obrazowania intravitalnego grasicy. Nasza technika powinna pomóc w identyfikacji „nisz” w obrębie grasicy, w których zachodzi rozwój limfocytów T.

Obrazowanie przyżyciowe grasicy myszy z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej

Obrazowanie poklatkowe u żywego zwierzęcia dostarcza cennych informacji na temat reorganizacji strukturalnej w nienaruszonym mózgu. Tutaj wprowadzamy preparat z rozcieńczoną czaszką, który umożliwia przezczaszkowe obrazowanie znakowanych fluorescencyjnie struktur synaptycznych w żywej korze myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Dwufotonowe obrazowanie in vivo kolców dendrytycznych w korze myszy przy użyciu preparatu z rozrzedzoną czaszką

Celem protokołu jest pokazanie podłużnego śledzenia tymocytów w czasie rzeczywistym za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej w implantach grasicy w przedniej komorze oka myszy. Przezroczystość rogówki i unaczynienie przeszczepu pozwala na ciągłe rejestrowanie rekrutacji komórek progenitorowych i wyjścia dojrzałych komórek T.

Śledzenie w czasie rzeczywistym in vivo tymocytów w przedniej komorze oka za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej

W tym badaniu prezentujemy protokół do przeprowadzenia dwufotonowego obrazowania intravital i analizy interakcji komórkowych w mysiej błonie śluzowej tchawicy po zakażeniu wirusem grypy. Protokół ten będzie istotny dla naukowców badających dynamikę komórek odpornościowych podczas infekcji dróg oddechowych.

Obrazowanie interakcji komórkowej w błonie śluzowej tchawicy podczas zakażenia wirusem grypy za pomocą dwufotonowej mikroskopii przyżyciowej

Zmiany morfologiczne występują w komórkach fibroblastów reagujących immunologicznie po aktywacji i sprzyjają zmianom w rekrutacji komórek. Wykorzystanie obrazowania 2-fotonowego w połączeniu z genetycznie modyfikowanym białkiem 1 specyficznym dla fibroblastów (FSP1)-cre; Linia myszy tdTomato floxed-stop-floxed (TB / TB) i zielony fluorescencyjnie oznaczony lipopolisacharyd-FITC, możemy zilustrować wysoce specyficzny wychwyt lipopolisacharydu w fibroblastach skóry i zmiany morfologiczne in vivo.

Dwukolorowe obrazowanie 2-fotonowe in vivo genetycznie znakowanych komórek reporterowych w skórze

Obecny protokół opisuje procedurę radiologii interwencyjnej ustaloną dla iniekcji dograsiczych u myszy, aby uniknąć ryzyka otwartej operacji i poprawić dokładność ślepych iniekcji przezskórnych.

Minimalnie inwazyjna, dokładna i wydajna technika wstrzykiwania dograsiczego u myszy

Tutaj prezentujemy protokół do dożylnego obrazowania przeszczepionego lewego płuca myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Stanowi to cenne narzędzie do badania dynamiki i interakcji komórkowych w czasie rzeczywistym po przeszczepie płuc u myszy.

Przyżyciowa mikroskopia dwufotonowa przeszczepionego płuca myszy

Protokół ten zawiera szczegółowy opis krok po kroku podejścia dla przewlekłego modelu myszy z przewlekłym oknem czaszki oraz mikronaczyniowym zatorem naczyniowym, zoptymalizowanego do mikroskopii in vivo dwufotonowej z użyciem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych.

Model mikronaczyniowej embolii myszy do mikroskopii in vivo dwufotonowej z wykorzystaniem fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych

Badanie to przedstawia podejście in vivo do obrazowania dwufotonowego do wizualizacji struktur niskoprogowych zakończeń aksonów mechanoreceptorów (LTMR) w skórze przedniej łapy myszy. Wykorzystując powtarzalne, wysokorozdzielcze obrazowanie poszczególnych aksonów, metoda ta stanowi nową platformę do badania struktury i funkcji skórnego obwodu czuciowego podczas rozwoju oraz u dorosłych.

Dwufotonowe obrazowanie wewnątrzżyciowe morfologii aksonów dotykowych u skóry myszy

Poznaj metodę obrazowania grasicy myszy in situ za pomocą mikroskopii 2-fotonowej. Technika umożliwia obserwację migracji pojedynczych komórek T i badanie mechanizmów selekcji w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie in situ grasicy myszej z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej

Przeglądaj więcej filmów