Name: Wydajny protokół do analizy CUT and RUN mysich komórek satelitarnych izolowanych od FACS (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Poznaj protokół CUT&RUN do analizy komórek satelitarnych mięśni myszy izolowanych metodą FACS. Ta metoda umożliwia badanie regulacji transkrypcji i funkcji receptorów jądrowych w tkance mięśniowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Anastasii Bannwarth za doskonałą pomoc techniczną. Dziękujemy obiektowi IGBMC w pomieszczeniach dla zwierząt, hodowli komórkowej, Instytutowi Klinicznemu Myszy (ICS, Illkirch, Francja), obrazowaniu, mikroskopii elektronowej, cytometrii przepływowej oraz platformie GenomEast, członkowi konsorcjum "France Génomique" (ANR-10-INBS-0009).
Ta praca Interdyscyplinarnego Instytutu Tematycznego IMCBio, w ramach programu ITI 2021-2028 Uniwersytetu w Strasburgu, CNRS i Inserm, była wspierana przez IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) oraz przez projekt SFRI-STRAT'US (ANR 20-SFRI-0012) i EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) w ramach Francuskiego Programu Inwestycje dla Przyszłości. Dodatkowe finansowanie zostało zapewnione przez INSERM, CNRS, Unistra, IGBMC, Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), program strategiczny AFM-Téléthon 24376 (dla D.D.), INSERM grant dla młodych naukowców (dla D.D.), ANR-10-LABX-0030-INRT oraz francuski fundusz państwowy zarządzany przez ANR w ramach programu ramowego Investissements d'Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02). J.R. był wspierany przez Program CDFA-07-22 z Université franco-allemande i Ministère de l'Enseignement Supérieur de la Recherche et de l'Innovation, a K.G. przez Association pour la Recherche à l'IGBMC (ARI).

Satellite Cell Isolation from Mouse Limb Muscles and Flow Cytometry Analysis

<ol><li>Frontera, W. R., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle%3A+a+brief+review+of+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle: a brief review of structure and function.</a> Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).</li>
<li>Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repairing+skeletal+muscle%3A+regenerative+potential+of+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).</li>
<li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biophysical+and+Biochemical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).</li>
<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+progenitor+cells+and+the+role+of+Pax+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+Biologies%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle progenitor cells and the role of Pax genes.</a> Comptes Rendus Biologies. 330 (6-7), 530-533 (2007).</li>
<li>Tosic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lsd1+regulates+skeletal+muscle+regeneration+and+directs+the+fate+of+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Lsd1 regulates skeletal muscle regeneration and directs the fate of satellite cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 366(2018).</li>
<li>Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche+regulation+of+muscle+satellite+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation.</a> Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).</li>
<li>Collins, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+function%2C+self-renewal%2C+and+behavioral+heterogeneity+of+cells+from+the+adult+muscle+satellite+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche.</a> Cell. 122 (2), 289-301 (2005).</li>
<li>Robinson, D. C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+elongation+factor+regulates+muscle+progenitor+expansion+for+efficient+myofiber+repair+and+stem+cell+pool+repopulation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Negative elongation factor regulates muscle progenitor expansion for efficient myofiber repair and stem cell pool repopulation.</a> Developmental Cell. 56 (7), 1014-1029 (2021).</li>
<li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+fixation+redefines+quiescence+and+early+activation+of+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells.</a> Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).</li>
<li>Hainer, S. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+chromatin+profiling+using+CUT%26RUN%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85(2019).</li>
<li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+CUT%26RUN+chromatin+profiling+tools%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Improved CUT&RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, (2019).</li>
<li>Gunther, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myf5-positive+satellite+cells+contribute+to+Pax7-dependent+long-term+maintenance+of+adult+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells.</a> Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).</li>
<li>Donlin, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+high-dimensional+analysis+of+cells+dissociated+from+cryopreserved+synovial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue.</a> Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139(2018).</li>
<li>Rico, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+identification+of+cell+doublet+profiles%3A+Comparison+of+light+scattering+with+fluorescence+measurement+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques.</a> Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).</li>
<li>Schreiber, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+NEUROG3+occupancy+in+the+human+pancreatic+endocrine+gene+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network.</a> Molecular Metabolism. 53, 101313(2021).</li>
<li>Rovito, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myod1+and+GR+coordinate+myofiber-specific+transcriptional+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Myod1 and GR coordinate myofiber-specific transcriptional enhancers.</a> Nucleic Acids Research. 49 (8), 4472-4492 (2021).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peak+calling+by+Sparse+Enrichment+Analysis+for+CUT%26RUN+chromatin+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN chromatin profiling.</a> Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42(2019).</li>
<li>Ramirez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((deepTools2%3A+a+next+generation+web+server+for+deep-sequencing+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis.</a> Nucleic Acids Research. 44, W160-W165 (2016).</li>
<li>Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Genomics+Viewer+%28IGV%29%3A+high-performance+genomics+data+visualization+and+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration.</a> Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).</li>
<li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+combinations+of+lineage-determining+transcription+factors+prime+cis-regulatory+elements+required+for+macrophage+and+B+cell+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities.</a> Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).</li>
<li>Zou, Z., Ohta, T., Miura, F., Oki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-Atlas+2021+update%3A+a+data-mining+suite+for+exploring+epigenomic+landscapes+by+fully+integrating+ChIP-seq%2C+ATAC-seq+and+Bisulfite-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data.</a> Nucleic Acids Research. 50, W175-W182 (2022).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li>
<li>Brandhorst, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+human+islet+isolation+utilizing+recombinant+collagenase%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase.</a> Diabetes. 52 (5), 1143-1146 (2003).</li>
<li>Nikolic, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+collagenase+XI+and+liberase+H1+for+the+isolation+of+human+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatogastroenterology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of collagenase XI and liberase H1 for the isolation of human pancreatic islets.</a> Hepatogastroenterology. 57 (104), 1573-1578 (2010).</li>
<li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+damage+induces+a+conserved+stress+response+that+initiates+quiescent+muscle+stem+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation.</a> Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).</li>
<li>Diel, P., Baadners, D., Schlupmann, K., Velders, M., Schwarz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C2C12+myoblastoma+cell+differentiation+and+proliferation+is+stimulated+by+androgens+and+associated+with+a+modulation+of+myostatin+and+Pax7+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">C2C12 myoblastoma cell differentiation and proliferation is stimulated by androgens and associated with a modulation of myostatin and Pax7 expression.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 40 (5), 231-241 (2008).</li>
<li>Gronemeyer, H., Gustafsson, J. A., Laudet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+for+modulation+of+the+nuclear+receptor+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Principles for modulation of the nuclear receptor superfamily.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 3 (11), 950-964 (2004).</li>
<li>Billas, I., Moras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+controls+of+nuclear+receptor+function+in+the+regulation+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Allosteric controls of nuclear receptor function in the regulation of transcription.</a> Journal of Molecular Biology. 425 (13), 2317-2329 (2013).</li>
<li>Garcia-Prat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO+maintains+a+genuine+muscle+stem-cell+quiescent+state+until+geriatric+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age.</a> Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).</li>
<li>Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Established+cell+surface+markers+efficiently+isolate+highly+overlapping+populations+of+skeletal+muscle+satellite+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Skeletal Muscle. 6, 35(2016).</li>
<li>Schultz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+study+of+the+satellite+cell+population+in+postnatal+mouse+lumbrical+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">A quantitative study of the satellite cell population in postnatal mouse lumbrical muscle.</a> The Anatomical Record. 180 (4), 589-595 (1974).</li>
<li>Hyder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+pancreatic+digestion+with+liberase+versus+collagenase+on+the+yield%2C+function+and+viability+of+neonatal+rat+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Effect of the pancreatic digestion with liberase versus collagenase on the yield, function and viability of neonatal rat pancreatic islets.</a> Cell Biology International. 29 (9), 831-834 (2005).</li>
<li>Liang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+skeletal+muscle+for+flow+cytometric+characterization+of+immune+cells+in+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques.</a> Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).</li>
<li>Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+and+tissue+residency+of+lymphocytes+in+the+murine+oral+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa.</a> Frontiers in Immunology. 8, 250(2017).</li>
<li>Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+tissue+enzymatic+digestion+on+analysis+of+immune+cells+in+mouse+reproductive+mucosa+with+a+focus+on+gammadelta+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 474, 112665(2019).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W niniejszym badaniu przedstawiono znormalizowaną, wiarygodną i łatwą do wykonania metodę izolacji i hodowli mysich komórek satelitarnych, a także ocenę regulacji transkrypcji metodą CUT&RUN.
Protokół ten obejmuje kilka krytycznych kroków. Pierwszym z nich jest rozerwanie mięśni i trawienie błonnika w celu zapewnienia dużej liczby pobranych komórek. Pomimo zwiększonego stężenia enzymu uzyskano więcej żywych komórek niż przy użyciu Protokołu 1. Komórki satelitarne wyrażają specyficzny wzór różn...

Mięśnie poprzecznie prążkowane stanowią średnio 40% masy całego ciała ludzkiego1. Włókna mięśniowe wykazują niezwykłą zdolność do regeneracji po urazie, co opisuje fuzja nowo powstałych miocytów i generowanie nowych miowłókien, które zastępują uszkodzone2. W 1961 roku Alexander Mauro opisał populację komórek jednojądrzastych, które określił jako komórki satelitarne3. Te komórki macierzyste wyrażają sparowaną ramkę 7 czynnika transkrypcyjnego (PAX7) i znajdują się między blaszką podstawną a sarkolemmą włókien mięśniowych4. Doniesiono, że wykazują one ekspresję klastra różnicowania 34 (CD34; marker hematopoetyczny, progenitor śródbłonka i mezenchymalny marker komórek macierzystych), integryny alfa 7 (ITGA7; marker gładki mięśnia sercowego i mięśni szkieletowych), a także receptora chemokiny C-X-C typu 4 (CXCR4; marker limfocytów, komórek krwiotwórczych i satelitarnych)5. W warunkach podstawowych komórki satelitarne znajdują się w określonym mikrośrodowisku, które utrzymuje je w stanie spoczynku6. Po uszkodzeniu mięśni ulegają aktywacji, namnażają się i ulegają miogenezie7. Jednak ich analizy całego genomu, które stanowią tylko niewielki ułamek całkowitej liczby komórek mięśniowych, są szczególnie trudne, zwłaszcza w warunkach fizjologicznych (<1% wszystkich komórek).
Opisano różne metody izolacji chromatyny z komórek satelitarnych, które obejmują immunoprecypitację chromatyny, po której następuje masowe sekwencjonowanie równoległe (ChIP-seq) lub dzielenie pod celami i eksperymenty tagmentacji (CUT&Tag). Niemniej jednak te dwie techniki mają pewne istotne ograniczenia, które pozostają niekwestionowane. Rzeczywiście, ChIP-seq wymaga dużej ilości materiału wyjściowego do wytworzenia wystarczającej ilości chromatyny, której duża część jest tracona podczas etapu sonikacji. CUT&Tag jest bardziej odpowiedni dla małej liczby komórek, ale generuje więcej miejsc rozszczepienia poza celem niż ChIP-seq ze względu na aktywność transpozazy Tn5. Ponadto, ponieważ enzym ten ma wysokie powinowactwo do regionów otwartej chromatyny, podejście CUT&Tag może być preferencyjnie stosowane do analizy modyfikacji histonów lub czynników transkrypcyjnych związanych z aktywnie transkrybowanymi regionami genomu, zamiast wyciszonej heterochromatyny8,9.
Prezentowany tutaj jest szczegółowy protokół, który pozwala na izolację komórek satelitarnych mięśni kończyn myszy za pomocą FACS w celu rozszczepienia pod celami i uwolnienia za pomocą nukleazy (CUT&RUN)10,11 analiza. Poszczególne etapy obejmują mechaniczne rozerwanie tkanki, sortowanie komórek i izolację jąder. Skuteczność metody w zakresie przygotowania żywej zawiesiny komórkowej wykazano poprzez przeprowadzenie analizy CUT&RUN pod kątem kowalencyjnych modyfikacji histonów i czynników transkrypcyjnych. Jakość izolowanych komórek sprawia, że opisana metoda jest szczególnie atrakcyjna do otrzymywania chromatyny, która wiernie oddaje natywny stan zajętości genomu i prawdopodobnie będzie odpowiednia do uchwycenia konformacji chromosomów w połączeniu z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości w określonych loci (sekwencja 4C) lub na poziomie całego genomu (Hi-C).

<table><tbody><tr><td>Mikroprobówka 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>2080422</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówka 2 ml</td><td>Star Lab</td><td>S1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 5 ml</td><td>CORNING-FALCON</td><td>352063</td> 50 ml Falcon 352098 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anty-AR</td><td>abcam</td><td>ab108341</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD11b</td><td>eBioscience</td><td>25-0112-82</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD31</td><td>eBioscience</td><td>12-0311-82</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD34</td><td>eBioscience</td><td>48-0341-82</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD45</td><td>eBioscience</td><td>12-0451-83</td><td></td></tr><tr><td>anty-CXCR4</td><td>eBioscience</td><td>17-9991-82</td><td></td></tr><tr><td>anty-DMD</td><td>abcam</td><td>ab15277</td><td></td></tr><tr><td>anty-H3K27ac</td><td>Aktywny motyw</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>anty-H3K4me2</td><td>Active Motif</td><td>39141</td><td></td></tr><tr><td>anty-ITGA7</td><td>MBL</td><td>k0046-4</td><td></td></tr><tr><td>anty-PAX7</td><td>DSHB</td><td>AB_528428</td><td></td></tr><tr><td>anty-TER119</td><td>BD Pharmingen TM</td><td>553673</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki</td><td>Polysciences</td><td>86057-3</td><td>BioMag&reg; Plus Concanavalin A</td></tr><tr><td>Sitko do komórek 100 &mikro; m</td><td>Corning&reg; &nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>431752 Sitko komórkowe 40 & mikro; m</td><td>Corning&reg; &nbsp;</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek 70 & mikro; m</td><td>Corning&reg; &nbsp;</td><td></td><td>Wirówka 431751</td></tr><tr><td>1</td><td>Eppendorf</td><td>521-0011</td><td>Wirówka 5415 R</td></tr><tr><td>Wirówka 2</td><td>Wirówka 5805000010 Eppendorf</td><td></td><td>5804 R</td></tr><tr><td>System suwaków komorowych&nbsp;</td><td>ThermoFischer</td><td>171080</td><td>Syst&egrave; me Nunc&trade; Lab-Tek&handel; Środek do czyszczenia zjeżdżalni komorowych</td></tr><tr><td></td><td>Sigma&nbsp; &nbsp;</td><td>SLBQ7780V</td><td>Kolagenaza RNaseZAPTM</td></tr><tr><td>, typ I&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>17100017</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>Rozpuszczalność&nbsp;</td><td>STEMCELL technologies</td><td>7913</td><td>5 U/mL</td></tr><tr><td>DynaMag&trade;-2 Aimant</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Fixable Viability Stain</td><td>BD Biosciences</td><td>565388</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>BD FACSAria&trade; Cytometr Fusion Flow</td><td>23-14816-01</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G z DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>00-4959-52</td><td></td></tr><tr><td>Przeglądarka genomu&nbsp;</td><td>IGV</td><td></td><td>http://software.broadinstitute.org/software/igv/</td></tr> <tr><td>Glicerol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Hydrożel</td><td>Corning&reg; &nbsp;</td><td>354277</td><td>Matrigel matryca z kwalifikacją hESC</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazu</td><td>Obraz J&reg;</td><td></td><td>V 1.8.0</td></tr><tr><td>Film laboratoryjny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td>PARAFILM&reg; M</td></tr><tr><td>Liberase LT</td><td>Roche</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>Galusan propylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2370</td><td></td></tr><tr><td>Sekwencer&nbsp;</td><td>Illumina Hiseq 4000</td><td>SY-401-4001</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna z potrząsaniem</td><td>Bioblock Scientific polytest 20</td><td>18724</td><td></td></tr></tbody></table>

wydajny protokół do analizy cut&run mysich komórek satelitarnych izolowanych od facs

An Efficient Protocol for CUT&amp;RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells

Analizy całego genomu z populacjami małych komórek są głównym ograniczeniem dla badań, szczególnie w dziedzinie komórek macierzystych. Praca ta opisuje skuteczny protokół izolacji komórek satelitarnych z aktywowanego fluorescencją sortowania komórek (FACS) z mięśnia kończyny, tkanki o wysokiej zawartości białek strukturalnych. Wypreparowane mięśnie kończyn u dorosłych myszy zostały mechanicznie przerwane przez mielenie w pożywce uzupełnionej dypazą i kolagenazą typu I. Po roztrawieniu homogenat przefiltrowano przez sitka komórkowe, a komórki zawieszono w buforze FACS. Żywotność określono za pomocą możliwego do naprawienia barwienia żywotności, a wyizolowano immunologicznie wyizolowane komórki satelitarne za pomocą FACS. Komórki poddano lizie za pomocą Triton X-100, a uwolnione jądra zostały związane z kulkami magnetycznymi konkanawaliny A. Kompleksy jądro/kulki inkubowano z przeciwciałami przeciwko czynnikowi transkrypcyjnemu lub modyfikacjom histonów, które były przedmiotem zainteresowania. Po przemyciu kompleksy jądro/kulki inkubowano z nukleazą białkową A-mikrokokową, a rozszczepienie chromatyny zainicjowano za pomocą CaCl2. Po ekstrakcji DNA wygenerowano i zsekwencjonowano biblioteki, a za pomocą analizy bioinformatycznej uzyskano profile wiązania czynników transkrypcyjnych w całym genomie i kowalencyjnych modyfikacji histonów. Piki uzyskane dla różnych znaczników histonowych wykazały, że zdarzenia wiązania były specyficzne dla komórek satelitarnych. Co więcej, analiza znanych motywów ujawniła, że czynnik transkrypcyjny jest związany z chromatyną poprzez pokrewny element odpowiedzi. Protokół ten jest zatem przystosowany do badania regulacji genów w komórkach satelitarnych mięśni kończyn dorosłych myszy.

Komórki satelitarne z mięśni szkieletowych myszy wyizolowano, łącząc protokoły Gunthera i współpracowników (dalej określany jako Protokół 1)12 oraz Liu i współpracowników23 (dalej określany jako Protokół 2). Ponieważ po trawieniu przy zastosowaniu stężenia kolagenazy i dispazy zaproponowanego w Protokołe 1 zaobserwowano nietrawione włókna mięśniowe, zwiększono ilość enzymów w celu poprawy dysocjacji włókien mięśniowych, zgodnie z opisem w krokach 1.2.1 i 1.2.3. Zgodnie z Pr...

Prezentowany tutaj jest skuteczny protokół do izolacji komórek satelitarnych mięśni kończyn myszy aktywowanym fluorescencyjnie (FACS), przystosowany do badania regulacji transkrypcji we włóknach mięśniowych poprzez rozszczepienie pod tarczami i uwolnienie za pomocą nukleazy (CUT&RUN).

Wydajny protokół do analizy CUT&RUN mysich komórek satelitarnych izolowanych od FACS

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient ...

Od ponad 20 lat nasze laboratorium interesuje się patofizjologiczną rolą receptorów jądrowych. Aby rozszyfrować ich funkcję in vivo, zaprojektowaliśmy model myszy, który umożliwia przestrzenną i czasową kontrolę ich ekspresji. Równolegle opracowaliśmy najnowocześniejsze techniki do badania ich funkcji molekularnej w tkankach myszy.Nasze zainteresowania naukowe doprowadziły nas ostatnio do określenia sygnalizacji receptorów sekosteroidowych i steroidowych w różnych tkankach, w tym w mięśniach szkieletowych. Niedawno wykazaliśmy, że receptor androgenowy w włóknach mięśniowych, który różnicuje komórki mięśni szkieletowych, odgrywa zasadniczą rolę w ich funkcjach skurczowych i metabolicznych. Nasze ostatnie odkrycia pozwalają lepiej zrozumieć patofizjologiczną dynamikę mięśni szkieletowych, która ma kluczowe znaczenie dla opracowania skutecznych metod leczenia zaburzeń związanych z mięśniami.Opracowaliśmy ten protokół, aby móc przeprowadzić analizę cistrome na komórkach macierzystych mięśni in vivo. We wszystkich poprzednich protokołach stosowano modale in vitro, co całkowicie oddziela badanie od kontekstu całego organizmu. Oprócz tego, że jest tani i efektywny czasowo, protokół ten zapewnia skuteczne warunki eksperymentalne do badania rekrutacji czynników transkrypcyjnych i krajobrazu chromatyny w komórkach progenitorowych mięśni szkieletowych.Chromatyna przygotowana za pomocą tego protokołu zapewniła pierwszą analizę całego genomu cistrome AR w komórkach satelitarnych i ułatwi przyszłe badania nad regulacją genów. Jednym z wielu z nich, naszym przyszłym celem byłoby rozszerzenie tych badań na inne receptory oksosteroidowe i zbadanie ich specyficznych współregulatorów w różnych typach komórek zaangażowanych w proces regeneracji mięśni szkieletowych.

an-efficient-protocol-for-cut-run-analysis-facs-isolated-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Izolacja i hodowla czystej populacji spokojnych komórek satelitarnych, populacji komórek macierzystych mięśni, jest niezbędna do zrozumienia biologii i regeneracji komórek macierzystych mięśni, a także przeszczepu komórek macierzystych do terapii dystrofii mięśniowej i innych chorób zwyrodnieniowych.

Izolacja, hodowla i przeszczep satelitarnych komórek mięśniowych

Pojedyncze kardiomiocyty od myszy typu dzikiego i zmutowanych mogą być izolowane z serca w celu zbadania ich kurczliwości i przejściowych stanów wapnia. Pozwala to na scharakteryzowanie udziału dysfunkcji komórkowej w dysfunkcji serca z dowolnej przyczyny.

Izolacja i analiza fizjologiczna kardiomiocytów myszy

Zachowanie fibroblastów leży u podstaw całego spektrum jednostek klinicznych, ale pozostają one słabo scharakteryzowane, głównie ze względu na ich wrodzoną heterogeniczność. Tradycyjne badania nad fibroblastami opierają się na manipulacji in vitro, maskowaniu zachowania fibroblastów in vivo. Opisujemy oparty na FACS protokół izolacji fibroblastów skóry myszy, który nie wymaga hodowli komórkowej.

Izolacja fibroblastów skórnych myszy metodą FACS

Modele mysie pozwalają badać kluczowe mechanizmy arytmogenezy. W tym celu niezbędne są wysokiej jakości kardiomiocyty do wykonywania pomiarów typu patch-clamp. W tym miejscu opisano metodę izolacji mysich miocytów przedsionków i komór za pomocą wstecznej perfuzji Langendorffa opartej na enzymach, która umożliwia jednoczesne pomiary stanów przejściowych wapnia i prądu wapniowego typu L.

Izolacja wysokiej jakości mysich miocytów przedsionkowych i komorowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądu wapniowego typu L

Przedstawiona tutaj metoda podsumowuje zoptymalizowane protokoły oceny bioenergetyki komórkowej w nieprzylegających mysich hematopoetycznych komórkach macierzystych i prymitywnych komórkach progenitorowych (HSPC) przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego do pomiaru wskaźnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) i wskaźnika zużycia tlenu (OCR) HSPC w czasie rzeczywistym.

Ocena bioenergetyki komórkowej w krwiotwórczych komórkach macierzystych myszy i prymitywnych komórkach progenitorowych przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego

CUT&amp;RUN i jego warianty mogą być używane do określania obecności białek na chromatynie. Protokół ten opisuje, w jaki sposób określić lokalizację białka na chromatynie za pomocą jednokomórkowego uliCUT&amp;RUN.

Lokalizacja czynnika jednokomórkowego na chromatynie przy użyciu ultra-niskiego rozszczepienia wejściowego pod celami i uwalniania za pomocą nukleazy

Precyzyjna identyfikacja fibro-adipogennych komórek progenitorowych (FAP) i komórek macierzystych mięśni (MuSCs) jest kluczowa dla badania ich funkcji biologicznej w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Protokół ten zawiera wytyczne dotyczące izolacji, oczyszczania i hodowli FAP i MuSC z mięśni dorosłych myszy.

FACS-Izolacja i hodowla włóknisto-adipogennych progenitorów i mięśniowych komórek macierzystych z niezakłóconych i uszkodzonych mięśni szkieletowych myszy

Badacze nowi w dziedzinie epigenetyki uznają CUT&amp;Tag za znacznie łatwiejszą alternatywę dla testów ChIP. Projekt CUT&amp;Tag przyniósł ogromne korzyści badaniom epigenetycznym na rzadkich i pierwotnych populacjach komórek, uzyskując wysokiej jakości dane z bardzo niewielu komórek. Protokół ten opisuje wykonywanie testów H3K4me1 CUT&amp;Tag na mysich mioblastach wyizolowanych z mięśni kończyn tylnych myszy.

Wykorzystanie testu rozszczepienia pod tarczami i znakowania (CUT&Tag) w badaniach mioblastów myszy

Ten protokół opisuje test pozachromosomalnego łączenia niehomologicznych końców (NHEJ) i test rekombinacji homologicznej (HR) w celu ilościowego określenia efektywności NHEJ i HR w komórkach HEK-293T.

Analiza niehomologicznego łączenia końców i skuteczności rekombinacji homologicznej w komórkach HEK-293T przy użyciu systemów reporterowych opartych na GFP

Aby uzyskać perycyte kory mózgowej myszy spełniające wymagania scRNA-seq, przedstawiamy krytycznie zoptymalizowany protokół FACS oparty na selekcji CD13⁺/CD31⁻. Nasze kluczowe udoskonalenia znacząco poprawiają żywotność komórek i integralność RNA, umożliwiając niezawodne profilowanie transkryptomowe.

Izolacja perycytów z tkanki kory mysiego mózgu za pomocą FACS do sekwencjonowania pojedynczych komórek

Protokół ten zapewnia ustandaryzowaną metodę izolowania i wzbogacania pierwotnych mioblastów z mięśni szkieletowych dorosłych i noworodków myszy poprzez dysocjację tkanek, filtrację sekwencyjną, wstępne nakładanie oraz określone warunki hodowlane, umożliwiając tworzenie i utrzymanie hodowli mioblastów pochodzących z komórek satelitarnych do dalszych zastosowań eksperymentalnych.

Izolacja komórek satelitarnych mięśni szkieletowych do badań in vitro miogenezy

Poznaj protokół CUT&RUN do analizy komórek satelitarnych mięśni myszy izolowanych metodą FACS. Ta metoda umożliwia badanie regulacji transkrypcji i funkcji receptorów jądrowych w tkance mięśniowej.

Wydajny protokół do analizy CUT&RUN mysich komórek satelitarnych izolowanych od FACS

Przeglądaj więcej filmów