Name: Uniwersalna retencja molekularna z 11-krotną mikroskopią ekspansywną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T12:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Poznaj metodę Magnify w mikroskopii ekspansyjnej do nanoskopii próbek biologicznych i klinicznych. Technika umożliwia 11-krotną ekspansję tkanek przy zachowaniu epitopów białkowych bez specjalistycznego sprzętu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Carnegie Mellon University i D.S.F. Charitable Foundation (Y.Z. i X.R.), National Institutes of Health (N.I.H.) Director's New Innovator Award DP2 OD025926-01 oraz Fundacji Kauffmana.

Wszystkie procedury eksperymentalne na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health (NIH) i zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee na Carnegie Mellon University. Próbki tkanek ludzkich uzyskano komercyjnie.
1. Przygotowanie podstawowych odczynników i roztworów
UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą Materiałów, aby zapoznać się z listą użytych odczynników.
<ol>
	<li>Przygotować żelujące roztwory podstawowe. Zostaną one połączone bezpośrednio przed etapem żelowania.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy monomeru (4 g/100 ml kwasu N,N-dimetyloakrylamidu [DMAA], 50 g/100 ml akrylanu sodu [SA], 66,7 g/100 ml akryloamidu [AA], 0,10 g/100 ml N,N′-metylenobisakryloamidu [Bis], 33 g/100 ml chlorku sodu [NaCl], 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanem; PBS) przy użyciu składników wymienionych w tabeli 1. Rozpuścić lub rozcieńczyć wszystkie roztwory podstawowe w wodzie. Roztwór podstawowy monomeru może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez co najmniej 3 miesiące.</li>
		<li>Przygotować oddzielnie w wodzie następujące roztwory podstawowe: 0,5% (m/w) 4-Hydroxy-TEMPO (4HT), który hamuje żelowanie podczas dyfuzji monomeru do tkanek, oraz 10% (w/w) tetrametyloetylenodiaminy (TEMED), która przyspiesza wytwarzanie rodników zainicjowane przez nadsiarczan amonu (APS) i jest przygotowywana w stężeniu 10% (m/w). 
		UWAGA: Roztwory podstawowe można rozprowadzić w podwielokrotnościach o objętości 1-2 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy; jednak APS wykonuje się bezpośrednio przed przygotowaniem roztworu żelującego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować bufor homogenizacyjny (1% w/v S.D.S., 8 M mocznika, 25 mM EDTA, 2x PBS, pH 8, w temperaturze pokojowej [RT]) przez zmieszanie 1 g SDS, 48,048 g mocznika, 5 ml EDTA (0,5 M, pH 8), 20 ml 10 x PBS, 25 ml Tris (2 M) i 0,75 g glicyny. Dodaj wodę do całkowitej objętości 100 ml. Rozwiązanie można skalować w górę lub w dół w zależności od potrzeb i można je przechowywać w R.T.</li>
</ol>
2. Przygotowanie tkanek do zarchiwizowanych i świeżo przygotowanych preparatów tkanek klinicznych
UWAGA: Etapy wstępnego przetwarzania tkanek różnią się w zależności od sposobu przygotowania próbek.
<ol>
	<li>W przypadku próbek klinicznych z zatopioną parafiną utrwaloną w formaldehydzie (FFPE) należy postępować zgodnie z poniższymi czynnościami.
	<ol>
		<li>Umieścić próbki w sekwencyjnej serii roztworów (można użyć szklanego szkiełka do barwienia lub stożkowej probówki o pojemności 50 ml): ksylen, 95% etanol, 70% etanol i 50% etanol, a następnie podwójnie dejonizowana woda. Używaj każdego roztworu dwa razy przez co najmniej 3 minuty za każdym razem. Za pomocą kleszczy umieść szkiełko w pojemniku i dodaj 15 ml odpowiedniego roztworu (tyle, aby przykryć próbkę). Umieść zaślepioną stożkową rurkę poziomo na wytrząsarce w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku próbek barwionych i montowanych na szkiełkach stałych należy postępować zgodnie z poniższymi czynnościami.
	<ol>
		<li>Umieść szkiełko na krótko w ksylenie i ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe za pomocą odpowiedniego narzędzia, takiego jak żyletka. Jeśli szkiełko nakrywkowe nadal jest zablokowane, przywróć szkiełka z ksylenu do temperatury pokojowej, aż szkiełko nakrywkowe się poluzuje.</li>
		<li>Następnie przetworzyć próbki jako próbki FFPE (krok 2.1.1). 
		UWAGA: W przypadku szkiełek barwionych hematoksyliną i eozyną (H&E) barwienie hematoksyliną i eozyną jest tracone podczas procesu rozprężania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku nieutrwalonych szkiełek tkankowych zamrożonych w roztworze o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), należy utrwalić tkanki w acetonie w temperaturze -20 °C na 10 minut, a następnie umyć próbki 1 x roztworem PBS trzy razy przez 10 minut za każdym razem w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>W przypadku wcześniej utrwalonych zamrożonych klinicznych szkiełek tkankowych, stopić OCT, inkubując szkiełka przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć 1x roztworem PBS trzy razy przez 5 minut za każdym razem w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
3. Przygotowanie tkanek do mózgu myszy utrwalonego paraformaldehydem
<ol>
	<li>Postępuj zgodnie z tym protokołem dla sekcji mózgu myszy o grubości 30-50 μm. 
	UWAGA: Sukces można osiągnąć przy większych sekcjach, ale dyfuzja i homogenizacja roztworu monomeru może wymagać dłuższego czasu.</li>
	<li>Jeśli skrawki nie są obecnie przechowywane w 1 roztworze PBS (na przykład w 30% roztworze glicerolu i 30% roztworze glikolu etylenowego w 1 PBS), myj trzy razy przez co najmniej 10 minut za każdym razem w temperaturze pokojowej w 1 x PBS w płytce 6 do 24 dołków.</li>
	<li>Zaopatrzyć się w szkiełko mikroskopowe bez powłoki. Jeśli jedna strona szkiełka jest pokryta, użyj mokrego pędzla, aby sprawdzić, czy strona nie jest powlekana (często etykieta strony powlekanej będzie wykonana ze zmielonego szkła i stanie się mniej nieprzezroczysta, gdy będzie mokra).</li>
	<li>Użyj pędzla, aby zwilżyć niepowlekany szkiełko. Usuń tkankę mózgową myszy z płytki dołka za pomocą pędzla i ostrożnie umieść ją na szkiełku, wykonując ruch toczny, aby upewnić się, że tkanka jest płaska. Pozwól, aby nadmiar PBS pozostał na tkance, dopóki wszystkie sekcje nie zostaną zamontowane. 
	UWAGA: Podczas gdy pojedyncze szkiełko może być używane do wielu odcinków tkanek, gdy więcej odcinków tkanek jest żelowanych jednocześnie (nawet na oddzielnych szkiełkach), należy zachować większą ostrożność, aby nie wyschły całkowicie.</li>
	<li>Za pomocą laboratoryjnej ściereczki papierowej usuń większość nadmiaru PBS ze szkiełka. Pozostaw mały pierścień płynu wokół każdej części tkanki, ale resztę szkiełka pozostaw w większości suchą. Ten pozostały płyn pokryje tkankę podczas przygotowywania roztworu monomeru żelu.</li>
</ol>
4. Żelowanie
UWAGA: Ten protokół jest odpowiedni dla wszystkich typów tkanek przygotowanych do użycia tą techniką.
<ol>
	<li>Zastosuj przekładki po obu stronach sekcji tkanki (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A), aby zapobiec uciskowi tkanki. W tym celu należy wykonać przekładki, cienko wycinając kawałki szkła nakrywkowego za pomocą pisaka z diamentową końcówką, a następnie przymocować je do szkiełka za pomocą niewielkiej ilości wody lub 1x PBS lub przymocować za pomocą niewielkiej ilości super kleju. Następnie delikatnie umieść przekładki po obu stronach tkanki.</li>
	<li>Przygotuj końcowy roztwór żelujący. Ogólnie rzecz biorąc, ~ 200 μL jest wystarczające na wycinek tkanki, ale objętość nie powinna przekraczać 800 μL na szkiełko. Każde więcej roztworu żelującego spowoduje rozlanie się. 
	UWAGA: Metakroleina służy do zakotwiczania biomolekuł w żelu. Nie jest jednak wymagany oddzielny etap zakotwiczania, a metakroleina może być dodawana bezpośrednio do końcowego roztworu żelującego.
	<ol>
		<li>Na każdą sekcję należy połączyć w kolejności: 200 μl roztworu monomeru, 0,5 μl 0,5% roztworu podstawowego 4HT (rozcieńczenie 1:400), 0,2-0,5 μl metakuleiny (rozcieńczenie 1:400-1:1000 w zależności od rodzaju tkanki; zazwyczaj należy stosować rozcieńczenie 1:1000 dla próbek utrwalonych paraformaldehydem [PFA] i 1:400 dla próbek klinicznych FFPE), 2 μl 10% roztworu podstawowego TEMED (rozcieńczenie 1:100), i 5 μl 10% roztworu podstawowego APS (rozcieńczenie 1:40). 
		UWAGA: Gotowy końcowy roztwór żelujący należy przygotować bezpośrednio przed użyciem. Aby zapobiec przedwczesnemu żelowaniu, roztwór APS należy dodać na końcu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunąć nadmiar roztworu z sekcji tkankowej i umieścić szkiełko na szalce Petriego. Dodać cały świeżo przygotowany, zimny roztwór żelujący do próbki i inkubować mieszaninę na tkance przez 30 minut w temperaturze 4 °C, aby umożliwić dyfuzję do tkanki.</li>
	<li>Ostrożnie umieść drugi szkiełko bez powłoki na roztworze tkanki i żelu. Należy unikać pęcherzyków powietrza (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). 
	UWAGA: Jeśli pęcherzyki powietrza zostaną uwięzione na chusteczce, szklaną pokrywę można ostrożnie podnieść i odłożyć z powrotem. Dodatkowo każdy roztwór monomeru, który się wyleje, może zostać odcięty po polimeryzacji i nie spowoduje żadnych problemów dla tkanki.</li>
	<li>Upewnij się, że polimeryzacja została zakończona. Polimeryzację tę można przeprowadzić na dwa sposoby, z których każdy daje podobne wyniki. Najpierw inkubować próbki w temperaturze 37 °C w wilgotnym środowisku (takim jak zamknięta szalka Petriego z wilgotnym ręcznikiem papierowym) przez noc. Alternatywnie, w celu szybszej polimeryzacji, próbki należy inkubować w wilgotnej atmosferze przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, a następnie przez 1 godzinę w temperaturze 60 °C.</li>
</ol>
5. Trawienie próbki i rozszerzanie tkanek
UWAGA: Ten protokół jest odpowiedni dla wszystkich typów tkanek.
<ol>
	<li>Zakładając okulary ochronne, wsuń żyletkę między dwa szklane szkiełka komory żelowania, aby je rozdzielić. 
	UWAGA: Szkiełka powinny się bardzo łatwo rozdzielać. Jeśli różne części żelu są przyklejone do obu szkiełek, można użyć pędzla, aby poprowadzić żel do jednego lub drugiego. Jeśli żel stał się szczególnie suchy podczas polimeryzacji, 1x PBS można nałożyć na zewnątrz komory żelowej, ale nie należy całkowicie zanurzać żelu, ponieważ spowoduje to jego rozszerzanie się przed homogenizacją tkanki, co spowoduje pękanie.</li>
	<li>Przytnij ślepy żel wokół tkanki, aby zminimalizować objętość. Asymetryczne cięcie żelu pozwala na śledzenie orientacji żelu po homogenizacji, ponieważ próbka będzie całkowicie przezroczysta.</li>
	<li>Delikatnie podnieś żel zawierający tkankę ze szkiełka za pomocą żyletki i delikatnie przenieś go do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml za pomocą pędzla.</li>
	<li>Napełnić probówkę do góry buforem homogenizacyjnym (Tabela 2) podgrzanym do temperatury 80 °C.</li>
	<li>Inkubować próbkę, wytrząsając w temperaturze 80 °C przez 8 godzin (w przypadku mózgu myszy z utrwalonym PFA) lub 60 godzin (większość próbek klinicznych FFPE; patrz tabela 3). 
	UWAGA: Czas homogenizacji zależy od rodzaju tkanki i metody utrwalania. Wiele z tych warunków zostało już zweryfikowanych, ale w przypadku innych może być konieczna optymalizacja.</li>
	<li>Wlać zawartość probówki wirówkowej do pojedynczego dołka 6-dołkowej plastikowej płytki do hodowli komórek.</li>
	<li>Usunąć bufor denaturacyjny za pomocą pipety transferowej.</li>
	<li>W celu całkowitego usunięcia pozostałej karty charakterystyki z hydrożelu, przemyć próbkę w 1% roztworze niejonowego środka powierzchniowo czynnego (C12E10) w następujący sposób: co najmniej trzy razy przez 10 minut za każdym razem w temperaturze pokojowej; przez 60 minut w temperaturze 60 °C; a następnie kolejne trzy płukania przez 10 minut za każdym razem w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przechowywać próbkę w 1x PBS + 0,02% azydeku sodu w temperaturze 4 °C do czasu konieczności przeprowadzenia barwienia po rozprężaniu i obrazowania. 
	UWAGA: W tym momencie próbka powinna być ~3-4,5-krotnie większa w każdym wymiarze, w zależności od rodzaju tkanki.</li>
</ol>
6. Profilowanie biomolekuł po ekspansji
<ol>
	<li>Barwienie przeciwciałami 
	UWAGA: Jest to zgodne z typowym protokołem barwienia immunofluorescencyjnego (IF)/immunohistochemicznego (IHC). Ilości użytych przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych zależą od stężeń sugerowanych przez producenta lub od optymalizacji dla konkretnego eksperymentu. Poszczególne mogą być zastępowane według uznania użytkownika.
	<ol>
		<li>Z próbką w jednym dołku 6-dołkowej płytki do hodowli komórkowej, przemyć rozszerzone próbki trzy razy przez 10 minut za każdym razem w 1x PBS przy RT, przenosząc ciecz za pomocą pipety.</li>
		<li>Wykonać opcjonalny etap blokowania (na przykład 3% albuminy surowicy bydlęcej/0,1% Triton-X100 w 1x PBS) przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi w buforze barwiącym (na przykład 0,1% Triton-X100 1x PBS lub 9x PBS/1% TritonX/10 mg/L heparyny) przez noc w temperaturze 37 °C. W zależności od wielkości próbki, 0,5-2 ml powinno odpowiednio pokryć żel.</li>
		<li>Umyć próbkę trzy razy przez co najmniej 10 minut za każdym razem w 1x PBS w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Inkubować w odpowiednich przeciwciałach drugorzędowych przez 3 godziny w temperaturze 37 °C w wybranym buforze barwiącym.</li>
		<li>Umyć próbkę trzy razy przez co najmniej 10 minut za każdym razem w 1x PBS w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie białek pan-estrowych NHS
	<ol>
		<li>Umieść próbkę na płytce 6-dołkowej, wlej 1-2 ml glikolu polietylenowego (PEG 200) na próbkę (tyle, aby całkowicie ją pokryć). 
		UWAGA: Tkanka powinna się skurczyć i powrócić do pierwotnego rozmiaru sprzed ekspansji (lub zbliżonego do niego).</li>
		<li>Barwienie estrem NHS sprzężonym z fluoroforem rozcieńczonym do 13,3-80 μg / ml przez 3 godziny w R.T. w 1-2 ml buforu barwiącego (na przykład 1x PBS, 2x SSC lub 100 mM roztworu wodorowęglanu sodu).</li>
		<li>Umyć próbkę trzy razy przez co najmniej 10 minut za każdym razem w 1x PBS w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie lipidami 
	UWAGA: Barwienie lipidów po ekspansji nie jest skuteczne w próbkach klinicznych FFPE, ponieważ lipidy są tracone podczas procesu utrwalania.
	<ol>
		<li>Umyć próbkę trzy razy przez co najmniej 10 minut za każdym razem w 1x PBS w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zastosuj konwencjonalny barwnik lipofilowy (DiO, DiI lub DiD) rozcieńczony 200-krotnie w 2 ml 0,1% TritonX-100/1x PBS przez 72-96 godzin w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyj co najmniej trzy razy za pomocą 1x PBS</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH)
	<ol>
		<li>Umieścić homogenizowane próbki żelu w buforze hybrydyzacyjnym podgrzanym do temperatury 60 °C na 30 minut.</li>
		<li>Przygotuj bufor hybrydyzacyjny dla FISH: Połącz 2x S.S.C. (300 mM NaCl, 30 mM cytrynian sodu, pH 7,0), 10% (v/v) siarczan dekstranu, 20% (v/v) węglan etylenu i 0,1% (v/v) Tween20.</li>
		<li>Próbki żelu inkubować z buforem hybrydyzacyjnym zawierającym 10 pM (na oligonukleotykatu) sond FISH przeciwko genowi docelowemu (co najmniej 20 sond na 10 kb) w temperaturze 45 °C przez noc.</li>
		<li>Umyć rygorystycznym buforem do płukania (2x S.S.C. i 0,1% Tween20) dwa razy przez 15 minut za każdym razem w temperaturze 45 °C.</li>
		<li>Przemyć buforem do płukania jeszcze dwa razy przez 10 minut za każdym razem w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Na koniec umyć 1x PBS co najmniej trzy razy przez 10 minut za każdym razem w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Próbki są gotowe do obrazowania lub przechowywania w 1x PBS + 0,02% azydku sodu w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pełna ekspansja tkanek i obrazowanie fluorescencyjne 
	UWAGA: Współczynnik ekspansji osiągalny za pomocą Magnify różni się w zależności od typu tkanki i metody ekspansji (pełne podsumowanie można znaleźć w Tabeli 3). Jednak ogólnie rzecz biorąc, próbka Magnify rozszerzy się 3-4,5-krotnie w 1x PBS, 5-7-krotnie w PBS rozcieńczonym do 1:50 w ddH2O i 8-11-krotnie w ddH2O. Optymalny współczynnik rozszerzalności obrazowania zależy od potrzeb każdego eksperymentu. Współczynnik rozszerzalności jest wysoce przestrajalny, dzięki czemu pojedyncza próbka może być wielokrotnie rozszerzana i zmniejszana w celu obrazowania w różnych skalach.
	<ol>
		<li>Przenieść próbki rozprężone 4-krotnie w PBS na 6-dołkową płytkę obrazową ze szklanym dnem za pomocą pędzla. Przenieś dowolną rozszerzoną próbkę dalej, krojąc ją na mniejsze kawałki lub delikatnie umieszczając na dużej płytce obrazowej ze szklanym dnem z cienkim kawałkiem elastycznego tworzywa sztucznego.</li>
		<li>Wykonaj obrazowanie fluorescencyjne za pomocą konwencjonalnego mikroskopu szerokokątnego, mikroskopu konfokalnego lub innego wybranego systemu obrazowania. Usunięcie nadmiaru płynu wokół żelu za pomocą papierowej ściereczki laboratoryjnej może zapobiec ruchowi żelu podczas obrazowania. Żele można również unieruchomić, nakładając 0,1% poli-L-lizyny na powierzchnię szkła przed obrazowaniem. 
		UWAGA: Zastosowanie poli-L-lizyny spowoduje, że żel będzie całkowicie unieruchomiony w kontakcie. Z tego powodu należy zachować ostrożność, aby żel nakładać na szkło bez składania lub rozciągania. Ponadto nie należy dopuścić do całkowitego wyschnięcia żelu na szkle pokrytym poli-L-lizyną, ponieważ może to utrudnić usunięcie, a żelu nie należy obkurczać w PBS, gdy jest on nadal przymocowany do szkła za pomocą poli-L-lizyny, ponieważ może to spowodować uszkodzenie żelu lub tkanki.</li>
		<li>Po zobrazowaniu obkurczyć próbki w 1x PBS z co najmniej trzema płukaniami przez 10 minut za każdym razem, ponieważ nie zaleca się długotrwałego przechowywania próbek w ddH2O ze względu na degradację sygnału fluorescencji. W szczególności w pełni ekspandowane próbki barwione barwnikami lipofilowymi powinny być obrazowane jak najbliżej czasu ekspansji, aby zapobiec dysocjacji barwnika w wodzie.</li>
		<li>Próbki należy przechowywać w 1x PBS + 0,02% azydek sodu w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Expansion Microscopy for Robust 11-Fold Expansion

<ol><li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Far-field+optical+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Far-field optical nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li>
<li>Combs, C. A., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%3A+A+concise+guide+to+current+imaging+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods.</a> Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li>
<li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li>
<li>Tillberg, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-retention+expansion+microscopy+of+cells+and+tissues+labeled+using+standard+fluorescent+proteins+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).</li>
<li>Chozinski, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy+with+conventional+antibodies+and+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).</li>
<li>Ku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+and+scalable+super-resolution+imaging+of+three-dimensional+protein+localization+in+size-adjustable+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+imaging+of+R.N.A.+with+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale imaging of R.N.A. with expansion microscopy.</a> Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).</li>
<li>Tsanov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SmiFISH+and+FISH-quant+-+A+flexible+single+R.N.A.+detection+approach+with+super-resolution+capability%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">SmiFISH and FISH-quant - A flexible single R.N.A. detection approach with super-resolution capability.</a> Nucleic Acids Research. 44 (22), 165(2016).</li>
<li>Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+imaging+of+high-density+libraries+of+R.N.A.s+with+MERFISH+and+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Multiplexed imaging of high-density libraries of R.N.A.s with MERFISH and expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 4847(2018).</li>
<li>Wen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+direct+grafting+strategies+via+trivalent+anchoring+for+enabling+lipid+membrane+and+cytoskeleton+staining+in+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy.</a> ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).</li>
<li>Sun, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click-ExM+enables+expansion+microscopy+for+all+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules.</a> Nature Methods. 18, 107-113 (2021).</li>
<li>White, B. M., Kumar, P., Conwell, A. N., Wu, K., Baskin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Lipid expansion microscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 144 (40), 18212-18217 (2022).</li>
<li>Truckenbrodt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X10+expansion+microscopy+enables+25-nm+resolution+on+conventional+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes.</a> EMBO Reports. 19 (9), e45836(2018).</li>
<li>Chang, J. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope-preserving+magnified+analysis+of+proteome+%28eMAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Epitope-preserving magnified analysis of proteome (eMAP).</a> Science Advances. 7 (46), (2021).</li>
<li>Klimas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnify+is+a+universal+molecular+anchoring+strategy+for+expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy.</a> Nature Biotechnology. , (2023).</li>
<li>Gao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+stimulated+emission+depletion+microscopy+%28ExSTED%29%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Expansion stimulated emission depletion microscopy (ExSTED).</a> ACS Nano. 12 (5), 4178-4185 (2018).</li>
<li>Zwettler, F. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+resolution+imaging+by+post-labeling+expansion+single-molecule+localization+microscopy+%28Ex-SMLM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM).</a> Nature Communications. 11, 3388(2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują następujące konkurencyjne interesy finansowe: Y.Z., A.K., Z.C. i B.R.G. wynalazły kilka wynalazków związanych z Magnify i ExM.

Tutaj przedstawiamy protokół Magnify17, wariant ExM, który może zatrzymać wiele biomolekuł za pomocą jednej kotwicy chemicznej i rozszerzyć wymagające próbki kliniczne FFPE nawet 11-krotnie dzięki denaturacji cieplnej. Kluczowe zmiany w tym protokole, które odróżniają go od innych protokołów ExM, obejmują zastosowanie przeformułowanego żelu, który pozostaje wytrzymały mechanicznie nawet po pełnym rozprężeniu, a także zastosowanie metakrolineiny jako kotwicy biomolekuły. Najbardziej krytyczne kroki...

Systemy biologiczne wykazują strukturalną niejednorodność, począwszy od kończyn i organów, a skończywszy na poziomach białek w nanoskali. W związku z tym pełne zrozumienie działania tych systemów wymaga oględzin w tych skalach wielkości. Jednak granica dyfrakcji światła powoduje wyzwania w wizualizacji struktur mniejszych niż ~200-300 nm na konwencjonalnym mikroskopie fluorescencyjnym. Ponadto metody optycznej superrozdzielczości1,2,3, takie jak wymuszone zubożenie emisji (STED), mikroskopia lokalizacyjna aktywowana fotowoltaicznie (PALM), stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (STORM) i mikroskopia oświetlenia strukturalnego (SIM), choć potężne, stanowią własne wyzwania, ponieważ wymagają drogiego sprzętu i odczynników, a także często mają powolny czas akwizycji i słabą zdolność obrazowania duże objętości w 3D.
Mikroskopia ekspandacyjna4 (ExM) dostarcza alternatywnego sposobu na obejście limitu dyfrakcji światła poprzez kowalencyjne zakotwiczenie biomolekuł w pęczniejącym żelu polimerowym i fizyczne ich rozdzielenie, dzięki czemu stają się one rozdzielalne na konwencjonalnych mikroskopach optycznych. Od czasu pierwotnej publikacji ExM niecałą dekadę temu opracowano wiele wariantów protokołu ExM, a protokoły te umożliwiają bezpośrednie włączenie białek5,6,7, RNA8,9,10, lub lipids11,12,13 do sieci żelowej poprzez zmianę kotwicy chemicznej lub dalsze rozszerzanie próbki (poprawiając w ten sposób efektywną rozdzielczość) w jednym kroku14 lub w wielu iteracyjnych krokach15,16. Do niedawna żaden pojedynczy protokół ExM nie był w stanie utrzymać tych trzech klas biomolekuł za pomocą jednej dostępnej na rynku kotwicy chemicznej, zapewniając jednocześnie mechanicznie wytrzymały żel, który mógł rozszerzyć się ~10-krotnie w jednej rundzie rozprężania.
Tutaj prezentujemy Magnify17, najnowszy dodatek do arsenału ExM, który wykorzystuje metakroreinę jako kotwicę biomolekuł. Metakroleina tworzy wiązania kowalencyjne z tkankami, takimi jak paraformaldehyd, zapewniając zachowanie wielu klas biomolekuł w sieci żelowej bez konieczności stosowania różnych specyficznych lub niestandardowych środków kotwiczących. Ponadto technika ta może rozszerzyć szerokie spektrum tkanek nawet 11-krotnie, w tym notorycznie trudne próbki, takie jak próbki kliniczne zatopione w parafinie (FFPE) utrwalone w formalinie. Poprzednie metody namnażania takich mechanicznie sztywnych próbek wymagały ostrego trawienia proteazą, co uniemożliwiało znakowanie przeciwciałami interesujących białek po namnażaniu próbki. W przeciwieństwie do tego, technika ta osiąga ekspansję próbek klinicznych FFPE za pomocą gorącego roztworu denaturującego, zachowując w ten sposób epitopy całych białek w żelu, które mogą być przeznaczone do obrazowania po ekspansji (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).

<table><tbody><tr><td>4-hydroxy-TEMPO (4HT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>176141</td><td>Inhibitor</td></tr><tr><td>6-dołkowa szklana płytka denna (#1,5 szkła nakrywkowego)</td><td>Cellvis</td><td>P06-1.5H-N</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8887</td><td>Żel Monomer Składnik</td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu (APS)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td>Inicjator</td></tr><tr><td>DAPI (1 mg / ml)</td><td>Thermo Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Eter monododecylowy glikolu dekaetylenowego (C12E10)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9769</td><td>Niejonowy środek powierzchniowo czynny</td></tr><tr><td>Nóż diamentowy nr 88 CM</td><td>Narzędzia ogólne</td><td>31116</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Pharmco</td><td></td><td></td>111000200</tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) 0,5 M</td><td>VWR</td><td>BDH7830-1</td><td>Kleszczyki</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> do <tr>homogenizacyjnych<td>Glicyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8898</td><td>Składnik buforu homogenizacyjnego</td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Metakryneina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>133035</td><td>Środek kotwiący</td></tr><tr><td>Mikro osłona Szkło #1 (24x60mm)</td><td>VWR</td><td>48393 106</td><td></td></tr><tr><td>Mikro osłona szklana #1.5 (24x60mm)</td><td>VWR</td><td>48393 251</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;- Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td>Akcelerator</td></tr><tr><td>N,N&prime;-Metylenobisakryloamid (Bis)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7279</td><td>Składnik monomeru żelowego</td></tr><tr><td>N,N-dimetyloakryloamid (DMAA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>274135</td><td>Żelowy składnik monomeru</td></tr><tr><td>Nunclon 4-dołkowe x 5 ml MultiDish Naczynie do hodowli komórkowych Thermo</td><td>Fisher</td><td>167063</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe naczynie do hodowli komórkowych Nunclon</td><td>Thermo Fisher</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&trade; 15mL&nbsp; Stożkowy</td><td>Thermo Fisher</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&trade; 50mL&nbsp; Stożkowy</td><td>pędzel</td><td></td> do wytrząsarki orbitalnej Thermo Fisher 339653 <td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td></td><td></td><td></td></tr> Sól fizjologiczna <tr><td>buforowana fosforanami (PBS), 10x roztwór</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP399-1</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy&nbsp; 200</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-3015</td><td></td></tr><tr><td></td> Proteinaza K (<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Klasa biologii molekularnej)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>Fischer Scientifc</td><td>12640</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek Safelock 1,5 ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>3457</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek Safelock 2,0 ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>3459</td><td></td></tr><tr><td>Akrylan sodu (SA)</td><td>AK Scientific</td><td>R624</td><td>Składnik</td></tr> <tr>monomeru żelowego<td>Azydek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu trójzasadowy dwuwodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8532-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td>Bufor homogenizacyjny Składnik</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Bufor homogenizacyjny Składnik</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U5378</td><td>Bufor homogenizacyjny Składnik</td></tr><tr><td>ksyleny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9763</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lizyna&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr></tbody></table>

uniwersalna retencja molekularna z 11-krotną mikroskopią ekspansywną

Universal Molecular Retention with 11-Fold Expansion Microscopy

Obrazowanie próbek biologicznych w nanoskali może poprawić zrozumienie patogenezy chorób. W ostatnich latach wykazano, że mikroskopia ekspansywna (ExM) jest skuteczną i tanią alternatywą dla optycznej mikroskopii superrozdzielczej. Zostało to jednak ograniczone przez potrzebę stosowania specyficznych i często niestandardowych środków kotwiczących w celu zachowania różnych klas biomolekuł w żelu oraz przez trudności z rozszerzeniem standardowych formatów próbek klinicznych, takich jak tkanka zatopiona w parafinie utrwalona w formalinie, zwłaszcza jeśli pożądane są większe współczynniki ekspansji lub zachowane epitopy białkowe. W tym miejscu opisujemy Magnify, nową metodę ExM zapewniającą solidną ekspansję do 11-krotności w szerokiej gamie typów tkanek. Wykorzystując metakroleinę jako chemiczną kotwicę między tkanką a żelem, Magnify zatrzymuje wiele biomolekuł, takich jak białka, lipidy i kwasy nukleinowe, w żelu, umożliwiając w ten sposób obrazowanie tkanek w szerokiej skali nano na konwencjonalnych mikroskopach optycznych. Protokół ten opisuje najlepsze praktyki mające na celu zapewnienie solidnej i wolnej od pęknięć ekspansji tkanek, a także wskazówki dotyczące obchodzenia się i obrazowania wysoce ekspandowanych żeli.

Jeśli protokół został pomyślnie zakończony (Rycina 1), próbka po denaturacji termicznej będzie przejrzysta i płaska; jakiekolwiek zagięcia lub zmarszczki wskazują na niepełną homogenizację. Pomyślnie rozwinięta próbka będzie 3-4,5-krotnie większa niż przed rozwinięciem w 1x PBS oraz 8-11-krotnie większa po pełnym rozwinięciu w ddH2O. Rycina 3 przedstawia przykładowe obrazy próbki ludzkiej nerki FFPE o grubości 5 µm przed i po rozwinięciu, przetworzone...

Prezentowana jest tutaj nowa wersja mikroskopii ekspansyjnej (ExM), Magnify, która jest zmodyfikowana do 11-krotnej ekspansji, zachowując szeroki wachlarz klas biomolekuł i jest kompatybilna z szerokim zakresem typów tkanek. Umożliwia badanie konfiguracji biomolekuł w nanoskali przy użyciu konwencjonalnych mikroskopów o ograniczonej dyfrakcji.

Uniwersalna retencja molekularna z 11-krotną mikroskopią ekspansywną

The nanoscale imaging of biological specimens can improve the understanding of disease pathogenesis. In recent years, expansion microscopy (ExM) has been ...

Staramy się znaleźć łatwe i tanie sposoby dla badaczy na obrazowanie swoich próbek biologicznych w rozdzielczościach poniżej limitu dyfrakcji, szczególnie w obszarach neuronauki i patologii klinicznej. Wiele najnowszych osiągnięć mikroskopii ekspansyjnej obejmuje modyfikację chemii żelu w celu dalszego rozszerzania próbek, zmianę cząsteczki kotwiczącej w celu wizualizacji różnych celów oraz wykorzystanie denaturacji ogrzewania w celu zachowania epitopów białkowych. Dzięki innowacyjnemu Magnify, solidnej metodzie mikroskopii ekspansywnej, która umożliwia obrazowanie w nanoskali różnych próbek biologicznych lub klinicznych.Upraszcza mikroskopię superrozdzielczą, eliminując potrzebę specjalistycznego sprzętu, jednocześnie zachowując skomplikowane cechy biologiczne o rozdzielczości do 15 nanometrów, zwiększając w ten sposób dostępność i użyteczność w laboratoriach na całym świecie. Wcześniej użytkownicy musieli eksperymentować z różnymi technikami mikroskopii ekspansyjnej w zależności od tkanki i biomolekuł, które chcieli zobrazować. Magnify umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości w różnych biomolekułach i typach tkanek bez konieczności stosowania specjalnych etapów zakotwiczania lub specjalistycznego sprzętu, wypełniając w ten sposób znaczącą lukę w obrazowaniu w nanoskali.Magnify rozszerza ponad czterokrotnie trudniejsze próbki kliniczne, zachowując epitopy białek, umożliwiając dokładniejsze badanie chorób u ludzi. Jego kotwica chemiczna zachowuje również szeroką gamę biomolekuł, dzięki czemu jest przydatny do podstawowych badań w modelach analogowych. Magnify symbolizuje obrazowanie biomolekuł i nienaruszonych próbek w nanoskali bez skomplikowanej optyki i specjalistycznego sprzętu.Można go dostosować do różnych modalności obrazowania i strategii mikroskopii ekspansji, umożliwiając dostępne, opłacalne obrazowanie w nanoskali, które może przyspieszyć leczenie lekami i badania nad chorobami, jednocześnie potencjalnie przekształcając generowanie atlasu tkanek. Magnify oferuje nieskończone możliwości badań. Obecne obszary zainteresowania obejmują rozszerzanie miejsc w tkankach, badanie patologicznych próbek ludzkich w nanoskali oraz badanie najmniejszych zmian w mózgu podczas uczenia się i choroby.Zacznij od pobrania przygotowanych zarchiwizowanych świeżych tkanek lub preparatów tkanki mózgowej myszy utrwalonych paraformaldehydem. Wytnij cienkie kawałki szkła nakrywkowego pisakiem z diamentową końcówką, aby zrobić przekładki. Następnie przymocuj je do szkiełka za pomocą niewielkiej ilości wody, PBS lub super kleju.Delikatnie umieść przekładki po obu stronach tkanki. Przygotować końcowy roztwór żelujący, łącząc odczynniki bezpośrednio przed użyciem. Umieścić szkiełko na szalce Petriego po usunięciu nadmiaru roztworu z wycinka tkankowego.Dodać świeżo przygotowany zimny roztwór żelujący do próbki i inkubować mieszaninę na tkance przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby umożliwić dyfuzję do tkanki. Ostrożnie umieść drugie niepowlekane szkiełko na roztworze tkanki i żelu, unikając pęcherzyków powietrza. Pozwól próbkom na polimeryzację przez inkubację przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym środowisku.Na początek weź szkiełko ze spolimeryzowaną, zarchiwizowaną świeżą tkanką lub tkanką mózgową myszy utrwaloną paraformaldehydem. Zakładając okulary ochronne, użyj żyletki, aby oddzielić dwa szklane szkiełka komory żelowania. Przytnij ślepy żel wokół tkanki, aby zminimalizować objętość i upewnij się, że tniesz asymetrycznie, aby śledzić orientację żelu po homogenizacji.Delikatnie podnieś chusteczkę zawierającą żel ze szkiełka za pomocą żyletki. Przenieś go do dwumililitrowej probówki wirówkowej. Napełnij probówkę do góry buforem homogenizacyjnym podgrzanym do 80 stopni Celsjusza.Następnie inkubować próbkę, wstrząsając w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez osiem do 60 godzin. Wlać zawartość probówki wirówkowej do pojedynczego dołka sześciodołkowej płytki do hodowli komórek z tworzywa sztucznego i usunąć bufor denaturacyjny za pomocą pipety transferowej. Aby całkowicie usunąć pozostałą kartę charakterystyki z hydrożelu, przemyj próbkę w 1% niejonowym roztworze środka powierzchniowo czynnego.Na koniec przechowuj próbkę w PBS i 0,02% azydku sodu w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Na początek weź strawioną i ekspandowaną zarchiwizowaną lub świeżą próbkę tkanki klinicznej i przystąp do barwienia przeciwciał, umieszczając ją w jednym dołku sześciodołkowej płytki do hodowli komórek. Przemyć próbkę trzykrotnie PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.W zależności od wielkości próbki dodać 0,5 do dwóch mililitrów pierwszorzędowych przeciwciał w buforze barwiącym, aby odpowiednio pokryć żel. Inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie przemyć próbkę trzykrotnie PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Dodać odpowiednie przeciwciała drugorzędowe i inkubować przez trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wybranym buforze barwiącym. Ponownie umyj próbkę, jak pokazano wcześniej, i dodaj od jednego do dwóch mililitrów glikolu polietylenowego na próbkę w sześciodołkowej płytce. Wybarwić próbkę estrem NHS sprzężonym z fluoroforem przez trzy godziny w temperaturze pokojowej.Pod koniec inkubacji przemyć próbkę trzykrotnie PBS. Następnie, aby wykonać barwienie lipidów, weź ekspandowaną próbkę tkanki przemytą trzykrotnie w PBS. Nałóż konwencjonalny barwnik lipofilowy rozcieńczony 200-krotnie w dwóch mililitrach 0,1% Triton X-100 lub PBS przez 72 do 96 godzin w temperaturze pokojowej i umyj co najmniej trzy razy PBS.Aby wykonać FISH, przygotuj bufor hybrydyzacyjny, łącząc 2x SSC, 10% siarczan dekstranu, 20% węglan etylenu i 0,1% Tween 20. Umieścić homogenizowane próbki żelu w buforze hybrydyzacyjnym podgrzanym do 60 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie inkubuj próbki żelu z buforem hybrydyzacyjnym zawierającym 10 sond FISH picomolar przeciwko genowi docelowemu przez noc w temperaturze 45 stopni Celsjusza.Przemyć próbki rygorystycznym buforem do przemywania dwa razy w temperaturze 45 stopni Celsjusza każda przez 15 minut i dwa razy przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przemyć próbkę trzykrotnie PBS przez 10 minut i przystąpić do obrazowania lub przechowywania próbki w PBS plus 0,02% azydku sodu w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby w pełni rozszerzyć i zobrazować tkankę, przenieś próbki czterokrotnie ekspandowane w PBS na sześciodołkową płytkę obrazową ze szklanym dnem.Jeśli próbka została jeszcze bardziej rozszerzona, pokrój ją na mniejsze kawałki. Nałóż 0,1% poli-L-lizyny na powierzchnię szkła. Umieść próbkę na szkiełku podstawowym i usuń nadmiar płynu wokół żelu za pomocą papierowej ściereczki laboratoryjnej, aby zapobiec przemieszczaniu się żelu podczas obrazowania.Następnie wykonaj obrazowanie fluorescencyjne za pomocą konwencjonalnego mikroskopu szerokokątnego, mikroskopu konfokalnego lub innego wybranego systemu obrazowania. Po zobrazowaniu należy obkurczyć próbki w PBS z co najmniej trzema 10-minutowymi płukaniami, ponieważ długotrwałe przechowywanie w wodzie dejonizowanej prowadzi do degradacji sygnału fluorescencyjnego. Na koniec przechowuj próbki w PBS z 0,02% azydkiem sodu w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Konfokalne obrazy w pełni rozwiniętej tkanki mózgowej myszy pozwoliły na wizualizację białek oraz struktur błon komórkowych i mitochondrialnych. Zidentyfikowano również kwasy nukleinowe w formalnej i utrwalonej tkance ludzkich węzłów chłonnych zanurzonej w parafinie. Po 3,5-krotnym rozszerzeniu odcinka nerkowego zaobserwowano poszerzone kłębuszki nerkowe bez pęknięć.Jednak nieodpowiednie zakotwiczenie lub homogenizacja spowodowały pękanie, zniekształcenia i utratę znakowanych celów w innym odcinku nerki.

universal-molecular-retention-with-11-fold-expansion-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie klinicznych próbek tkanek w nanoskali może pomóc lepiej zrozumieć patogenezę choroby. Patologia ekspansji (ExPath) to wersja mikroskopii ekspansyjnej (ExM), zmodyfikowana pod kątem kompatybilności ze standardowymi klinicznymi próbkami tkanek, w celu zbadania konfiguracji biomolekuł w nanoskali przy użyciu konwencjonalnych mikroskopów o ograniczonej dyfrakcji.

Obrazowanie nanoskopowe skrawków tkanek ludzkich poprzez ekspansję fizyczną i izotropową

Przedstawiona metoda umożliwia wizualizację znakowanych fluorescencyjnie białek komórkowych za pomocą mikroskopii ekspansywnej, co prowadzi do rozdzielczości 70 nm na konwencjonalnym mikroskopie.

Obrazowanie białek podocytarnych nefryny, aktyny i podocyny za pomocą mikroskopii ekspansyjnej

Protokół mikroskopii rozszerzania retencji etykiet (LR-ExM) jest zademonstrowany. LR-ExM wykorzystuje nowatorski zestaw kotew trójfunkcyjnych, który zapewnia lepszą wydajność etykietowania w porównaniu z wcześniej wprowadzonymi mikroskopami ekspandacyjnymi.

Mikroskopia rozszerzająca retencję etykiety (LR-ExM) umożliwia obrazowanie w superrozdzielczości i etykietowanie o wysokiej wydajności

Tutaj przedstawiono protokół implementacji mikroskopii ekspansywnej we wczesnych zarodkach Drosophila w celu uzyskania obrazowania w superrozdzielczości przy użyciu konwencjonalnego laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego.

Wykorzystanie mikroskopii ekspansywnej do fizycznego powiększenia całych zarodków Drosophila w celu obrazowania w superrozdzielczości

To badanie pokazuje szczegółowy protokół do przeprowadzenia mikroskopii ekspansji ultrastruktury w trzech etapach cyklu życia in vitro Trypanosoma cruzi, patogenu odpowiedzialnego za chorobę Chagasa. Uwzględniamy zoptymalizowaną technikę białek cytoszkieletu i znakowania pan-proteomu.

Mikroskopia ekspansji ultrastrukturalnej w trzech etapach cyklu życia Trypanosoma cruzi in vitro

Tutaj proponujemy prosty protokół łączący metaboliczną inżynierię oligosacharydów, chemię kliknięć i mikroskopię ekspansji, który umożliwia bioobrazowanie wewnątrzkomórkowych sjalowanych N-glikoprotein z lepszą rozdzielczością przy użyciu rutynowego sprzętu mikroskopowego.

Wizualizacja sialilacji wewnątrzkomórkowej za pomocą chemii kliknięć i mikroskopii ekspansyjnej

Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół łączący metody kriofiksacji i mikroskopii ekspansyjnej (Cryo-ExM), umożliwiający obrazowanie w wysokiej rozdzielczości z zachowaniem strukturalnym dostosowanym do różnych próbek biologicznych. Próbki biologiczne są zamrażane, osadzane w polimerze puchniącym, denaturowane, rozszerzane i znakowane immunosystemowo, co umożliwia obrazowanie o nadrozdzielczości za pomocą standardowych mikroskopów świetlnych.

Mikroskopia ekspansyjna: Obrazowanie fluorescencyjne o wysokiej rozdzielczości za pomocą konwencjonalnego mikroskopu

W niniejszym filmie demonstrujemy sposób znakowania i wizualizacji pojedynczej egzocytozy oraz transportu pęcherzyków synaptycznych w komórkach bipolarnych siatkówki złotych rybek przy użyciu mikroskopii TIRF (całkowitego wewnętrznego odbicia fluorescencji).

Obrazowanie egzocytozy w bipolarnych komórkach siatkówki z wykorzystaniem mikroskopii TIRF

W niniejszym materiale prezentujemy protokoły przeprowadzania mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek na żywych komórkach bakteryjnych, co umożliwia wykrywanie, śledzenie i kwantyfikację funkcjonalnych kompleksów molekularnych.

Wizualizacja pojedynczych kompleksów molekularnych In vivo Wykorzystanie zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej

Niniejszy protokół demonstruje prostą technikę mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek służącą do wizualizacji replikacji DNA przez poszczególne replisomy w czasie rzeczywistym.

Wizualizacja replikacji pojedynczych cząsteczek DNA za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Poznaj metodę Magnify w mikroskopii ekspansyjnej do nanoskopii próbek biologicznych i klinicznych. Technika umożliwia 11-krotną ekspansję tkanek przy zachowaniu epitopów białkowych bez specjalistycznego sprzętu.

Uniwersalna retencja molekularna z 11-krotną mikroskopią ekspansywną

Przeglądaj więcej filmów