Sekwencjonowanie całego genomu w celu szybkiej charakterystyki wirusa wścieklizny przy użyciu technologii nanoporowej

Nasze badania wykorzystują zaawansowaną genomikę w celu usprawnienia nadzoru nad patogenami w krajach o niskich i średnich dochodach. Pomaga nam to umożliwić lokalnym badaczom znalezienie odpowiedzi na pięć ważnych pytań: kto, co, gdzie, dlaczego i kiedy. A to może pomóc w wypracowaniu praktycznych rozwiązań w terenie.

Używamy technologii nanoporów do decentralizacji sekwencjonowania. Jego łatwość użycia, przenośność i niższe koszty w porównaniu z innymi platformami sprawiają, że idealnie nadaje się do ustawień o niskich zasobach. A zdolność do szybkiego sekwencjonowania u źródła próbki oznacza, że możemy prowadzić nadzór na styku zwierzę-człowiek-środowisko.

Stoimy przed wyzwaniami związanymi z pozyskiwaniem całych genomów z próbek o różnej jakości. Często zgłoszenia z odległych obszarów były transportowane w złych warunkach przechowywania. A także mamy ograniczone doświadczenie w zakupie narzędzi informatycznych, które byłyby przydatne w interpretacji danych.

Więc te narzędzia byłyby jak MADDOG i RABV-GLUE. Można to wykorzystać do interpretowania danych w uniwersalny sposób, aby pomóc w zainicjowaniu kontroli. Okej, próbujemy zademonstrować, jak zoptymalizować protokół szybkich sekwencji dla całych sekwencji genomowych wścieklizny i zobaczyć, jak można go dostosować i wykorzystać w krajach o niskich dochodach do sekwencjonowania wścieklizny.

Tak więc aby odpowiedzieć na różne pytania jak naprawdę on krąży, co jest w obiegu, oraz kiedy on krąży. A te informacje są niezbędne do strategii eliminacji wścieklizny. Nadzór genomiczny nad wirusami jest teraz bardziej dostępny.

Wytyczne dotyczące analizy i interpretacji danych na potrzeby lokalnych działań kontrolnych są jednak bardziej ograniczone. Nasz protokół oferuje kompleksowy potok, zapewniając lokalnym naukowcom możliwości nadzoru na pierwszej linii. Większa dostępność genomów wirusów i metod interpretacji tych danych pozwala naukowcom przełożyć wiedzę epidemiologiczną na użyteczne informacje dla ministerstw rządowych lub programów kontroli chorób oraz kierować procesem podejmowania decyzji.

Przygotuj dwie probówki z kulkami ceramicznymi, wypełniając dwumililitrową probówkę do PCR probówką o pojemności około 200 mikrolitrów pełną 1,4-milimetrowych kulek ceramicznych i odpowiednio oznacz probówkę przed przeniesieniem jej do sterylnego kaptura. Dodaj zalecaną objętość buforu do lizy znajdującą się w zestawie do ekstrakcji RNA do oznakowanej probówki PCR. Za pomocą drewnianego aplikatora pobrać około trzymilimetrową kostkę sześcienną z próbki mózgu, u której potwierdzono zakażenie wścieklizną, i umieścić ją w oznakowanej probówce z identyfikatorem próbki i 100 mikrolitrami wody wolnej od nukleaz do probówki z kontrolą negatywną.

Rozbij tkankę mózgową ręcznie za pomocą drewnianego aplikatora w sztyfcie, a następnie wiruj z maksymalną prędkością, aż do uzyskania pełnej homogenizacji tkanki. Następnie odwirować homogenizowany lizat. Przenieść supernatant do nowo znakowanej probówki mikrowirówkowej za pomocą pipety i użyć go do dalszych etapów ekstrakcji RNA, przygotowania CDNA i amplifikacji PCR.

Po przygotowaniu CDNA i amplifikacji PCR przy użyciu pul starterów A i B, należy przeprowadzić oczyszczanie PCR i kwantyfikację w obszarze po PCR. Porcje SPRI umieścić w probówkach do mikrowirówek z głównej butelki. Można je również przygotować z wyprzedzeniem.

Przechowuj probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub przechowuj je w zimnym stojaku lub lodzie. Następnie ogrzej porcję kulki SPRI w temperaturze około 20 stopni Celsjusza i dokładnie zwiruj, aby ponownie zawiesić kulki w całym roztworze. Następnie w 1,5-mililitrowych probówkach połącz produkty PCR z puli starterów A i z puli starterów B dla każdej próbki.

W razie potrzeby dodaj wodę, aby zwiększyć objętość do 25 mikrolitrów, a następnie dodaj 25 mikrolitrów kulek SPRI do każdego połączonego produktu i wymieszaj go. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 10 minut, od czasu do czasu odwracając lub przesuwając probówki. Następnie umieść probówki na stojaku magnetycznym, aż do oddzielenia koralików i roztworu.

Po zakończeniu wyrzuć supernatant bez naruszania granulki kulki. Następnie przepłucz się dwa razy po 30 sekund świeżo przygotowanymi 200 mikrolitrami 80% etanolu i wyrzuć etanol. Po drugim umyciu usuń wszelkie ślady etanolu za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów.

Wysuszyć granulkę na powietrzu, aż śladowe ilości etanolu wyparują, a granulka zmieni kolor z błyszczącego na matowy. Ponownie zawiesić kulki w 15 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz, aby odzyskać oczyszczony produkt DNA i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Oddziel koraliki od roztworu na stojaku magnetycznym.

Po przeniesieniu supernatantu do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra, należy przygotować rozcieńczenie każdej próbki w stosunku 1:10 w wodzie wolnej od nukleaz. Zmierz stężenie DNA w każdej rozcieńczonej próbce za pomocą wysoce czułego i specyficznego fluorometru, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Rozpocznij zalewanie i ładowanie komory przepływowej o sprawdzonej jakości, odchylając do tyłu pokrywę urządzenia do sekwencjonowania i przesuwając pokrywę portu zalewowego zgodnie z ruchem wskazówek zegara, wizualizując port zalewania.

Aby usunąć pęcherzyki powietrza, ustaw pipetę P1000 na 200 mikrolitrów i włóż końcówkę pipety pionowo do portu zasysającego. Obracaj pokrętłem, aż zobaczysz niewielką objętość wchodzącą do końcówki pipety. Załaduj 800 mikrolitrów wstępnie przygotowanej mieszanki gruntującej do komory przepływowej do komory przepływowej przez port zasysający, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków.

Podnieś pokrywę portu próbki i załaduj 200 mikrolitrów pozostałej mieszanki gruntującej do komory przepływowej przez port zasysający. Aby zapewnić wymieszanie kulek ładujących, ponownie zawiesić główną mieszankę biblioteczną przez pipetowanie i upuszczając krople, załadować 75 mikrolitrów do celi przepływowej przez port próbki. Delikatnie załóż pokrywę portu próbki, upewniając się, że korek wchodzi do portu próbki.

Zamknij port zalewowy i załóż pokrywę urządzenia sekwencjonującego. Do nawiązywania połączeń z bazą na żywo użyj RAMPART. Użyj środowiska artic-rabv i pracuj w katalogu utworzonym dla Rampart_Output.

Następnie wpisz polecenie RAMPART, aby przejść do wymaganych ścieżek. Najpierw protokół schematu specyficzny dla RAMPART, a następnie basecalledPath, folder wyjściowy minknow fastq_pass dla przebiegu. Otwórz okno przeglądarki i przejdź do localhost:3000 w polu URL.

Poczekaj, aż wystarczająca ilość danych zostanie wywołana do bazy, zanim wyniki pojawią się na ekranie. Trzy górne panele pokazują wykresy podsumowujące dla całego przebiegu. Wykres pierwszy przedstawia głębokość pokrycia zmapowanych odczytów dla każdego kodu kreskowego na pozycję nukleotydu w genomie referencyjnym indeksu.

Wykres drugi pokazuje zmapowane odczyty ze wszystkich kodów kreskowych w czasie. Wykres trzeci pokazuje zmapowane odczyty na kod kreskowy. Dolne panele pokazują rzędy wykresów dla każdego kodu kreskowego.

Po lewej stronie przedstawiono głębokość pokrycia zmapowanych odczytów na pozycję nukleotydu w genomie referencyjnym indeksu. Rozkład długości zmapowanych odczytów znajduje się pośrodku. Proporcja pozycji nukleotydów w genomie referencyjnym indeksu, które uzyskują 10-, 100-krotne i 1,000-krotne pokrycie zmapowanych odczytów w czasie, jest widoczna w prawym rogu.

Do przypisywania linii sekwencji konsensusu należy użyć MADDOG. Pobierz repozytorium MADDOG z GitHub, aby zapewnić pracę z najnowszą wersją. Utwórz folder w wcześniej utworzonym lokalnym repozytorium MADDOG.

Wewnątrz folderu dodaj plik FASTA zawierający sekwencje konsensusu. Dodaj również plik metadanych do folderu. Upewnij się, że ten plik jest plikiem CSV z czterema kolumnami o nazwach ID, kraj, rok i przypisanie.

Pobierz repozytorium MADDOG z GitHub, aby zapewnić pracę z najnowszą wersją. W interfejsie wiersza poleceń aktywuj środowisko conda za pomocą polecenia conda activate MADDOG. W interfejsie wiersza poleceń przejdź do folderu repozytorium MADDOG.

Najpierw wykonaj przypisanie pochodzenia w sekwencjach, aby sprawdzić, czy nie ma potencjalnych nieprawidłowości i określić, czy uruchomienie dłuższego kroku oznaczania pochodzenia jest właściwe, uruchamiając polecenie sh assignment. sh. Po wyświetleniu monitu wprowadź Y, aby potwierdzić, że repozytorium zostało pobrane i działa z najnowszą wersją MADDOG.

Po wyświetleniu monitu wprowadź nazwę folderu zawierającego plik FASTA w repozytorium MADDOG. Po zakończeniu przypisywania pochodzenia sprawdź plik wyjściowy w folderze. Jeśli dane wyjściowe są zgodne z oczekiwaniami i wiele sekwencji jest przypisanych do tego samego pochodzenia, uruchom oznaczenie pochodzenia.

Podczas uruchamiania oznaczenia pochodzenia usuń właśnie utworzony plik wyjściowy przypisania. W terminalu, w folderze repozytorium MADDOG, uruchom polecenie sh designation.sh. Po wyświetleniu monitu wprowadź Y, aby wskazać, że repozytorium zostało pobrane, a praca jest wykonywana przy użyciu najnowszej wersji MADDOG.

Po wyświetleniu monitu wprowadź nazwę folderu w folderze repozytorium MADDOG zawierającym plik FASTA i metadane. Przepływ pracy od próbki do sekwencji i interpretacji wirusa wścieklizny RABV został z powodzeniem zastosowany w różnych warunkach laboratoryjnych w krajach endemicznych, takich jak Tanzania, Kenia, Nigeria i Filipiny. Wywołanie bazy na żywo za pomocą RAMPART pokazało generowanie odczytów w czasie rzeczywistym i procentowe pokrycie na próbkę.

Klasyfikacja linii w systemie nomenklatury, MADDOG, używana do kompilacji i interpretacji wynikowych sekwencji RAPV, wykazała wyższą rozdzielczość klasyfikacji lokalnych linii, po przypisaniu MADDOG.