Name: Sekwencjonowanie całego genomu w celu szybkiej charakterystyki wirusa wścieklizny przy użyciu technologii nanoporowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T12:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Poznaj metodę sekwencjonowania całego genomu wirusa wścieklizny przy użyciu technologii nanoporowej. To podejście umożliwia szybką identyfikację liniage wirusów i wspiera lokalne działania nadzoru epidemiologicznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Wellcome [207569/Z/17/Z, 224670/Z/21/Z], Newton funding od Medical Research Council [MR/R025649/1] i Filipińskiego Departamentu Nauki i Technologii (DOST), UK Research and Innovation Global effort on COVID-19 [MR/V035444/1], University of Glasgow Institutional Strategic Support Fund [204820], Medical Research Council New Investigator Award (KB) [MR/X002047/1], oraz Fundusz Rozwoju Partnerstwa Międzynarodowego, stypendium DOST British Council-Filipiny (CB), stypendium Narodowego Instytutu Badań nad Zdrowiem [17/63/82] GemVi (GJ) oraz stypendia Uniwersytetu w Glasgow z MVLS DTP (KC) [125638-06], EPSRC DTP (RD) [EP/T517896/1] i Wellcome IIB DTP (HF) [218518/Z/19/Z]. Jesteśmy wdzięczni kolegom i współpracownikom, którzy wspierali tę pracę: Danielowi Streickerowi, Alice Broos, Elizabeth Miranda, DVM, Darii Manalo, DVM, Thumbi Mwangi, Kennedy'emu Lushasi, Charlesowi Kayukiemu, Jude Karlo Bolivarowi, Jeromirowi Bondocowi, Estevenowi Balbinowi, Ronnelowi Tongohanowi, Agatha Ukande, Davisowi Kuchace, Mumbua Mutunga, Lwitiko Sikana i Annie Czuprynie.

A Nanopore-Based Genomic Approach to Control Rabies in Low-Income Countries

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dostępny przepływ pracy sekwencjonowania całego genomu oparty na nanoporach został opracowany przez Brunkera i wsp.61, wykorzystując zasoby sieci ARTIC46. W tym miejscu przedstawiamy zaktualizowany przepływ pracy, z pełnymi krokami od próbki, przez sekwencję, po interpretację. Przepływ pracy szczegółowo opisuje przygotowanie próbek tkanki mózgowej do sekwencjonowania całego genomu, przedstawia proces bioinformatyczny do przetwarzania odczytów i generowania sekwencji konsensusu oraz podkreśla dwa narzędzia specyficzne dla wścieklizny, które automatyzują przypisywanie linii i określają kontekst filogenetyczny. Zaktualizowany przepływ pracy zawiera również kompleksowe instrukcje dotyczące konfigurowania odpowiednich obliczeniowych i laboratoryjnych obszarów roboczych z uwzględnieniem implementacji w różnych kontekstach (w tym w ustawieniach o niskich zasobach). Wykazaliśmy udane wdrożenie przepływu pracy zarówno w środowisku akademickim, jak i instytutu badawczym w czterech endemicznych LMIC, które nie mają lub mają ograniczone możliwości nadzoru genomowego. Przepływ pracy okazał się odporny na zastosowanie w różnych ustawieniach i zrozumiały dla użytkowników o różnej wiedzy specjalistycznej.
Ten przepływ pracy dla sekwencjonowania RABV jest najbardziej wszechstronnym publicznie dostępnym protokołem (obejmującym etapy od próbki, sekwencji do interpretacji) i specjalnie dostosowanym w celu obniżenia kosztów zarówno uruchomienia, jak i eksploatacji. Czas i koszty wymagane do przygotowania biblioteki i sekwencjonowania za pomocą technologii nanoporowej są znacznie zmniejszone w porównaniu z innymi platformami, takimi jak Illumina61, a ciągły rozwój technologii poprawia jakość i dokładność sekwencji, aby była porównywalna z Illumina62.
Ten protokół został zaprojektowany tak, aby był odporny w różnych kontekstach o niskich zasobach. Odwołując się do wskazówek dotyczących rozwiązywania problemów i modyfikacji dostarczonych wraz z podstawowym protokołem, użytkownicy mogą dostosować przepływ pracy do swoich potrzeb. Dodanie przyjaznych dla użytkownika narzędzi bioinformatycznych do przepływu pracy stanowi istotny postęp w stosunku do oryginalnego protokołu, zapewniając szybkie i ustandaryzowane metody, które mogą być stosowane przez użytkowników z minimalnym wcześniejszym doświadczeniem bioinformatycznym do interpretacji danych sekwencji w lokalnych kontekstach. Zdolność do tego celu in situ jest często ograniczona ze względu na konieczność posiadania określonych umiejętności programistycznych i filogenetycznych, które wymagają intensywnych i długoterminowych inwestycji w szkolenie w umiejętności. Chociaż ten zestaw umiejętności jest ważny dla dokładnej interpretacji danych sekwencyjnych, podstawowe i dostępne narzędzia interpretacyjne są równie pożądane, aby zdolić lokalnych "mistrzów sekwencjonowania", których podstawowa wiedza specjalistyczna może być oparta na mokrym laboratorium, umożliwiając im interpretację i przejęcie odpowiedzialności za swoje dane.
Ponieważ protokół jest stosowany od wielu lat w kilku krajach, możemy teraz udzielić wskazówek, jak zoptymalizować schematy multipleksów w celu poprawy zasięgu i radzenia sobie ze skumulowaną różnorodnością. Podjęto również wysiłki, aby pomóc użytkownikom w poprawie opłacalności lub ułatwić zamawianie zamówień w danym regionie, co zazwyczaj stanowi wyzwanie dla trwałości podejść molekularnych63. Na przykład w Afryce (Tanzania, Kenia i Nigeria) zdecydowaliśmy się na główną mieszankę ligazy / TA na etapie ligacji adaptera, która była łatwiej dostępna u lokalnych dostawców i stanowiła tańszą alternatywę dla innych odczynników do ligacji.
Z doświadczenia wynika, że istnieje kilka sposobów na obniżenie kosztu w przeliczeniu na próbkę i na serię. Zmniejszenie liczby próbek w serii (np. z 24 do 12 próbek) może wydłużyć żywotność komórek przepływowych w wielu cyklach, podczas gdy zwiększenie liczby próbek w serii maksymalizuje czas i odczynniki. W naszych rękach byliśmy w stanie umyć i ponownie wykorzystać komory przepływowe w co trzecim cyklu sekwencjonowania, co umożliwiło sekwencjonowanie dodatkowych 55 próbek. Mycie komory przepływowej natychmiast po użyciu lub, jeśli nie jest to możliwe, usuwanie płynu odpadowego z kanału odpływowego po każdym uruchomieniu, wydawało się zachowywać liczbę porów dostępnych dla drugiego cyklu. Biorąc pod uwagę początkową liczbę porów dostępnych w komorze przepływowej, jeden cykl może być również zoptymalizowany w celu zaplanowania, ile próbek ma być uruchamianych w danej komorze przepływowej.
Chociaż przepływ pracy ma być tak wszechstronny, jak to tylko możliwe, z dodaniem szczegółowych wskazówek i oznaczonych zasobów, procedura jest nadal złożona i może być zniechęcająca dla nowego użytkownika. Użytkownik jest zachęcany do skorzystania z osobistego szkolenia i wsparcia, najlepiej lokalnie lub alternatywnie za pośrednictwem współpracowników zewnętrznych. Na przykład na Filipinach w ramach projektu dotyczącego budowania zdolności w ramach regionalnych laboratoriów w zakresie nadzoru genomicznego nad SARS-CoV-2 za pomocą ONT rozwinięto podstawowe kompetencje diagnostów opieki zdrowotnej, które można łatwo przenieść do sekwencjonowania RAPV. Ważne kroki, takie jak czyszczenie koralików SPRI, mogą być trudne do opanowania bez praktycznego szkolenia, a nieskuteczne czyszczenie może uszkodzić komórkę przepływową i zagrozić przebiegowi. Zanieczyszczenie próbki jest zawsze poważnym problemem, gdy amplikony są przetwarzane w laboratorium i mogą być trudne do wyeliminowania. W szczególności zanieczyszczenie krzyżowe między próbkami jest niezwykle trudne do wykrycia podczas bioinformatyki po uruchomieniu. Dobre techniki i praktyki laboratoryjne, takie jak utrzymywanie czystych powierzchni roboczych, oddzielanie obszarów przed i po PCR oraz stosowanie kontroli ujemnych, są niezbędne do zapewnienia kontroli jakości. Szybkie tempo rozwoju sekwencjonowania nanoporowego jest zarówno zaletą, jak i wadą rutynowego nadzoru genomowego RAPV. Ciągłe ulepszenia dokładności, dostępności i repertuaru protokołów nanoporów poszerzają się i poprawiają zakres ich zastosowania. Jednak te same zmiany sprawiają, że utrzymanie standardowych procedur operacyjnych i rurociągów bioinformatycznych jest wyzwaniem. W tym protokole udostępniamy dokument wspomagający przejście ze starszych na obecne zestawy do przygotowania biblioteki nanoporowej (Tabela Materiałów).
Częstą przeszkodą na drodze do sekwencjonowania w krajach o niskich i średnich dochodach jest dostępność, w tym nie tylko koszty, ale także możliwość terminowego pozyskiwania materiałów eksploatacyjnych (w szczególności odczynników do sekwencjonowania, które są stosunkowo nowe dla zespołów zaopatrzeniowych i dostawców) oraz zasobów obliczeniowych, a także po prostu dostęp do stabilnego zasilania i Internetu. Wykorzystanie przenośnej technologii sekwencjonowania nanoporowego jako podstawy tego przepływu pracy pomaga w wielu z tych problemów z dostępnością, a my zademonstrowaliśmy użycie naszego protokołu w różnych ustawieniach, przeprowadzając pełny protokół i analizę w kraju. Trzeba przyznać, że terminowe zaopatrzenie w sprzęt i sekwencjonowanie materiałów eksploatacyjnych pozostaje wyzwaniem, a w wielu przypadkach byliśmy zmuszeni do przewożenia lub wysyłania odczynników z Wielkiej Brytanii. Jednak w niektórych obszarach byliśmy w stanie całkowicie polegać na lokalnych trasach dostaw odczynników, korzystając z inwestycji w sekwencjonowanie SARS-CoV-2 (np. Filipiny), które usprawniły procesy zaopatrzenia i zaczęły normalizować stosowanie genomiki patogenów.
Potrzeba stabilnego połączenia internetowego jest zminimalizowana przez jednorazowe instalacje; na przykład repozytoria GitHub, pobieranie oprogramowania i sekwencjonowanie nanoporowe wymagają jedynie dostępu do Internetu do rozpoczęcia działania (nie w całości) lub mogą być wykonywane całkowicie offline za zgodą firmy. Jeśli dane komórkowe są dostępne, telefon może być używany jako hotspot do laptopa, aby rozpocząć sekwencjonowanie, przed rozłączeniem na czas trwania. Podczas rutynowego przetwarzania próbek wymagania dotyczące przechowywania danych mogą szybko wzrosnąć, a najlepiej byłoby, gdyby dane były przechowywane na serwerze. W przeciwnym razie dyski twarde z dyskami półprzewodnikowymi (SSD) są stosunkowo tanie w zaopatrzeniu.
Chociaż zdajemy sobie sprawę, że nadal istnieją bariery utrudniające nadzór genomiczny w krajach o niskich i średnich dochodach, rosnące inwestycje w budowanie dostępności i wiedzy specjalistycznej w zakresie genomiki (np. Africa Pathogen Genomics Initiative [Africa PGI])64 sugerują, że sytuacja ta ulegnie poprawie. Nadzór genomiczny ma kluczowe znaczenie dla gotowości na wypadek pandemii6 , a zdolności można ustanowić poprzez rutynizację nadzoru genomicznego nad endemicznymi patogenami, takimi jak RABV. Globalne dysproporcje w zdolnościach sekwencjonowania, które uwypukliły się podczas pandemii SARS-CoV-2, powinny być motorem zmian katalitycznych mających na celu rozwiązanie tych nierówności strukturalnych.
Ten przepływ pracy od próbki do sekwencji i interpretacji dla RABV, w tym dostępne narzędzia bioinformatyczne, może zostać wykorzystany do kierowania środkami kontroli ukierunkowanymi na cel, jakim jest zerowa liczba zgonów ludzi z powodu wścieklizny za pośrednictwem psów, do 2030 r., a ostatecznie do eliminacji wariantów RAPV. W połączeniu z odpowiednimi metadanymi, dane genomiczne wygenerowane za pomocą tego protokołu ułatwiają szybką charakterystykę RABV podczas dochodzeń w sprawie epidemii oraz w identyfikacji krążących linii w kraju lub regionie 60,61,65. Ilustrujemy nasz pipeline głównie na przykładach wścieklizny wywoływanej przez psy; Jednak przepływ pracy ma bezpośrednie zastosowanie do wścieklizny dzikich zwierząt. Ta przenośność i niski koszt minimalizują wyzwania związane z łatwym dostępem do rutynowego sekwencjonowania, nie tylko w przypadku wścieklizny, ale także innych patogenów 46,66,67, w celu poprawy zarządzania i kontroli choroby.

Wirus wścieklizny (RABV) to lyssawirus z rodziny Rhabdoviridae, który powoduje śmiertelną chorobę neurologiczną u ssaków1. Chociaż wściekliźnie można w 100% zapobiec poprzez szczepienia, pozostaje ona poważnym problemem zdrowia publicznego i gospodarki w krajach endemicznych. Szacuje się, że spośród 60 000 zgonów ludzi z powodu wścieklizny, ponad 95% ma miejsce w Afryce i Azji, gdzie psy są głównym rezerwuarem2. W przeciwieństwie do tego, szczepienia psów doprowadziły do wyeliminowania wścieklizny wywoływanej przez psy w Europie Zachodniej, Ameryce Północnej i dużej części Ameryki Łacińskiej. W tych regionach rezerwuary wścieklizny są teraz ograniczone do dzikich zwierząt, takich jak nietoperze, szopy pracze, i dzikie psowate3. W całej Ameryce Łacińskiej nietoperz wampir jest problematycznym źródłem wścieklizny ze względu na regularne przenoszenie się z nietoperzy zarówno na ludzi, jak i zwierzęta gospodarskie podczas nocnego karmienia krwią4. Szacuje się, że roczny globalny wpływ ekonomiczny wścieklizny wynosi 8,6 miliarda dolarów, przy czym straty w inwentarzu żywym stanowią 6%5.
Dane sekwencji patogenów wirusowych w połączeniu z metadanymi na temat czasu i źródła infekcji mogą dostarczyć solidnych informacji epidemiologicznych6. W przypadku RABV sekwencjonowanie zostało wykorzystane do zbadania pochodzenia ognisk choroby7,8, zidentyfikuj powiązania gospodarza z dzikimi zwierzętami lub psami domowymi8,9,10,11,12, oraz źródła śledzenia przypadków u ludzi13,14. Badania epidemii z wykorzystaniem analizy filogenetycznej wykazały, że wścieklizna pojawiła się w prowincji Bali, która była wcześniej wolna od wścieklizny, w Indonezji, poprzez pojedyncze wprowadzenie z pobliskich endemicznych obszarów Kalimantan lub Sulawesi15. Tymczasem na Filipinach udowodniono, że wybuch epidemii na wyspie Tablas w prowincji Romblon został wprowadzony z głównej wyspy Luzon16. Dane genomiczne wirusów wykorzystano również do lepszego zrozumienia dynamiki przenoszenia patogenów, która jest niezbędna do geograficznego ukierunkowania środków kontroli. Na przykład charakterystyka genomiczna RABV ilustruje geograficzne grupowanie kladów17,18,19, co-circulation of lineages20,21,22, ludzki ruch wirusowy17,23,24, oraz Dynamika metapopulacji25,26.
Monitorowanie chorób to jedna z ważnych funkcji nadzoru genomicznego, która została wzmocniona wraz z globalnym wzrostem zdolności sekwencjonowania w odpowiedzi na pandemię SARS-CoV-2. Nadzór genomiczny umożliwił śledzenie w czasie rzeczywistym wariantów SARS-COV-2 budzących obawy27,28 i powiązane środki zaradcze6. Postępy w dostępnej technologii sekwencjonowania, takie jak technologia nanoporowa, doprowadziły do powstania ulepszonych i bardziej przystępnych cenowo protokołów szybkiego sekwencjonowania zarówno human29,30,31,32 i animal33,34,35 Patogenów. Jednak w wielu krajach endemicznych dla wścieklizny nadal istnieją bariery utrudniające operacjonalizację nadzoru genomowego patogenów, o czym świadczą globalne dysproporcje w zdolności sekwencjonowania SARS-CoV-236. Ograniczenia w infrastrukturze laboratoryjnej, łańcuchach dostaw i wiedzy technicznej sprawiają, że ustanowienie i rutynizacja nadzoru genomicznego jest wyzwaniem. W tym artykule pokazujemy, w jaki sposób zoptymalizowany, szybki i niedrogi przepływ pracy sekwencjonowania całego genomu można wdrożyć do nadzoru RABV w warunkach ograniczonych zasobów.

<table><tbody><tr><td>Nazwa marki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do sekwencjonowania (MinKnow)</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>https://community.nanoporetech.com/downloads</td><td></td></tr><tr><td>zestaw narzędzi bioinformatycznych (Guppy)</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>https://community.nanoporetech.com/docs/prepare/library_prep_protocols/Guppy-protocol/v/gpb_2003_v1_revao_14dec2018</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermal cycler (miniPCR&trade; mini16 thermal cycler)</td><td>Cambio</td><td>MP-QP-1016-01</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator (Homogenizator dotykowy Precellys Evolution)</td><td>Bertin Instruments</td><td>EQ02520-300</td><td></td></tr><tr><td>Cold Racks (0,2-0,5 mL) (PCR Mini-cooler z przezroczystą pokrywą)</td><td>MARKA&nbsp;</td><td>781260</td><td></td></tr><tr><td>Pipettor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Pipetman L Fixed F1000L, 1000 uL)</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>SKU: FA10030</td><td></td></tr><tr><td>(Pipetman L Fixed F100L, 100 uL)</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>Kod produktu: FA10024</td><td></td></tr><tr><td>(Pipetman L Fixed F10L, 10 uL)</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>SKU: FA10020</td><td></td></tr><tr><td>(Pipetman L Fixed F1L, 1 uL)</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>SKU: FA10025</td><td></td></tr><tr><td>(Pipetman L Fixed F20L, 20 uL)</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>SKU: FA10021</td><td></td></tr><tr><td>(Pipetman L Fixed F250L, 250 uL)</td><td>Gilson&nbsp;</td><td>SKU: FA10026</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometr (Qubit&nbsp; 4 Fluorometr)&nbsp;</td><td>Thermofisher scientific/Fisher scientific</td><td>Q33238</td><td></td></tr><tr><td>Laptop&nbsp; (Dowolna marka z ~2 GB miejsca na dysku, minimum 512 GB przestrzeni dyskowej, instalator msi [GPU])Mikrowirówka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> (Wirówka z chłodzeniem)</td><td>Thermofisher scientific/Fisher scientific</td><td>75004081</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy (Podstawowy mieszalnik wirowy)&nbsp;</td><td>Thermofisher scientific/Fisher scientific</td><td>88882011</td><td></td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny (DynaMag -2 Magnet)</td><td>Thermofisher scientific/Fisher scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do sekwencjonowania (MinION)</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>MinION Mk1B</td><td></td></tr><tr><td>RNA Ekstrakcja&nbsp; Zestaw do ekstrakcji </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNA (Qiagen RNEasy Mini Kit 250)</td>Odczynniki stabilizujące RNA <td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(RNA później)&nbsp; </td><td>Invitrogen</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>(DNA/RNA Shield)</td><td>Zymo Research</td><td>R1100-50</td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz (Woda wolna od nukleaz [not&nbsp; Poddany działaniu DEPC])</td><td>Thermofisher scientific/Fisher scientific</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Master mix do syntezy pierwszej nici cDNA (LunaScript RT SuperMix Kit)</td><td>New England Biolabs</td><td>E3010S</td><td></td></tr><tr><td>Mistrzowska mieszanka amplifikacji DNA (Q5&reg; Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix [NEB])</td><td>New England Biolabs</td><td>M0494L</td><td></td></tr><tr><td>Primer (schemat) (Custom DNA oligos)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPRI Bead Clean-up</td><td></td><td></td><td></td>SPRI</tr> <tr><td>Beads (Aline Biosciences PCR Clean DX )</td><td>Cambio</td><td>AL-AC1003-50</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, czysty absolut, >99.8% (GC) [Riedel-De Haen]</td><td>Merck</td><td>818760</td><td></td></tr><tr><td>Short Fragment buffer (SFB expansion pack)</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>EXP-SFB001</td><td></td></tr><tr><td>Oznaczanie ilościowe DNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>zestaw do kwantyfikacji DNA (Zestaw do oznaczania kubitów&reg; dsDNA HS)</td><td>Thermofisher scientific/Fisher scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>probówki do oznaczania ilościowego DNA (Qubit &trade; Probówki testowe)</td><td>Thermofisher scientific/Fisher scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>End Prep and barcoding (Qubit &trade; Probówki testowe)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>End Prep master mix (NEBNext Ultra End Repair/dA-Tailing Module)</td><td>New England Biolabs</td><td>E7546L</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw</td><td></td><td></td><td></td> kodów kreskowych</tr><tr><td>*Chemia 9&nbsp; </td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>*Chemia 9&nbsp; </td><td></td></tr><tr><td>(Natywne rozszerzenie kodów kreskowych 1-12)</td><td></td><td>EXP-NBD104&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>(Natywne rozszerzenie kodów kreskowych 13-24)&nbsp; </td><td></td><td>EXP-NBD114&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>(Native Barcoding Expansion 96)</td><td></td><td>EXP-NBD196</td><td></td></tr><tr><td>*Chemistry 14</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>*Chemistry 14</td><td></td></tr><tr><td>(niezgodny)&nbsp; </td><td></td><td>(niezgodny)&nbsp; </td><td></td></tr><tr><td>(Natywny zestaw kodów kreskowych 24 V14)</td><td></td><td>SQK-NBD114.24</td><td></td></tr><tr><td>(Natywny zestaw kodów kreskowych 96 V14)</td><td></td><td>SQK-NBD114.96</td><td></td></tr><tr><td>Ligacja mastermix (Blunt/TA Ligase Master Mix)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0367S</td><td></td></tr><tr><td>Adapter Ligation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adapter podwiązywania mastera mix</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(NEBNext&nbsp; Moduł szybkiego podwiązywania)</td><td>New England Biolabs</td><td>E6056S&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>(Moduł podwiązania NEBNext Ultra II)&nbsp; </td><td>New England Biolabs</td><td>E7595S</td><td></td></tr><tr><td>(Blunt/TA Ligase Master Mix)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0367S</td><td></td></tr><tr><td>Adapter mix</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>*Chemia 9&nbsp; </td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>*Chemistry 9 EXP-AMII001</td><td></td></tr><tr><td>(Adapter Mix II [AMII])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>*Chemistry 14</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>*Chemistry 14 EXP-NBA114</td><td></td></tr><tr><td>(Adapter natywny [NA])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><silne>Sekwencjonowanie&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do gruntowania Flowcell</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>*Chemia 9&nbsp; </td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>*Chemistry 9 EXP-FLP002</td><td></td></tr><tr><td>(Flush Buffer [FB])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Flush Tether [FT])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>*Chemistry 14</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>*Chemistry 14 EXP-FLP004</td><td></td></tr><tr><td>(Flow Cell Flush [FCF])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Flow Cell Tether [FCT])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do sekwencjonowania ligacji&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>*Chemia 9&nbsp; </td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>*Chemistry 9 SQK-LSK109</td><td></td></tr><tr><td>Adapter Mix (Adapter Mix [AMX])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor ligacyjny (Bufor ligacyjny [LNB])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Short Fragment Buffer (Short Fragment buffer [SFB])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor sekwencjonujący (Bufor sekwencjonujący [SQB])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor elucyjny (Bufor elucyjny [EB])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ładowanie koralików (Ładowanie koralików [LB])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sekwencjonowanie uwięzi (Sekwencjonowanie uwięzi [SQT])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>*Chemistry 14</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>*Chemistry 14 SQK-LSK114</td><td></td></tr><tr><td>Adapter Mix (Adapter do ligacji [LA])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor ligacyjny (Bufor ligacyjny [LNB])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor krótkich fragmentów (Bufor krótkich fragmentów [SFB])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor sekwencjonowania (Bufor sekwencjonowania [SB])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor elucyjny (Bufor elucyjny [EB])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ładowanie koralików (Ładowanie koralików [LIB])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sekwencjonowanie Tether (Flow Cell Tether [FCT])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rozwiązanie biblioteczne (Rozwiązanie biblioteczne [LIS])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor do płukania (Płukanie komory przepływowej [FCF])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komórka przepływowa&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>*Chemia 9&nbsp; </td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>*Chemia 9 FLO-MIN106D</td><td></td></tr><tr><td>(Komórka przepływowa&nbsp; [R9.4.1])</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>*Chemia 14</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>*Chemia 14 FLO-MIN114</td><td></td></tr><tr><td>(Komórka przepływowa&nbsp; [R10.4.1])Mycie </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow Cell&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do mycia komór przepływowych (Zestaw do mycia komór przepływowych)</td><td>Oxford Nanopore Technologies</td><td>EXP-WSH004</td><td></td></tr><tr><td>Materiały eksploatacyjne&nbsp; </mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odkażanie powierzchni&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(DNA Away Surface Deminant, butelka do wyciskania [Molecular Bio])</td><td>Thermofisher scientific/Fisher scientific</td><td>7010PK</td><td></td></tr><<tr><td>em>(RNase Away Surface Deminant, butelka [Molecular Bio])</td><td>Thermofisher scientific/Fisher scientific</td><td>7002PK</td><td></td></tr><tr><td>Pasek z 8 probówkami do PCR 0,2 ml, indywidualna nakrętka (8-tubowy pasek do PCR 0,2 ml, z indywidualnie dołączonymi płaskimi nakrętkami, sterylny, DNAse/RNAse, bez pirogenów, naturalny [Greiner])</td><td>Greiner</td><td>608281</td><td></td></tr><tr><td>probówka do PCR 0,2 ml (probówka do PCR 0,2 ml, naturalna [wypukła nakrętka] pakowana w 500s, niesterylna [Greiner])</td><td>Greiner</td><td>671201</td><td></td></tr><tr><td>1000 i mikro; L Końcówki filtrów (500) (ułożone 1000 i mikro; L Końcówki filtrów [500])</td><td>Thermofisher scientific/Fisher scientific</td><td>11977724</td><td></td></tr><tr><td>100&micro; L Końcówki filtracyjne (1000)</td><td>Thermofisher scientific/Fisher scientific</td><td>11947724</td><td></td></tr><tr><td>10&micro; L Końcówki filtrów (1000) (ułożone 100 i mikro; L Końcówki filtrów [1000])</td><td>Thermofisher scientific/Fisher scientific</td><td>11907724</td><td></td></tr><tr><td>Rurki wzmocnione&nbsp; rurki (2ml)&nbsp; z nakrętkami i o-ringami (Fisherbrand&trade; &nbsp; Probówki zbiorcze)</td><td>Thermofisher scientific/Fisher scientific</td><td>15545809</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek (1,5 ml) (1,5 ml probówki Eppendorf [500])</td><td>Probówki Eppendorf</td><td>1229888</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind&nbsp; (1,5 ml) (probówki DNA LoBind)</td><td>Thermofisher scientific/Fisher scientific</td><td>10051232</td><td></td></tr><tr><td>Etykiety Cryobabies Rękawiczki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(S/M/L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ręcznik papierowy</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sekwencjonowanie całego genomu w celu szybkiej charakterystyki wirusa wścieklizny przy użyciu technologii nanoporowej

Whole Genome Sequencing for Rapid Characterization of Rabies Virus Using Nanopore Technology

Dane genomiczne mogą być wykorzystywane do śledzenia transmisji i geograficznego rozprzestrzeniania się chorób zakaźnych. Jednak zdolność sekwencjonowania wymagana do nadzoru genomicznego pozostaje ograniczona w wielu krajach o niskich i średnich dochodach (LMIC), w których wścieklizna przenoszona przez psy i/lub wścieklizna przenoszona przez dzikie zwierzęta, takie jak nietoperze wampiry, stanowi poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego i gospodarki. Przedstawiamy tutaj szybki i przystępny cenowo przepływ pracy od próbki, sekwencji i interpretacji przy użyciu technologii nanoporów. Pokrótce opisano protokoły pobierania próbek i diagnozowania wścieklizny, a następnie szczegółowo opisano zoptymalizowany przebieg sekwencjonowania całego genomu, w tym projektowanie starterów i optymalizację reakcji łańcuchowej polimerazy multipleksowej (PCR), zmodyfikowane, tanie przygotowanie biblioteki sekwencjonowania, sekwencjonowanie z wywoływaniem bazy na żywo i offline, oznaczanie linii genetycznej i analizę filogenetyczną. Zademonstrowano implementację przepływu pracy i podkreślono kluczowe kroki dla wdrożenia lokalnego, takie jak walidacja rurociągu, optymalizacja starterów, włączenie kontroli ujemnych oraz wykorzystanie publicznie dostępnych danych i narzędzi genomicznych (GLUE, MADDOG) do klasyfikacji i umieszczenia w filogenezie regionalnej i globalnej. Czas realizacji przepływu pracy wynosi 2-3 dni, a koszt waha się od 25 USD za próbkę w przypadku 96 prób do 80 USD za próbkę w przypadku 12 próbek. Dochodzimy do wniosku, że ustanowienie nadzoru genomowego nad wirusem wścieklizny w krajach o niskich i średnich dochodach jest wykonalne i może przyczynić się do postępu w kierunku globalnego celu, jakim jest zerowa liczba zgonów ludzi z powodu wścieklizny za pośrednictwem psów do 2030 r., a także ulepszone monitorowanie rozprzestrzeniania się wścieklizny dzikich zwierząt. Co więcej, platformę można dostosować do innych patogenów, pomagając w budowaniu wszechstronnych zdolności genomicznych, które przyczyniają się do gotowości na wypadek epidemii i pandemii.

Przepływ pracy od próbki do sekwencjonowania i interpretacji dla RABV opisany w niniejszym protokole został z sukcesem zastosowany w różnych warunkach laboratoryjnych w krajach endemicznych, takich jak Tanzania, Kenia, Nigeria i Filipiny (Rycina 4). Protokół był stosowany dla różnych typów próbek i warunków (Tabela 6): świeżej i zamrożonej tkanki mózgowej, ekstraktów cDNA i RNA z tkanki mózgowej transportowanej w łańcuchu chłodniczym przez dłuższy czas oraz kart FTA z rozmazami tkanki mózgowej.
Podgląd odczytów w czasie rzeczywistym (live basecalling) przy użyciu RAMPART (Rysunek 5) pokazuje generowanie odczytów niemal w czasie rzeczywistym oraz procentowe pokrycie dla każdej próbki. Jest to szczególnie przydatne przy podejmowaniu decyzji o przerwaniu uruchomienia i zachowaniu komórki przepływowej do ponownego użycia. Zaobserwowano zmienność czasu trwania procesu – niektóre przebiegi kończyły się w ciągu 2 h, podczas gdy inne wymagały więcej niż 12 h, aby osiągnąć odpowiednią głębokość pokrycia (x100). Można również zidentyfikować regiony z niską amplifikacją; na przykład Rysunek 6 przedstawia zrzut ekranu z jednego przebiegu sekwencjonowania, w którym profile pokrycia wykazują niektóre amplikony o bardzo niskiej amplifikacji, co wskazuje na potencjalnie problematyczne primery. Dzięki dokładniejszej analizie tych słabo amplifikowanych regionów udało nam się zidentyfikować niedopasowania primerów, co pozwoli na ich ponowne zaprojektowanie i ulepszenie. Niektóre zestawy primerów wykazały więcej niedopasowań niż inne. Zaobserwowano to w zestawie primerów dla Afryki Wschodniej w porównaniu z zestawem dla Filipin, co jest zgodne z docelową różnorodnością, ponieważ zestaw dla Afryki Wschodniej ma na celu uchwycenie znacznie szerszego zakresu różnorodności.
Do kompilacji i interpretacji uzyskanych sekwencji RABV wykorzystano RABV-GLUE42, ogólne narzędzie do zarządzania danymi genomowymi RABV, oraz MADDOG60, system klasyfikacji linii i nomenklatury. Tabela 7 przedstawia główne i poboczne klady krążące w każdym kraju, przypisane za pomocą RABV-GLUE. Przedstawiono również klasyfikację linii lokalnych o wyższej rozdzielczości zgodnie z przypisaniem MADDOG.
<img alt="Schemat procesu od próbki do sekwencjonowania: pobranie materiału, ekstrakcja RNA, synteza cDNA, PCR, sekwencjonowanie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65414/65414fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat procesu od próbki przez sekwencjonowanie aż do interpretacji dla RABV. Przedstawiono podsumowanie etapów dla (A) przygotowania próbki, (B) PCR i przygotowania biblioteki oraz (C) sekwencjonowania i bioinformatyki, aż po analizę i interpretację. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/65414fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat projektowania nakładających się starterów do amplikonów z starterami prawym i lewym na genomie referencyjnym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65414/65414fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schemat rozmieszczenia starterów. Pozycje hybrydyzacji wzdłuż „genomu referencyjnego indeksu” (ciemnofioletowy) dla par starterów prawych i lewych (półstrzałki), które są przypisane do dwóch oddzielnych pul: A (czerwona) i B (zielona). Pary starterów generują nakładające się amplikony o długości 400 bp (niebieskie), które są ponumerowane sekwencyjnie wzdłuż genomu referencyjnego indeksu w formacie „scheme_name_X_DIRECTION”, gdzie „X” to numer odnoszący się do amplikonu wygenerowanego przez starter, a „DIRECTION” to „LEFT” lub „RIGHT”, opisujące odpowiednio kierunek prawy lub lewy. Nieparzyste lub parzyste wartości „X” określają pulę (odpowiednio A lub B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/65414fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Ogniwo przepływowe do sekwencjonowania DNA, schemat przedstawiający porty odpływowe, SpotON, port próbkowy, macierz sensorów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65414/65414fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Ogniwo przepływowe Nanopore48. Niebieskie etykiety ilustrują poszczególne części ogniwa przepływowego, w tym pokrywę portu inicjującego, która zakrywa port inicjujący, do którego dodaje się roztwór inicjujący, pokrywę portu próbkowego SpotON zakrywającą port próbkowy, przez który próbka jest dodawana kroplowo, porty odpływowe 1 i 2 oraz identyfikator (ID) ogniwa przepływowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/65414fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Globalna mapa rozmieszczenia sekwencji, 2021-2022; lokalizacje sekwencji według rozmiaru i częstotliwości oznaczonej kolorami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65414/65414fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Mapa przedstawiająca lokalizacje, w których w latach 2021 i 2022 przeprowadzono sekwencjonowanie RABV przy użyciu zoptymalizowanego schematu postępowania. Rozmiar i kolor kółek odpowiadają liczbie sekwencji na daną lokalizację, gdzie mniejsze i ciemniejsze kółka oznaczają mniejszą liczbę, a większe i jaśniejsze większą liczbę. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/65414fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza mapowania w czasie rzeczywistym; wykresy słupkowe i liniowe; wizualizacja danych; interfejs oprogramowania RAMPART." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65414/65414fig05v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Zrzut ekranu wizualizacji RAMPART w przeglądarce internetowej. Nazwy kodów kreskowych zostały zastąpione nazwami próbek zgodnie z konfiguracją bioinformatyczną. Trzy górne panele przedstawiają wykresy podsumowujące dla całego przebiegu: głębokość pokrycia zmapowanych odczytów dla każdego kodu kreskowego na pozycję nukleotydową w referencyjnym genomie indeksowym (lewa góra, kolorowanie według kodu kreskowego), sumaryczną liczbę zmapowanych odczytów ze wszystkich kodów kreskowych w czasie (środek góry) oraz zmapowane odczyty na kod kreskowy (prawa góra, kolorowanie według kodu kreskowego). Dolne panele pokazują rzędy wykresów dla każdego kodu kreskowego. Od lewej do prawej: głębokość pokrycia zmapowanych odczytów na pozycję nukleotydową w referencyjnym genomie indeksowym (lewo), rozkład długości zmapowanych odczytów (środek) oraz proporcję pozycji nukleotydowych w referencyjnym genomie indeksowym, które osiągnęły 10x, 100x i 1 000x pokrycia zmapowanych odczytów w czasie (prawo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/65414fig05largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres analizy sekwencjonowania genomu przedstawiający głębokość odczytu w poszczególnych pozycjach; niezbędny do detekcji wariantów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65414/65414fig06v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Przykład pokrycia odczytami w całym genomie dla próbki wirusa wścieklizny z Filipin, zsekwencjonowanej zgodnie z protokołem. Przedstawiono pokrycie odczytami w każdej pozycji nukleotydowej w genomie wraz z pozycjami nakładających się amplikonów (1-41) użytych do przygotowania biblioteki. Skoki głębokości pokrycia odpowiadają obszarom nakładania się amplikonów. Amplikony o niskiej głębokości pokrycia są zaznaczone na czerwono, co wskazuje na problematyczne regiony, które mogą wymagać optymalizacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/65414fig06largev2.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela 1: Master mix i warunki termocyklera dla przygotowania cDNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Table%201.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Master mix i warunki cyklera termicznego dla multiplex PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Table%202.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 3: Master mix i warunki cyklera termicznego dla reakcji end-prep. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Table%203.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 4: Skład master mixu oraz warunki cyklera termicznego dla kodowania kreskowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Table%204.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 5: Master mix do ligacji adapterów oraz końcowe rozcieńczenie biblioteki do sekwencjonowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Table-5_revised.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 6: Liczba wygenerowanych pełnych sekwencji genomu wirusa wścieklizny oraz rodzaje próbek wykorzystanych w różnych krajach w ramach schematu postępowania od próbki do sekwencji i interpretacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Table%206.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 7: Przypisania do kladów głównych i pobocznych z RABV-GLUE oraz przypisania do linii z MADDOG dla sekwencji wygenerowanych przy użyciu opisanego schematu postępowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Table%207.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Plik uzupełniający 1: Projektowanie i optymalizacja schematu starterów oraz analiza głębokości odczytu amplikonu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: Konfiguracja obliczeniowa <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Supplementary%20File%202.docx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 3: Arkusz protokołu WGS dla RABV <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65414/Supplementary%20File%203-%20Worksheet.xlsx" target="_blank">Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.</a>

Tutaj prezentujemy szybki i ekonomiczny proces charakteryzowania genomów wirusa wścieklizny (RABV) za pomocą technologii nanoporowej. Przepływ pracy ma na celu wsparcie nadzoru opartego na genomice na poziomie lokalnym, dostarczając informacji na temat krążących linii RABV i ich umiejscowienia w regionalnych filogenezach w celu ukierunkowania środków kontroli wścieklizny.

Sekwencjonowanie całego genomu w celu szybkiej charakterystyki wirusa wścieklizny przy użyciu technologii nanoporowej

Genomic data can be used to track the transmission and geographic spread of infectious diseases. However, the sequencing capacity required for genomic ...

Nasze badania wykorzystują zaawansowaną genomikę w celu usprawnienia nadzoru nad patogenami w krajach o niskich i średnich dochodach. Pomaga nam to umożliwić lokalnym badaczom znalezienie odpowiedzi na pięć ważnych pytań: kto, co, gdzie, dlaczego i kiedy. A to może pomóc w wypracowaniu praktycznych rozwiązań w terenie.Używamy technologii nanoporów do decentralizacji sekwencjonowania. Jego łatwość użycia, przenośność i niższe koszty w porównaniu z innymi platformami sprawiają, że idealnie nadaje się do ustawień o niskich zasobach. A zdolność do szybkiego sekwencjonowania u źródła próbki oznacza, że możemy prowadzić nadzór na styku zwierzę-człowiek-środowisko.Stoimy przed wyzwaniami związanymi z pozyskiwaniem całych genomów z próbek o różnej jakości. Często zgłoszenia z odległych obszarów były transportowane w złych warunkach przechowywania. A także mamy ograniczone doświadczenie w zakupie narzędzi informatycznych, które byłyby przydatne w interpretacji danych.Więc te narzędzia byłyby jak MADDOG i RABV-GLUE. Można to wykorzystać do interpretowania danych w uniwersalny sposób, aby pomóc w zainicjowaniu kontroli. Okej, próbujemy zademonstrować, jak zoptymalizować protokół szybkich sekwencji dla całych sekwencji genomowych wścieklizny i zobaczyć, jak można go dostosować i wykorzystać w krajach o niskich dochodach do sekwencjonowania wścieklizny.Tak więc aby odpowiedzieć na różne pytania jak naprawdę on krąży, co jest w obiegu, oraz kiedy on krąży. A te informacje są niezbędne do strategii eliminacji wścieklizny. Nadzór genomiczny nad wirusami jest teraz bardziej dostępny.Wytyczne dotyczące analizy i interpretacji danych na potrzeby lokalnych działań kontrolnych są jednak bardziej ograniczone. Nasz protokół oferuje kompleksowy potok, zapewniając lokalnym naukowcom możliwości nadzoru na pierwszej linii. Większa dostępność genomów wirusów i metod interpretacji tych danych pozwala naukowcom przełożyć wiedzę epidemiologiczną na użyteczne informacje dla ministerstw rządowych lub programów kontroli chorób oraz kierować procesem podejmowania decyzji.Przygotuj dwie probówki z kulkami ceramicznymi, wypełniając dwumililitrową probówkę do PCR probówką o pojemności około 200 mikrolitrów pełną 1,4-milimetrowych kulek ceramicznych i odpowiednio oznacz probówkę przed przeniesieniem jej do sterylnego kaptura. Dodaj zalecaną objętość buforu do lizy znajdującą się w zestawie do ekstrakcji RNA do oznakowanej probówki PCR. Za pomocą drewnianego aplikatora pobrać około trzymilimetrową kostkę sześcienną z próbki mózgu, u której potwierdzono zakażenie wścieklizną, i umieścić ją w oznakowanej probówce z identyfikatorem próbki i 100 mikrolitrami wody wolnej od nukleaz do probówki z kontrolą negatywną.Rozbij tkankę mózgową ręcznie za pomocą drewnianego aplikatora w sztyfcie, a następnie wiruj z maksymalną prędkością, aż do uzyskania pełnej homogenizacji tkanki. Następnie odwirować homogenizowany lizat. Przenieść supernatant do nowo znakowanej probówki mikrowirówkowej za pomocą pipety i użyć go do dalszych etapów ekstrakcji RNA, przygotowania CDNA i amplifikacji PCR.Po przygotowaniu CDNA i amplifikacji PCR przy użyciu pul starterów A i B, należy przeprowadzić oczyszczanie PCR i kwantyfikację w obszarze po PCR. Porcje SPRI umieścić w probówkach do mikrowirówek z głównej butelki. Można je również przygotować z wyprzedzeniem.Przechowuj probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub przechowuj je w zimnym stojaku lub lodzie. Następnie ogrzej porcję kulki SPRI w temperaturze około 20 stopni Celsjusza i dokładnie zwiruj, aby ponownie zawiesić kulki w całym roztworze. Następnie w 1,5-mililitrowych probówkach połącz produkty PCR z puli starterów A i z puli starterów B dla każdej próbki.W razie potrzeby dodaj wodę, aby zwiększyć objętość do 25 mikrolitrów, a następnie dodaj 25 mikrolitrów kulek SPRI do każdego połączonego produktu i wymieszaj go. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 10 minut, od czasu do czasu odwracając lub przesuwając probówki. Następnie umieść probówki na stojaku magnetycznym, aż do oddzielenia koralików i roztworu.Po zakończeniu wyrzuć supernatant bez naruszania granulki kulki. Następnie przepłucz się dwa razy po 30 sekund świeżo przygotowanymi 200 mikrolitrami 80% etanolu i wyrzuć etanol. Po drugim umyciu usuń wszelkie ślady etanolu za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów.Wysuszyć granulkę na powietrzu, aż śladowe ilości etanolu wyparują, a granulka zmieni kolor z błyszczącego na matowy. Ponownie zawiesić kulki w 15 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz, aby odzyskać oczyszczony produkt DNA i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Oddziel koraliki od roztworu na stojaku magnetycznym.Po przeniesieniu supernatantu do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra, należy przygotować rozcieńczenie każdej próbki w stosunku 1:10 w wodzie wolnej od nukleaz. Zmierz stężenie DNA w każdej rozcieńczonej próbce za pomocą wysoce czułego i specyficznego fluorometru, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Rozpocznij zalewanie i ładowanie komory przepływowej o sprawdzonej jakości, odchylając do tyłu pokrywę urządzenia do sekwencjonowania i przesuwając pokrywę portu zalewowego zgodnie z ruchem wskazówek zegara, wizualizując port zalewania.Aby usunąć pęcherzyki powietrza, ustaw pipetę P1000 na 200 mikrolitrów i włóż końcówkę pipety pionowo do portu zasysającego. Obracaj pokrętłem, aż zobaczysz niewielką objętość wchodzącą do końcówki pipety. Załaduj 800 mikrolitrów wstępnie przygotowanej mieszanki gruntującej do komory przepływowej do komory przepływowej przez port zasysający, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków.Podnieś pokrywę portu próbki i załaduj 200 mikrolitrów pozostałej mieszanki gruntującej do komory przepływowej przez port zasysający. Aby zapewnić wymieszanie kulek ładujących, ponownie zawiesić główną mieszankę biblioteczną przez pipetowanie i upuszczając krople, załadować 75 mikrolitrów do celi przepływowej przez port próbki. Delikatnie załóż pokrywę portu próbki, upewniając się, że korek wchodzi do portu próbki.Zamknij port zalewowy i załóż pokrywę urządzenia sekwencjonującego. Do nawiązywania połączeń z bazą na żywo użyj RAMPART. Użyj środowiska artic-rabv i pracuj w katalogu utworzonym dla Rampart_Output.Następnie wpisz polecenie RAMPART, aby przejść do wymaganych ścieżek. Najpierw protokół schematu specyficzny dla RAMPART, a następnie basecalledPath, folder wyjściowy minknow fastq_pass dla przebiegu. Otwórz okno przeglądarki i przejdź do localhost:3000 w polu URL.Poczekaj, aż wystarczająca ilość danych zostanie wywołana do bazy, zanim wyniki pojawią się na ekranie. Trzy górne panele pokazują wykresy podsumowujące dla całego przebiegu. Wykres pierwszy przedstawia głębokość pokrycia zmapowanych odczytów dla każdego kodu kreskowego na pozycję nukleotydu w genomie referencyjnym indeksu.Wykres drugi pokazuje zmapowane odczyty ze wszystkich kodów kreskowych w czasie. Wykres trzeci pokazuje zmapowane odczyty na kod kreskowy. Dolne panele pokazują rzędy wykresów dla każdego kodu kreskowego.Po lewej stronie przedstawiono głębokość pokrycia zmapowanych odczytów na pozycję nukleotydu w genomie referencyjnym indeksu. Rozkład długości zmapowanych odczytów znajduje się pośrodku. Proporcja pozycji nukleotydów w genomie referencyjnym indeksu, które uzyskują 10-, 100-krotne i 1,000-krotne pokrycie zmapowanych odczytów w czasie, jest widoczna w prawym rogu.Do przypisywania linii sekwencji konsensusu należy użyć MADDOG. Pobierz repozytorium MADDOG z GitHub, aby zapewnić pracę z najnowszą wersją. Utwórz folder w wcześniej utworzonym lokalnym repozytorium MADDOG.Wewnątrz folderu dodaj plik FASTA zawierający sekwencje konsensusu. Dodaj również plik metadanych do folderu. Upewnij się, że ten plik jest plikiem CSV z czterema kolumnami o nazwach ID, kraj, rok i przypisanie.Pobierz repozytorium MADDOG z GitHub, aby zapewnić pracę z najnowszą wersją. W interfejsie wiersza poleceń aktywuj środowisko conda za pomocą polecenia conda activate MADDOG. W interfejsie wiersza poleceń przejdź do folderu repozytorium MADDOG.Najpierw wykonaj przypisanie pochodzenia w sekwencjach, aby sprawdzić, czy nie ma potencjalnych nieprawidłowości i określić, czy uruchomienie dłuższego kroku oznaczania pochodzenia jest właściwe, uruchamiając polecenie sh assignment. sh. Po wyświetleniu monitu wprowadź Y, aby potwierdzić, że repozytorium zostało pobrane i działa z najnowszą wersją MADDOG.Po wyświetleniu monitu wprowadź nazwę folderu zawierającego plik FASTA w repozytorium MADDOG. Po zakończeniu przypisywania pochodzenia sprawdź plik wyjściowy w folderze. Jeśli dane wyjściowe są zgodne z oczekiwaniami i wiele sekwencji jest przypisanych do tego samego pochodzenia, uruchom oznaczenie pochodzenia.Podczas uruchamiania oznaczenia pochodzenia usuń właśnie utworzony plik wyjściowy przypisania. W terminalu, w folderze repozytorium MADDOG, uruchom polecenie sh designation.sh. Po wyświetleniu monitu wprowadź Y, aby wskazać, że repozytorium zostało pobrane, a praca jest wykonywana przy użyciu najnowszej wersji MADDOG.Po wyświetleniu monitu wprowadź nazwę folderu w folderze repozytorium MADDOG zawierającym plik FASTA i metadane. Przepływ pracy od próbki do sekwencji i interpretacji wirusa wścieklizny RABV został z powodzeniem zastosowany w różnych warunkach laboratoryjnych w krajach endemicznych, takich jak Tanzania, Kenia, Nigeria i Filipiny. Wywołanie bazy na żywo za pomocą RAMPART pokazało generowanie odczytów w czasie rzeczywistym i procentowe pokrycie na próbkę.Klasyfikacja linii w systemie nomenklatury, MADDOG, używana do kompilacji i interpretacji wynikowych sekwencji RAPV, wykazała wyższą rozdzielczość klasyfikacji lokalnych linii, po przypisaniu MADDOG.

whole-genome-sequencing-for-rapid-characterization-rabies-virus-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Sekwencjonowanie nanoporowe to nowatorska technologia, która pozwala na efektywne kosztowo sekwencjonowanie w odległych lokalizacjach i miejscach o ograniczonych zasobach. W tym miejscu przedstawiamy protokół sekwencjonowania mRNA z krwi pełnej, który jest zgodny z takimi warunkami.

Sekwencjonowanie mRNA z krwi pełnej za pomocą sekwencjonowania nanoporowego

Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w pan-lyssavirus została opracowana w celu wykrywania wszystkich znanych lyssawirusów. Walidacja z wykorzystaniem próbek mózgu różnych gatunków zwierząt pod kątem wścieklizny wykazała, że metoda ta ma czułość i swoistość równoważną złotemu standardowi testu na przeciwciała fluorescencyjne i może być stosowana do rutynowej diagnostyki wścieklizny.

Ocena uniwersalnej zagnieżdżonej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w celu wykrycia lyssawirusów

Ten RT-PCR w czasie rzeczywistym wykorzystujący barwnik interkalacyjny dsDNA jest odpowiedni do diagnozowania infekcji wirusem lyssa. Metoda rozpoczyna się od ekstrakcji RNA z próbek przedubojowych lub pośmiertnych z podejrzeniem wścieklizny, szczegółowo opisując przygotowanie mieszanki wzorcowej, dodanie RNA, ustawienie maszyny w czasie rzeczywistym i prawidłową interpretację wyników.

Pan-lyssavirus RT-PCR w czasie rzeczywistym do diagnozowania wścieklizny

Przedstawiamy kompletny protokół do pośmiertnej diagnozy wścieklizny zwierząt w warunkach polowych przy użyciu szybkiego immunochromatograficznego testu diagnostycznego (RIDT), od pobrania próbki z biopsji mózgu do ostatecznej interpretacji. Opisujemy również dalsze zastosowania urządzenia do analizy molekularnej i genotypowania wirusów.

Terenowy pośmiertny szybki immunochromatograficzny test diagnostyczny wścieklizny do zastosowań o ograniczonych zasobach z dalszymi zastosowaniami molekularnymi

Wcześniej sprawdziliśmy protokół sekwencjonowania całego genomu wirusa Usutu (USUV) opartego na amplikonie na platformie sekwencjonowania nanoporowego. W tym miejscu bardziej szczegółowo opisujemy stosowane metody i określamy poziom błędu nanoporowej celi przepływowej R10.

Walidacja sekwencjonowania nanoporowego całego genomu na przykładzie wirusa Usutu

Niniejsze wideo jest demonstracją techniczną protokołu hybrydyzacji dla zestawu CGH z płytkami o gęstym pokryciu całego genomu (whole genome tiling path array CGH), który pozwala na przeskanowanie całego ludzkiego genomu przy użyciu zaledwie 25-100 ng DNA, które można wyizolować z różnych źródeł, w tym z archiwalnego materiału utrwalonego w formalinie.

Demonstracja techniczna porównawczej hybrydyzacji genomowej całego genomu z wykorzystaniem macierzy (array CGH)

Protokół infekcji komórek HeLa wirusem Vaccinia oraz analizy ekspresji genów gospodarza i wirusa. Część 1 z 3.

Infekcja wirusem vaccinia oraz analiza czasowa ekspresji genów wirusa: Część 1

Protokół infekcji komórek HeLa wirusem Vaccinia oraz analizy ekspresji genów gospodarza i wirusa. Część 2 z 3.

Infekcja wirusem vaccinia i analiza czasowa ekspresji genów wirusa: część 2

Protokół infekcji komórek HeLa wirusem Vaccinia oraz analizy ekspresji genów gospodarza i wirusa. Część 3 opisuje proces znakowania fluorescencyjnego namnożonego RNA z próbek gospodarza i wirusa poprzez sprzęganie barwników za pomocą grup aminoallilowych. Część 3 z 3.

Infekcja wirusem vaccinia i analiza czasowa ekspresji genów wirusowych: Część 3

Nabłonek sensoryczny ucha wewnętrznego dorosłych danio przebraniego stanowi dobry model badawczy do zrozumienia mechanizmów regeneracji komórek rzęskowych u dorosłych kręgowców. Niniejszy protokół prezentuje precyzyjną dyssekcję nabłonków, która pozwala na pobranie próbek tkanek do badania procesów regeneracyjnych na poziomie komórkowym i subkomórkowym.

Makro- i mikrosekcja nabłonków sensorycznych ucha wewnętrznego u dorosłych danio pręgowanych (Danio rerio)

Poznaj metodę sekwencjonowania całego genomu wirusa wścieklizny przy użyciu technologii nanoporowej. To podejście umożliwia szybką identyfikację liniage wirusów i wspiera lokalne działania nadzoru epidemiologicznego.

Sekwencjonowanie całego genomu w celu szybkiej charakterystyki wirusa wścieklizny przy użyciu technologii nanoporowej

Przeglądaj więcej filmów