Name: Zoptymalizowana zautomatyzowana analiza modulacji homeostazy mitochondriów neuronalnych w żywych organizmach neuronalnych przez specyficzne dla izoform receptory kwasu retinowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Odkryj zautomatyzowaną analizę mitochondriów neuronowych przy użyciu MATLAB i algorytmów uczenia maszynowego. To narzędzie usprawnia badania nad dynamiką organelli w neurobiologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Akwizycja obrazu została przeprowadzona w obiekcie LiM iBiMED, węzła PPBI (Portugalska Platforma BioObrazowania): POCI-01-0145-FEDER-022122. Prace te były wspierane przez FCT (EXPL/BTM-SAL/0902/2021), LCF (CI21-00276), grant dla DT z Fundação para a Ciência e Tecnologia Ministério da Educação e Ciência (2020.02006.CEECIND), grant od ATG-The Gabba Alumni Association dla VP oraz Institute for Biomedicine-iBiMED, Uniwersytet w Aveiro.

UWAGA: Protokół ten składa się z dwóch głównych etapów: etapu laboratoryjnego, obejmującego hodowlę komórek oraz konfokalną mikroskopię żywych komórek w celu uzyskania obrazów żywych mitochondriów (Rycina 1) oraz an in silico kroki analizy uzyskanych obrazów (Rycina 2). Do zautomatyzowanej analizy danych z obrazowania 3D żywych mitochondriów wykorzystano aplikację MATLAB Mitometer udostępnioną przez Lefebvre i wsp.9Procedura optymalizacji została napisana w języku MATLAB. Oprogramowanie, jego zaktualizowane wersje oraz makra ImageJ do przetwarzania obrazu są bezpłatnie dostępne w internecie za pośrednictwem serwisu GitHub pod adresem https://github.com/JoseJoaoMV/Routine_Optimization_Mitometer_APP_MATLAB. 
1. Mikroskopia żywych komórek
<img alt="Obrazowanie na żywo komórek SH-SY5Y; inkubacja z TMRM; analiza za pomocą Mitometer; automatyczna metoda segmentacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65452/65452fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Protokół eksperymentalny. Komórki SH-SY5Y zostały zróżnicowane i poddane działaniu retinoidów. (A) Do obrazowania na żywo zdrowych mitochondriów w potraktowanych komórkach z użyciem mikroskopu konfokalnego wykorzystano TMRM, rejestrując z-stack w trybie time-lapse z pięciu pól widzenia. (B) Aplikacja Mitometer w środowisku MATLAB automatycznie segmentuje i analizuje obrazy mitochondriów. Oprócz analizy oprogramowanie to automatycznie rozróżnia mitochondria w zależności od bliskości jądra. Niebieskie kropki oznaczają początkowe pozycje mitochondriów; czerwone kropki oznaczają pozycje końcowe. Pasek skali = 30 µm. Skrót: TMRM = tetrametylorodamina, ester metylowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65452/65452fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<ol>
	<li>Hodowla komórkowa
	<ol>
		<li>Inkubować komórki SH-SY5Y w 37 °C w uwilgotnionej atmosferze z dodatkiem 5% CO22 oraz 95% powietrza, hodowane w równej objętości pożywki MEM (Minimal Essential Medium) i pożywki F12 (Ham's F12 Nutrient Mix), uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).</li>
		<li>Wysiać komórki SH-SY5Y w szalkach hodowlanych z szklanym dnem z gęstością 15 × 104 komórek/ml</li>
		<li>Diferencjuj komórki poprzez 5-dniową inkubację z 10 µM wszystko-trans kwas retinowy w pożywce hodowlanej zawierającej 1% FBS, a następnie 2-dniowa inkubacja z czynnikiem neurotroficznym pochodzenia mózgowego (BDNF) w stężeniu 10 ƞg/mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obróbka komórek
	<ol>
		<li>Przemyć komórki sterylnym solnym roztworem buforowanym fosforanowo (PBS) i inkubować przez 72 h z 10-7 Agoniści izoform RAR w równych częściach pożywki MEM (Minimal Essential Medium) i pożywki F12 (Ham's F12 Nutrient Mix), uzupełnionej o 1% FBS. 
		UWAGA: Jako agonistę RARα zastosowano AM580; jako agonistę RARβ zastosowano CD2314; natomiast Ch55 wykorzystano jako agonistę oraz koagonistę RARα i β; wRA zastosowano jako kontrolę pozytywną, a BMS493 jako antagonistę RAR pan-antagonista.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie konfokalne żywych komórek
	<ol>
		<li>Wymień pożywkę hodowlaną na świeżą pożywkę zawierającą 1% FBS i 20 nM esteru metylowego tetrametylorodaminy (TMRM) na 45 min. 
		UWAGA: TMRM jest przenikającym przez błony komórkowe barwnikiem fluorescencyjnym, który jest sekwestrowany przez aktywne mitochondriach, a ten okres inkubacji pozwala na osiągnięcie stanu równowagi TMRM oraz jego pobranie przez spolaryzowane mitochondria11Obrazowanie należy rozpocząć przed osiągnięciem stanu równowagi, ponieważ intensywność sygnału TMRM może sztucznie wzrosnąć w trakcie obrazowania.</li>
		<li>Umieść komórki w inkubatorze podłączonym do konfokalnego mikroskopu skanującego laserowo w 37 °C.</li>
		<li>Obrazy należy zarejestrować przy użyciu obiektywu apochromatycznego z imersją olejową o powiększeniu 63x, przy rozmiarze obrazu wynoszącym 512 x 512 pikseli uzyskane za pomocą przysłona otworkowa z 1 jednostka Airy'ego, rejestrując szereg czasowy 15 klatek z pięciu różnych pól widzenia w każdej płytce komórkowej, oraz stos Z** z 8 równoodległe płaszczyzny zOtrzymany plik .lsm stanowi stos obrazów w czasie, pozycji i w osi z. 
		UWAGA: Ustawienia wzmocnienia, kontrastu i jasności muszą zostać początkowo zoptymalizowane przy użyciu minimalnej mocy lasera niezbędnej do wykorzystania pełnego zakresu dynamicznego detektora i utrzymane na stałym poziomie przez cały czas trwania badania, aby zapewnić przeprowadzenie wszystkich obrazowań w tych samych warunkach. W tej kombinacji sprzętowo-programowej można zarejestrować do dziewięciu różnych pozycji, a mikroskop automatycznie przełącza się między pozycjami obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analiza obrazu
<img alt="Przetwarzanie danych w MATLAB, potok analizy obrazu, schemat przebiegu eksperymentu, wyniki intensywności TMRM." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65452/65452fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Optymalizacja rutynowa. (A) Reprezentatywny kod optymalizacji rutynowej. (B) Live-Script optymalizacji rutynowej. (C) Schemat optymalizacji rutynowej. (D) Walidacja wyników optymalizacji rutynowej: reprezentatywny obraz mitochondriów w komórkach niepoddanych działaniu czynników (panel lewy), traktowanych atRA (10-7 M, 72 h, panel środkowy) oraz traktowanych antagonistą RAR BMS493 (10-7 M, 72 h, panel prawy), obrazowanych po inkubacji z TMRM (20 nM, inkubacja 45 min). Pasek skali = 30 µm. (E) Intensywność TMRM w mitochondriach ciała komórki. Istotny spadek po traktowaniu kwasem all-trans retinowym (atRA, 10-7 M, 72 h) w porównaniu z kontrolą (p=0,0062), niezaobserwowany po traktowaniu antagonistą RAR (BMS493, 10-7 M, 72 godziny). W każdej z trzech powtórek dla każdego stanu poddano kwantyfikacji pięć komórek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65452/65452fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol>
	<li>Przetwarzanie obrazów
	<ol>
		<li>Otwórz pliki w programie ImageJ 2.1.0 i rozdziel stosy pozycyjne według pól widzenia: Otwórz program ImageJ i kliknij Pasek menu | Obraz | Powiel | Wprowadź liczbę przekrojów/klatek | OK. 
		UWAGA: Aby ograniczyć liczbę powtarzalnych operacji wprowadzanych do oprogramowania, opracowano makro ImageJ, które ułatwia duplikowanie i zapisywanie obrazów pola widzenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Protokół główny
	<ol>
		<li>Wyznacz obszar zainteresowania (ROI) wokół komórki z narzędzie do zaznaczania dowolnego obszaru.</li>
		<li>Uruchom makro, otwierając program ImageJ i przechodząc do Pasek menu | Wtyczki | Makra | Uruchom makro Czyszczenie tła i zapisywanie obrazów. 
		UWAGA: Obrazy w tym procesie mogą być randomizowane, a klucz odpowiedzi przechowywany zgodnie z wymogami optymalizacji.</li>
		<li>Wyznacz rozmiar piksela i głębokość woksela: Otwórz ImageJ | obraz i przejdź do Pasek menu | Obraz | Właściwości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Alternatywny protokół bezpośredni 
	UWAGA: Ta alternatywna metoda nie wykorzystuje makr do przetwarzania obrazów
	<ol>
		<li>Wyznacz rozmiar piksela i głębokość woksela: otwórz ImageJ | Otwórz obraz i przejdź do Pasek menu | Obraz | Właściwości.</li>
		<li>Wyznacz obszar zainteresowania (ROI) wokół komórki z narzędzie do zaznaczania dowolnego obszaruaby upewnić się, że obejmuje ona całą komórkę przez wszystkie 15 klatek.</li>
		<li>Przejdź do Pasek menu | Edycja | Wyczyść obszar zewnętrzny.</li>
		<li>Przejdź do Pasek menu | Plik | Zapisz jako | Wybierz Tiff.</li>
		<li>Wybierz folder zapisu i kliknij Zapisz. 
		UWAGA: Na tym etapie, przed przejściem do analizy, obrazy można poddać ślepemu badaniu lub randomizacji w sposób ręczny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zautomatyzowana analiza obrazu
	<ol>
		<li>Przygotuj foldery na pliki z analizą.
		<ol>
			<li>Utwórz trzy główne foldery o nazwach „Wszystkie ślady”, „Ślady okojądrowe” i „Ślady telojądrowe”. 
			UWAGA: Opcje te odpowiadają głównym opcjom ścieżki automatycznej.</li>
			<li>W każdym głównym folderze należy utworzyć podfolder dla każdego obrazu do przetworzenia, ponumerowane kolejno od 1 wzwyż.</li>
			<li>Dodaj kopię dwóch rutynowych plików uzupełniających do optymalizacji (mitometer2table.m oraz getTXTfiles.m) do każdego folderu z obrazami. 
			UWAGA: Pliki te pomagają w analizie danych i końcowym formatowaniu układu. Liczba folderów musi odpowiadać liczbie elementów w zrandomizowanym arkuszu kalkulacyjnym (.xlsx). Po utworzeniu wszystkich ponumerowanych podfolderów z plikami uzupełniającymi dla jednego zestawu danych, można je skopiować i wkleić zbiorczo do pozostałych zestawów danych.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do analizy obrazów należy wykorzystać aplikację Mitometer w środowisku MATLAB. 
	UWAGA: Protokół ten był uruchamiany w programie mitometer, zainstalowanym w środowisku MATLAB R2022a. W celu optymalizacji czasu pracy i zrównoważenia wyników należy wczytywać obrazy w partiach po 30 sztuk. Maksymalna wielkość pliku MAT jest ograniczona przez natywny system plików: domyślnie operacje „zapisz” mogą utworzyć plik &lt; 231 bajty (~2 GB); zamiast tego można zastosować format zapisu MAT-Files Version 7.3, który umożliwia obsługę maksymalnych rozmiarów zmiennych przekraczających 2 GB.
	<ol>
		<li>Identyfikacja/zmiana domyślnej wersji pliku MAT: Na Strona główna karta w Środowisko sekcja, kliknij Preferencje i wybierz MATLAB | Ogólne | Pliki MAT.</li>
		<li>Użyj narzędzia Mitometer w programie MATLAB, aby przeanalizować: otwórz program MATLAB i przejdź do Pasek menu | APLIKACJE | Otwórz Mitometer | Wybierz Start 3D | Wprowadź dane (Rozmiar piksela (µm): 0,1395089/Czas między klatkami (s): 2/Liczba płaszczyzn z: 8/Odległość osiowa między płaszczyznami z (µm): 0,418809 | Wybierz obrazy do wprowadzenia.</li>
		<li>Przejdź do menu bocznego Mitometer, wybierz Obraz, kliknij w Wybierz zaznaczoneprzejdź do mitometru Pasek menu | Wybierz ścieżki | Widoki ścieżek | wybierz Wszystkie ścieżki, telonuklearne lub perinuklearne | Pasek menu mitometer | Wybierz analizę | Wybierz element (t. j. Długość) | wybierz Zapisz do pliku „.txt”. 
		UWAGA: Można jednocześnie pobrać więcej niż jeden parametr, jeśli zostaną one zaznaczone równocześnie.</li>
		<li>Wypakuj pliki z wynikami do utworzonych folderów (2.2.1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rutynowa optymalizacja i analiza danych
	<ol>
		<li>Przygotuj/dostosuj plik „Randomization.xlsx” zawierający klucz do kodowania obrazów.
		<ol>
			<li>Wprowadź do kolumny A listę kolejnych liczb całkowitych, zaczynając od 1. 
			UWAGA: Zaleca się przechowywanie kopii zapasowej folderu z obrazami o oryginalnych nazwach.</li>
			<li>W kolumnie B należy umieścić zmienne analityczne złożone z tzw. znaków alfanumerycznych. 
			UWAGA: Liczba linii w dokumencie musi być zgodna z liczbą folderów znajdujących się w głównym zbiorze danych. Skopiuj i wklej ten plik „Randomization.xlsx” do dwóch pozostałych głównych zbiorów danych.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zoptymalizowana analiza danych
		<ol>
			<li>Kliknij dwukrotnie plik „executable.mlx”, wprowadź liczbę folderów, określ katalog folderów (skopiuj ścieżkę z górnej części okna folderu) | katalog zapisu (skopiuj ścieżkę z górnej części okna folderu) | nazwę arkusza w pliku wyjściowym i kliknij Uruchom.</li>
			<li>Przeprowadzić analizę statystyczną w razie potrzeby. 
			UWAGA: Można wybrać opcjonalne tworzenie pliku .xlsx w każdym folderze z danymi .txt oraz sygnał dźwiękowy po zakończeniu analizy. Live Script generuje jeden plik arkusza kalkulacyjnego w formacie tabeli. W tym pliku wyjściowym kolumny reprezentują analizowane parametry (np. „Długość osi głównej”; „Intensywność”), a linie reprezentują pola widzenia zmiennych analitycznych (np., „Kontrola”).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

MATLAB Optimization for Analyzing Mitochondrial Networks in Neuroscience

<ol><li>Trigo, D., Avelar, C., Fernandes, M., Sa, J., da Cruz, E. S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+energy%2C+and+metabolism+in+neuronal+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, energy, and metabolism in neuronal health and disease.</a> FEBS Letters. 596 (9), 1095-1110 (2022).</li>
<li>Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and cancer.</a> Molecular Cell. 61 (5), 667-676 (2016).</li>
<li>Clare, D. K., Saibil, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-driven+molecular+chaperone+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">ATP-driven molecular chaperone machines.</a> Biopolymers. 99 (11), 846-859 (2013).</li>
<li>Tourniaire, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-trans+retinoic+acid+induces+oxidative+phosphorylation+and+mitochondria+biogenesis+in+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">All-trans retinoic acid induces oxidative phosphorylation and mitochondria biogenesis in adipocytes.</a> Journal of Lipid Research. 56 (6), 1100-1109 (2015).</li>
<li>Psarra, A. M., Sekeris, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+receptors+and+other+nuclear+transcription+factors+in+mitochondria%3A+regulatory+molecules+in+a+new+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Nuclear receptors and other nuclear transcription factors in mitochondria: regulatory molecules in a new environment.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (1), 1-11 (2008).</li>
<li>Trigo, D., Goncalves, M. B., Corcoran, J. P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+mitochondrial+dynamics+in+neurite+outgrowth+by+retinoic+acid+receptor+beta+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">The regulation of mitochondrial dynamics in neurite outgrowth by retinoic acid receptor beta signaling.</a> FASEB Journal. 33 (6), 7225-7235 (2019).</li>
<li>Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+dynamics+and+functions+using+imaging+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches.</a> Current Protocols in Cell Biology. Chapter 4 (Unit 4), 1-21 (2010).</li>
<li>Sajic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impulse+conduction+increases+mitochondrial+transport+in+adult+mammalian+peripheral+nerves+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo.</a> PLoS Biology. 11 (12), e1001754(2013).</li>
<li>Lefebvre, A., Ma, D., Kessenbrock, K., Lawson, D. A., Digman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+segmentation+and+tracking+of+mitochondria+in+live-cell+time-lapse+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated segmentation and tracking of mitochondria in live-cell time-lapse images.</a> Nature Methods. 18 (9), 1091-1102 (2021).</li>
<li>Chu, C. -H., Tseng, W. -W., Hsu, C. -M., Wei, A. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+analysis+of+the+mitochondrial+network+morphology+with+applications+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Image analysis of the mitochondrial network morphology with applications in cancer research.</a> Frontiers in Physics. 10, 855775(2022).</li>
<li>Creed, S., McKenzie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+with+the+fluorescent+dye+tetramethylrhodamine+methyl+ester+%28TMRM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial membrane potential with the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM).</a> Methods in Molecular Biology. 1928, 69-76 (2019).</li>
<li>Kovalevich, J., Langford, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+the+use+of+SH-SY5Y+neuroblastoma+cells+in+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 9-21 (2013).</li>
<li>Sahin, M., Oncu, G., Yilmaz, M. A., Ozkan, D., Saybasili, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+SH-SY5Y+cell+line+into+neuron-like+cells%3A+Investigation+of+electrophysiological+and+biomechanical+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Transformation of SH-SY5Y cell line into neuron-like cells: Investigation of electrophysiological and biomechanical changes.</a> Neuroscience Letters. 745, 135628(2021).</li>
<li>Trigo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+dysfunction+and+impaired+response+to+oxidative+stress+promotes+proteostasis+disruption+in+aged+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Mitochondria dysfunction and impaired response to oxidative stress promotes proteostasis disruption in aged human cells.</a> Mitochondrion. 69, 1-9 (2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Obrazowanie żywych komórek generuje duże pliki, które wymagają poważnego przetwarzania obliczeniowego, ale nawet najnowsze narzędzia wymagają obszernego ręcznego wprowadzania danych do przetworzenia. Ta rutynowa optymalizacja koncentruje się na uproszczeniu procesu analizy mitochondriów za pomocą mitometru, ponieważ narzędzie to zapewnia bardzo dobrą równowagę między danymi wejściowymi użytkownika a danymi wyjściowymi. Kompleksowe porównanie różnych narzędzi do analizy obrazu mitochondriów zostało już wcześniej przeanali...

Komórkowe mitochondria znajdują się w centrum wszystkich stanów fizjologicznych, a dokładne zrozumienie ich homeostazy (mitotazy) i zachowania jest niezbędne do pomocy w identyfikacji leczenia farmakologicznego dla szerokiego zakresu chorób, w tym raka i choroby Alzheimera1,2.
Mitochondria odgrywają kluczową rolę komórkową w homeostazie energetycznej, wytwarzaniu ATP, buforowaniu wapnia i regulacji ROS, a mitostaza jest niezbędna do utrzymania homeostazy białek, ponieważ molekularne białka opiekuńcze są zależne od energii3. Wymagają one stałej i dynamicznej modulacji i adaptacji sieci, aby skutecznie zaspokajać potrzeby komórkowe, a transport mitochondriów jest regulowany przez różne szlaki sygnałowe; Poprzednie prace opisywały jeden z takich szlaków, receptory kwasu retinowego (RAR)4,5. Kwas retinowy (RA) wspomaga wzrost aksonów i neurytów poprzez aktywację RAR. W pierwotnych neuronach korowych myszy aktywacja RAR-β pobudza wzrost, szybkość i ruchliwość mitochondriów w klasie neurite<sup="xref">6.
Biorąc pod uwagę zdolność adaptacyjną i dynamikę sieci mitochondrialnej, możliwość oceny mitotazy w "czasie rzeczywistym" jest niezbędna nie tylko do badania homeostazy energetycznej, ale także do ochrony proteostazy, zdrowia komórek, proliferacji czy sygnalizacji. Powszechnie stosowana metoda oceny mitostazy opiera się na mikroskopii konfokalnej po podświetleniu mitochondriów za pomocą barwnika fluorescencyjnego lub markera, a także na specyficznej konfiguracji mikroskopii umożliwiającej regulację temperatury i/lub CO2 7. Ten typ konfiguracji eksperymentalnej zakłada, że jednorazowo wykonywana jest jedna replika eksperymentalna. Oprócz eksperymentalnego powtarzania różnych zabiegów, należy wziąć pod uwagę, że większość eksperymentów powinna mieć swoje techniczne powtórzenia (gdzie więcej niż jedna pozycja jest obrazowana na płytce), z serią płaszczyzn ogniskowych (z-stacks) rejestrowanych w szeregu punktów czasowych. Tak więc, eksperymentalny projekt z trzema powtórzeniami jednej kontroli i dwoma zabiegami, z pięcioma pozycjami obrazowania na płytkę i 15 punktami czasowymi, daje 225 stosów do przetworzenia. Klasycznie, filmy z żywymi mitochondriami były analizowane za pomocą wykresów kymograficznych, które były indywidualnie analizowane8, w czasochłonnym procesie wymagającym obszernego ręcznego wprowadzania, nawet w przypadku polegania na narzędziach komputerowych.
Niedawno opisano algorytm9, który umożliwia automatyczną segmentację i śledzenie mitochondriów w plikach poklatkowych 2D i 3D z żywymi komórkami. Dostępne są inne techniki kwantyfikacji, ale wszystkie mają swoje ograniczenia10. Mitometer, zautomatyzowana aplikacja typu open source, jest szczególnie odpowiednia do analizy poklatkowej i dynamiki mitochondriów, wymagającej niewielkiego wkładu użytkownika. Aplikacja ta ma szereg zalet w porównaniu z innymi istniejącymi narzędziami opartymi na MATLAB, a mianowicie umożliwia automatyczne przetwarzanie poszczególnych stosów TIF przy użyciu do 13 różnych parametrów, co jest szczególnie interesujące dla neuronauki, ponieważ rozróżnia mitochondria okołojądrowe i telejądrowe.
Jednak dla eksperymentu takiego jak opisany powyżej, te 13 parametrów zastosowanych do 225 stosów daje w wyniku 2 925 indywidualnych plików wyjściowych. Wymagają one czterech indywidualnych wejść komputerowych, co daje w sumie ponad 10 000 ręcznych danych wejściowych wymaganych do pobrania wszystkich plików wyjściowych. W przypadku dużych projektów eksperymentalnych powoduje to niepotrzebną, niezwykle czasochłonną analizę każdego pliku i integrację danych. W niniejszym artykule przedstawiamy rutynową optymalizację, która pozwala na szybką analizę plików, znacznie ograniczając odczyt dokumentów i przetwarzanie danych, analizując dane w zdefiniowany sposób, zgodny z wynikami z istniejących narzędzi.

<table><tbody><tr><td>AM580</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8843</td><td></td></tr><tr><td>BDNF&nbsp;</td><td>Thermo-Fisher</td><td>RP8642</td><td></td></tr><tr><td>BMS493</td><td>Tocris Bioscience&nbsp;</td><td>3409</td><td></td></tr><tr><td>CD2314</td><td>Tocris Bioscience</td><td>3824</td><td></td></tr><tr><td>Ch55</td><td>Tocris Bioscience&nbsp;</td><td>2020</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism v4.0</td><td>Oprogramowanie GraphPad, La Jolla</td><td>bez</td><td></td></tr><tr><td>szynki s F12 Mieszanka składników odżywczych</td><td>Thermo-Fisher</td><td>21765029</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB R2022a&nbsp;</td><td>MathWorks</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium</td><td>Thermo-Fisher</td><td>31095</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Naczynia ze szklanym dnem</td><td>Thermo-Fisher</td><td>150680</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy roztwór soli</td><td>Thermo-Fisher</td><td>28372</td><td></td></tr><tr><td>Kwas retinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; Przekaźnik Chłodniczy R2625</td><td></td></tr><tr><td>TMRM&nbsp;</td><td>Thermo-Fisher</td><td>T668</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510</td><td>Carl Zeiss</td><td>n/a</td><td>Wyposażony w komorę do obrazowania żywych komórek i obiektyw 63x zanurzeniowy w oleju&nbsp;</td></tr></tbody></table>

zoptymalizowana zautomatyzowana analiza modulacji homeostazy mitochondriów neuronalnych w żywych organizmach neuronalnych przez specyficzne dla izoform receptory kwasu retinowego

Optimized Automated Analysis of Live Neuronal Mitochondria Homeostasis Modulation by Isoform-Specific Retinoic Acid Receptors

Złożona sieć mitochondrialna sprawia, że segmentacja, śledzenie i analizowanie żywych komórek jest bardzo trudne. Narzędzia MATLAB pozwalają na analizę mitochondriów w plikach timelapse, co znacznie upraszcza i przyspiesza proces przetwarzania obrazu. Niemniej jednak istniejące narzędzia generują dużą objętość wyjściową, wymagającą indywidualnej uwagi ręcznej, a podstawowe konfiguracje eksperymentalne mają dane wyjściowe tysięcy plików, z których każdy wymaga obszernej i czasochłonnej obsługi. 
Aby rozwiązać te problemy, opracowano rutynową optymalizację, zarówno w kodzie MATLAB, jak i w formie skryptów na żywo, co pozwoliło na szybką analizę plików i znacznie ograniczyło odczytywanie dokumentów i przetwarzanie danych. Dzięki prędkości 100 plików/min optymalizacja pozwala na ogólną szybką analizę. Optymalizacja osiąga wyniki poprzez uśrednianie danych specyficznych dla poszczególnych mitochondriów w różnych ramach czasowych, analizując dane w zdefiniowany sposób, zgodny z danymi wyjściowymi z istniejących narzędzi. Obrazowanie konfokalne na żywo przeprowadzono przy użyciu estru metylowego barwnika tetrametylorodaminy, a rutynowa optymalizacja została potwierdzona poprzez leczenie komórek neuronalnych agonistami receptora kwasu retinowego (RAR), których wpływ na mitochondria neuronalne ustalono w literaturze. Wyniki były zgodne z literaturą i pozwoliły na dalszą charakterystykę zachowania sieci mitochondrialnej w odpowiedzi na modulację RAR specyficzną dla izoformy. 
Ta nowa metodologia pozwoliła na szybką i zweryfikowaną charakterystykę sieci mitochondriów całego neuronu, ale pozwala również na różnicowanie mitochondriów aksonów i komórek ciała, co jest istotną cechą do zastosowania w dziedzinie neuronauki. Co więcej, protokół ten może być stosowany w eksperymentach z wykorzystaniem szybko działających metod leczenia, umożliwiając obrazowanie tych samych komórek przed i po zabiegach, wykraczając poza dziedzinę neuronauki.

W celu usprawnienia i przyspieszenia analizy plików wynikowych w formacie .txt, zaprogramowano rutynową optymalizację, która odczytuje dane zgodne z plikami wyjściowymi Mitometer w formacie .txt, w których kolumny reprezentują klatkę, a wiersze zidentyfikowane mitochondria. Rutynowa optymalizacja generuje dane w formie pojedynczej wartości na parametr poprzez uśrednianie klatek dla każdego zidentyfikowanego mitochondrium, a następnie uśrednianie wyników wszystkich mitochondriów w obrębie pola widzenia. Opracowana procedu...

Sieć mitochondrialna jest niezwykle złożona, co czyni ją bardzo trudną do analizy. Nowatorskie narzędzie MATLAB analizuje na żywo mitochondria zobrazowane konfokalnie na zdjęciach poklatkowych, ale skutkuje dużą objętością wyjściową wymagającą indywidualnej uwagi ręcznej. Aby rozwiązać ten problem, opracowano rutynową optymalizację, która pozwala na szybką analizę plików.

Zoptymalizowana zautomatyzowana analiza modulacji homeostazy mitochondriów neuronalnych w żywych organizmach neuronalnych przez specyficzne dla izoform receptory kwasu retinowego

The complex mitochondrial network makes it very challenging to segment, follow, and analyze live cells. MATLAB tools allow the analysis of mitochondria in ...

Moje badania koncentrowały się na obszarze neurobiologii, a w szczególności chcemy zrozumieć molekularne podstawy choroby. To skłoniło nas do przyjrzenia się komórkom, ich strukturze i organellom, które pełnią różne funkcje komórkowe. Coraz częściej mitochondria cieszą się coraz większą uwagą.Anomalie na poziomie mitochondriów stają się absolutnie niezbędne do zrozumienia procesów chorobowych, a nawet mogą stanowić interesujące cele dla nowych leków lub strategii terapeutycznych. Tutaj, na Uniwersytecie w Aveiro, udało nam się opracować narzędzia, które są interesujące dla badania mitochondriów. Nie tylko mikroskopia i bardziej tradycyjne podejścia, ale także udało nam się zoptymalizować zautomatyzowane narzędzia analityczne w połączeniu ze strategiami bioinformatycznymi, aby móc określić ilościowo i zapewnić bardziej szczegółową analizę funkcji mitochondriów.Najnowsze osiągnięcia obejmują algorytmy uczenia maszynowego do segmentacji obrazu i kwantyfikacji parametrów mitochondriów. A także wysokowydajne platformy obrazowania i algorytmy głębokiego uczenia w celu poprawy dokładności i wydajności charakterystyki mitochondriów. Technologie wykorzystywane obecnie do rozwoju analizy mitochondrialnej obejmują mikroskopię o wysokiej rozdzielczości, systemy obrazowania na żywo, narzędzia do analizy obliczeniowej w połączeniu z protokołami uczenia maszynowego oraz edycję genomu CRISPR-Cas9 na potrzeby morfologii mitochondriów i analizy biologicznej.Obecne wyzwania eksperymentalne w dziedzinie mitochondriów obejmują opracowanie wiarygodnych i dokładnych pomiarów parametrów mitochondriów, uwzględnienie heterogeniczności populacji mitochondrialnych, analizę wzajemnych oddziaływań między biologią mitochondrialną a komórkową oraz opracowanie nieinwazyjnych narzędzi do badania mitochondriów in vivo. Nasze narzędzie zwiększa wydajność i niezawodność, umożliwiając solidną automatyczną analizę mitochondriów. Ponadto możemy zbadać potencjał modulacji receptora kwasu hialuronowego w medycynie spersonalizowanej dla mitochondriów.

optimized-automated-analysis-live-neuronal-mitochondria-homeostasis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Prezentujemy zastosowanie wskaźnika fluorescencyjnego TMRM w neuronach kory mózgu w celu określenia względnych zmian natężenia fluorescencji TMRM przed i po zastosowaniu specyficznego bodźca. Przedstawiamy również zastosowanie sondy fluorescencyjnej H2DCF-DA do oceny względnego poziomu reaktywnych form tlenu w neuronach kory mózgu.

Oznaczanie potencjału błony mitochondrialnej i reaktywnych form tlenu w żywych neuronach korowych szczura

Źródło: Katsalifis, A., et al. Obrazowanie na żywo mitochondrialnego stanu redoks glutationu w neuronach pierwotnych przy użyciu wskaźnika ratiometrycznego. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje obrazowanie mitochondrialnego stanu redoks w neuronach pierwotnych przy użyciu ratiometrycznego wskaźnika fluorescencyjnego. Stosując dwie długości fal wzbudzenia pod mikroskopem fluorescencyjnym, mierzy się współczynnik intensywności fluorescencji w celu oceny utleniania mitochondriów. Protokół obejmuje...

Obrazowanie mitochondrialnego stanu redoks w neuronach pierwotnych za pomocą wskaźnika ratiometrycznego

Tutaj opisano szczegółowy protokół do przeprowadzania testu stresu mitochondrialnego i testu szybkości glikolitycznej w próbkach tkanki siatkówki ex vivo przy użyciu komercyjnego bioanalizatora.

Oznaczanie oddychania mitochondrialnego i glikolizy w próbkach tkanki siatkówki ex vivo

Ten artykuł opisuje metodę mitochondrialnego obrazowania poklatkowego kultur astrocytów wyposażonych w biosensor MitoTimer i wynikową wieloparametryczną analizę dynamiki mitochondriów, mobilności, morfologii, biogenezy, stanu redoks i obrotu.

Obrazowanie na żywo układu mitochondrialnego w hodowanych astrocytach

Ten artykuł opisuje protokół do określania różnic w podstawowym stanie redoks i redoks odpowiedzi na ostre perturbacje w pierwotnych neuronach hipokampa i kory mózgowej za pomocą konfokalnej mikroskopii na żywo. Protokół może być stosowany do innych typów komórek i mikroskopów przy minimalnych modyfikacjach.

Obrazowanie na żywo mitochondrialnego stanu redoks glutationu w neuronach pierwotnych przy użyciu wskaźnika ratiometrycznego

Status metaboliczny ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (H-RPE) odzwierciedla ich zdrowie i funkcję. Przedstawiono zoptymalizowany protokół badania strumienia metabolicznego H-RPE w czasie rzeczywistym za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Analiza bioenergetyki w czasie rzeczywistym w pierwotnych komórkach nabłonka barwnikowego ludzkiej siatkówki przy użyciu respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Tutaj opisujemy pomiar szybkości transportu aksonów konstytutywnych stabilizatorów błon retikulum endoplazmatycznego (ER) związanych z mitochondriami (MAM) poprzez zwiększanie lub utrzymywanie neurotoksycznego generowania β-amyloidu (Aβ) z neuronów choroby Alzheimera (AD) w czasie rzeczywistym, aby służyć jako bezpośredni i ilościowy wskaźnik do pomiaru stabilizacji MAM i wspomagania rozwoju terapii AD.

Analiza ilościowa stabilizacji błony retikulum endoplazmatycznego powiązanej z mitochondriami (MAM) w neuronalnym modelu choroby Alzheimera (AD)

Wprowadzamy nowatorskie urządzenie do pomiaru wskaźników zużycia tlenu (OCR) w hodowlach nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Urządzenie może mierzyć OCR przez wiele tygodni na RPE hodowanym na standardowych płytkach do hodowli komórkowych ze standardowymi pożywkami, podczas gdy płytki znajdują się w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych.

Długoterminowe monitorowanie wskaźników zużycia tlenu w wysoce zróżnicowanych i spolaryzowanych kulturach nabłonka barwnikowego siatkówki

Przedstawiamy protokół selektywnego przepuszczania błony plazmatycznej, umożliwiając ukierunkowane dostarczanie substratów i inhibitorów do oceny mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) w hodowanych komórkach, pokonując bariery transportowe błony plazmatycznej, które zazwyczaj utrudniają takie analizy. Stosując tę technikę, wykazaliśmy, jak funkcja OXPHOS jest modulowana przez agonistów muskarynowych i antagonistów.

Modulacja ligandu cholinergiczna sprzężenia fosforylacji oksydacyjnej w komórkach neuroblastooma BE(2)-C z cyfrytoninami

Opracowaliśmy program komputerowy do analizy morfologii neuronów. W połączeniu z dwoma istniejącymi narzędziami analitycznymi o otwartym kodzie źródłowym, nasz program przeprowadza analizę Sholla oraz określa liczbę neurytów, punktów rozgałęzień i zakończeń neurytów. Analizy są wykonywane w taki sposób, aby można było obserwować lokalne zmiany w morfologii neurytów.

Zautomatyzowana analiza Sholla zdigitalizowanej morfologii neuronów w wielu skalach

Odkryj zautomatyzowaną analizę mitochondriów neuronowych przy użyciu MATLAB i algorytmów uczenia maszynowego. To narzędzie usprawnia badania nad dynamiką organelli w neurobiologii.

Zoptymalizowana zautomatyzowana analiza modulacji homeostazy mitochondriów neuronalnych w żywych organizmach neuronalnych przez specyficzne dla izoform receptory kwasu retinowego (Wideo) | JoVE Journal

Zoptymalizowana zautomatyzowana analiza modulacji homeostazy mitochondriów neuronalnych w żywych organizmach neuronalnych przez specyficzne dla izoform receptory kwasu retinowego

Przeglądaj więcej filmów