Name: Wytwarzanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym na zautomatyzowanym procesorze komórkowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T14:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Poznaj półzautomatyzowaną metodę wytwarzania limfocytów T CAR na zautomatyzowanym procesorze komórkowym. Protokół umożliwia produkcję komórek klasy klinicznej przy niższych kosztach niż alternatywy komercyjne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować za wkład kilku osób i organizacji w tę pracę. Laboratorium Terapii Komórkowej i Genowej oraz Laboratorium Badań Translacyjnych i Korelacyjnych Uniwersytetu Pensylwanii zapewniły cenną pomoc w opracowywaniu procesów i przygotowaniu do składania wniosków IND. Melissa Varghese i Amanda DiNofia przyczyniły się do opracowania procesu i przygotowania zgłoszeń IND, które leżą u podstaw tego manuskryptu. Prace te zostały wsparte grantem akceleracyjnym Cell and Gene Therapy Collaborative ze Szpitala Dziecięcego w Filadelfii. Autorzy pragną również podziękować firmie Miltenyi Biotec za wsparcie techniczne i badawcze. Rysunek 1 jest objęty prawami autorskimi © 2023 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG; Wszelkie prawa zastrzeżone.

Automated Processor for Clinical-Scale CAR-T Cell Manufacturing

<ol><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+in+children+and+young+adults+with+B-cell+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).</li>
<li>Shah, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bispecific+anti-CD20%2C+anti-CD19+CAR+T+cells+for+relapsed+B+cell+malignancies%3A+A+phase+1+dose+escalation+and+expansion+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bispecific anti-CD20, anti-CD19 CAR T cells for relapsed B cell malignancies: A phase 1 dose escalation and expansion trial.</a> Nature Medicine. 26 (10), 1569-1575 (2020).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+humanized+CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29-modified+T+cells+in+children+and+young+adults+with+relapsed%2Frefractory+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficacy of humanized CD19-targeted chimeric antigen receptor (CAR)-modified T cells in children and young adults with relapsed/refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 128 (22), 217(2016).</li>
<li>Mock, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+manufacturing+of+CAR-T+cells+for+adoptive+immunotherapy+using+CliniMACS+Prodigy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Automated manufacturing of CAR-T cells for adoptive immunotherapy using CliniMACS Prodigy.</a> Cytotherapy. 18 (8), 1002-1011 (2016).</li>
<li>Fernández, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GMP-compliant+manufacturing+of+NKG2D+CAR+memory+T+cells+using+CliniMACS+Prodigy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">GMP-compliant manufacturing of NKG2D CAR memory T cells using CliniMACS Prodigy.</a> Frontiers in Immunology. 10 (10), 2361(2019).</li>
<li>Zhu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closed-system+manufacturing+of+CD19+and+dual-targeted+CD20%2F19+chimeric+antigen+receptor+T+Cells+using+CliniMACS+Prodigy+device+at+an+academic+medical+center%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Closed-system manufacturing of CD19 and dual-targeted CD20/19 chimeric antigen receptor T Cells using CliniMACS Prodigy device at an academic medical center.</a> Cytotherapy. 20 (3), 394-406 (2018).</li>
<li>Zhang, W., Jordan, K. R., Schulte, B., Purev, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+clinical+grade+CD19+chimeric+antigen+receptor+T+cells+produced+using+automated+CliniMACS+prodigy+system%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Design%2C+Development+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Characterization of clinical grade CD19 chimeric antigen receptor T cells produced using automated CliniMACS prodigy system.</a> Drug Design, Development and Therapy. 12 (12), 3343-3356 (2018).</li>
<li>Abou-El-Enein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+manufacturing+of+CAR+T+cells+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy.</a> Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).</li>
<li>Miltenyi Biotec. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22CliniMACS+Prodigy+User+Manual%22">CliniMACS Prodigy User Manual</a>. , https://static.miltenyibiotec.com/asset/150655405641/document_h0fd9i4al17q32uhfuf4h7lu25?content-disposition=inline (2021).</li>
<li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+manufacturing+of+non-activated+potent+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Rapid manufacturing of non-activated potent CAR T cells.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (2), 118-128 (2022).</li>
<li>U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Chemistry%2C+manufacturing%2C+and+control+%28CMC%29+information+for+human+gene+therapy+investigational+new+drug+applications+%28INDs%29+guidance+for+industry%22">Chemistry, manufacturing, and control (CMC) information for human gene therapy investigational new drug applications (INDs) guidance for industry</a>. , https://www.fda.gov/media/113760/download (2020).</li>
<li>U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Considerations+for+the+development+of+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+T+cell+products+draft+guidance+for+industry%22">Considerations for the development of chimeric antigen receptor (CAR) T cell products draft guidance for industry</a>. , https://www.fda.gov/media/156896/download (2022).</li>
</ol>

S.K., S.G. i Y.W. otrzymały wsparcie badawcze od Miltenyi Biotec.

Terapia komórkami CAR-T okazała się obiecującym podejściem do leczenia komórek B i innych nowotworów złośliwych. Jednak tradycyjne metody produkcji ogniw CAR-T mają kilka ograniczeń, takich jak wysokie koszty, pracochłonna produkcja i otwarte etapy, które zwiększają ryzyko zanieczyszczenia. Ostatnio pojawiło się kilka półautomatycznych platform, w tym Miltenyi CliniMACS Prodigy ("procesor"), aby rozwiązać te problemy. Proces transdukcji limfocytów T (TCT), zintegrowany z procesorem opisanym w tym manuskrypcie, obejmuje w...

Adopcyjny transfer limfocytów T zmodyfikowanych tak, aby wyrażały chimeryczny receptor antygenowy (CAR), wykazał niezwykłą skuteczność w leczeniu pacjentów z opornymi na leczenie nowotworami złośliwymi komórek B1,2,3,4,5. Jednakże tradycyjne metody wytwarzania komórek CAR-T są pracochłonne, czasochłonne i wymagają wysoko wykwalifikowanych techników do przeprowadzenia bardzo specjalistycznych etapów. Na przykład tradycyjny proces produkcji autologicznego produktu z komórek CAR-T obejmuje wirowanie w gradiencie gęstości, elutriację&#160;lub separację magnetyczną w celu wzbogacenia frakcji limfocytów T, aktywację i transdukcję wektorem wirusowym w sterylnej kolbie oraz ekspansję w bioreaktorze przed zbiorem i formulacją. W ostatnim czasie pojawiło się wiele systemów mających na celu częściową automatyzację tego procesu. Przykładem jest Miltenyi CliniMACS Prodigy (zwany dalej „procesorem”), który jest zautomatyzowanym urządzeniem do przetwarzania komórek, mogącym wykonywać wiele z tych etapów w sposób zautomatyzowany6,7,8,9. Szczegółowa dyskusja na temat tradycyjnych i zautomatyzowanych metod wytwarzania CAR-T została przedstawiona w niedawnym artykule przeglądowym10.
Procesor opiera się na funkcjonalności systemu CliniMACS Plus, urządzenia medycznego zatwierdzonego przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) do przetwarzania komórek progenitorowych krwiotwórczych. Procesor zawiera jednostkę hodowli komórkowej, która umożliwia&#160;zautomatyzowane przemywanie, frakcjonowanie i hodowlę komórek (Rycina 1). Proces transdukcji limfocytów T (TCT) jest wstępnie zdefiniowanym programem w urządzeniu procesora, który w dużej mierze odtwarza ręczną produkcję komórek CAR-T. TCT pozwala na konfigurowalne przetwarzanie komórek za pomocą graficznego interfejsu użytkownika (tzw. „Activity Matrix”, Rycina 2). Ponieważ procesor automatyzuje wiele etapów i konsoliduje funkcjonalność wielu urządzeń w jednej maszynie, wymaga on od technologów mniejszego przeszkolenia i rzadszego stosowania specjalistycznych umiejętności rozwiązywania problemów. Ponieważ wszystkie etapy są wykonywane w zamkniętym, jednorazowym zestawie drenów, procesor może być eksploatowany w placówkach z mniej rygorystyczną infrastrukturą uzdatniania powietrza, niż byłoby to uznane za dopuszczalne w przypadku otwartego procesu produkcyjnego. Na przykład procesor wykorzystujemy w placówce certyfikowanej zgodnie z normą ISO klasa 8 (odpowiednik klasy C według norm UE).
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65488/65488fig01.jpg" /> 
Rysunek 1: Produkcja komórek CAR-T przy użyciu systemu transdukcji limfocytów T. Przedstawiono procesor&#160;z zainstalowanym zestawem drenów. Zestaw drenów umożliwia połączenie innych komponentów, takich jak worki zawierające bufor procesowy, pożywkę hodowlaną i wektor lentiwirusowy, za pomocą zgrzewania sterylnego. Po dodaniu produktu leukaferezy do worka aplikacyjnego (Application bag), można go oznakować kuleczkami do selekcji limfocytów T (T Cell Selection Beads), przepuścić przez kolumnę separacyjną (Separation column), a następnie przenieść do worka reaktywacyjnego (Reapplication bag). Wyselekcjonowane komórki są następnie kierowane do jednostki hodowlanej (Cultivation unit) urządzenia w celu hodowli i aktywowane odczynnikiem aktywującym (patrz Tabela materiałów). Produkt końcowy jest zbierany do worka z komórkami docelowymi (Target cell bag). W trakcie całego procesu możliwe jest aseptyczne pobieranie próbek do kontroli jakości. Szare numery w kółkach reprezentują ponumerowane zawory w procesorze, które kierują przepływem cieczy przez zestaw drenów. Reprodukowano za zgodą 11.&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65488/65488fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65488/65488fig02.jpg" /> 
Rysunek 2: Macierz aktywności. Po selekcji i aktywacji limfocytów T pozostała część procesu wytwarzania komórek CAR-T jest w pełni konfigurowalna. Aktywności&#160;mogą być dodawane, usuwane i planowane na odpowiedni dzień i godzinę, a objętość hodowli po zakończeniu danej aktywności może zostać określona (Volume). Na przykład aktywność transdukcji została skonfigurowana tak, aby rozpoczęła się o godzinie 10:00 w dniu 1., a objętość hodowli na koniec tej aktywności została ustawiona na 100 mL. Macierz aktywności można edytować przez cały okres hodowli. Stan procesu można monitorować na zintegrowanym ekranie urządzenia procesowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65488/65488fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Celem niniejszego opracowania jest szczegółowe przedstawienie procesu wytwarzania komórek CAR-T z wykorzystaniem procesora, a także udzielenie wskazówek dotyczących kontroli wewnątrzprocesowej oraz testów zwolnienia produktu, które prawdopodobnie będą wymagane przez organy regulacyjne w celu zatwierdzenia wniosku o dopuszczenie nowego leku do badań (IND). Przedstawiony protokół ściśle odpowiada zaleceniom producenta i stanowi podstawę protokołu IND 28617, który jest obecnie oceniany w jednocentrowym, inicjowanym przez badacza badaniu klinicznym fazy I/II. Badanie to ma na celu określenie bezpieczeństwa i skuteczności wykorzystania tego procesora do wytwarzania humanizowanych autologicznych komórek CAR-T skierowanych przeciwko CD19 dla pacjentów z ostrą białaczką limfoblastyczną z komórek B (B-ALL) lub chłoniakiem limfoblastycznym z linii B (B-Lly) [NCT05480449]. Badanie rozpoczęło się we wrześniu 2022 roku i zakłada włączenie do 89 pacjentów w wieku 0–29 lat z B-ALL lub B-Lly. W opracowaniu przedstawiamy niektóre wyniki procesu wytwarzania uzyskane w ramach tego badania.
Pragniemy zaznaczyć, że choć niniejszy tekst jest przedstawiony jako protokół z krokami do wykonania, należy go traktować jako punkt wyjścia dla innych osób rozpoczynających optymalizację własnego procesu wytwarzania komórek CAR-T. Niepełna lista możliwych modyfikacji przedstawionego protokołu obejmuje: wykorzystanie świeżych zamiast krio konserwowanych komórek T jako materiału wyjściowego; zastosowanie innej metody wzbogacania komórek T lub całkowite zrezygnowanie z tego etapu; użycie innych pożywek i koktajli cytokin, takich jak IL7/IL15 zamiast IL2; zmianę stężenia ludzkiej surowicy AB lub całkowitą rezygnację z niej; zmianę czasu transdukcji; zastosowanie transdukcji typu „multi-hit”; modyfikację intensywności mieszania, objętości hodowli i harmonogramu dokarmiania; wykorzystanie innych metod transferu genetycznego, w tym elektroporacji kwasów nukleinowych lub wektorów nielentiwiralnych; zastosowanie innego buforu do końcowej formulacji i/lub innego krioprotektanta; oraz infuzję świeżych komórek CAR-T zamiast ich krio konserwacji w celu późniejszej infuzji. Modyfikacje te mogą mieć istotny wpływ na skład komórkowy i aktywność produktu terapeutycznego.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Ogólny etap procesu</td>
			<td >Dzień procesu</td>
			<td colspan="4">Szczegóły techniczne</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Wzbogacanie komórek</td>
			<td rowspan="2">Dzień 0</td>
			<td colspan="4">Selekcja limfocytów T CD4+/CD8+&#160;</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Aktywacja komórek</td>
			<td colspan="4">Wysiew i aktywacja hodowli limfocytów T</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Transdukcja komórek</td>
			<td >Dzień 1</td>
			<td colspan="4">Transdukcja lentiwirusowa (objętość hodowli 100 mL)&#160;</td>
		</tr >
		<tr >
			<td rowspan="12">Ekspansja komórek (następnie formulacja komórek)</td>
			<td >Dzień 2</td>
			<td colspan="4">--</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Dzień 3</td>
			<td colspan="4">Płukanie hodowli (1 cykl); aktywacja wytrząsarki; zwiększenie objętości hodowli do 200 mL</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Dzień 4</td>
			<td colspan="4">--</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Dzień 5</td>
			<td colspan="4">Dokarmianie (50 mL); osiągnięcie końcowej objętości hodowli 250 mL</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Dzień 6</td>
			<td colspan="4">Próbka procesowa; wymiana pożywki (-125 mL / +125 mL)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Dzień 7</td>
			<td colspan="4">Wymiana pożywki (-150 mL / +150 mL) lub zbiór&#160;</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Dzień 8</td>
			<td colspan="4">Próbka procesowa; wymiana pożywki (-150 mL / +150 mL) lub zbiór</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Dzień 9</td>
			<td colspan="4">Wymiana pożywki (-180 mL / +180 mL) lub zbiór</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Dzień 10</td>
			<td colspan="4">Próbka procesowa; wymiana pożywki (-180 mL / +180 mL) lub zbiór</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Dzień 11</td>
			<td colspan="4">Wymiana pożywki (-180 mL / +180 mL) lub zbiór</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Dzień 12</td>
			<td colspan="4">Wymiana pożywki (-180 mL / +180 mL) lub zbiór</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Dzień 13</td>
			<td colspan="4">Zbiór</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Harmonogram i przegląd procesu. Tabela ta podsumowuje etapy procesu TCT stosowane w aktualnym badaniu klinicznym [NCT05480449]. Proces rozpoczyna się w dniu 0 od wzbogacenia limfocytów T poprzez selekcję &#160;CD4+/CD8+,&#160;zasiewu hodowli&#160;oraz aktywacji, a następnie transdukcji w dniu 1. Komórki spoczywają przez 48 h, po czym następuje przemycie hodowli, zwiększenie objętości hodowli do 200 mL oraz mieszanie za pomocą mechanizmu wstrząsowego. W dniu 6 pobierana jest pierwsza próbka kontrolna procesu. Komórki są zbierane, gdy dostępna jest ich liczba wystarczająca na co najmniej trzy pełne dawki komórek CAR-T (5 × 106 komórek CAR-T/kg, jeśli pacjent waży &#60;50 kg, w przeciwnym razie 2.5 × 108 komórek CAR-T) oraz na testy kontroli jakości (~2 × 106 komórek CAR-T); lub gdy hodowla osiągnie łącznie 4-5 x 109 komórek. Skróty: TCT = transdukcja limfocytów T; CAR-T = limfocyty T z chimerycznym receptorem antygenowym; MACS = magnetyczne sortowanie komórek.

<table><tbody><tr><td>12 x 75 probówek borokrzemianowych</td><td>Charles River</td><td>TL1000</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Worek na odczynniki</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-631</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Rurka stożkowa</td><td>Fisher</td><td>05-539-10</td><td></td></tr><tr><td>150 ml Zestaw transferowy</td><td>Fenwal</td><td>4R2001</td><td></td></tr><tr><td>2,000 ml Zestaw transferowy</td><td>Fenwal</td><td>4R2041</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>BDB559925</tr><tr><td>Alkohol Prep</td><td>Tyco/Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bag Access</td><td>Medline</td><td>2300E-0500</td><td></td></tr><tr><td>CD19 APC-Vio770 REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-643</td><td></td></tr><tr><td>CD19 CAR Odczynnik do wykrywania Biotyna</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-129-550</td><td></td></tr><tr><td>CD19 PE</td><td>BD</td><td>555413</td><td></td></tr><tr><td>CD3 APC</td><td>BD</td><td>340440</td><td></td></tr><tr><td>CD4 VioBright FITC REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-229</td><td></td></tr><tr><td>CD45 VioBlue REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-637</td><td></td></tr><tr><td>CD8 APC-Vio770 REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-681</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki referencyjne do celometru 10um</td><td>Nexcelom</td><td>B10-02-020</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki referencyjne do celometru 15um</td><td>Nexcelom</td><td>B15-02-010</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki referencyjne do celometru 5um</td><td>Nexcelom</td><td>B05-02-050</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka do celometru</td><td>Nexcelom</td><td>CHT4-SD100-002</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS CD4 GMP MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>276-01</td><td>Odczynnik CD4</td></tr><tr><td>CliniMACS CD8 GMP MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>275-01</td><td>Odczynnik CD8</td></tr><tr><td>CliniMACS PBS/EDTA Buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-021-201</td><td>Bufor</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Origen</td><td>CP-10</td><td></td></tr><tr><td>Worek do zamrażania 50 ml</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>200-074-400</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka do zamrażania, 1,8 ml</td><td>Nunc</td><td>12565171N</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka do zamrażania, 4,5 ml</td><td>Nunc</td><td>12565161N</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka surowica</td><td>AB Valley Biomedical</td><td></td><td>Sterylna filtrowana, inaktywowana termicznie</td></tr><tr><td>albumina surowicy ludzkiej 25%</td> <td>Grifols</td><td>68516-5216-1</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy ludzkiej 5%</td> <td>Grifols</td><td>68516-5214-1</td><td></td></tr><tr><td>MACS GMP Rekombinowana ludzka IL-2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-148</td><td>Cytokiny</td></tr><tr><td>MACS GMP T Cell TransAct</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>200-076-202</td><td>Odczynnik aktywacyjny</td></tr><tr><td>MycoSeq Mycoplasma Zestaw detekcji</td><td>Life Technologies</td><td>4460623</td><td></td></tr><tr><td>Igły, Igły do SWD200573</td><td></td><td></td>podskórne 14G <td>Medline</td></tr><tr><td>, Końcówki do pipet SlideSafe 18G</td><td>BD</td><td>B-D305918</td><td></td></tr>, <tr><td>2-200 &mu; L, pojedynczo pakowane</td> końcówki do pipet <td>Eppendorf</td><td>022492209</td><td></td></tr><tr><td>, 50-1000 &mm; L, pakowane pojedynczo</td><td>Eppendorf</td><td>022492225</td><td></td></tr><tr><td>Pipety 10 ml</td><td>Fisher</td><td>13-678-27F</td><td></td></tr><tr><td>Pipety 25 ml</td><td>Fisher</td><td>13-675-30</td><td></td></tr><tr><td>Pipety 5 ml</td><td>Fisher</td><td>13-678-27E</td><td></td></tr><tr><td>Plasmalyte-A</td><td>Baxter</td><td>2B2544X</td><td>Roztwór elektrolitu</td></tr><tr><td>Zestaw węży Prodigy TS520</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076- 600</td><td>Zestaw wężyków</td></tr><tr><td>Sterile Field</td><td>Medline</td><td>NON21001</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna PE-Vio770</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-106-793</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 10 ml</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 3 mL</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 30 ml</td><td>BD</td><td>302832</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 50 ml</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>TexMACS GMP Medium</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-306</td><td>Średni</td></tr><tr><td>adapter do potrójnego pobierania próbek</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-609</td><td></td></tr><tr><td>Wektor wirusowy</td><td>CHOP Wektor kliniczny Rdzeń</td><td></td><td>huCART19</td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bezpieczeństwo biologiczne Szafka</td><td>Baker Co</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celometr Auto 2000</td><td>Nexcelom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS Prodigy</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>200-075-301</td><td>Procesor</td></tr><tr><td>Sterowana szybkość zamrażarki</td><td>Strugarka/Kryosave</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Endosafe nexgen-PTS150K</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mettler Balance</td><td>Mettler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka z chłodzeniem</td><td>Fisher Sci</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SCD Sterylna spawarka do rur</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sebra Zgrzewarka do rur</td><td>Sebra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Varitherm</td><td>Barkey</td><td></td><td>Urządzenie do rozmrażania na sucho</td></tr><tr><td>XN-330 Analizator hematologiczny</td><td>Sysmex</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie limfocytów t z chimerycznym receptorem antygenowym na zautomatyzowanym procesorze komórkowym

Chimeric Antigen Receptor T Cell Manufacturing on an Automated Cell Processor

Receptor antygenu chimerycznego (CAR)-T Limfocyty reprezentują obiecujące podejście immunoterapeutyczne w leczeniu różnych chorób złośliwych i niezłośliwych. Komórki CAR-T to genetycznie zmodyfikowane limfocyty T, które wyrażają chimeryczne białko, które rozpoznaje i wiąże się z celem na powierzchni komórki, powodując zabicie komórki docelowej. Tradycyjne metody produkcji ogniw CAR-T są pracochłonne, kosztowne i mogą wiązać się z ryzykiem zanieczyszczenia. CliniMACS Prodigy, zautomatyzowany procesor komórkowy, pozwala na wytwarzanie produktów terapii komórkowej na skalę kliniczną w systemie zamkniętym, minimalizując ryzyko zanieczyszczenia. Przetwarzanie odbywa się półautomatycznie pod kontrolą komputera, a tym samym minimalizuje zaangażowanie człowieka w proces, co oszczędza czas i zmniejsza zmienność i błędy.
Ten manuskrypt i film opisują proces transdukcji limfocytów T (TCT) w produkcji komórek CAR-T przy użyciu tego procesora. Proces TCT obejmuje wzbogacanie limfocytów T CD4 + / CD8 +, aktywację, transdukcję wektorem wirusowym, ekspansję i zbiór. Korzystając z Matrycy Aktywności, funkcjonalności, która umożliwia uporządkowanie i określenie czasu tych kroków, proces TCT można w dużym stopniu dostosować. Przedstawiamy proces produkcji ogniw CAR-T zgodnie z aktualną Dobrą Praktyką Wytwarzania (cGMP) oraz omawiamy wymagane testy uwalniania i eksperymenty przedkliniczne, które będą wspierać wniosek o dopuszczenie do obrotu nowego leku eksperymentalnego (IND). Pokazujemy wykonalność i omawiamy zalety i wady stosowania półautomatycznego procesu do klinicznej produkcji komórek CAR-T. Na koniec opisujemy trwające badanie kliniczne zainicjowane przez badaczy, które jest ukierunkowane na nowotwory złośliwe komórek B u dzieci [NCT05480449] jako przykład tego, jak ten proces produkcyjny można zastosować w warunkach klinicznych.

Wyniki z trzech początkowych serii produkcji CAR-T w badaniu NCT05480449 przedstawiono poniżej w Tabeli 3. Materiał wyjściowy, wektor, cytokiny hodowlane oraz stężenia surowicy AB pozostawały stałe dla każdej serii. Produkty zbierano w dniu 7. lub 8. Średni dzienny wzrost komórek wynosił 46% (wzrost całkowitej liczby komórek), co wskazuje, że proces TCT był skuteczny w promowaniu ekspansji komórek. Wyniki te sugerują, że urządzenie może wytwarzać spójne i powtarzalne produkty komórek CAR-T.
<p class=...

Ten artykuł szczegółowo opisuje proces produkcji limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym do użytku klinicznego, w szczególności przy użyciu automatycznego procesora komórkowego zdolnego do przeprowadzania transdukcji wirusa i hodowli limfocytów T. Przedstawiamy rekomendacje i opisujemy pułapki, które należy wziąć pod uwagę podczas opracowywania procesu i wdrażania badania klinicznego wczesnej fazy.

Wytwarzanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym na zautomatyzowanym procesorze komórkowym

Chimeric antigen receptor (CAR)-T cells represent a promising immunotherapeutic approach for the treatment of various malignant and non-malignant ...

Zaletą naszego protokołu jest to, że jest to półautomatyczny system zamknięty, który nadal oferuje elastyczność. Pracochłonne kroki są zastępowane automatyzacją, która jest uruchamiana przez komputer, a ponieważ jest uruchamiana przez komputer, użytkownik może dostosować swój protokół. To wszystko odbywa się również w systemie zamkniętym.Odkryliśmy, że laboratoria komórek macierzystych, które są powszechnie obecne w szpitalach, mają możliwość produkcji komórek T CAR klasy klinicznej przy znacznie niższych kosztach niż komercyjne alternatywy. Sądzimy, że nasz proces można łatwo zaadaptować do wytwarzania komórek CAR-T specyficznych dla innych celów, a także do produkcji innych rodzajów terapii komórkowych i genowych. Nasz zespół jest gotowy do zbadania innych celów limfocytów T CAR i nowych terapii genowych.Na szerszą skalę terapie komórkowe i genowe szybko się rozwijają, a my cieszymy się, że możemy nadal wspierać i wprowadzać innowacje w tej ekscytującej dziedzinie. Zacznij od włączenia przyrządu i wybrania procesu transdukcji limfocytów T z interfejsu ekranu dotykowego. Kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć procedurę, a następnie postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie.Na ekranie wprowadzania obwodu wprowadź inicjały operatora, numer partii zestawu przewodów i datę ważności. Następnie wybierz opcję Pełny proces na ekranie konfiguracji procesu. Teraz wybierz dwie fiolki odczynnika selekcyjnego do metody wyboru CD4 CD8.Zainstaluj zestaw przewodów, upewniając się, że wszystkie dolne połączenia są szczelnie ustawione, i zakończ testy integralności górnego i dolnego, postępując zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie dotykowym. Teraz przymocuj worki buforowe na podłoże i przetwarzanie zgodnie ze wskazówkami wyświetlanymi na ekranie i rozpocznij automatyczne zalewanie zestawu przewodów. Gdy pojawi się ekran produktu z komórką transferową, przenieś rozmrożony produkt z komórek T do 150-mililitrowego worka transferowego i sterylnie zgrzewaj go z workiem aplikacyjnym zestawu rurek.Następnie za pomocą woreczka do kontroli jakości należy pobrać próbkę z worka aplikacyjnego i przeprowadzić zliczanie komórek za pomocą analizatora hematologicznego. Podłącz fiolki z odczynnikami CD4 i CD8 do zestawu przewodów i rozpocznij proces selekcji do wzbogacania limfocytów T. Po wzbogaceniu wyjmij próbkę wybranych komórek z torebki kontroli jakości worka do ponownego nakładania.Wprowadź żądane stężenie komórek i numer początkowy. Teraz podłącz fiolkę z odczynnikiem aktywacyjnym, zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, a następnie ustaw stężenie dwutlenku węgla na 5% w komorze hodowlanej na 39 stopni Celsjusza. Ustal matrycę aktywności, korzystając z ulepszonego protokołu żywienia jako punktu wyjścia, i zmodyfikuj poszczególne kroki zgodnie z konkretnym, zoptymalizowanym protokołem.W takim przypadku należy ustawić czas aktywności transdukcji na 24 godziny po wysianiu, a mycie kultur na 48 godzin po transdukcji. Ustaw czas aktywacji wytrząsarki tak, aby rozpoczynał się 30 minut po rozpoczęciu mycia kultur. Usuń wszelkie czynności związane z wymianą średnich worków i wymianą worków na odpady, ponieważ nie są już potrzebne.Następnie naciśnij OK na ekranie, aby rozpocząć uprawę. Pozwól instrumentowi automatycznie przepompować wymaganą objętość z worka do ponownej aplikacji do komory hodowlanej. Przygotuj obliczoną objętość wektora w 20-mililitrowej torbie na odczynniki z zimnym podłożem, aby osiągnąć końcową objętość 10 mililitrów.Dostosuj matrycę aktywności, aby ustawić czas transdukcji na dwie minuty w przyszłość i naciśnij OK, aby zainicjować aktywność transdukcji. Sterylnie przyspawaj worek vector do zestawu przewodów, postępując zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie. Zmodyfikuj matrycę aktywności zgodnie z rzeczywistym czasem rozpoczęcia transdukcji, z płukaniem hodowli zaplanowanym na 48 godzin po transdukcji.Zaplanuj czas aktywacji wytrząsarki na 30 minut po myciu kultur. Na koniec upewnij się, że wymiana mediów odbywa się po południu o godzinie 14:00 szóstego dnia. Naciśnij przycisk Sample (Próbka) i postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby pobrać próbkę kontroli jakości z aktywnej hodowli.Podzielić próbkę na trzy jednomililitrowe podwielokrotności do różnych analiz. Przygotuj ostateczny bufor do formulacji, zachowując część na późniejszy preparat krioprotektantu. Następnie dostosuj matrycę aktywności, ustawiając koniec kultury na dwie minuty w przyszłości.Podłącz końcowy bufor preparatu do zestawu wężyków i rozpocznij zbiory. Zapieczętuj i wyjmij docelową torbę na komórki. Ten worek zawiera limfocyty T CAR gotowe do infuzji lub kriokonserwacji.Przebiegi CAR T w badaniu klinicznym wyniosły 46%Wskazuje to, że proces TCT skutecznie promował ekspansję komórek. Żywotność komórek produktu końcowego wynosiła od 88 do 94%, a czystość limfocytów T CD3 wynosiła od 89 do 93%Endotoksyna, mykoplazma, bezpłodność, lentiwirus kompetentny do replikacji i resztkowe komórki białaczkowe nie były wykrywalne.

chimeric-antigen-receptor-t-cell-manufacturing-on-an-automated-cell

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film demonstruje technikę wytwarzania limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) ex vivo. Ludzkie limfocyty T są inkubowane za pomocą kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28, wraz z pożywką uzupełnioną interleukiną-2 (IL-2), co prowadzi do aktywacji i proliferacji limfocytów T. Wprowadzane są transgeniczne wektory lentiwirusowe, które umożliwiają transgenicznemu RNA integrację z genomem gospodarza i ekspresję transgenu. Powoduje to, że transdukowane...

Technika ex vivo do wytwarzania chimerycznych limfocytów T receptora antygenowego

Celem tego protokołu jest produkcja specyficznych dla patogenów klinicznych limfocytów T przy użyciu laboratoryjnego, zautomatyzowanego urządzenia do wzbogacania komórek drugiej generacji, które zawiera zamknięty system wychwytywania cytokin i nie wymaga dedykowanego personelu ani korzystania z urządzenia GMP. Wygenerowane limfocyty T specyficzne dla wirusa cytomegalii pp65 mogą być bezpośrednio podawane pacjentom.

Zautomatyzowane wzbogacanie komórek limfocytów T specyficznych dla wirusa cytomegalii do zastosowań klinicznych przy użyciu systemu wychwytywania cytokin

Opisujemy ilościowy system testów cytolizy in vitro w czasie rzeczywistym, aby ocenić siłę działania limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenu ukierunkowanych na płynne i lite komórki nowotworowe. Protokół ten można rozszerzyć w celu oceny innych komórek efektorowych układu odpornościowego, a także leczenia skojarzonego.

Test siły działania w czasie rzeczywistym dla chimerycznych limfocytów T receptora antygenowego ukierunkowanych na stałe i hematologiczne komórki nowotworowe

Opisujemy podejście do niezawodnego generowania limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) i testowania ich różnicowania i funkcji in vitro i in vivo.

Wytwarzanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) do immunoterapii adoptywnej

Ten protokół opisuje proces transdukcji pierwotnych ludzkich limfocytów T za pomocą interesującego genu, zapewniając zgodność ze standardami Dobrej Praktyki Produkcyjnej (GMP).

Zgodna z GMP procedura wytwarzania limfocytów T modyfikowanych genetycznie

Ten protokół usprawnia produkcję wektorów retrowirusowych i transdukcję mysich limfocytów T, ułatwiając efektywne wytwarzanie mysich komórek CAR-T.

Wydajne wytwarzanie mysich chimerycznych receptorów antygenowych (CAR)-T

Ten protokół zapewnia usprawniony przepływ pracy do generowania i testowania ludzkich limfocytów regulatorowych receptora antygenu chimerycznego (Treg CAR).

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T regulatorowych receptora antygenu chimerycznego

Ten protokół opisuje kluczowe kroki uprawy pierwotnych komórek T, w tym ich izolację, aktywację, ekspansję oraz przejściową transfekcję przez elektroporację mRNA. Dodatkowo proponowany jest przepływ pracy i panel przeciwciał do analizy cytometrycznej fenotypu, markerów aktywacji, żywotności oraz ekspresji chimerycznych receptorów antygenowych (CAR).

Izolacja, hodowla i przejściowa transfekcja pierwotnych ludzkich komórek T w celu wygenerowania komórek T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR)

Opisano wysokoprzepustową, zautomatyzowaną platformę rozwoju linii komórkowych do produkcji białkowych leków terapeutycznych. Wdrożenie sortera komórek BD FACS Aria, obrazownika CloneSelect Imager oraz systemu do obsługi cieczy TECAN Freedom EVO wykazało znaczące zwiększenie wydajności przetwarzania w procesie rozwoju linii komórkowych, przy jednoczesnej poprawie jakości linii komórkowych i wysokiej powtarzalności.

Wysokoprzepustowa zautomatyzowana platforma do opracowywania linii komórkowych produkcyjnych dla białkowych produktów terapeutycznych

Niniejszy protokół umożliwia identyfikację czynników modulujących funkcjonalną masę komórek beta w celu znalezienia potencjalnych celów terapeutycznych w leczeniu cukrzycy. Protokół składa się z usprawnionej metody oceny replikacji wysepek oraz funkcji komórek beta w izolowanych wysepkach szczura po manipulacji ekspresją genów za pomocą adenowirusów.

Ocena replikacji i funkcji komórek beta w izolowanych wysepkach gryzoni poddanych transdukcji adenowirusowej

Poznaj półzautomatyzowaną metodę wytwarzania limfocytów T CAR na zautomatyzowanym procesorze komórkowym. Protokół umożliwia produkcję komórek klasy klinicznej przy niższych kosztach niż alternatywy komercyjne.

Wytwarzanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym na zautomatyzowanym procesorze komórkowym

Przeglądaj więcej filmów