Name: Test zakrzepicy żylnej w mysim modelu raka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 40 s
Description: Poznaj udoskonaloną technikę chirurgiczną z zaciskami naczyniowymi w mysim modelu ksenotransplantatu raka okrężnicy do badania zakrzepicy żylnej związanej z nowotworem. Metoda zapewnia większą powtarzalność i spójność wyników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez AHA Cardio-oncology SFRN CAT-HD Center grant 857078 (KR, VCC, XY i SL) oraz R01HL166608 (KR i VCC).

Do tego badania wykorzystano 16 samic myszy C57Bl6/J w wieku 8-12 tygodni i masie ciała od 20 do 25 g. Myszy trzymano w standardowych warunkach i karmiono karmą i wodą ad libitum. Badanie to zostało przeprowadzone za zgodą Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na Uniwersytecie Bostońskim. Opisane tu procedury otwarte zostały przeprowadzone w stanie sterylnym.
1. Model ksenoprzeszczepu
<ol>
	<li>Hodowla komórkowa
	<ol>
		<li>Przed heterotopową implantacją podskórną należy wyhodować komórki MC-38 jako monowarstwę do 80% zgrywania.</li>
		<li>Po trypsynizacji i ponownym zawieszeniu w 10% pożywce zawierającej FBS, odwirować komórki w temperaturze 277 x g, 4 °C przez 5 min. Następnie ponownie zawiesić komórki w pożywce bez surowicy do stężenia 1 x 104 komórek MC-38/μL pożywki bez surowicy.
		<ol>
			<li>W celu trypsynizacji należy hodować komórki MC-38, aż osiągną pożądane zbieganie (zwykle około 70%-80%), a następnie odessać pożywkę hodowlaną z szalki Petriego.</li>
			<li>Dodać 1 ml roztworu trypsyny-EDTA i inkubować komórki z trypsyną przez 1 minutę w temperaturze 37 °C, aby umożliwić oderwanie. Delikatnie postukaj lub potrząśnij szalką Petriego, aby zapewnić równomierne oderwanie.</li>
			<li>Dodaj pożywkę hodowlaną zawierającą surowicę lub inhibitor trypsyny, aby zneutralizować aktywność i zapobiec dalszej dysocjacji komórek. Zbierz oderwane komórki wraz ze zneutralizowanym roztworem trypsyny.</li>
			<li>Do ponownego zawieszenia, po odłączeniu komórek przez trypsynizację, przygotuj je do przeszczepu lub dalszych eksperymentów. Odwirować zebraną zawiesinę komórek o stężeniu 277 x g, aby uzyskać granulki komórek.</li>
			<li>Ostrożnie usunąć supernatant (ciecz znajdująca się nad osadem komórkowym). Dodaj 9 ml pożywki hodowlanej, buforu lub roztworu do osadu komórkowego, aby osiągnąć pożądane stężenie komórek do przeszczepu lub eksperymentów.</li>
			<li>Delikatnie zawiesić komórki, pipetując w górę i w dół lub używając wytrząsarki do kolby hodowlanej. Należy unikać intensywnego pipetowania, które mogłoby uszkodzić komórki. 
			UWAGA: W zależności od użytego wariantu lub linii komórkowej, komórki mogą być ponownie zawieszone w stosunku 1:1 rozpuszczonej macierzy błony podstawnej i pożywki wolnej od surowicy, aby spowolnić bardzo agresywny wzrost i rozprzestrzenianie się komórek myszy po implantacji. Wszystkie etapy hodowli komórkowej powinny być przeprowadzane w całkowicie aseptycznym kapturze w specjalnie przeznaczonej przestrzeni do hodowli komórkowej i regularnie badane na obecność mykoplazmy.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek zgodnie z dostarczonym protokołem ręcznym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Implantacja komórek
	<ol>
		<li>Losowo przypisz osiem myszy do grupy eksperymentalnej i osiem myszy do grupy kontrolnej w następujący sposób. W grupie kontrolnej należy użyć myszy z ksenoprzeszczepem MC38 i wykonać podwiązanie IVC za pomocą szwu polipropylenowego 5-0. W grupie eksperymentalnej użyj myszy z ksenoprzeszczepem MC38 i wykonaj podwiązanie IVC za pomocą dostosowanego klipsa naczyniowego.</li>
		<li>Umieść mysz w lewej pozycji bocznej i ogol prawą stronę między kończynami przednimi i tylnymi. Alkohol i jod należy nanieść wzdłuż grzbietowej części lędźwiowej, aby w asepcie przygotować miejsce do wstrzyknięcia.</li>
		<li>Wstrzyknąć 2 x 106 komórek MC-38 przygotowanych w 200 μl pożywki podskórnie w bok, w połowie odległości między najbardziej dystalnym żebrem zwierzęcia a wyniosłością miednicy, używając igły 27G, delikatnie trzymając zwierzę w niedominującej ręce.</li>
		<li>Po wstrzyknięciu należy dokładnie obejrzeć zwierzęta i umieścić je z powrotem w klatce. Zwierzęta powinny zostać skontrolowane pod kątem następujących elementów: 1. Zmiany w zachowaniu, poziomie aktywności i ogólnej mobilności myszy. Wszelkie znaczące zmiany mogą wskazywać na dyskomfort lub problemy zdrowotne. 2. Ogólny stan fizyczny myszy, w tym jakość sierści, nawyki pielęgnacyjne oraz wszelkie widoczne oznaki niepokoju lub nieprawidłowości 3. Wróć do spożywania pokarmów i przyjmowania wody 4. Wszelkie zmiany w ich poziomie aktywności, postawie lub interakcjach z kolegami z klatki. Letarg lub zwiększona agresja mogą być oznakami niepokoju.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Obserwacja wzrostu guza
<ol>
	<li>Monitoruj zwierzęta co dwa tygodnie pod kątem trendów wzrostu guza przez 3-4 tygodnie. Zmierz guzy suwmiarką i zapisz wymiary guza.
	<ol>
		<li>Zmierz guzy wzdłuż ich najdłuższej osi (L) i osi prostopadłej do długiej osi (W). Oblicz objętość guza (V) za pomocą równania L x (W2) = V. Jeśli rozmiar guza przekracza 20 mm w każdym wymiarze i/lub guz ma dowody na owrzodzenie, należy poddać zwierzęta eutanazji przed zakończeniem eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy objętość guza osiągnie 400 mm3, zaplanuj użycie myszy do podwiązania IVC.</li>
</ol>
3. Znieczulenie i przygotowanie
<ol>
	<li>Znieczulić mysz w komorze izofluranu i wstrzyknąć środek przeciwbólowy podskórnie: Trzymaj zwierzę od nasady ogona. Trzymaj zwierzę na grzbietowej powierzchni ręki niedominującej.</li>
	<li>Przenieść zwierzę do komory indukcyjnej do ciągłego znieczulania wypełnionej 3%-4% izofluranem. Potwierdź odpowiednie znieczulenie ogólne przy braku odruchu szczypania palców u stóp. Stosować dawkę podtrzymującą 1%-3% izofluranu. Nałóż maść weterynaryjną na oba oczy.</li>
	<li>Wstrzyknięcie podskórne z buprenorfiną (opioid łagodzący ból): Rozpuścić zapas buprenorfiny w stężeniu 0,3 mg/ml w 0,9% chlorku sodu (NaCl), aby osiągnąć stężenie 0,03 mg/ml.</li>
	<li>Dawkę 0,05-0,1 mg/kg 0,03 mg/ml buprenorfiny należy wstrzyknąć wraz z 500 μl jałowego 0,9% NaCl podskórnie przed zabiegiem. W przypadku 20 g myszy wymagana jest ilość 2 μg lub 66 μl 0,03 mg/ml buprenorfiny.</li>
	<li>Przygotowanie skóry: Umieść w pełni znieczuloną mysz w pozycji leżącej na kocu grzewczym. Zdezynfekuj przednią część brzucha 0,5% nalewką z chlorheksydyny, 2x. Często sprawdzaj temperaturę koca grzewczego podczas zabiegu i upewnij się, że temperatura nie spada.</li>
</ol>
4. Podwiązanie IVC
<ol>
	<li>Laparotomia w linii środkowej
	<ol>
		<li>Naciąć skórę brzucha cienkimi nożyczkami, zaczynając od wyniosłości mieczykowatej do pęcherza moczowego. Ściśnij otrzewną w połowie długości nacięcia skóry za pomocą atraumatycznych kleszczy. Zapewnij odpowiednią przestrzeń między nacięciem a leżącymi nad nim jelitami (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
		<li>Otwórz otrzewną w sposób podłużny wraz z jałową linią białką.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zewnętrzizowanie jelit na prawą stronę brzucha
	<ol>
		<li>Pociągnij jelita mokrymi bawełnianymi końcówkami. Przykryj jelita całkowicie wilgotną, sterylną gazą. Upewnij się, że zakryte jelita są w kierunku wolnym od trakcji, bez nadmiernego nacisku na naczynia krezkowe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pełna ekspozycja IVC i gałęzi, w tym zbieg lewej żyły nerkowej z IVC (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B).
	<ol>
		<li>Upuść 200-300 μl soli fizjologicznej. Zapoznaj się z kursem moczowodów, IVC, aorty i żył nerkowych (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Płaszczyzna beznaczynkowa w punkcie zbiegu IVC podnerkowego i zbiegu lewej żyły nerkowej.
	<ol>
		<li>Przełóż szew polipropylenowy 6-0 delikatnie przez płaszczyznę beznaczynkową 2x-3x ruchami ogonowymi do głowowych za pomocą atraumatycznych kleszczy z zamkniętą końcówką.</li>
		<li>Upewnij się, że minimalne sączenie jest kontrolowane za pomocą delikatnego nacisku wyposażonego w tamponadę z bawełnianą końcówką. Poszerz przewidzianą płaszczyznę, przechodząc przez szew polipropylenowy 6-0 delikatnymi ruchami ogonowymi do czaszki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kauteryzacja gałęzi gonadalnych i lędźwiowych (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D)
	<ol>
		<li>Mogą być obecne do 4 gałęzi tylnych lub lędźwiowych. Aby uniknąć potencjalnych powikłań niedokrwienia i chromania kręgosłupa, w obecnym protokole należy pozostawić gałęzie lędźwiowe nienaruszone.</li>
		<li>Sprawdź, czy obecne są 2 do 3 bocznych gałęzi, w tym obustronne zaopatrzenie tętnicy rogu macicy i naczynia podbrzuszne. Zapewnienie konsekwentnego zakłócania pierwszych oddziałów obecnych dwustronnie. Kauteryzuj obustronne gałęzie tuż dystalnie do zbiegu lewej żyły nerkowej i IVC (IVC podnerkowego). Upewnij się, że naczynia drenujące żyły rogu macicy nie są naruszone. 
		UWAGA: Kauteryzacja gałęzi bocznych jest wybierana, ponieważ ta metoda zapewnia gładką i nieprzerwaną powierzchnię, zmniejszając ryzyko niekontrolowanego krwawienia. Co więcej, kauteryzacja jest szybsza i bardziej wykonalna niż podwiązanie szwów z szwami 10-0. W związku z tym zwierzęta będą narażone na krótszą i bezpieczniejszą procedurę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dokładnie sprawdź przebieg moczowodów i unaczynienie, aby upewnić się, że nie ma wyciekającego lub niezamierzonego kauteryzacji (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C).</li>
	<li>Podwiązanie IVC z klipsami naczyniowymi w grupie eksperymentalnej
	<ol>
		<li>Dostosuj klipsy naczyniowe o szerokości nylonowego szwu 2-0 za pomocą atraumatycznych kleszczy. Zastosuj niestandardowe klipsy naczyniowe w grupie eksperymentalnej obwodowo wokół IVC podnerkowego.</li>
		<li>Nałóż klipsy naczyniowe na szew. Główny kanał szwu zapewnia wystarczającą płaszczyznę beznaczyniową z dwoma do trzech skrupulatnych ruchów od ogona do czaszki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2E-F).</li>
		<li>Następnie przełóż klipsy naczyniowe przez przygotowaną płaszczyznę. Przygotuj płaszczyznę u zbiegu lewej żyły nerkowej i IVC na tyle szeroko, aby umożliwić bezproblemowe przejście klipsa (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2E).</li>
		<li>Umieść dostosowany klips naczyniowy poziomo, prostopadle do przebiegu IVC, przez przygotowaną płaszczyznę. Umieść klipsy naczyniowe na szwie polipropylenowym 5-0, aby zapewnić odpowiednią pozostałą przestrzeń (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2G).</li>
		<li>Upewnij się, że powyższe kroki są wykonywane delikatnie, aby zapobiec uszkodzeniu naczynia lub krwawieniu w miejscu klipsów naczyniowych. Obserwuj pole operacyjne pod kątem potencjalnego sączenia. Delikatnie dociśnij bawełnianą końcówką do pola operacyjnego w przypadku sączenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podwiązanie IVC ze szwem w grupie kontrolnej
	<ol>
		<li>Podwiązanie szwów szwem polipropylenowym 6-0. Wykonać chirurgiczny szew węzła kwadratowego wokół IVC podnerkowego w przygotowanej płaszczyźnie na jedwabnym szwie 5-0.</li>
		<li>Po zakończeniu szwu delikatnie zdejmij szew jedwabny, aby zapewnić odpowiednią pozostałość miejsca.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonać podskórne wstrzyknięcie 200 μl soli fizjologicznej. 
	UWAGA: Aby zapewnić porównywalną technikę częściowej okluzji IVC z zastosowaniem zacisku, klips naczyniowy jest dostosowywany w obecnym badaniu, aby zapewnić przestrzeń między wargami. Klips naczyniowy jest następnie umieszczany w przygotowanej płaszczyźnie jałowej u zbiegu lewej żyły nerkowej i IVC.</li>
	<li>Zamknij laparotomię za pomocą ciągłego trwającego szwu vicryl 4-0.</li>
</ol>
5. Obserwacja po operacji indeksu
<ol>
	<li>Po operacji należy stale monitorować zwierzę przez 1 godzinę lub do momentu przywrócenia równowagi i zdolności prostowania, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej, w izolowanej czystej klatce, aż do całkowitego wyzdrowienia.</li>
	<li>Monitoruj zwierzę codziennie przez 2 dni. Jeśli zwierzę wygląda na przygnębione, monitoruj je dwa razy dziennie przez 2 dni. Podawaj pooperacyjne środki przeciwbólowe i płyny zgodnie z protokołem.
	<ol>
		<li>Rozpuścić zapas buprenorfiny o stężeniu 0,3 mg/ml w 0,9% chlorku sodu (NaCl) do uzyskania stężenia 0,03 mg/ml.</li>
		<li>Wstrzykiwać dawkę 0,05-0,1 mg/kg 0,03 mg/ml buprenorfiny podskórnie wraz z 500 μl sterylnego 0,9% NaCl, co 8 do 12 godzin przez pierwsze 48 godzin po operacji wskaźnikowej. W przypadku myszy o masie 20 g wymagane jest 2 μg lub 66 μl 0,03 mg/ml buprenorfiny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Eutanazja i pobieranie IVC zawierającego skrzep
<ol>
	<li>Znieczul mysz w komorze izofluranowej, przytrzymaj zwierzę od nasady ogona i trzymaj zwierzę na grzbietowej powierzchni dłoni.</li>
	<li>Przenieść zwierzę do komory indukcyjnej do ciągłego znieczulania wypełnionej 3%-4% izofluranem. Ułóż zwierzę w pozycji leżącej.</li>
	<li>Wykonaj długą laparotomię w linii środkowej, zaczynając od mieczykowatej części ciała do pęcherza moczowego, jak opisano.</li>
	<li>Zewnętrznie przesunąć jelito na prawą stronę brzucha i pobrać zaciśnięty IVC dystalnie do rozwidlenia biodrowego do stopnia IVC podnerkowego (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2G).</li>
	<li>Po pobraniu skrzepu i guza należy poddać zwierzę eutanazji ze zwichnięciem szyjki macicy.</li>
</ol>
7. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Analizę statystyczną należy przedstawić jako średnią, medianę i odchylenie standardowe (SD) lub błąd standardowy średniej (SEM), 25. lub 75. percentyla lub cały zakres wartości, w tym wartości minimalne i maksymalne, w zależności od przypadku. Wykonaj test t-Studenta i test F, jeśli to konieczne. Oceń istotność statystyczną na poziomie p <0,05.</li>
</ol>

Optimized Venous Thrombosis Assay in a Mouse Cancer Model Using Vascular Clips

<ol><li>Blom, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+venous+thrombosis+in+a+large+cohort+of+66%2C329+cancer+patients%3A+results+of+a+record+linkage+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Incidence of venous thrombosis in a large cohort of 66,329 cancer patients: results of a record linkage study.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 4 (3), 529-535 (2006).</li>
<li>Gabre, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+protein+C+accelerates+venous+thrombus+resolution+through+heme+oxygenase-1+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Activated protein C accelerates venous thrombus resolution through heme oxygenase-1 induction.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (1), 93-102 (2014).</li>
<li>Chang, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorafenib+%28BAY+43-9006%29+inhibits+tumor+growth+and+vascularization+and+induces+tumor+apoptosis+and+hypoxia+in+RCC+xenograft+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemotherapy+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Sorafenib (BAY 43-9006) inhibits tumor growth and vascularization and induces tumor apoptosis and hypoxia in RCC xenograft models.</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 59 (5), 561-574 (2007).</li>
<li>Khorana, A. A., Kuderer, N. M., Culakova, E., Lyman, G. H., Francis, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+predictive+model+for+chemotherapy-associated+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a predictive model for chemotherapy-associated thrombosis.</a> Blood. 111 (10), 4902-4907 (2008).</li>
<li>Chew, H. K., Wun, T., Harvey, D., Zhou, H., White, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+venous+thromboembolism+and+its+effect+on+survival+among+patients+with+common+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Incidence of venous thromboembolism and its effect on survival among patients with common cancers.</a> Archives of Internal Medicine. 166 (4), 458-464 (2006).</li>
<li>Leiva, O., Newcomb, R., Connors, J. M., Al-Samkari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+and+thrombosis%3A+new+insights+to+an+old+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+de+Medecine+Vasculaire%22%5BJournal%5D)">Cancer and thrombosis: new insights to an old problem.</a> Journal de Medecine Vasculaire. 45 (6S), 6S8-6S16 (2020).</li>
<li>Chen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bevacizumab+promotes+venous+thromboembolism+through+the+induction+of+PAI-1+in+a+mouse+xenograft+model+of+human+lung+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Bevacizumab promotes venous thromboembolism through the induction of PAI-1 in a mouse xenograft model of human lung carcinoma.</a> Molecular Cancer. 14, 140(2015).</li>
<li>Goto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+a+new+vascular+targeting+agent%2C+ZD6126%2C+in+pulmonary+metastases+by+human+lung+adenocarcinoma+in+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Activity of a new vascular targeting agent, ZD6126, in pulmonary metastases by human lung adenocarcinoma in nude mice.</a> Cancer Research. 62 (13), 3711-3715 (2002).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+anchorage-independent+growth+and+lung+metastasis+of+A549+lung+carcinoma+cells+by+IkappaBbeta%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Inhibition of anchorage-independent growth and lung metastasis of A549 lung carcinoma cells by IkappaBbeta.</a> Oncogene. 20 (18), 2254-2263 (2001).</li>
<li>Salup, R. R., Wiltrout, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjuvant+immunotherapy+of+established+murine+renal+cancer+by+interleukin+2-stimulated+cytotoxic+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Adjuvant immunotherapy of established murine renal cancer by interleukin 2-stimulated cytotoxic lymphocytes.</a> Cancer Research. 46 (7), 3358-3363 (1986).</li>
<li>Deatrick, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+matrix+metalloproteinase+2+and+matrix+metalloproteinase+2%2F9+deletion+in+experimental+post-thrombotic+vein+wall+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">The effect of matrix metalloproteinase 2 and matrix metalloproteinase 2/9 deletion in experimental post-thrombotic vein wall remodeling.</a> Journal of Vascular Surgery. 58 (5), 1375.e2-1384.e2 (2013).</li>
<li>Diaz, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+a+mouse+model+of+venous+thrombosis%3A+a+consensus+assessment+of+utility+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Choosing a mouse model of venous thrombosis: a consensus assessment of utility and application.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (4), 699-707 (2019).</li>
<li>Henke, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+9+signaling+is+critical+for+early+experimental+deep+vein+thrombosis+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 9 signaling is critical for early experimental deep vein thrombosis resolution.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (1), 43-49 (2011).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferior+vena+cava+stenosis-induced+deep+vein+thrombosis+is+influenced+by+multiple+factors+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Inferior vena cava stenosis-induced deep vein thrombosis is influenced by multiple factors in rats.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 128, 110270(2020).</li>
<li>von Brühl, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes%2C+neutrophils%2C+and+platelets+cooperate+to+initiate+and+propagate+venous+thrombosis+in+mice+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (4), 819-835 (2012).</li>
<li>Brill, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((von+Willebrand+factor-mediated+platelet+adhesion+is+critical+for+deep+vein+thrombosis+in+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">von Willebrand factor-mediated platelet adhesion is critical for deep vein thrombosis in mouse models.</a> Blood. 117 (4), 1400-1407 (2011).</li>
<li>Stark, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Pathogenesis+of+Pancreatic+Cancer+Microvesicle-Associated+Venous+Thrombosis+Identifies+New+Antithrombotic+Targets+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct Pathogenesis of Pancreatic Cancer Microvesicle-Associated Venous Thrombosis Identifies New Antithrombotic Targets In Vivo.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 772-786 (2018).</li>
<li>Belghasem, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolites+in+a+mouse+cancer+model+enhance+venous+thrombogenicity+through+the+aryl+hydrocarbon+receptor-tissue+factor+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Metabolites in a mouse cancer model enhance venous thrombogenicity through the aryl hydrocarbon receptor-tissue factor axis.</a> Blood. 134 (26), 2399-2413 (2019).</li>
<li>Tracz, A., Mastri, M., Lee, C. R., Pili, R., Ebos, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+spontaneous+metastatic+renal+cell+carcinoma+%28mRCC%29+in+mice+following+nephrectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Modeling spontaneous metastatic renal cell carcinoma (mRCC) in mice following nephrectomy.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e51485(2014).</li>
<li>Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+functions+of+platelet%2Fendothelial+cell+adhesion+molecule-1+%28CD31%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31).</a> Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).</li>
<li>Payne, H., Brill, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stenosis+of+the+Inferior+Vena+Cava%3A+A+Murine+Model+of+Deep+Vein+Thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Stenosis of the Inferior Vena Cava: A Murine Model of Deep Vein Thrombosis.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56697(2017).</li>
<li>Yabit, F., Hughes, L., Sylvester, B., Tiesenga, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypersensitivity+Reaction+Post+Laparoscopic+Cholecystectomy+Due+to+Retained+Titanium+Clips%5BTitle%5D)+AND+%22Cureus%22%5BJournal%5D)">Hypersensitivity Reaction Post Laparoscopic Cholecystectomy Due to Retained Titanium Clips.</a> Cureus. 14 (6), e26167(2022).</li>
<li>Nagorni, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-laparoscopic+cholecystectomy+Mirizzi+syndrome+induced+by+polymeric+surgical+clips%3A+a+case+report+and+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Case+Reports%22%5BJournal%5D)">Post-laparoscopic cholecystectomy Mirizzi syndrome induced by polymeric surgical clips: a case report and review of the literature.</a> Journal of Medical Case Reports. 10, 135(2016).</li>
<li>Zemelka-Wiacek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+Allergy%3A+State-of-the-Art+Mechanisms%2C+Biomarkers%2C+Hypersensitivity+to+Implants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Metal Allergy: State-of-the-Art Mechanisms, Biomarkers, Hypersensitivity to Implants.</a> Journal of Clinical Medicine. 11 (23), 6971(2022).</li>
<li>Poyyamoli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((May-Thurner+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Diagnosis+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">May-Thurner syndrome.</a> Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 11 (5), 1104-1111 (2021).</li>
<li>Streiff, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NCCN+Guidelines+Insights%3A+Cancer-Associated+Venous+Thromboembolic+Disease%2C+Version+2.2018%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Comprehensive+Cancer+Network%22%5BJournal%5D)">NCCN Guidelines Insights: Cancer-Associated Venous Thromboembolic Disease, Version 2.2018.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 16 (11), 1289-1303 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W syngenicznym modelu ksenoprzeszczepu raka jelita grubego obserwujemy wyższą trombogenność i ekspresję markerów krzepnięcia w grupie eksperymentalnej w porównaniu z grupą kontrolną. Co ważne, wariancja wszystkich tych parametrów była niższa w grupie eksperymentalnej w porównaniu z grupą kontrolną. Modyfikacja polegała na wprowadzeniu klipsa naczyniowego o określonym profilu ucisku w miejscu zbiegu IVC i lewej żyły nerkowej. Klips został umieszczony na przekładce, którą był szew polipropylenowy 5-0. Modyfikacja ta zmniejsza zmienność wielkości skrzepu i markerów zakrzepicy. Wszystkie myszy doświadczyły 100% przeżycia.
Niuanse techniczne Procedura obejmowała zwrócenie szczególnej uwagi na kilka etapów. Po laparotomii oba moczowody zostały dokładnie zbadane, aby zapobiec przypadkowym urazom. Aby osiągnąć optymalną ekspozycję, jelita przykryto wilgotną gazą i utrzymywano w prawym górnym kwadrancie bez nadmiernej przyczepności. Następnie boczne gałęzie IVC zostały kauteryzowane w odległości 2 do 3 mm od moczowodów, IVC i aorty, aby zapobiec uszkodzeniu żył. Po zapewnieniu pełnej hemostazy przygotowano płaszczyznę do podwiązania IVC. Ważne jest, aby pamiętać, że aorta i IVC u myszy są ściśle połączone wzdłuż swojego przebiegu, a próba ich wypreparowania może prowadzić do krwawienia i utraty zwierzęcia. Jedynym wyjątkiem jest punkt zbiegu lewej żyły nerkowej i aorty21. Następnie przygotowano przejście szwu, wykonując nie więcej niż trzy skrupulatne, ostre, rozbieżne ruchy kleszczami.
Podaje się, że średnica IVC myszy w wieku od 8 do 12 tygodni mieści się w zakresie od około 0,3 do 0,5 mm. Procedura częściowego podwiązania IVC powinna zapewnić przestrzeń do odróżnienia od całkowitego podwiązania. W obecnym badaniu rozważaliśmy kaliber szwów 5-0, odpowiadający od 0,10 do 0,15 mm dla przekładki. W związku z tym przestrzeń wargową klipsów naczyniowych została dostosowana do szwu 2-0, aby zapewnić odpowiednią przestrzeń dla IVC 0,3 mm i przestrzeni 0,1 mm.
Szew polipropylenowy stanowił bezkrwawą prowadnicę, pozwalającą na poszerzenie płaszczyzny z powtarzającym się ruchem ogonowym do czaszki o dodatkowe 1 do 2 mm, aby dostosować się do zastosowania klipsów naczyniowych. Na koniec umieszczono niestandardowe klipsy naczyniowe z pozostałą przestrzenią wargową kompatybilną ze szwem polipropylenowym 5-0.
Wybór klipsów z metalu szlachetnego, takich jak platyna, do zamykania naczyń krwionośnych wynika z faktu, że taki materiał jest stosunkowo obojętny i zmniejsza stan zapalny wywołany materiałem w porównaniu ze specyficznymi szwami wchłanialnymi i wchłanialnymi 22,23,24. Te metalowe klipsy są odporne na reakcje chemiczne, dzięki czemu są stabilne. Prowadzi to do bezpieczniejszej i skuteczniejszej alternatywy o niższym ryzyku wystąpienia stanu zapalnego w porównaniu z użyciem materiałów do szycia.
Znaczenie translacyjne modelu Modele zakrzepicy żył mysich zasadniczo różnią się od zakrzepicy żył głębokich u ludzi. Po pierwsze, w modelach gryzoni tworzenie się skrzepów obserwuje się w kierunku górnym. Jednak kliniczne VT powstają poniżej nidus25,26. Po drugie, związki przyczynowo-skutkowe są różne między modelami ludzkimi i mysimi. U ludzi tworzenie się skrzepów jest zdarzeniem wskaźnikowym, po którym następuje niedrożność przepływu krwi. Jednym z wyjątków jest zespół Maya-Thurnera. Zespół Maya-Thurnera odnosi się do stanu chorobowego, w którym zwiększone ciśnienie zewnętrzne na lewą żyłę biodrową, znajdującą się między kręgosłupem a prawą tętnicą biodrową, zwiększa ryzyko zakrzepicy lewej żyły biodrowej lub zakrzepu krwi w lewej żyle biodrowej. W modelach mysich przeszkodą w przepływie żylnym jest pierwotne zdarzenie, które powoduje powolny przepływ krwi i tworzenie się skrzepliny25.
W porównaniu z innymi modelami, takimi jak uraz elektrolityczny żyły udowejmodel 12, zastój IVC daje wyraźną przewagę. Umożliwia badanie miejscowych środków terapeutycznych, takich jak filtry IVC, tromboliza kierowana przez cewnik i rekanalizacja endoluminalna z zapewnieniem środowiska do tworzenia się skrzepów w obecności przepływu krwi. W ten sposób w tym modelu badane są dwa ramiona uszkodzenia śródbłonka i zastoju. Zakrzepy w IVC są również związane z częstszym występowaniem powikłań, takich jak zatorowość płucna. Jednym z ograniczeń jest to, że IVC jest mniej powszechnym miejscem zakrzepicy żył głębokich u ludzi.
Ramy redukcja-udoskonalenie-wymiana (3R) Ważne jest, aby zintegrować ramy 3R z modelami zwierzęcymi. Integracja ram 3R ogranicza cierpienie zwierząt i promuje etyczne i odpowiedzialne praktyki badawcze na zwierzętach. 3R odnosi się do naszego obecnego odkrycia, ponieważ nie zaobserwowaliśmy śmiertelności u myszy. Możliwe jest również wykorzystanie mniejszej liczby zwierząt w badaniach. W ten sposób można zmniejszyć liczbę myszy i koszt.
Ograniczenia badania Możliwym ograniczeniem metody klipsowej jest stosunkowo wąski zakres profilu nacisku badanych klipsów naczyniowych. W związku z tym mogą zostać zaprojektowane dalsze badania z szerokim zakresem profili ciśnienia. Wcześniejsze badania wykazały, że myszy ze szczepem o obniżonej odporności są bardziej podatne na tworzenie się skrzepów, a masa skrzepów może się różnić u myszy immunokompetentnych12. Zachęca się do przyszłych badań w celu zbadania stopnia spójności masy skrzepów w różnych tłach szczepów myszy.
Konkluzja Obecna metoda zapewnia bardziej spójną miarę badania zakrzepicy żylnej za pomocą częściowego modelu podwiązania IVC. Mamy nadzieję, że ta modyfikacja pozwoli na wygenerowanie solidnych i wiarygodnych modeli mysich do badania konsekwencji zakrzepicy związanej z rakiem przy użyciu różnych modeli nowotworów mających znaczenie dla chorób u ludzi.
Podczas gdy obecne prace koncentrowały się w szczególności na zakrzepicy związanej z rakiem, przyszłe prace będą obejmowały przeprowadzenie kompleksowej analizy mysich modeli różnych chorób współistniejących (takich jak otyłość, przewlekła niewydolność nerek) i normalnych myszy zwiększających ryzyko zakrzepicy.

Żylna choroba zakrzepowo-zatorowa (ŻChZZ) związana z rakiem<br />
Ryzyko żylnej choroby zakrzepowo-zatorowej (ŻChZZ) jest od 4 do 7 razy wyższe u osób, które przeżyły raka w porównaniu z populacją ogólną1,2,3. Ten stan okazuje się śmiertelny u jednego na siedmiu pacjentów z rakiem. Częstość występowania ŻChZZ różni się w zależności od rodzaju nowotworu i obciążenia guzem i jest najwyższa wśród pacjentów z rakiem trzustki i żołądka4.
Choroba zakrzepowo-zakrzepowa związana z rakiem u pacjentów z rakiem ma znaczenie prognostyczne . Wiąże się to z niekorzystnym całkowitym przeżyciem w pierwszym roku po rozpoznaniu raka, nawet po uwzględnieniu wieku, rasy i stadium podstawowego raka5. Odkrycia te podkreślają znaczenie badania choroby zakrzepowo-zatorowej związanej z rakiem oraz potrzebę zbadania jej mechanizmu przy użyciu modelu zwierzęcego. Translacyjne znaczenie tego obszaru jest dodatkowo podkreślone przez fakt, że ŻChZZ u pacjentów z rakiem można zapobiec i leczyć za pomocą profilaktyki zakrzepowej i terapii przeciwzakrzepowej6.
Zwierzęce modele raka i zakrzepicy żylnej 
Modele raka są konwencjonalnie nazywane ksenoprzeszczepami, które polegają na wstrzyknięciu komórek rakowych myszom. Wstrzyknięcie komórek rakowych w miejscu takim jak jego pochodzenie jest określane jako model ortotopowy, podczas gdy w innym miejscu (płaszczyzna podskórna nad bokiem) jest znane jako model heterotopowy. Gatunek pochodzenia komórek nowotworowych determinuje je jako model allogeniczny, taki jak linia komórkowa HT-29 (ludzki rak jelita grubego)7,8,9. Wręcz przeciwnie, modele syngeniczne wykorzystują mysie linie komórkowe raka, w tym linie komórkowe RenCa i MC-383,10.
Literatura opisuje modele zakrzepicy tętniczej, żylnej i kapilarnej u gryzoni. Zakrzepica żylna jest wywoływana w żyle głównej dolnej (IVC) przez uraz mechaniczny (drut prowadnikowy) lub całkowite podwiązanie IVC, chemiczne (chlorek żelaza) lub uraz elektrolityczny. Zakrzepica indukowana chlorkiem żelaza lub ligacja IVC reprezentuje kompletne modele okluzji. To ostatnie powoduje zastój krwi i nacieki zapalne w żyłach11,12,13. Kompletny model ligacji powoduje wysoki wskaźnik powstawania zakrzepicy u 95% do 100% myszy. Model częściowej ligacji IVC może obejmować przerwanie bocznych gałęzi biodrowo-lędźwiowych, a powrót żylny jest zniesiony przez zastosowanie podwiązania szwów w dystalnych punktach docelowych IVC12. Czasami do częściowego przerwania powrotu żylnego stosuje się uchwyt na przestrzeń. Jednak masa skrzepliny jest niespójna w obecnym modelu częściowej okluzji, co skutkuje dużą zmiennością masy i wysokości skrzepów12,14.
Oba te modele mechaniczne dużych żył (częściowy i kompletny) mają ograniczenia. Po pierwsze, podwiązanie IVC (model zastoju) często powoduje niedociśnienie. Krew jest przetaczana przez żyły kręgowe. Chociaż w doświadczonych rękach, śmiertelność w tym modelu waha się od 5% do 30%, przy czym oczekuje się, że wskaźnik ten będzie wyższy podczas krzywej uczenia się. Co ważne, kompletny model okluzji nie odtwarza zakrzepicy żył głębokich (DVT) u ludzi, gdzie skrzeplina zwykle jest nieoklepna. Całkowita okluzja prawdopodobnie zmieni czynniki hemoreologiczne i parametry farmakodynamiczne, zmieniając biodostępność związków w miejscu lokalnym. Ze względu na te ograniczenia, kompletne modele okluzji mogą nie być optymalne do testowania nowych związków chemicznych do celów terapeutycznych i odkrywania leków12.
Należy zauważyć, że aby zapewnić bardziej klinicznie istotny mysi model zakrzepicy żylnej ze zmniejszonym przepływem z uszkodzeniem śródbłonka, wprowadzono model zakrzepicy żylnej, gdzie DVT jest wywoływane przez ograniczenie przepływu krwi przy braku zaburzenia śródbłonka. Model został zweryfikowany za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej15. Preferowanym klinicznie istotnym modelem zakrzepicy jest model z prawie całkowitą zakrzepicą, który umożliwia odkrywanie leków. Tworzenie skrzepów w obecnych modelach częściowej okluzji jest niespójne, co skutkuje dużą zmiennością masy i wysokości skrzepu12,16. Co więcej, masa skrzepu jest zmienna w przypadku konwencjonalnych metod, co wymaga większej liczby myszy na badanie12.
Poprzednie modele zakrzepicy związanej z rakiem koncentrowały się na raku okrężnicy, trzustki i płuc i wszystkie były kompletnymi modelami okluzji17,18,19. Ten manuskrypt modyfikuje model częściowej zakrzepicy okluzji, aby zapewnić skrzepy o mniejszej zmienności i śmiertelności myszy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)". W poprzednich badaniach wykorzystano allogeniczne linie komórkowe raka na myszach z obniżoną odpornością atymicznych background19,20,21. W tym manuskrypcie wykorzystano ksenoprzeszczep syngeniczny komórek MC-38 u myszy C57Bl6 / J, co pozwala na wykorzystanie myszy immunokompetentnych i badanie składników odpornościowych trombogenezy.

<table><tbody><tr><td>Buprenorfina 0,3 mg/ml</td><td>PAR Farmaceutyczny</td><td>&nbsp; NDC 42023-179-05</td><td></td></tr><tr><td>Myszy C57BL/6J</td><td>Laboratorium Jacksona IMSR_JAX</td><td>:000664</td><td></td></tr><tr><td>Caliper</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>12777-830</td><td></td></tr><tr><td>CD31</td><td>Abcam</td><td>Ab9498</td><td></td></tr><tr><td>Licznik komórek</td><td>MOXIE</td><td>MXZ000</td><td></td></tr><tr><td>Clamp</td><td>&nbsp; Narzędzia naukowe</td><td>&nbsp; &nbsp; 13002-10</td><td></td></tr><tr><td>Klipsy ASSI. Pojedynczy zacisk B2V, ogólnego przeznaczenia,</td> <td>dokładny chirurgiczny i Instrumenty naukowe</td><td>PR 2 144.50 289.00</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5SF</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>precyzyjnej 11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Fibryna</td><td>Millipore</td><td>MABS2155-100UG</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki - duże pętle</td><td>Narzędzia do nauki o naprawie</td><td>14040-10</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>&nbsp; Fine Science Tools</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>Hill Hemostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>13111-12</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane, USP</td><td>&nbsp; Covetrus</td><td>NDC 11695-6777-2</td><td></td></tr><tr><td>MC-38 komórka</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SCC172</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>odwrócony Nikon Eclipse</td> Nożyczki <td>TE2000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>&nbsp; Fine Science Tools</td><td>&nbsp; 14079-10</td><td></td></tr><tr><td>Szew- Vicryl</td><td>AD-Chirurgiczny</td><td>#L-G330R24</td><td></td></tr><tr><td>Szew-Nylon 2-0</td><td>Ethilon</td><td>664H</td><td></td></tr><tr><td>Szew-Prolene 5-0</td><td>Ethicon</td><td>8661G</td><td></td></tr><tr><td>Szew-Prolene 6-0</td><td>Ethicon</td><td>PDP127</td><td></td></tr><tr><td>VEV03100</td><td>VisualSonics</td><td>FujiFilm</td><td></td></tr><tr><td>Vitrogel Matrigel Matrix</td><td>The Well Bioscience</td><td>VHM01&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

test zakrzepicy żylnej w mysim modelu raka

Venous Thrombosis Assay in a Mouse Model of Cancer

Ten artykuł metodologiczny podkreśla niuanse chirurgiczne modelu zakrzepicy żylnej u gryzoni, szczególnie w kontekście zakrzepicy związanej z rakiem (CAT). Zakrzepica żył głębokich jest częstym powikłaniem u osób, które przeżyły raka i może być potencjalnie śmiertelna. Obecne modele zakrzepicy żył mysich zazwyczaj obejmują całkowite lub częściowe mechaniczne zamknięcie żyły głównej dolnej (IVC) za pomocą szwu. Procedura ta indukuje całkowity lub częściowy zastój krwi i uszkodzenie śródbłonka, wywołując trombogenezę. Obecne modele mają ograniczenia, takie jak większa zmienność masy skrzepów, znaczna śmiertelność i wydłużona krzywa uczenia się. W niniejszym raporcie przedstawiono udoskonalenia chirurgiczne za pomocą klipsów naczyniowych, aby wyeliminować niektóre z tych ograniczeń. Korzystając z mysiego modelu ksenoprzeszczepu syngenicznego raka jelita grubego, zastosowaliśmy niestandardowe klipsy naczyniowe do podwiązania żyły głównej podnerkowej. Klipsy te zapewniają pozostałą przestrzeń wargową podobną do szwu polipropylenowego 5-0 po podwiązaniach IVC. Myszy z metodą szwów służyły jako kontrole. Metoda klipsa naczyniowego skutkowała spójną, powtarzalną częściową niedrożnością naczyń i większą masą skrzepów przy mniejszej zmienności niż metoda szwowa. Spodziewano się większej masy skrzepu, większej masy skrzepu i skrzepu w obszarze światła IVC ze względu na wyższy profil ciśnienia klipsów naczyniowych w porównaniu ze szwem polipropylenowym 6-0. Podejście to zostało zweryfikowane za pomocą ultrasonografii w skali szarości, która wykazała konsekwentnie większą masę skrzepu w żyle głównej podnerkowej z klipsami naczyniowymi w porównaniu z metodą szwów. Obserwacje te zostały dodatkowo potwierdzone barwieniem immunofluorescencyjnym. Badanie to oferuje ulepszoną metodę generowania modelu zakrzepicy żylnej u myszy, który można wykorzystać do pogłębienia mechanistycznego zrozumienia CAT oraz w badaniach translacyjnych, takich jak odkrywanie leków.

Grupa samic myszy C57Bl6/J w wieku 8–12 tygodni otrzymała wstrzyknięcie komórek MC-38 w logarytmicznej fazie wzrostu. Ksenoprzeszczepy rosły szybko między trzecim a czwartym tygodniem po wstrzyknięciu18. Gdy guzy osiągnęły średnią objętość 400 mm3, myszy rozprzydelono losowo do grupy kontrolnej i eksperymentalnej. W grupie kontrolnej wykonano podwiązanie IVC za pomocą szwu, natomiast myszy w grupie eksperymentalnej poddano podwiązaniu IVC poprzez zastosowanie klipsa naczyniowego. Objętości guzów w grupie kontrolnej i eksperymentalnej były porównywalne i nie wykazywały istotnych różnic (353 ± 100 mm3 vs. 367 ± 46,2 mm3, p = 0,445). Po 48 h pobrano odcinki IVC od miejsca bifurkacji żył biodrowych do obszaru podnerkowego zawierającego skrzep, a masa skrzepu posłużyła jako biologiczny odczyt trombogenności żylnej. Przebieg pooperacyjny u wszystkich zwierząt w grupach kontrolnej i eksperymentalnej był niepowikłowany, bez oznak przebarwienia rogów macicy, niedokrwienia mięśniowo-szkieletowego czy problemów z chromaniem kończyn dolnych. Podczas drugiej laparotomii nie zaobserwowano przemieszczenia klipsów naczyniowych. Przed zakończeniem eksperymentów nie odnotowano żadnych zgonów.
Stosunek masy skrzepu do znormalizowanej masy ciała 
Ponieważ myszy z ksenoprzeszczepami wykazują tendencję do utraty masy ciała, masy skrzepów (w mg) znormalizowano do całkowitej masy ciała w momencie pobrania (obie wartości w mg). W grupie doświadczalnej zaobserwowano niemal 1,5-krotny wzrost znormalizowanego stosunku masy skrzepu do masy ciała (średnia ± SEM, 0,002580 ± 0,00098) w porównaniu z myszami kontrolnymi (0,001453 ± 0,002666, wartość P: 0,0019; Rysunek 3).
Analiza immunofluorescencyjna 
Do oceny histopatologicznej wykorzystano żyłę główną dolną (IVC) oraz skrzepliny. Przekroje z IVC poniżej poziomu nerek, zatopione w parafinie, barwiono przeciwciałami anty-CD31 (markerem komórek śródbłonka)20 oraz anty-fibryną, a także barwnikiem DAPI (Rysunek 4A).
Żyła główna dolna poniżej nerek u myszy kontrolnych wykazywała nieprzerwane barwienie CD31 oraz obecność fibryny częściowo wypełniającej światło naczynia. W grupie doświadczalnej ekspresja CD31 nie była nieprzerwana, co sugerowało uszkodzenie komórek śródbłonkowych, oraz stwierdzono obecność dużego skrzepu z wyraźną ekspresją fibryny. W ścianie naczynia również zaobserwowano barwienie na fibrynę (Rycina 4A).
Do immunofluorescencji wykorzystano mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko fibrynie w rozcieńczeniu 1:1000, inkubując je przez noc w temperaturze 4 °C. W przypadku CD31 zastosowano królicze poliklonalne przeciwciało anty-CD31, zwalidowane do immunoblottingu i IF (rozcieńczenia 1:1000 i 1:100, inkubacja przez noc w 4 °C). Przeciwciało to wykazuje reaktywność wobec CD31 mysiego, ludzkiego i świńskiego. W badaniu IF jako przeciwciała wtórne zastosowano Alexa Fluor 488, 594 i 647 w rozcieńczeniu 1:250 przez 45 min w temperaturze pokojowej.
W celu kwantyfikacji obrazów całe szkiełko zostało zeskanowane za pomocą zmotoryzowanego systemu przesuwu. Obrazy przetworzono w programie ImageJ, w którym sygnał przekształcono w skalę szarości, a liczbę i intensywność pikseli przeanalizowano jako gęstość zintegrowaną. Obszar żyły wyznaczono jako obszar zainteresowania (ROI). Gęstość zintegrowana wszystkich obrazów została znormalizowana do ich powierzchni18.
Wykazano, że ich ekspresja jest zwiększona w modelach zakrzepicy głębokich żył powiązanej z nowotworami. Ilościowa analiza kilku obrazów została przeprowadzona z wykorzystaniem analizy zintegrowanej gęstości, zgodnie z wcześniejszą procedurą z zastosowaniem oprogramowania Image J18. W grupie kontrolnej stwierdzono istotnie niższą ekspresję fibryny w porównaniu z grupą eksperymentalną (p:0,0080; Rysunek 4B; 174 ± 104 vs. 503,5 ± 182,4 średnia ± SD). Co istotne, wariancje w ekspresji fibryny były niższe w grupie eksperymentalnej w porównaniu z grupą kontrolną (statystyka F, DFn, Dfd: 3,074, 4, 4).
Ultrasonografia w skali szarości 
Po 2 dniach od operacji i bezpośrednio przed pobraniem skrzepu, myszy poddano ultrasonografii w skali szarości. W obu grupach myszy stwierdzono obecność skrzepów w podnerkowej żyle głównej. Skrzepy były jednak większe u myszy z zastosowaniem klipsa naczyniowego. Reprezentatywne obrazy ultrasonograficzne przedstawiono na Rysunku 5. Obszar naczynia bezechowy sugeruje drożność światła, natomiast zagęszczenie hiperechogeniczne w naczyniu wskazuje na zorganizowany skrzep. Podnerkowa żyła główna myszy z grupy kontrolnej wykazuje częściowy skrzep wyznaczony przez dwie żółte groty strzałek na Rysunku 5A. W przeciwieństwie do tego, Rysunek 5B przedstawia duży skrzep prawie całkowicie zamykający podnerkową żyłę główną w modelu z użyciem klipsa naczyniowego (wskazany przez dwie żółte groty strzałek i oznaczony białymi gwiazdkami). Warto zauważyć, że w grupie kontrolnej podnerkowa żyła główna była zapadnięta, podczas gdy w grupie eksperymentalnej była poszerzona, co jest zgodne z większym obciążeniem skrzepem w tej drugiej grupie.
Oba testy (ultrasonografia i IF) wskazują, że w grupie badawczej skrzepy były konsekwentnie większe niż w grupie kontrolnej.
<img alt="Schemat anatomiczny, naczynia krwionośne jamy brzusznej człowieka, IVC, aorta, żyły nerkowe; badanie krążenia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65518/65518fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat przedstawiający IVC-aortę oraz zastosowanie klipsa nad złączem lewej żyły nerkowej (LRV)-IVC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65518/65518fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Anatomia chirurgiczna, wiele widoków; sekcja, odsłonięcie organów, badanie fizjologiczne, ustawienie badawcze." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65518/65518fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Śródoperacyjny model zakrzepicy IVC z zastosowaniem klamer. (A) Laparotomia pośrodkowa. (B) Pełne odsłonięcie IVC, w tym miejsca ujścia lewej żyły nerkowej do IVC. (C) Przedstawienie przebiegu moczowodu i unikanie wszelkich jatrogennych urazów lewego moczowodu. (D) Koagulacja gałęzi gonadnych. (E) Disekcja IVC do punktu ujścia lewej żyły nerkowej. (F) Przeciąganie szwu polipropylenowego 5-0 przez rozdzieloną płaszczyznę w celu jej poszerzenia dla ułatwienia wprowadzenia nici. (G) Wprowadzenie zacisku naczyniowego przez przygotowaną płaszczyznę. (H) Tworzenie się skrzepu 48 h po zaklemowaniu IVC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65518/65518fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres słupkowy masy skrzepu/masy ciała; grupa kontrolna vs. doświadczalna; istotna różnica." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65518/65518fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Grupa myszy z podwiązaniem IVC za pomocą klipsów naczyniowych wykazywała wyższy znormalizowany stosunek masy skrzepu do masy ciała. Średni znormalizowany stosunek masy skrzepu do masy ciała. Obie wartości wyrażone w miligramach. Słupki błędów = SD. Zastosowano test t Studenta. P &lt;0.0001 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65518/65518fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Immunofluorescencja CD31 i fibryny w grupie kontrolnej i eksperymentalnej; wykres słupkowy przedstawia gęstość fibryny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65518/65518fig04v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Zwiększona ekspresja fibryny i CD31 w grupie myszy z ligacją IVC za pomocą klipsów naczyniowych. Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne uzyskane przy powiększeniu 100x z grupy kontrolnej z ligacją IVC szwem oraz z grupy eksperymentalnej z ligacją IVC klipsami naczyniowymi. Przedstawiono losowo wybrane obrazy dla każdej myszy (N= 4 myszy/grupa). (A) Ekspresja fibryny i CD31 w grupach kontrolnej i eksperymentalnej. Dwa żółte groty strzałek oznaczone białymi gwiazdkami wskazują duży skrzep niemal całkowicie zamykający IVC, co wskazuje na częściowe zamknięcie IVC. (B) Zintegrowana gęstość fibryny: Linia reprezentuje wartość mediany. Przeprowadzono test t Studenta. p-value = 0,0080. Barwienie IF reprezentatywnych obrazów podnerkowej żyły głównej, w tym skrzepek w grupach kontrolnej i eksperymentalnej, barwionych przeciwciałami anty-CD31 oraz wtórnymi przeciwciałami Alexa Fluor. Przedstawiono powiększenie 400x. Paski skali = 100 µm. Słupki błędów odnoszą się do SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65518/65518fig04largev2.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Porównanie ultradźwiękowe, grupa kontrolna vs. eksperymentalna; gęstość tkanki; analiza obrazu w badaniach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65518/65518fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Zwiększona powierzchnia skrzepu w częściowo zaklempowanej IVC w grupie myszy z ligacją IVC za pomocą klipsów naczyniowych. Reprezentatywne obrazy sonograficzne w skali szarości grupy kontrolnej i eksperymentalnej. (A) Reprezentatywny obraz Dopplera w skali szarości grupy kontrolnej: region IVC wykazuje obszar bezechowy sugerujący drożne światło naczynia, a druga część wykazuje obszar hiperechowy wskazujący na skrzep. (B) Reprezentatywny obraz Dopplera w skali szarości grupy eksperymentalnej: zorganizowany skrzep (biała gwiazdka) w obrębie IVC, wskazany żółtymi grotami strzałek, był bardziej wyraźny w grupie eksperymentalnej. Co więcej, skrzep występował w dwóch różnych formach w przekroju strzałkowym. Po drugiej stronie IVC zarysowano również skrzep zamykający znaczną część przekroju poprzecznego światła naczynia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65518/65518fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten artykuł ma na celu przedstawienie zoptymalizowanej metody oceny zakrzepicy żylnej w modelu raka myszy, przy użyciu klipsów naczyniowych do uzyskania podwiązania żylnego. Optymalizacja minimalizuje zmienność pomiarów związanych z zakrzepicą i zwiększa znaczenie dla zakrzepicy żylnej związanej z rakiem u ludzi.

Test zakrzepicy żylnej w mysim modelu raka

This methodology paper highlights the surgical nuances of a rodent model of venous thrombosis, specifically in the context of cancer-associated thrombosis ...

Badania te mają na celu ulepszenie modelu gryzoni dla zakrzepicy żylnej, koncentrując się na zakrzepicy związanej z rakiem. Wprowadza udoskonaloną technikę chirurgiczną wykorzystującą klipsy naczyniowe w mysim modelu ksenoprzeszczepu syngennego raka jelita grubego w celu poprawy spójności i odtwarzalności. Nasze rozległe zrozumienie mechanistyczne związane z zakrzepicą nowotworową i odkrywanie leków.Chociaż model redukcji przepływu został wprowadzony w modelach zwężenia IVC w 2012 roku, w ciągu ostatnich 10 lat nie poczyniono znaczących postępów w modelach zakrzepicy związanej z rakiem. To było uzasadnienie tego przedsięwzięcia. W dziedzinie badań nad zakrzepicą związaną z rakiem obecne technologie obejmują zaawansowane techniki obrazowania, takie jak skaningowe obrazy mikroskopem elektronowym, narzędzia biologii molekularnej, takie jak barwienie immunofluorescencyjne, precyzyjne narzędzie chirurgiczne, oprogramowanie do analizy danych i interpretacja danych oraz dobrostan zwierząt.Obecne wyzwania eksperymentalne obejmują zmienność odpadów pazurów, wysoką śmiertelność i wydłużoną krzywą uczenia się w modelach zakrzepicy żylnej u gryzoni. Dodatkowo kierunek przepływu żylnego i mechanizmy tworzenia skrzepów różnią się od przypadków klinicznych. Nasz protokół badawczy wypełnia luki w modelach zakrzepicy związanej z rakiem u gryzoni.Wprowadza nowatorską technikę chirurgiczną wykorzystującą klipsy naczyniowe w modelach ksenoprzeszczepów, zapewniając bardziej spójne i powtarzalne wyniki zakrzepicy. Poszerza to naszą wiedzę na temat zakrzepicy związanej z rakiem i odkrywania leków w badaniach translacyjnych. Na początek użyj cienkich nożyczek, aby wykonać nacięcie na skórze brzucha znieczulonej myszy, zaczynając od wyniosłości jarzmowej do pęcherza.Za pomocą pary atraumatycznych kleszczy ściśnięć otrzewną w połowie wzdłuż nacięcia skóry, zapewniając odpowiednią szczelinę między nacięciem a leżącymi nad nim jelitami. Następnie otwórz otrzewną wzdłużnie wzdłuż jałowej linii białej. Następnie użyj mokrych bawełnianych końcówek, aby ostrożnie wyciągnąć jelita.Następnie upuść od 200 do 300 mikrolitrów soli fizjologicznej na jelita i zbadaj drogę żyły głównej dolnej moczowodów lub IVC, aorty i żył nerkowych. Kauteryzuj obustronne gałęzie dystalnie do zbiegu lewej żyły nerkowej i żyły głównej dolnej podnerkowej. Sprawdź moczowody i naczynia krwionośne pod kątem sączenia.Aby zapobiec potencjalnym powikłaniom niedokrwienia kręgosłupa i chromania, należy pozostawić nienaruszone gałęzie lędźwiowe. Sprawdź boczne gałęzie, w tym obustronny róg macicy i naczynia podbrzuszne. Następnie użyj atraumatycznych kleszczy z zamkniętą końcówką, aby delikatnie przeciągnąć szew polipropylenowy z sześcioma zerami przez płaszczyznę jałową, dwa do trzech razy.Delikatnie dociśnij bawełnianą końcówką, aby kontrolować wyciekanie. Na koniec przełóż szew polipropylenowy z pięcioma zerami przez płaszczyznę z delikatnymi ruchami czaszki, aby ją poszerzyć. Umieść zaciski naczyniowe na szwie, aby zagwarantować odpowiednią przestrzeń.Masy skrzepów w grupie eksperymentalnej ksenoprzeszczepu wykazały 1,5-krotny wzrost w porównaniu z myszami kontrolnymi. Testy immunofluorescencyjne wykazały, że IVC z grupy kontrolnej miał nienaruszony CD 31 i fibrynę częściowo zajmującą światło naczynia. Ekspresja CD 31 nie była nienaruszona w grupie eksperymentalnej, a ściana wykazywała barwienie fibryną.Grupa kontrolna miała istotnie niższą ekspresję fibryny w porównaniu z grupą eksperymentalną. Ultradźwiękowa analiza graficzna myszy wykazała, że podwiązana żyła główna podnerkowa myszy z grupy kontrolnej miała częściowy skrzep. Grupa eksperymentalna miała jednak duży skrzep, prawie zamykający żyłę główną podnerkową.

venous-thrombosis-assay-in-a-mouse-model-of-cancer

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Myszie kompletne model stazy w zakrzepicy żyły głównej dolnej pozwala na uzyskanie mierzalnych ilości tkanki ściany żyły oraz zakrzepu. Model ten okazał się użyteczny w ocenie oddziaływań między ścianą żyły a zakrzepem zamykającym światło naczynia oraz w analizie przejścia od stanu ostrego do chronicznego stanu zapalnego.

Myszy w całkowitym modelu zastoju zakrzepicy żyły głównej dolnej

Ten film opisuje technikę wstrzykiwania oznaczonych komórek rakowych za pomocą iniekcji żyły ogonowej do modelu mysiego. Ponadto monitorujemy powstawanie i wzrost przerzutów raka piersi za pomocą obrazowania żywych zwierząt w czasie rzeczywistym.

Wstrzyknięcie żyły ogonowej: metoda podawania komórek rakowych do badań przerzutowych w modelu mysim

Procedura chirurgiczna została opracowana w celu dostarczenia komórek guza sutka do mysiej wątroby poprzez wstrzyknięcie do żyły wrotnej. Model ten umożliwia badanie późnych stadiów przerzutów do wątroby u w pełni kompetentnego immunologicznie gospodarza, w tym wynaczynienia komórek nowotworowych, siewu, przeżycia i przerzutowego wzrostu w wątrobie.

Model iniekcji żyły wrotnej do badania przerzutów raka piersi do wątroby

Opisujemy tutaj zwężenie w żyle głównej dolnej jako mysi model zakrzepicy żył głębokich. Model ten podsumowuje ograniczenie przepływu krwi, jeden z głównych czynników wywołujących zakrzepicę żylną u ludzi.

Zwężenie żyły głównej dolnej: mysi model zakrzepicy żył głębokich

Obecny protokół opisuje kroki do uzyskania zakrzepicy żylnej za pomocą modelu zastoju. Ponadto stosujemy nieinwazyjną metodę pomiaru powstawania skrzepliny i ustępowania w czasie.

Zakrzepica żył głębokich wywołana zastojem u myszy monitorowanych za pomocą ultrasonografii wysokiej częstotliwości

Metoda lokalizacji immunofluorescencji in vivo (IVIL) może być użyta do badania in vivo biodystrybucji przeciwciał i koniugatów przeciwciał do celów onkologicznych w organizmach żywych przy użyciu kombinacji metod celowania w nowotwory in vivo i barwienia immunologicznego ex vivo.

Lokalizacja immunofluorescencji in vivo do oceny terapeutycznej i diagnostycznej biodystrybucji przeciwciał w badaniach nad rakiem

Opisane podejście łączy eksperymentalne testy przerzutów do żył ogonowych z obrazowaniem żywych zwierząt in vivo, aby umożliwić monitorowanie w czasie rzeczywistym powstawania i wzrostu przerzutów raka piersi, a także ilościowe określenie liczby i wielkości przerzutów w płucach.

Łączne wykorzystanie testów przerzutów do żył ogonowych i obrazowania in vivo w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia kolonizacji przerzutowej raka piersi i obciążenia płuc

Dożylne wstrzykiwanie komórek rakowych jest często stosowane w badaniach nad przerzutami, ale obciążenie guzem przerzutowym może być trudne do analizy. W tym artykule demonstrujemy model przerzutów do iniekcji żyły ogonowej i uwzględniamy nowatorskie podejście do analizy wynikającego z przerzutowego obciążenia guzem płuc.

Analiza patologiczna przerzutów do płuc po bocznym wstrzyknięciu komórek nowotworowych do żyły ogonowej

Opisujemy mysi model raka piersi z przerzutami do mózgu generowanymi przez wstrzyknięcie do żyły ogonowej endogennej linii komórkowej zapalnego raka piersi z amplifikacją HER2.

Modelowanie przerzutów do mózgu poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej komórek zapalnego raka piersi

Wstrzyknięcie organoidów raka jelita grubego (CRC) do żyły wrotnej powoduje przerzuty do wątroby bogate w zręb. Ten mysi model przerzutów do wątroby CRC stanowi użyteczne narzędzie do badania interakcji guz-zręb i opracowywania nowych terapii ukierunkowanych na zręb, takich jak terapie genowe za pośrednictwem wirusa związanego z adenowirusem.

Wstrzyknięcie do żyły wrotnej organoidów raka jelita grubego w celu zbadania zrębu z przerzutami do wątroby

Ten artykuł opisuje metodę modelowania całkowitego znieczulenia dożylnego (TIVA) podczas operacji resekcji raka u myszy. Celem jest odtworzenie kluczowych cech podawania znieczulenia pacjentom z rakiem. Metoda pozwala na zbadanie, jak technika anestezjologiczna wpływa na nawrót nowotworu po operacji resekcji.

Mysi model in vivo całkowitego znieczulenia dożylnego podczas operacji resekcji raka

Poznaj udoskonaloną technikę chirurgiczną z zaciskami naczyniowymi w mysim modelu ksenotransplantatu raka okrężnicy do badania zakrzepicy żylnej związanej z nowotworem. Metoda zapewnia większą powtarzalność i spójność wyników.

Test zakrzepicy żylnej w mysim modelu raka

Przeglądaj więcej filmów