Name: Mikroprzepływowy model martwiczego zapalenia jelit zawierający enteroidy jelitowe ludzkiego noworodka i mikrobiom dysbiotyczny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T12:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Poznaj mikroprzepływowy model martwiczego zapalenia jelit z enteroidami jelitowymi noworodka i mikrobiomem dysbiotycznym. Ta metoda pozwala badać mechanizmy NEC i opracowywać nowe strategie terapeutyczne dla wcześniaków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten manuskrypt był wspierany przez R01DK118568 (MG), R01DK124614 (MG) i R01HD105301 (MG) z National Institutes of Health, Chan Zuckerberg Initiative Grant 2022-316749 (MG), Thrasher Research Fund Early Career Award (LCF), UNC Children's Development Early Career Investigator Grant (LCF) dzięki hojnemu wsparciu darczyńców dla University of North Carolina w Chapel Hill, oraz Wydział Pediatrii Uniwersytetu Karoliny Północnej w Chapel Hill.

A Necrotizing Enterocolitis Model for Mechanistic Studies and Drug Discovery

<ol><li>Alsaied, A., Islam, N., Thalib, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+incidence+of+Necrotizing+Enterocolitis%3A+a+systematic+review+and+Meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Global incidence of Necrotizing Enterocolitis: a systematic review and Meta-analysis.</a> BMC Pediatrics. 20 (1), 344(2020).</li>
<li>Neu, J., Walker, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Necrotizing enterocolitis.</a> The New England Journal of Medicine. 364 (3), 255-264 (2011).</li>
<li>Frazer, L. C., Good, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelium+in+early+life%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelium in early life.</a> Mucosal Immunology. 15 (6), 1181-1187 (2022).</li>
<li>Good, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+milk+oligosaccharide+2%27-fucosyllactose+attenuates+the+severity+of+experimental+necrotising+enterocolitis+by+enhancing+mesenteric+perfusion+in+the+neonatal+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">The human milk oligosaccharide 2'-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine.</a> The British Journal of Nutrition. 116 (7), 1175-1187 (2016).</li>
<li>Mihi, B., Lanik, W. E., Gong, Q., Good, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mouse+Model+of+Necrotizing+Enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Mouse Model of Necrotizing Enterocolitis.</a> Methods in Molecular Biology. 2321, 101-110 (2021).</li>
<li>Afrazi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+4-mediated+endoplasmic+reticulum+stress+in+intestinal+crypts+induces+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 4-mediated endoplasmic reticulum stress in intestinal crypts induces necrotizing enterocolitis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (14), 9584-9599 (2014).</li>
<li>Neal, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+4+is+expressed+on+intestinal+stem+cells+and+regulates+their+proliferation+and+apoptosis+via+the+p53+up-regulated+modulator+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 4 is expressed on intestinal stem cells and regulates their proliferation and apoptosis via the p53 up-regulated modulator of apoptosis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (44), 37296-37308 (2012).</li>
<li>Sodhi, C., Richardson, W., Gribar, S., Hackam, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+animal+models+for+the+study+of+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+models+%26+mechanisms%22%5BJournal%5D)">The development of animal models for the study of necrotizing enterocolitis.</a> Disease models & mechanisms. 1 (2-3), 94-98 (2008).</li>
<li>Ares, G. J., McElroy, S. J., Hunter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+science+and+necessity+of+using+animal+models+in+the+study+of+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+pediatric+surgery%22%5BJournal%5D)">The science and necessity of using animal models in the study of necrotizing enterocolitis.</a> Seminars in pediatric surgery. 27 (1), 29-33 (2018).</li>
<li>Lu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+gastrointestinal+and+liver+diseases.+Animal+models+of+necrotizing+enterocolitis%3A+pathophysiology%2C+translational+relevance%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Gastrointestinal+and+liver+physiology%22%5BJournal%5D)">Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of necrotizing enterocolitis: pathophysiology, translational relevance, and challenges.</a> American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 306 (11), G917-G928 (2014).</li>
<li>Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+induction+of+experimental+necrotizing+enterocolitis+in+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocol%22%5BJournal%5D)">A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice.</a> STAR Protocol. 2 (4), 100951(2021).</li>
<li>Egan, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+4-mediated+lymphocyte+influx+induces+neonatal+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 4-mediated lymphocyte influx induces neonatal necrotizing enterocolitis.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 495-508 (2016).</li>
<li>Stanford, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+comparison+of+mouse+and+human+intestinal+development+using+epithelial+gene+expression+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">A direct comparison of mouse and human intestinal development using epithelial gene expression patterns.</a> Pediatric Research. 88 (1), 66-76 (2020).</li>
<li>Noll, K. E., Ferris, M. T., Heise, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Collaborative+Cross%3A+A+Systems+Genetics+Resource+for+Studying+Host-Pathogen+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">The Collaborative Cross: A Systems Genetics Resource for Studying Host-Pathogen Interactions.</a> Cell Host Microbe. 25 (4), 484-498 (2019).</li>
<li>Ericsson, A. C., Franklin, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiome+of+laboratory+mice%3A+considerations+and+best+practices+for+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Mammalian+Genome%22%5BJournal%5D)">The gut microbiome of laboratory mice: considerations and best practices for translational research.</a> Mammalian Genome. 32 (4), 239-250 (2021).</li>
<li>De Fazio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necrotizing+Enterocolitis%3A+Overview+on+In+Vitro+Models%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Necrotizing Enterocolitis: Overview on In Vitro Models.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761(2021).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Kasendra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+primary+human+Small+Intestine-on-a-Chip+using+biopsy-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids.</a> Scientific Reports. 8 (1), 2871(2018).</li>
<li>Middendorp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+stem+cells+in+the+small+intestine+are+intrinsically+programmed+with+their+location-specific+function%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function.</a> Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).</li>
<li>Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+for+a+pharmacokinetic-pharmacodynamic+%28PK-PD%29+model+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device for a pharmacokinetic-pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip.</a> Lab Chip. 10 (4), 446-455 (2010).</li>
<li>Sung, J. H., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+micro+cell+culture+analog+%28microCCA%29+with+3-D+hydrogel+culture+of+multiple+cell+lines+to+assess+metabolism-dependent+cytotoxicity+of+anti-cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A micro cell culture analog (microCCA) with 3-D hydrogel culture of multiple cell lines to assess metabolism-dependent cytotoxicity of anti-cancer drugs.</a> Lab Chip. 9 (10), 1385-1394 (2009).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li>
<li>Jang, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducing+human+and+cross-species+drug+toxicities+using+a+Liver-Chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Reproducing human and cross-species drug toxicities using a Liver-Chip.</a> Science translational medicine. 11 (517), eaax5516(2019).</li>
<li>Musah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+induced-pluripotent-stem-cell-derived+human+podocytes+reconstitute+kidney+glomerular-capillary-wall+function+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biomedical+engineering%22%5BJournal%5D)">Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip.</a> Nature biomedical engineering. 1, 0069(2017).</li>
<li>Chou, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+recapitulation+of+clinical+bone+marrow+toxicities+and+patient-specific+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biomedical+engineering%22%5BJournal%5D)">On-chip recapitulation of clinical bone marrow toxicities and patient-specific pathophysiology.</a> Nature biomedical engineering. 4 (4), 394-406 (2020).</li>
<li>Park, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-enhanced+Blood-Brain+Barrier+Chip+recapitulates+human+barrier+function+and+shuttling+of+drugs+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies.</a> Nature Communications. 10 (1), 2621(2019).</li>
<li>Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+heart+on+a+chip+for+higher+throughput+pharmacological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies.</a> Lab Chip. 13 (18), 3599-3608 (2013).</li>
<li>Jalili-Firoozinezhad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+radiation+injury-induced+cell+death+and+countermeasure+drug+responses+in+a+human+Gut-on-a-Chip%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Modeling radiation injury-induced cell death and countermeasure drug responses in a human Gut-on-a-Chip.</a> Cell Death & Disease. 9 (2), 223(2018).</li>
<li>Benam, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+airway-on-a-chip+enables+analysis+of+human+lung+inflammation+and+drug+responses+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro.</a> Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).</li>
<li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+3D+neuromuscular+model+for+drug+screening+and+precision+medicine+in+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">On-chip 3D neuromuscular model for drug screening and precision medicine in neuromuscular disease.</a> Nature Protocols. 15 (2), 421-449 (2020).</li>
<li>Chen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+Migration+Chip+for+Chemotaxis-based+Microfluidic+Selection+of+Heterogeneous+Cell+Populations%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations.</a> Scientific Reports. 5, 9980(2015).</li>
<li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-on-chip%3A+Recreating+human+intestine+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Gut-on-chip: Recreating human intestine in vitro.</a> Journal of tissue engineering. 11, 2041731420965318(2020).</li>
<li>Lanik, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+device+facilitates+in+vitro+modeling+of+human+neonatal+necrotizing+enterocolitis-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Microfluidic device facilitates in vitro modeling of human neonatal necrotizing enterocolitis-on-a-chip.</a> JCI Insight. 8 (8), e146496(2023).</li>
<li>Emulate. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Duodenum+Intestine-Chip+Protocol%22">Duodenum Intestine-Chip Protocol</a>. , https://emulatebio.wpenginepowered.com/wp-content/uploads/2022/10/EP203-Rev-A-Duodenum-Intestine-Chip-Protocol.pdf (2022).</li>
<li>Good, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactobacillus+rhamnosus+HN001+decreases+the+severity+of+necrotizing+enterocolitis+in+neonatal+mice+and+preterm+piglets%3A+evidence+in+mice+for+a+role+of+TLR9+%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Gastrointestinal+and+liver+physiology%22%5BJournal%5D)">Lactobacillus rhamnosus HN001 decreases the severity of necrotizing enterocolitis in neonatal mice and preterm piglets: evidence in mice for a role of TLR9 .</a> American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 306 (11), G1021-G1032 (2014).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+Dilutions+and+Plating%3A+Microbial+Enumeration%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration.</a> JoVE. , (2023).</li>
<li>VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-WRN+conditioned+medium+for+gastrointestinal+epithelial+stem+cell+culture+shows+replicable+batch-to-batch+activity+levels+across+multiple+research+teams%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams.</a> Stem Cell Research. 37, 101430(2019).</li>
<li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie ma konfliktu interesów związanego z tym manuskryptem.

Ten system NEC-on-a-chip jest nowym, potężnym narzędziem, które można wykorzystać do modelowania patofizjologii NEC. Platforma ta zapewnia złożone mikrośrodowisko, które bardziej przypomina środowisko jelitowe in vivo niż poprzednie modele, dzięki włączeniu systemu kohodowli z ciągłym przepływem światła i rozciąganiem. Warunki te sprzyjają rozwojowi architektury 3D przypominającej kosmki wyłożonej wysoce spolaryzowanym nabłonkiem składającym się z dojrzałych podtypów nabłonka i ścisłych połączeń (<strong class="...

Martwicze zapalenie jelit (NEC) dotyka wcześniaków, z częstością do 10% u urodzonych o wadze < 1500 g1. Patofizjologia NEC jest złożona i obejmuje uszkodzenie nabłonka jelitowego, przerwanie ścisłych połączeń jelitowych, zwiększoną przepuszczalność bariery jelitowej, dysregulację immunologiczną i śmierć komórek nabłonka2,3. Nasza wiedza na temat mechanizmów związanych z patogenezą NEC pozostaje niekompletna i pomimo dziesięcioleci badań nadal nie ma skutecznych terapii celowanych.
Istotną przeszkodą dla rozwoju badań NEC jest ograniczona dostępność i mały rozmiar pierwotnej tkanki jelitowej wyizolowanej od ludzkich niemowląt. Tkanka jelitowa wycięta od niemowląt z NEC jest często martwicza i poważnie uszkodzona, co komplikuje badania nad mechanizmami poprzedzającymi wystąpienie choroby. Na przykład jelito cienkie niemowląt z NEC jest zalane komórkami odpornościowymi, obserwuje się również zmniejszoną liczbę jelitowych komórek macierzystych, zmniejszoną proliferację komórek nabłonka i zwiększoną apoptozę komórek nabłonka4,5,6,7. Prowadzi to do trudności w hodowli komórek nabłonka jelitowego z tych próbek oraz w izolowaniu RNA i białek, które mogą ulec degradacji w tym nieprzyjaznym środowisku zapalnym. Dodatkowo, ponieważ proces chorobowy jest już zaawansowany u niemowląt z chirurgicznym NEC, badania mechanistyczne nad czynnikami wywołującymi chorobę są niewykonalne. Ograniczenia te doprowadziły do polegania na modelach zwierzęcych w badaniach mechanistycznych NEC.
Modele zwierzęce NEC zostały stworzone dla myszy, szczurów, prosiąt, królików i pawianów5,8,9,11. Mocną stroną modeli zwierzęcych jest to, że choroba jelitowa podobna do NEC jest wywoływana przez czynniki związane z wystąpieniem NEC u ludzi, w tym mikrobiom dysbiotyczny, powtarzające się epizody niedotlenienia i brak karmienia mlekiem matki5,8,10,11. Ponadto reakcja zapalna i zmiany patologiczne obserwowane podczas eksperymentalnej NEC równolegle z chorobą człowieka5,9,12. Chociaż modele te naśladują wiele cech ludzkiego NEC, istnieją nieodłączne różnice między patofizjologią NEC u zwierząt i ludzi. Na przykład mysi model NEC jest indukowany u myszy urodzonych o czasie i chociaż ich rozwój jelitowy jest niekompletny, patofizjologia NEC jest z natury inna w tym kontekście klinicznym. Ekspresja genów w jesim jelicie po urodzeniu jest podobna do ekspresji przedzdolnego do życia płodu ludzkiego i nie jest zbliżona do ekspresji wcześniaka w wieku 22-24 tygodni ciąży do dnia 14 (P14)13. To myli mysi model NEC, ponieważ uszkodzenie jelit nie może być generalnie wywołane u myszy po P10. Ponadto szczepy wsobne myszy nie mają immunologicznego14 i różnorodności mikrobiologicznej ludzkich noworodków15, co służy jako kolejny czynnik zakłócający. W związku z tym zwiększone włączenie pierwotnych próbek pobranych od ludzi do badań NEC zwiększa znaczenie kliniczne badań w tej dziedzinie.
Badania nad mechanizmami NEC in vitro tradycyjnie wykorzystywały monotypowe linie komórkowe pochodzące z dorosłych komórek raka jelita, takie jak gruczolakorak jelita grubego (Caco2) i ludzki gruczolakorak jelita grubego (HT-29)16. Modele te są wygodne, ale mają ograniczone znaczenie fizjologiczne ze względu na ich wzrost z dorosłych komórek rakowych, niespolaryzowaną architekturę i zmiany fenotypowe związane z powtarzającymi się pasażami w hodowli. Enteroidy jelitowe są lepsze od tych modeli, ponieważ mogą być hodowane z krypt tkanki jelitowej, różnicowane na wszystkie podtypy nabłonka jelitowego i tworzą trójwymiarową (3D) strukturę podobną do kosmków17,18,19,20. Ostatnio enteroidy jelitowe zostały połączone z technologią mikroprzepływową w celu opracowania modelu jelita cienkiego na chipie i zapewnienia bardziej fizjologicznie odpowiedniego systemu modelowego in vitro21.
Pierwsze urządzenia mikroprzepływowe typu organ-on-a-chip zostały wprowadzone na początku lat 200022,23,24. Pierwszym modelem narządu na chipie było ludzkie oddychanie płuc na chipie25. Następnie powstały liczne modele jednonarządowe, takie jak intestine21, liver26, kidneys27, bone marrow28, blood-brain barrier29 oraz heart30. Te modele narządów na chipie zostały wykorzystane do badania chorób ostrych, przewlekłych i rzadkich, w tym ostrego zespołu popromiennego, 31 przewlekła obturacyjna choroba płuc,32 i choroby neurodegeneracyjne33. Spolaryzowany charakter komórek na tych chipach i obecność dwóch przedziałów komórkowych oddzielonych porowatą błoną pozwala na modelowanie złożonych procesów fizjologicznych, takich jak perfuzja, gradienty stężeń chemicznych i chemotaksja komórek odpornościowych34,35. Te systemy mikroprzepływowe stanowią zatem nowe narzędzie do badania patofizjologii i mechanizmów chorób człowieka.
Model jelita cienkiego na chipie został opisany przez Kasendrę i in. w 2018 roku, którzy wykorzystali pediatryczne (w wieku 10-14 lat) próbki biopsji jelita cienkiego zróżnicowane na enteroidy i wyhodowane na urządzeniu mikroprzepływowym21. Komórki śródbłonka naczyń krwionośnych, ciągły przepływ mediów oraz rozciąganie/relaksacja zostały również włączone do tego modelu. Obserwowali różnicowanie podtypów nabłonka jelitowego, tworzenie osi 3D przypominających kosmki, produkcję śluzu i wzorce ekspresji genów w jelicie cienkim21. Ten model mikroprzepływowy został zastosowany do chorób noworodków wraz z opracowaniem systemu NEC-on-a-chip, który obejmuje enteroidy jelitowe noworodków, komórki śródbłonka i mikrobiom noworodka z klasą NEC36. NEC-on-a-chip podsumowuje wiele krytycznych cech ludzkiego NEC, w tym ekspresję genów zapalnych, utratę wyspecjalizowanych komórek nabłonkowych i zmniejszoną funkcję bariery jelitowej36. W związku z tym model ten ma wiele zastosowań w badaniach NEC, w tym w badaniach mechanistycznych i odkrywaniu leków. W niniejszym manuskrypcie przedstawiono szczegółowy protokół działania modelu NEC-on-a-chip.

<table><tbody><tr><td>[Leu15]-Gastrin I człowiek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>A 83-01</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0788</td><td></td></tr><tr><td>Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement, bez surowicy (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Basic Bio-kit</td><td>Emulate</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Wielomodowy czytnik mikropłytek BioTek Synergy 2</td><td>Agilent</td><td>&nbsp; 7131000</td><td></td></tr><tr><td>Kuwety z metakrylanu marki (PMMA), półmikro</td><td>BrandTech</td><td>759085D</td><td></td></tr><tr><td>Rozwiązanie do odzyskiwania komórek</td><td>Corning</td><td>354270</td><td></td></tr><tr><td>CFX Opus Systemy PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Bio-Rad</td><td>12011319</td><td></td></tr><tr><td>Podstawka do chipów</td><td>Emulacja</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Chip-S1 Rozciągliwy chip</td><td>emulacyjny</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML1046</td><td></td></tr><tr><td>przezroczyste płytki wielodołkowe poddane działaniu TC,&nbsp; 48 dołków&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen z ludzkiego łożyska</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza, typ I, proszek</td><td>Gibco</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>Kompletne podłoże dla ludzkich komórek śródbłonka z zestawem&nbsp;</td><td>Cell Biologics</td><td>H-1168</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe z polipropylenu, 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe z polipropylenu, 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-8</td><td></td></tr><tr><td>Prowadnice komory do liczenia komórek Countess</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Hrabina II automatyczny licznik komórek</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td></td><td></td>AMQAX1000</tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5942</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, Anionowy, Lizyna Fixable</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; D7132</td><td>Barwnik przepuszczalności&nbsp;</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe jednostki filtrujące PES, membrana 0,2um aPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB12566504</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Serum osła</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Zmodyfikowany Orzeł i liczba pierwsza; s Medium - wysoki poziom glukozy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0,5 M,&nbsp; pH 8,0</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik aktywacji powierzchniowej ER-1</td><td>Emuluj</td><td>odczynnik aktywacji chipa</td><td>ER-1</td></tr> 1 <tr><td>Odczynnik aktywacji powierzchniowej ER-2&nbsp;</td><td>Emuluj</td><td>odczynnik aktywacyjny chipa</td><td>ER-2</td> 2</tr><tr><td>Fibronektyna Białko ludzkie, Plasma</td><td>Gibco</td><td>33016015</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Szalki Petriego z przezroczystą pokrywką, 100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do powlekania na bazie żelatyny&nbsp;</td><td>Cell Biologics</td><td>6950</td><td></td></tr><tr><td>Genie Temp-Shaker 300</td><td>Scientific Industries, Inc.</td><td>SI-G300</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, Płynny roztwór 1M (238,3 mg/ ml)</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Trójchlorowodorek, Trójwodzian&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen ludzki typu I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CC050</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie pierwotne komórki śródbłonka mikronaczyniowego jelita cienkiego</td><td>Cell Biologics</td><td>H-6054</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-000-013</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiele wodne Isotemp ogólnego przeznaczenia Deluxe</td><td>Fisher Scientific</td><td>FSGPD10</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Bulion Luria (LB) agar, Miller</td><td>Supelco</td><td>L3027</td><td></td></tr><tr><td>L-WRN Cells&nbsp;</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-3276</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, bez LDEV&nbsp;</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Cell Culture Matrix</td></tr><tr><td>N-2 Suplement (100x)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylo-L-cysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1009005</td><td></td></tr><tr><td>LAMPA UV NAILSTAR</td><td>NailStar</td><td>NS-01-US</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop OneC&nbsp; Spektrofotometr UV-Vis o mikroobjętości</td><td>Thermo Scientific</td><td>840-274200</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72340</td><td></td></tr><tr><td>Moduł koncentratora Orb-HM1</td><td>Emulacja</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehydu</td><td>ThermoFisher</td><td>047392.9L</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Pipeta wielofunkcyjna Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite L8-200XLS+</td><td>Rainin</td><td>17013805</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet TR LTS 1000&micro; Przenośny moduł LS768A/8</td><td>Rainin</td><td>17014966</td><td></td></tr><tr><td>Pod</td><td>emuluje</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>najwyższej jakości płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (inaktywowanej termicznie)&nbsp;</td><td>Avantor Seradigm</td><td>1500-500</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect Zestaw do odwrotnej transkrypcji&nbsp;</td><td>QIAGEN</td><td>205313</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany mysi naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>Kwadratowe naczynie do testów biologicznych z uchwytami, nie poddane obróbce TC&nbsp;</td><td>Corning</td><td>431111</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced Uniwersalny SYBR&nbsp; Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725271</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip-GV Sterylna probówka wirówkowa Górny filtr</td><td>Millipore</td><td>SE1M179M6</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne sitka komórkowe, 70um</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne strzykawki, 10 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-453</td><td></td></tr><tr><td>Proste, cienkie, ostre nożyczki z ostrym końcem</td><td>Miltex&nbsp; Instrumenty</td><td>MH5-300</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Wirówka Sorvall X4R Pro-MD</td><td>Thermo Scientific</td><td>75016052</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>TRIzol Odczynnik&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>odczynnik do ekstrakcji RNA</td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego, 0,4% (w/v) w PBS, pH 7,5 &plusmn; 0,5</td><td>Corning</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X), bez czerwieni fenolowej&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td>Odczynnik dysocjacji enzymatycznej</td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>VIOS 160i Inkubator CO2, 165 L</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-998-252</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>Zo&euml;-CM1 Moduł hodowli</td><td>Emulacja</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroprzepływowy model martwiczego zapalenia jelit zawierający enteroidy jelitowe ludzkiego noworodka i mikrobiom dysbiotyczny

Microfluidic Model of Necrotizing Enterocolitis Incorporating Human Neonatal Intestinal Enteroids and a Dysbiotic Microbiome

Martwicze zapalenie jelit (NEC) jest ciężką i potencjalnie śmiertelną chorobą jelit, która była trudna do zbadania ze względu na jej złożoną patogenezę, która pozostaje nie do końca poznana. Patofizjologia NEC obejmuje przerwanie ścisłych połączeń jelitowych, zwiększoną przepuszczalność bariery jelitowej, śmierć komórek nabłonka, dysbiozę mikrobiologiczną i rozregulowany stan zapalny. Tradycyjne narzędzia do badania NEC obejmują modele zwierzęce, linie komórkowe oraz organoidy jelitowe ludzi lub myszy. Chociaż badania z wykorzystaniem tych systemów modelowych poprawiły zrozumienie patofizjologii chorób, ich zdolność do podsumowania złożoności ludzkiego NEC jest ograniczona. Udoskonalony model NEC in vitro wykorzystujący technologię mikroprzepływową, nazwany NEC-on-a-chip. Model NEC-on-a-chip składa się z urządzenia mikroprzepływowego wysiewanego enteroidami jelitowymi pochodzącymi od wcześniaków, współhodowanymi z ludzkimi komórkami śródbłonka i mikrobiomem niemowlęcia z ciężkim NEC. Model ten jest cennym narzędziem do badań mechanistycznych nad patofizjologią NEC i nowym źródłem do testowania nowych leków na choroby jelit u noworodków. W niniejszym manuskrypcie zostanie zamieszczony szczegółowy opis modelu NEC-on-a-chip.

Enteroidy zasiano na urządzeniu mikroprzepływowym (Rysunek 1>) i hodowano zgodnie z powyższym opisem. Wzrost enteroidów w hydrożelu matrycy hodowlanej przed zasianiem, a następnie późniejszą ekspansję jednowarstwy komórek nabłonka jelitowego po zasianiu urządzenia, monitorowano za pomocą mikroskopii w polu jasnym (Rysunek 2>). Powstała konfluentna jednowarstwa komórek nabłonka jelitowego, która następnie przekształciła się w dojrzałą strukturę 3D przypominającą ...

Ten protokół opisuje model in vitro martwiczego zapalenia jelit (NEC), który może być wykorzystany do mechanistycznych badań nad patogenezą choroby. Posiada chip mikroprzepływowy wysiany enteroidami jelitowymi pochodzącymi z ludzkiego jelita noworodka, komórek śródbłonka i mikrobiomu jelitowego noworodka z ciężkim NEC.

Mikroprzepływowy model martwiczego zapalenia jelit zawierający enteroidy jelitowe ludzkiego noworodka i mikrobiom dysbiotyczny

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a severe and potentially fatal intestinal disease that has been difficult to study due to its complex pathogenesis, ...

Badania w tej dziedzinie są trudne, ponieważ patofizjologia martwiczego zapalenia jelit jest złożona, a złożoność ta nie znajduje odzwierciedlenia w wielu powszechnie stosowanych modelach in vitro. Badania z wykorzystaniem próbek ludzkich są często ograniczone ze względu na małą objętość próbek i rzadkość próbek uzyskanych podczas operacji jelita. Naszym celem jest określenie mechanizmów, które prowadzą do rozwoju NEC u wcześniaków oraz zidentyfikowanie nowych strategii leczenia.System NEC-on-a-Chip jest lepszy od poprzednich modeli, ponieważ lepiej odzwierciedla fizjologię jelita noworodka. W tym modelu połączyliśmy organoidy jelitowe pochodzące od pacjenta, komórki śródbłonka i mikrobiom noworodka, który miał ciężki NEC, na chipie mikroprzepływowym. Na początek umieść chip i nośnik chipa w kołysce na chipy znajdującej się w sterylnym naczyniu do hodowli tkankowych i trzymaj je na boku w kapturze do hodowli tkankowych podczas przygotowywania odczynnika do aktywacji chipa.Dodać jeden mililitr roztworu CR2 do fiolki zawierającej proszek CR1. Przenieś roztwór z fiolki do 15-mililitrowej probówki owiniętej folią aluminiową. Powtarzać ten proces, aż cztery płukania i cztery mililitry CR2 zostaną przepłukane przez fiolkę CR1.Do ostatniego płukania należy zakryć fiolkę i odwrócić ją, aby usunąć resztki proszku. Następnie dodaj sześć mililitrów CR2 do 15-mililitrowej rurki zawierającej CR1. Wymieszaj końcowy 10 mililitrowy roztwór za pomocą pipety bez wprowadzania bąbelków.Używając końcówki do pipet o pojemności 200 mikrolitrów, dodaj 20 mikrolitrów roztworu CR1 do dolnego wlotu kanału, aż roztwór zacznie wychodzić z dolnego kanału. Dodaj 50 mikrolitrów roztworu CR1 przez wlot górnego kanału, aż roztwór zacznie wychodzić z górnego kanału. Następnie umieść frytki w świetle ultrafioletowym na 15 minut.Po ekspozycji usuń roztwór CR1 z górnego i dolnego kanału. Umyj oba kanały 100 mikrolitrami roztworu CR2. Następnie umyj dwukrotnie 100 mikrolitrami DPBS.Przygotuj roztwory macierzy zewnątrzkomórkowej dla górnego i dolnego kanału chipa. Dodaj 50 mikrolitrów roztworu macierzy zewnątrzkomórkowej do wlotu dolnego kanału, aż na wylocie pojawi się kropla. Następnie dodaj 50 mikrolitrów do wlotu górnego kanału, aż kropla pojawi się na wlocie.Dodaj DPBS do zbiornika kołyski na wióry. Przykryj pokrywką talerz i inkubuj frytki przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia przepłucz nabłonek lub górny kanał chipa 100 mikrolitrami wstępnie podgrzanego podłoża do rozprężania chipów.Następnie przepłucz śródbłonek lub dolny kanał 100 mikrolitrami wstępnie podgrzanej pożywki HIMEC. Po policzeniu dodaj 10 mikrolitrów HIMEC do kanału śródbłonka. W razie potrzeby dodaj organoidowe pożywki wzrostowe lub pożywki do rozprężania chipów do kanału nabłonkowego i sprawdź gęstość wysiewu HIMEC.Następnie odwróć chip do kołyski na chipsy umieszczonej w naczyniu do hodowli komórkowych. Dodaj DPBS do zbiornika w kołysce na wióry. I umieść chip w temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie do trzech godzin, aby umożliwić HIMEC przymocowanie się do membrany chipa.Po inkubacji ustawić kołyskę na wióry w pozycji pionowej. Delikatnie umyj kanał śródbłonka 100 mikrolitrami ciepłej pożywki HIMEC, a kanał nabłonkowy pożywką wzrostową organoidów lub pożywką do rozprężania chipów, pozostawiając pożywkę w kanale. W celu zebrania enteroidów delikatnie odessać pożywkę i umyć studzienki zawierające hydrożel z matrycą do hodowli komórkowych 500 mikrolitrami ciepłego DPBS.Dodaj 250 mikrolitrów roztworu do odzyskiwania zimnych komórek do każdego dołka i zdrap dno każdej studzienki świeżą końcówką pipety, aby rozbić hydrożel macierzy hodowli komórkowych. Dodaj rozłożoną zawiesinę komórkową do zimnej 15-mililitrowej probówki na lodzie i inkubuj przez 45 minut. Po inkubacji odwirować zawiesinę i usunąć supernatant.Następnie dodaj dwa mililitry ciepłej enteroidalnej pożywki dysocjacyjnej do osadu i umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 60 do 120 sekund. Następnie dodaj do probówki 10 mililitrów zimnego płynu do mycia tkanek. Następnie odwirować i usunąć supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu w 200 mikrolitrach pożywki rozszerzającej wióry.Za pomocą pipety P200 oddziel enteroidy i dodaj zawiesinę do 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki. Policz komórki i dostosuj objętość nośnika do rozprężania chipów, aby osiągnąć stężenie sześć razy 10 do sześciu komórek na mililitr. Następnie dodaj 30 mikrolitrów zawieszonej zawiesiny komórek do górnego kanału chipa.Po umieszczeniu chipsów w kołysce na wióry dodaj DPBS do zbiornika i inkubuj chipsy przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia dwukrotnie przepłucz kanał nabłonkowy 100 mikrolitrami pożywki do rozprężania chipów, a kanał śródbłonka 100 mikrolitrami pożywki HIMEC. Następnie dodaj dwa mililitry pożywki rozprężnej do chipów do zbiornika wlotowego górnego kanału i 300 mikrolitrów do zbiornika wylotowego górnego kanału.Dodaj dwa mililitry pożywki HIMEC do zbiornika wlotowego dolnego kanału i 300 mikrolitrów do zbiornika wylotowego dolnego kanału. Zagruntuj strąki i dodaj frytki do strąków. Następnie dodaj strąki do modułu hodowli, ustaw natężenie przepływu na 30 mikrolitrów na godzinę i rozpocznij cykl.Komórki nabłonka jelitowego wyhodowane przy użyciu jelita noworodka na chipie utworzyły monowarstwę komórek konfluencji, a następnie rozwinęły się w dojrzałą, trójwymiarową strukturę przypominającą kosmki. Dodanie dysbiotycznego mikrobiomu od noworodka z ciężkim martwiczym zapaleniem jelit do jelita noworodka na modelu chipowym wykazało zwiększoną ekspresję TNF alfa w porównaniu z kontrolą.

microfluidic-model-necrotizing-enterocolitis-incorporating-human

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film pokazuje rozwój choroby martwiczego zapalenia jelit w ludzkim modelu enteroidu noworodka, wywołanego leczeniem lipopolisacharydami. Model ten pomaga badać patofizjologię jelit.

Indukcja martwiczego zapalenia jelit w ludzkim nabłonkowym modelu enteroidalnym

Enteroidy wyłaniają się jako nowy model w badaniach nad chorobami ludzkimi. Protokół opisuje, w jaki sposób symulować enteroidalny model ludzkiego martwiczego zapalenia jelit za pomocą leczenia lipopolisacharydami (LPS) enteroidów generowanych z tkanki noworodka. Pobrane enteroidy wykazują zmiany zapalne podobne do tych obserwowanych w ludzkim martwiczym zapaleniu jelit.

Nowy ludzki nabłonkowy enteroidalny model martwiczego zapalenia jelit

Ten protokół opisuje model wierzchołkowego martwiczego zapalenia jelit (NEC) w naczyniu, wykorzystujący enteroidy jelita cienkiego z odwróconą polaryzacją, umożliwiającą dostęp do powierzchni wierzchołkowej. Zapewniamy protokół barwienia immunofluorescencyjnego w celu wykrycia przerwania nabłonka związanego z NEC oraz metodę określania żywotności enteroidów wierzchołkowych poddanych protokołowi NEC-in-a-dish.

In vitro Wierzchołkowy model enteroidalny martwiczego zapalenia jelit

Escherichia coli powoduje sepsę u noworodków, które połykają bakterie w czasie porodu. Proces związany ze zdolnością E. coli do przemieszczania się z przewodu pokarmowego do krwiobiegu jest słabo poznany. Ten model in vitro ocenia zdolność szczepów E. coli do przemieszczania się przez komórki nabłonka jelitowego.

Ocena transcytozy jelitowej izolatów bakteriemii Escherichia coli u noworodków

Ten protokół opisuje noworodkowy model mysiego nektyzującego enterokolitisu (NEC) oraz późniejsze izolację komórek odpornościowych z blaszki właściwej jelita cienkiego noworodków.

Model myszy noworodkowej nekrotyzującego enterokolitu i izolacji lamina propria w celu profilaktyki komórek odpornościowych

Modele dużych zwierząt mają wysoką wartość translacyjną w badaniu fizjologii i farmakologii niedotlenienia okołoporodowego. Wykorzystując noworodki prosiąt, opracowaliśmy eksperymentalny protokół symulacji niedotlenienia okołoporodowego, który umożliwia badanie hemodynamicznych parametrów systemowych i regionalnych, transportu tlenu wraz z szlakami biochemicznymi i patologicznymi oraz ich korelacji.

Model niedotlenienia okołoporodowego u świń

encefalopatia niedotlenieniowo-niedokrwienna po uduszeniu okołoporodowym może być badana na modelach zwierzęcych. Przedstawiono procedury niezbędne do ustalenia modelu encefalopatii niedotlenieniowo-niedokrwiennej noworodków u prosiąt.

Model prosięcia encefalopatii niedotlenieniowo-niedokrwiennej noworodków

Opisujemy metodę tworzenia ludzkich enteroidów z krypt jelita cienkiego i kolonoidów z krypt jelita grubego pobranych zarówno z tkanek chirurgicznych, jak i z biopsji. W tym artykule metodologicznym przedstawiamy metody hodowli, które są niezbędne do pomyślnego wzrostu i utrzymania ludzkich enteroidów i okronoidów.

Ustalenie ludzkich enteroidów nabłonkowych i kolonoidów z całej tkanki i biopsja

Przedstawiamy zabieg chirurgiczny polegający na cewnikowaniu jelitowego pnia limfatycznego u nowonarodzonych świń w celu pobrania dużych ilości składników metabolizmu lipidów z odprowadzającej limfy.

Długotrwałe cewnikowanie pnia limfatycznego jelit i pobieranie limfy u nowonarodzonych świń

Ten artykuł opisuje metodę generowania powtarzalnego uszkodzenia kompresyjnego rdzenia kręgowego (SCI) u noworodka myszy. Model ten stanowi korzystną platformę do badania mechanizmów plastyczności adaptacyjnej, które leżą u podstaw spontanicznej odbudowy funkcjonalnej.

Model urazu kompresyjnego rdzenia kręgowego u noworodków myszy

Poznaj mikroprzepływowy model martwiczego zapalenia jelit z enteroidami jelitowymi noworodka i mikrobiomem dysbiotycznym. Ta metoda pozwala badać mechanizmy NEC i opracowywać nowe strategie terapeutyczne dla wcześniaków.

Mikroprzepływowy model martwiczego zapalenia jelit zawierający enteroidy jelitowe ludzkiego noworodka i mikrobiom dysbiotyczny

Przeglądaj więcej filmów