Name: Izolacja i identyfikacja komórek niszy rąbka ramiennego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-27T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Poznaj metodę izolacji i identyfikacji komórek niszy rąbka ramiennego człowieka wykorzystującą sekwencjonowanie pojedynczych komórek. Technika ta wspiera badania nad regeneracją rogówki i leczeniem niedoboru komórek macierzystych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Podziękowania dla Wei Wanga, Lingjuana Xu i Rong Liu za wskazówki dotyczące tej pracy, Yongyao Tan, Bihui Jin, Chunxiu You i Li Guigang za dostarczenie części materiału, Guanyu Su za napisanie manuskryptu, Xiao Zhou, Yihong Xiong i Huatao Xie za poprawienie manuskryptu oraz Guigang Li za pełne wskazówki. Badanie to było wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (nr 82070936, 81470606, 81570819), projekt naukowo-badawczy dotyczący zdrowia i planowania rodziny w prowincji Hubei (nr 1). WJ2017M073), Dziesięć najlepszych translacyjnych projektów badań medycznych ze szpitala Tongji (nr 2016ZHYX20), Projekt szkoleniowy młodych pionierów medycyny w mieście Wuhan (nr 2015whzqnyxggrc10), Globalny program rekrutacji talentów (G2022154028L), projekt Narodowej Komisji Zdrowia prowincji Hubei w 2022 r. (WJ2021ZH0005) oraz Fundacja Budowy Przedmiotu Departamentu Finansów Hubei w 2022 r. (42000022815T000000102)

Tkanka rąbka od dawców w wieku od 50 do 60 lat została pobrana z Banku Oka Czerwonego Krzyża, Szpital Tongji (Wuhan, Chiny). Protokół został zatwierdzony przez Komitet Etyki Tongji i został przeprowadzony zgodnie z Deklaracją Helsińską.
1. Izolacja
<ol>
	<li>Uzyskaj tkankę rąbka rogówki ze średnioterminowego podłoża do przechowywania rogówki i pracuj w warunkach aseptycznych na ultra czystym stole warsztatowym.</li>
	<li>Zeskrob i usuń tęczówkę i śródbłonek wokół rogówki za pomocą sterylnego okrągłego ostrza chirurgicznego.</li>
	<li>Pokrój tkankę rąbka na dwanaście równych kawałków za pomocą ostrza chirurgicznego, pozostawiając 1 mm po obu stronach rogówki i twardówki.</li>
	<li>Przenieś tkanki rąbka na 3,5 cm płytkę hodowlaną, dodaj 1 ml kolagenazy A (2 mg/ml, w pożywce DF-12), aby zanurzyć wszystkie tkanki do trawienia.</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze komórkowym o temperaturze 37 °C, trawić tkanki rąbka przez 18 godzin 
	UWAGA: Zabiegi kontrolne są zwykle wykonywane drugiego dnia.</li>
	<li>Przygotować 6-dołkową płytkę hodowlaną pokrytą 5% macierzystą błoną podstawną (Matrigel).
	<ol>
		<li>Pokryć 5% matrycę błony podstawnej (rozpuszczoną w MESCM [Tabela 1]) na dnie studzienki.</li>
		<li>Przygotuj 200 μl i 1 ml końcówki, jedną 15 ml probówkę odśrodkową i jedną 6-dołkową płytkę w wysterylizowanej torbie.</li>
		<li>Umieścić wysterylizowaną torebkę (wraz z końcówkami i rurką odśrodkową) i nową płytkę 6-dołkową w temperaturze -20 °C lub -80 °C na 20 minut. Rozmrozić matrycę błony podstawnej w lodówce w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Wyjmij wstępnie schłodzone końcówki, rurkę odśrodkową i płytkę 6-dołkową ze środowiska -20 °C lub -80 °C, a następnie wykonaj następujące operacje na ultra czystym stole warsztatowym.</li>
		<li>Przenieś 50 μl 5% macierzystej membrany do 1 ml MESCM za pomocą końcówki 200 μl i delikatnie i równomiernie wymieszaj.</li>
		<li>Przenieść 5% macierzy błony podstawnej (rozpuszczonej w MESCM) do jednego dołka 6-dołkowej płytki hodowlanej za pomocą wstępnie schłodzonej końcówki o pojemności 1 ml.</li>
		<li>Delikatnie i poziomo wstrząsnąć 6-dołkową płytką, umieścić 6-dołkową płytkę do hodowli w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C na około 1 godzinę, a następnie wykonać następny krok.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po 18-godzinnym trawieniu wyjmij tkankę rąbka strawioną kolagenazą A, pozostaną tylko widoczne małe skupiska i niestrawione tkanki twardówki. 
	UWAGA: Mikroskopia w dużym powiększeniu ujawnia klaster złożony z wielu gęsto upakowanych komórek (w tym LNC).</li>
	<li>Użyj końcówki pipety o pojemności 200 μl, aby odłączyć klastry od niestrawionych tkanek twardówki pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
	<li>Przenieś klastry na 3,5-centymetrową płytkę hodowlaną i zanurz je w 0,25% TE, a następnie umieść płytkę w inkubatorze komórkowym na 15 minut.</li>
	<li>Dodaj 1 ml MESCM z 10% serum nokautującym, aby zatrzymać trawienie komórek i delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby ponownie zawiesić klastry w pojedynczych komórkach za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek do probówki odśrodkowej o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant, nie zakłócając wytrącania się komórek, a następnie dodać 1 ml MESCM w celu ponownego zawieszenia komórek.</li>
	<li>Pipetować w górę i w dół 2-3 razy, aż wytrącanie się dolnej komórki zostanie równomiernie zawieszone w MESCM za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 ml, a następnie pobrać 20 μl zawiesiny komórek do liczenia komórek.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek na 6-dołkową płytkę pokrytą 5% membraną podstawną z końcówką pipety o pojemności 1 ml i zwiększyć objętość MESCM do 2,5 ml.</li>
	<li>Delikatnie potrząśnij płytką 6-dołkową poziomo, aby równomiernie rozprowadzić komórki.</li>
	<li>Przenieść komórki do inkubatora hodowli po ich zobrazowaniu i zarejestrowaniu. Obserwuj i fotografuj komórki codziennie i zmieniaj podłoże co 3-4 dni.</li>
</ol>
2. Identyfikacja LNC
<ol>
	<li>Barwienie immunofluorescencyjne
	<ol>
		<li>Roztwory LNC należy roztrawić od spodu płytki przy użyciu 1 ml 0,25% TE przez 5 minut w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37°C.</li>
		<li>Zakończyć trawienie przez dodanie 1 ml MESCM (zawierającego surowicę wykaującą), odwirować zawiesinę komórkową o sile 200 x g przez 5 minut i ostrożnie odessać supernatant.</li>
		<li>Dodać 1 ml MESCM w celu ponownego zawieszenia komórek w zawiesinie. Przygotować zawiesinę komórek o objętości 80 μl (4 ×10 3 komórki na szkiełko) na 4 szkiełka (20 μl/szkiełko) i za pomocą systemu wirówkowego umieścić komórki na szkiełkach mikroskopowych zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Utrwal komórki (przyklejone do szkiełek w kroku 3) za pomocą 4% paraformaldehydu przez około 10 minut, a następnie przeniknij komórki na szkiełkach 0,2% Triton X-100 w PBS przez 15 minut.</li>
		<li>Zablokuj komórki na 1 godzinę za pomocą 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) przed inkubacją z pierwszorzędowymi przeciwciałami (Pan-CK [1:1000], Vim [1:100], CD90 [1:100], CD105 [1:200], SCF [1:100], PDGFRβ [1:100]) na wytrząsarce przez noc w temperaturze 4 °C. Po inkubacji usunąć niezwiązane przeciwciała pierwszorzędowe, przemłukując (5 min/płukanie, 3x) szkiełka PBST (PBS + 0,1% Tween 20).</li>
		<li>Inkubować odpowiednie przeciwciała drugorzędowe (przeciwciało drugorzędowe przeciwko mysim IgG u osła TRITC [1:1000], przeciwciało anty-królicze IgG FITC [1:500], przeciwciała anty-mysie osła IgG 488 [1:300], przeciwciała anty-królicze IgG osła 594 [1:400]) przez 1 godzinę z odpowiednimi niespecyficznymi przeciwciałami IgG IgG. Usunąć niezwiązane przeciwciało drugorzędowe za pomocą PBST (5 min/pranie, 3x).</li>
		<li>Wybarwić jądra przeciwtleowo za pomocą 5 μg/ml DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenyloindol) i uszczelnić szkiełka.</li>
		<li>Obrazowanie fluorescencyjne należy wykonać za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (powiększenie: 400x; Czas naświetlania: 50 ms).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR)
	<ol>
		<li>Weź zestaw do izolacji RNA, aby wyekstrahować całkowite RNA zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Użyj zestawu do transkrypcji cDNA o dużej pojemności, aby odwrócić transkrypcję 1-2 μg całkowitego RNA na cDNA.</li>
		<li>Przeprowadzić odwrotną transkrypcję (42 °C, 2 min; 50 °C, 85 min) i qPCR (95 °C, 5 min; 95 °C, 10 s, 40 cykli) w 20 μl roztworze zawierającym cDNA (100 ng), mieszankę do oznaczania ekspresji genów TaqMan (1 μL), uniwersalną mieszankę Mastera PCR (10 μL) i ddH2O (do 20 μL).</li>
		<li>Użyj techniki porównawczej CT (ΔΔCT)4,9, aby zbadać względną ekspresję genów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Charakterystyka LNC
<ol>
	<li>Zliczanie komórek (hemocytometr)
	<ol>
		<li>Roztwory LNC należy roztrawić od spodu płytki przy użyciu 0,25% TE przez 5 minut w inkubatorze komórkowym o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Zakończyć trawienie przez dodanie 1 ml MESCM (zawierającego surowicę wykaującą), odwirować zawiesinę komórkową o sile 200 x g przez 5 minut i ostrożnie odessać supernatant.</li>
		<li>Dodać 1 ml MESCM w celu ponownego zawieszenia komórek, a następnie pobrać 10 μl zawiesiny komórek do probówki wirówkowej o pojemności 0,5 ml. Dodać równą objętość 0,4% roztworu barwiącego błękit trypanowy.</li>
		<li>Umieścić 10 μl barwionej zawiesiny komórek na obszarze liczenia hemocytometru i przykryć go szkiełkiem nakrywkowym do liczenia. 
		UWAGA: Liczba komórek w pięciu środkowych obszarach kwadratu jest zdefiniowana jako "A"; liczbę komórek w 1 ml oblicza się jako 5A × 104 × 2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Badanie markerów LNC i BMMSC za pomocą cytometrii przepływowej15
	<ol>
		<li>Wykryj ekspresję SCF, CD73, CD90 i CD105 w LNC i BMMSC za pomocą cytometrii przepływowej15 (2-4 × 106 zdarzeń / próbkę, z każdej z próbek uzyskano 2 000 komórek, co daje łącznie 550 000 komórek, które były bramkowane jednocześnie).</li>
		<li>Zebrać i wybarwić komórki w temperaturze 20-30 °C przez 15 minut w buforze blokującym (3% BSA i 0,05% Tween-20 w PBS) przy użyciu wstępnie znakowanych przeciwciał (SCF [1:50], CD70 [1:50], CD90 [1:50] i CD105 [1:50]) zgodnie z instrukcjami zestawu.</li>
		<li>Wykonaj analizę sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) za pomocą cytometru przepływowego. W pracy wykorzystano oprogramowanie FACS Diva oraz oprogramowanie FlowJo. Dla każdej próbki zarejestruj 10 000 zdarzeń oraz przeanalizuj aktywne komórki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

A Protocol to Isolate, Culture, and Identify Human Limbal Niche Cells

<ol><li>Le, Q., Xu, J., Deng, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnosis+of+limbal+stem+cell+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">The diagnosis of limbal stem cell deficiency.</a> Ocular Surface. 16 (1), 58-69 (2018).</li>
<li>Polisetty, N., Fatima, A., Madhira, S. L., Sangwan, V. S., Vemuganti, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+cells+from+limbal+stroma+of+human+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye.</a> Molecular Vision. 14, 431-442 (2008).</li>
<li>Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+human+limbal+stromal+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of human limbal stromal niche cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 279-286 (2012).</li>
<li>Li, G. G., Zhu, Y. T., Xie, H. T., Chen, S. Y., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+limbal+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells derived from human limbal niche cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5686-5697 (2012).</li>
<li>Li, G. G., Chen, S. Y., Xie, H. T., Zhu, Y. T., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+potential+of+human+limbal+stromal+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis potential of human limbal stromal niche cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3357-3367 (2012).</li>
<li>Hu, W., Zhang, Y., Tighe, S., Zhu, Y. T., Li, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+isolation+method+of+human+lacrimal+canaliculus+epithelial+stem+cells+by+maintaining+close+association+with+their+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A new isolation method of human lacrimal canaliculus epithelial stem cells by maintaining close association with their niche cells.</a> International Journal of Medical Sciences. 15 (12), 1260-1267 (2018).</li>
<li>Kumar, A., Xu, Y., Yang, E., Du, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stemness+and+regenerative+potential+of+corneal+stromal+stem+cells+and+their+secretome+after+long-term+storage%3A+Implications+for+ocular+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Stemness and regenerative potential of corneal stromal stem cells and their secretome after long-term storage: Implications for ocular regeneration.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3728-3738 (2018).</li>
<li>Xiao, Y. T., Qu, J. Y., Xie, H. T., Zhang, M. C., Zhao, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+methods+for+isolation+of+limbal+niche+cells%3A+Maintenance+of+limbal+epithelial+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A comparison of methods for isolation of limbal niche cells: Maintenance of limbal epithelial stem/progenitor cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (14), 16(2020).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+niche+cells+and+three-dimensional+matrigel-induced+dedifferentiation+of+mature+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Limbal niche cells and three-dimensional matrigel-induced dedifferentiation of mature corneal epithelial cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (5), 1(2022).</li>
<li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+limbal+biopsy-derived+stromal+stem+cells+prevent+corneal+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human limbal biopsy-derived stromal stem cells prevent corneal scarring.</a> Science Translational Medicine. 6 (266), 266ra172(2014).</li>
<li>Acar, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+allogeneic+limbal+mesenchymal+stem+cell+therapy+in+corneal+healing%3A+role+of+administration+route%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of allogeneic limbal mesenchymal stem cell therapy in corneal healing: role of administration route.</a> Ophthalmic Research. 53 (2), 82-89 (2015).</li>
<li>Katikireddy, K. R., Dana, R., Jurkunas, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+potential+of+limbal+fibroblasts+and+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+to+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentiation potential of limbal fibroblasts and bone marrow mesenchymal stem cells to corneal epithelial cells.</a> Stem Cells. 32 (3), 717-729 (2014).</li>
<li>Polisetti, N., Sharaf, L., Reinhard, T., Schlunck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+ex+vivo+expansion+of+limbal+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and ex vivo expansion of limbal mesenchymal stromal cells.</a> Bio-Protocols. 12 (14), e4471(2022).</li>
<li>Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+epithelial+stem%2Fprogenitor+cells+attract+stromal+niche+cells+by+SDF-1%2FCXCR4+signaling+to+prevent+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Limbal epithelial stem/progenitor cells attract stromal niche cells by SDF-1/CXCR4 signaling to prevent differentiation.</a> Stem Cells. 29 (11), 1874-1885 (2011).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+limbal+niche+cells+are+a+powerful+regenerative+source+for+the+prevention+of+limbal+stem+cell+deficiency+in+a+rabbit+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human limbal niche cells are a powerful regenerative source for the prevention of limbal stem cell deficiency in a rabbit model.</a> Scientific Reports. 8, 6566(2018).</li>
<li>Kumar, A., Yun, H., Funderburgh, M. L., Du, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+therapy+for+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+In+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Regenerative therapy for the cornea.</a> Progress In Retinal and Eye Research. 87, 101011(2022).</li>
<li>Pineda, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPineda%2C+R+%22World+Corneal+Blindness.+Foundations+of+Corneal+Disease%22">World Corneal Blindness. Foundations of Corneal Disease</a>. , Springer, Cham. 299-305 (2020).</li>
<li>Zieske, J. D., Guimarães, S. R., Hutcheon, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+keratocyte+proliferation+in+response+to+epithelial+debridement%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement.</a> Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).</li>
<li>Resnikoff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+data+on+visual+impairment+in+the+year+2002%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Global data on visual impairment in the year 2002.</a> Bulletin of the World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).</li>
<li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+bio-engineered+tissue+employing+3D+nanofiber-aerogel+scaffold+to+facilitate+LSCs+growth+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Limbal bio-engineered tissue employing 3D nanofiber-aerogel scaffold to facilitate LSCs growth and migration.</a> Macromolecular Bioscience. 22 (5), e2100441(2022).</li>
<li>Aghamirsalim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+printed+hydrogels+for+ocular+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">3D printed hydrogels for ocular wound healing.</a> Biomedicines. 10 (7), 1562(2022).</li>
<li>Sasamoto, Y., Ksander, B. R., Frank, M. H., Frank, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repairing+the+corneal+epithelium+using+limbal+stem+cells+or+alternative+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Biological+Therapy%22%5BJournal%5D)">Repairing the corneal epithelium using limbal stem cells or alternative cell-based therapies.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 18 (5), 505-513 (2018).</li>
<li>Rohaina, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+limbal+stem+cell+deficient+corneal+surface+with+induced+human+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+on+amniotic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of limbal stem cell deficient corneal surface with induced human bone marrow mesenchymal stem cells on amniotic membrane.</a> Translational Research. 163 (3), 200-210 (2014).</li>
<li>O'Callaghan, A. R., Dziasko, M. A., Sheth-Shah, R., Lewis, M. P., Daniels, J. T. J. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+mucosa+tissue+equivalents+for+the+treatment+of+limbal+stem+cell+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biosystems%22%5BJournal%5D)">Oral mucosa tissue equivalents for the treatment of limbal stem cell deficiency.</a> Advanced Biosystems. 4 (7), e1900265(2020).</li>
<li>Yu, D., Chen, M., Sun, X., Ge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells+into+corneal+epithelial-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Differentiation of mouse induced pluripotent stem cells into corneal epithelial-like cells.</a> Cell Biology International. 37 (1), 87-94 (2013).</li>
<li>Zeppieri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+for+corneal+wound+healing+after+laser-induced+corneal+lesions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells for corneal wound healing after laser-induced corneal lesions in mice.</a> Journal of Clinical Medicine. 6 (12), 115(2017).</li>
<li>Kumar, A., Kumar, V., Rattan, V., Jha, V., Bhattacharyya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretome+cues+modulate+the+neurogenic+potential+of+bone+marrow+and+dental+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Secretome cues modulate the neurogenic potential of bone marrow and dental stem cells.</a> Molecular Neurobiology. 54 (6), 4672-4682 (2017).</li>
<li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+generation+of+multiple+ocular-like+cell+lineages+and+fabrication+of+functional+corneal+epithelial+cell+sheets+from+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Coordinated generation of multiple ocular-like cell lineages and fabrication of functional corneal epithelial cell sheets from human iPS cells.</a> Nature Protocols. 12 (4), 683-696 (2017).</li>
<li>Guo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+niche+cells+are+a+potent+resource+of+adult+mesenchymal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Limbal niche cells are a potent resource of adult mesenchymal progenitors.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3315-3322 (2018).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+expression+between+limbal+niche+progenitors+and+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Differential gene expression between limbal niche progenitors and bone marrow derived mesenchymal stem cells.</a> International Journal of Medical Sciences. 17 (4), 549-557 (2020).</li>
<li>González, S., Deng, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+native+limbal+stromal+cells+increases+the+expansion+efficiency+of+limbal+stem%2Fprogenitor+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Presence of native limbal stromal cells increases the expansion efficiency of limbal stem/progenitor cells in culture.</a> Experimental Eye Research. 116, 169-176 (2013).</li>
<li>Funderburgh, M. L., Du, Y., Mann, M. M., SundarRaj, N., Funderburgh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAX6+expression+identifies+progenitor+cells+for+corneal+keratocytes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">PAX6 expression identifies progenitor cells for corneal keratocytes.</a> FASEB Journal. 19 (10), 1371-1373 (2005).</li>
<li>Funderburgh, J. L., Funderburgh, M. L., Du, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+the+limbal+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Stem cells in the limbal stroma.</a> Ocular Surface. 14 (2), 113-120 (2016).</li>
<li>Chen, S. Y., Hayashida, Y., Chen, M. Y., Xie, H. T., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+isolation+method+of+human+limbal+progenitor+cells+by+maintaining+close+association+with+their+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">A new isolation method of human limbal progenitor cells by maintaining close association with their niche cells.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (5), 537-548 (2011).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+Growing+organoids+from+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: Growing organoids from stem cells.</a> Cell. 161 (7), 1700-1701 (2015).</li>
</ol>

Żaden z autorów nie posiada żadnych istotnych informacji finansowych.

Przezroczystość rogówki jest zwykle utrzymywana przez regularne ułożenie i rozmieszczenie małych włókien (o średnicy 25-30 nm) w zrębie rogówki, co ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej ostrości widzenia16. Na świecie jest 253 miliony osób niedowidzących, z czego 36 milionów to osobyniewidome17. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) uważa ślepotę rogówki za jedno z najpoważniejszych zagrożeń dla ludzkiego wzroku, odpowiadając za 5,1% wszystkich przypadków ślepoty na<sup class=...

Częstość występowania niedoboru komórek macierzystych nabłonka rogówki (CESD), zwanego również niedoborem rąbkowych komórek macierzystych (LSCD)1, oraz regeneracja nabłonka rogówki (CES) stają się coraz bardziej naglące z powodu infekcji i urazów rogówki. Jeśli CESD nie jest odpowiednio leczony, może prowadzić do ślepoty, która wymaga przeszczepu rogówki. W związku z tym rewitalizacja CES staje się coraz bardziej znacząca. Istnieje grupa komórek podporowych zwanych komórkami niszy rąbkowej (LNC), które zapewniają niezbędne wsparcie dla funkcji CES. Komórki macierzyste zrębu rąbka zostały po raz pierwszy wyizolowane przez Polisetty et al.2 i zidentyfikowane przez Xie et al.3 jako LNC, które są zlokalizowane w nabłonku rąbka i zrębie rąbka. LNC są kluczowymi komórkami macierzystymi podtrzymującymi brzeg rogówki, a dzięki funkcji MSC pochodzącego ze szpiku kostnego (BMMSC) mogą być indukowane do rozwoju w komórki nabłonka rogówki i komórki zrębu rogówki itp.3,4,5,6,7. Wcześniejsze badania wykazały, że właściwości komórek macierzystych LNC są bardziej prymitywne niż BMMSCs8, który jest już szeroko stosowany w klinice. LNC mogą nawet stać się kolejną realną opcją po MSC, zwłaszcza w leczeniu CESD. Jako ważne komórki wspierające CES, LNC są również komórkami macierzystymi pochodzącymi z "niszowej" struktury rąbka. LNC mogą odgrywać kluczową rolę w dedyferencjacji dojrzałych komórek nabłonka rogówki (MCEC) do CES9. Jednak badania nad LNC są nadal stosunkowo niewystarczające i nie ma zgody co do terminologii, izolacji, oczyszczania, identyfikacji i charakterystyki LNC. Niektórzy badacze nazwali LNC rąbkowe komórki macierzyste pochodzące z biopsji rąbka10, rąbkowe mezenchymalne komórki macierzyste11, rąbkowe komórki macierzyste fibroblastów12, oraz rąbkowe mezenchymalne komórki zrębowe13. Ponieważ charakterystyka wzrostu LNC nie została szczegółowo opisana, a także ze względu na ich obiecujące zastosowania naukowe i kliniczne, które mogą być jednym z najważniejszych narzędzi klinicznych w przyszłości, konieczne jest podsumowanie izolacji, oczyszczania, identyfikacji i charakterystyki LNC.
Według poprzedniego badania14, LNC występują głównie w nabłonku rąbkowym i zrębie rąbka. Protokół ten obejmuje leczenie tkanki rąbka za pomocą kolagenazy A, uzyskanie klastra składającego się z LEPC i LNC i trawienie go do pojedynczych komórek za pomocą 0,25% trypsyny-EDTA (TE). LNC były następnie selektywnie hodowane w zmodyfikowanym pożywce dla embrionalnych komórek macierzystych (MESCM) w celu oczyszczenia. Protokół opisany w tym artykule jest prosty i ma wysoką skuteczność w pozyskiwaniu ludzkich LNC w dużych ilościach.
Szczegółowa procedura izolacji, hodowli i identyfikacji LNC została nagrana w filmie dla naukowców, którzy są zainteresowani badaniem LNC, i może być wygodnie powtarzana w razie potrzeby.

<table><tbody><tr><td>4',6-diamidyno-2-fenyloindol</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>5&mu; g/ml</td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Sigma</td><td>V900919</td><td>1,25 &m; g / ml</td></tr><tr><td>anty-CD73</td><td>Abcam</td><td>ab202122</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>MERCK</td><td>A1933-CD105</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Proteintech</td><td>67075-1-IG</td><td>1:200</td></tr><tr><td>CD105</td><td>Abcam</td><td>AB114052</td><td>1:50</td></tr><tr><td>CD90</td><td>Proteintech</td><td>66766-1-IG</td><td>1:100</td></tr><tr><td>CD90</td><td>Abcam</td><td>ab307736</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Inkubator komórkowy</td><td>Shanghai Lishen</td><td>K1119K4644</td><td>HF90(HT)</td></tr><tr><td>System wirówek</td><td>StatSpin&nbsp;</td><td>StatSpin CytoFuge</td><td></td> 12-Collagenase</tr> <tr><td>A</td><td>Roche</td><td>10103578001</td><td>2 mg/ml</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>LSM700-Płytka</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>hodowlana virya</td><td>3500356</td><td>35 mm</td></tr><tr><td>DME/F-12 1:1 (1x)&nbsp;</td><td>cytiva</td><td>SH30023.01</td><td>90%</td></tr> <tr><td>Przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) ThermoFisher</td><td></td><td>A16016</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-królicze IgG (H+L) Przeciwciało wtórne</td><td>ThermoFisher</td><td>31568</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>FACS Diva sofware</td><td>BD Biosciences</td><td>Drzewo Cytometr z</td><td></td></tr> <tr><td>przepływem</td> gwiazdowym <td>BD Biosciences</td><td>Becton Dickinson LSRII</td><td>-</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>olympus</td><td>cx31&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Sigma</td><td>G1914</td><td>50 &mu; hemocytometr g/ml</td></tr><tr><td></td><td>MERCK</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do transkrypcji cDNA o dużej pojemności</td><td>Bright-Line ThermoFisher</td><td>4374966</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop z odwróconym kontrastem fazowym</td><td>&nbsp; UOP</td><td>DSZ2000X</td><td></td></tr><tr><td>ITS (insulina, transferyna, selenin sodu)</td><td>Sigma</td><td>I3146</td><td>5 &mu; g/ml insuliny, 5 &mu; g / ml transferyny, 5 ng / ml seleninu sodu</td></tr><tr><td>KnockOut SR Zamiennik surowicy dla ESC/iPSC</td><td>gibco</td><td>10828-028</td><td>10%</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BioCoat</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>356234-Pan-CK</td><td>Abcam</td><td>ab7753</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>NoninBio</td><td>NBS0135</td><td>4,00%</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>MKBio</td><td>MM-1505</td><td>4%</td></tr><tr><td>PDGFR&beta;</td><td>Abclonal</td><td>A1444</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Ilościowy przyrząd do fluorescencji PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Applied Biosystems</td><td>Step One</td><td></td></tr> <tr><td>Plus-Rekombinowany ludzki FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>4 ng / ml</td></tr><tr><td>Współistniejący czynnik hamujący ludzką białaczkę (Lif)</td> <td>Peprotech</td><td>300-05</td><td>10 ng / ml</td></tr><tr><td>RNeasy Mini zestaw do izolacji RNA</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>-</td></tr><tr><td>SCF</td><td>Bioss</td><td>bs-0545R</td><td>1:100</td></tr><tr><td>SCF</td><td>Abcam</td><td>ab52603</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>ZEISS</td><td>SteREO Discovery. V8</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne chirurgiczne okrągłe ostrze</td><td>Careforde</td><td>29500</td><td>rozmiar 10</td></tr><tr><td>Test ekspresji genów TaqMan Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4448489</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>MERCK</td><td>X100</td><td>0,20%</td></tr> <tr><td>Trypan niebieski</td><td>ThermoFisher</td><td>15250061</td><td>0,40%</td></tr> <tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Genview</td><td>GP3108</td><td>0,25%</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>MERCK</td><td>P9416-Ultra</td><td></td></tr> <tr><td>Clean Bench</td><td>LaiTe</td><td>LT20200705</td><td>SW-CJ-IFDG</td></tr><tr><td>Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>Vim&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab92547</td><td>1:100</td></tr></tbody></table>

izolacja i identyfikacja komórek niszy rąbka ramiennego

Isolation and Identification of Limbal Niche Cells

Tutaj przedstawiamy standardową procedurę izolacji i identyfikacji komórek niszy rąbkowej (LNC). Do izolacji LNC wykorzystano tkankę rąbka włoska pozyskaną z banku oka. Tkankę podzielono na 12 części w warunkach aseptycznych i trawiono przez 18 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych przy użyciu kolagenazy A w celu uzyskania klastrów komórek z LNC i komórkami progenitorowymi nabłonka rąbka. Klastry komórek były dalej trawione przez 15 minut w temperaturze 37 °C przy użyciu 0,25% trypsyny-EDTA w celu uzyskania pojedynczych komórek, a następnie hodowane w zmodyfikowanej pożywce dla embrionalnych komórek macierzystych (MESCM) na powierzchni z tworzywa sztucznego pokrytej 5% Matrigelem. Komórki pasażowano po 70% konfluencji, a LNC zidentyfikowano za pomocą immunofluorescencji, ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) i cytometrii przepływowej. Pierwotne LNC były izolowane i pasażowane więcej niż 12 razy. Aktywność proliferacyjna LNC od P4 do P6 była największa. LNC wykazywały wyższą ekspresję markerów komórek macierzystych niż BMMSC (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR i PDGFRβ). Ponadto wyniki wykazały, że LNC P4 jednolicie eksprymują VIM, CD90, CD105 i PDGFRβ, ale nie Pan-CK, który można wykorzystać jako marker do identyfikacji LNC. Analiza cytometryczna przepływowa wykazała, że około 95%, 97%, 92% i 11% LNC wyrażało odpowiednio CD73, CD90, CD105 i SCF, podczas gdy wynosiły 68%, 99%, 20%. i 3% w BMMSC. Standardowy proces izolacji i identyfikacji LNC może stanowić wiarygodną podstawę laboratoryjną dla powszechnego stosowania LNC.

Wzrost LNC 
Komórki LNC zostały skutecznie wyizolowane zgodnie z metodą trawienia tkanki brzegu rogówkowo-twardówkowego kolagenazą A (2 mg/mL), opisaną powyżej (Rysunek 1). Zgodnie z wcześniej opublikowanym badaniem3, po trawieniu kolagenazą A pod mikroskopem zaobserwowano skupiska przypominające gąsienice (Rysunek 2). Proporcja komórek wrzecionowatych stopniowo zwiększała się wraz z pasażowaniem komórek. Komórki o ksz...

Tutaj prezentujemy protokół do izolacji i identyfikacji ludzkich komórek niszy rąbkowej.

Izolacja i identyfikacja komórek niszy rąbka ramiennego

Here we report a standard procedure for the isolation and identification of limbal niche cells (LNCs). Limbus tissue obtained from an eye bank was used ...

Nasze badania koncentrują się na rekonstrukcji potrzeb rąbka w celu leczenia niedoboru rąbków komórek macierzystych oraz przywrócenia wzroku pacjenta. Próbujemy odpowiedzieć na pytanie, czy rąbkowe komórki macierzyste są kluczowymi komórkami wspierającymi funkcję rąbkowych komórek macierzystych, a jeśli tak, to jak to działa. Ostatnie badania wykazały, że łączący przeszczep mezenchymalnych komórek macierzystych ze szpiku kostnego zapobiegał niedoborowi rąbkowych komórek macierzystych w żywych poparzonych oczach.Jedną z technologii wykorzystywanych obecnie do rozwoju naszych badań technologicznych jest sekwencjonowanie pojedynczych komórek, które może analizować kluczowe działania szlaku sygnałowego na poziomie pojedynczej komórki w celu scharakteryzowania rąbkowych komórek macierzystych. Chociaż RNC mają potencjał, aby stać się ważnym narzędziem klinicznym w przyszłości, ich charakterystyka wzrostu nie została szczegółowo zbadana. Biorąc pod uwagę ich obiecujące zastosowania naukowe i kliniczne, konieczne jest podsumowanie izolacji, oczyszczania, identyfikacji i charakterystyki RNC.Wykonaj izolację komórek niszy rąbka (LNC) podczas pracy w sterylnych warunkach na ultra czystym stole warsztatowym. Pobrać tkankę rąbka z pożywki do przechowywania rogówki w okresie pośrednim. Za pomocą sterylnego okrągłego ostrza chirurgicznego zeskrob i usuń tęczówkę i śródbłonek wokół rogówki.Następnie sterylnym okrągłym ostrzem chirurgicznym pokrój tkankę rąbka na 12 równych kawałków, pozostawiając tylko jeden milimetr tkanki po obu stronach rogówki i twardówki. Następnie przenieś 12 kawałków tkanki rąbka na 35-milimetrową płytkę hodowlaną i dodaj jeden mililitr kolagenazy A, aby całkowicie zanurzyć tkanki w płytce. Trawić tkanki, inkubując płytkę hodowlaną w inkubatorze komórkowym o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 18 godzin.Rozmrozić żel matrycowy lub macierz błony podstawnej w lodówce ustawionej na cztery stopnie Celsjusza. Przygotuj wysterylizowaną torbę zawierającą 200 mikrolitrów i jeden mililitr końcówek, 15-mililitrową probówkę wirówkową i sześciodołkową płytkę i umieść worek w temperaturze minus 20 lub minus 80 stopni Celsjusza na 20 minut. Po wyjęciu końcówek, probówki wirówkowej i sześciodołkowej płytki z agregatu chłodniczego, przystąp do wykonywania kolejnych kroków na ultra czystym stole warsztatowym.Za pomocą wstępnie schłodzonej końcówki o pojemności 200 mikrolitrów odpipetuj 50 mikrolitrów rozmrożonej matrycy membrany podstawnej do jednego mililitra MESCM i delikatnie wymieszaj. Używając wstępnie schłodzonej końcówki o pojemności jednego mililitra umieszczonej w pipecie, przenieś powstałą 5% matrycę membrany podstawnej do pojedynczego dołka wstępnie schłodzonej sześciodołkowej płytki hodowlanej. Delikatnie potrząśnij sześciodołkową płytką poziomo przed umieszczeniem jej w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na około godzinę, aby przygotować płytkę hodowlaną pokrytą 5% matrygelem.Po 18-godzinnym trawieniu pobierz strawioną kolagenazę A tkankę rąbkową, w większości zawierającą małe widoczne skupiska. Pracując pod mikroskopem stereoskopowym, użyj końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby odłączyć klastry od niestrawionych tkanek twardówki. Zanurz oderwane klastry w 0,25% trypsyny EDTA na 35-milimetrowej płytce hodowlanej i inkubuj płytkę przez 15 minut.Następnie dodaj jeden mililitr MESCM z 10% serum nokautującego na płytkę, aby ugasić trawienie komórek. Delikatnie pipetować zawiesinę w górę i w dół za pomocą jednomililitrowej końcówki pipety, aby rozbić klastry na pojedyncze komórki. Przenieś zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i odwiruj ją w temperaturze 200G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Nie naruszając osadu komórkowego, ostrożnie usunąć supernatant i dodać jeden mililitr MESCM w celu ponownego zawieszenia komórek. Używając jednomililitrowej końcówki do pipety, pipetuj zawartość w górę iw dół dwa do trzech razy, aby upewnić się, że cała osadka jest ponownie zawieszona w MESCM, zbierz 20 mikrolitrów z zawiesiny do zliczenia komórek. Następnie, za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra, przenieś zawiesinę komórek na 5% płytkę sześciodołkową pokrytą matrycą membrany podstawnej, dodaj MESCM, aby całkowita objętość w studzience wynosiła 2,5 mililitra, delikatnie potrząśnij sześciodołkową płytką w poziomie, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek.Po zobrazowaniu komórek przenieś je do inkubatora do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zademonstrowany protokół z powodzeniem trawił tkankę brzegu rogówki i twardówki, generując skupiska, które można było uwidocznić pod mikroskopem. Zgodnie z przewidywaniami, grona przypominały kształtem gąsienicę.Pierwotne LNC rosły powoli i wymagały około 12 dni na hodowlę. LNC od pierwszego do ósmego przejścia potrzebowały około trzech dni na przejście, ale tempo wzrostu LNC po przejściu dziewiątym znacznie spadło. Morfologicznie LNC miały kształt wrzeciona i były okrągłe w przejściu zero.Po przejściu trzecim miały one kształt wrzeciona o jednakowych rozmiarach. Liczba podwojeń komórek, czyli NCD, reprezentowała tempo wzrostu LNC. Krzywe NCD i akumulatywne NCD ujawniły, że LNC rosły najszybciej od pasażu trzeciego do pasażu piątego.Aby zidentyfikować komórki niszy rąbka rąbka lub LNC przez barwienie immunofluorescencyjne, dodaj jeden mililitr 0,25% trypsyny EDTA na studzienkę do LNC hodowanych na 5% pokrytej matryżelem sześciodołkowej płytce, trawić komórki, inkubując płytkę przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Ugasić trawienie, dodając jeden mililitr surowicy nokautującej zawierającej MESCM do zawiesiny komórkowej. Przenieś zawiesinę komórek do probówki wirówkowej i odwiruj ją w temperaturze 200G przez pięć minut, a następnie ostrożnie zasysaj supernatant, ponownie zawieś osad w jednym mililitrze MESCM.Następnie, za pomocą cytofugi, nałóż 80 mikrolitrów zawiesiny komórek równomiernie na cztery szkiełka mikroskopowe zgodnie z instrukcją producenta. Napraw komórki 4% paraformaldehydem przez około 10 minut. Następnie przepuszczaj komórki na szkiełkach za pomocą 0,2%Triton X 100 i PBS przez 15 minut.Zablokuj komórki 2% albuminą surowicy bydlęcej na godzinę przed inkubacją z przeciwciałami pierwszorzędowymi na wytrząsarce przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji usunąć niezwiązane przeciwciała, przemłukując szkiełka PBST trzy razy przez pięć minut każde. Następnie należy inkubować próbkę z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę przed przemyciem wszelkich niezwiązanych przeciwciał, jak wykazano wcześniej.Przeciwbarwić jądra za pomocą DAPI o stężeniu pięciu mikrogramów na mililitr. Po uszczelnieniu szkiełek należy wykonać obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Za pomocą zestawu do izolacji RNA wyekstrahuj całkowite RNA z LNC zgodnie z instrukcjami producenta.Następnie, używając komplementarnego DNA o dużej pojemności lub zestawu do transkrypcji CDNA, dokonaj odwrotnej transkrypcji od jednego do dwóch mikrogramów RNA. Przygotuj 20 mikrolitrów roztworu zawierającego 2,5 mikrolitra CDNA, 0,8 mikrolitra odpowiedniego startera genetycznego, 10 mikrolitrów uniwersalnej mieszanki wzorcowej PCR i 6,7 mikrolitra podwójnie destylowanej wody. Następnie należy przeprowadzić ilościową reakcję łańcuchową polimerazy w odpowiednich warunkach.Na koniec zastosuj porównawczą technikę CT, aby zbadać względną ekspresję genów. Podwójne barwienie immunologiczne LNC czwartego pasażu wyraźnie ujawniło, że komórki te były konsekwentnie panCK ujemne, Vim dodatnie, CD90 dodatnie, CD105 dodatnie, SCF dodatnie i PDGFR dodatnie.

isolation-and-identification-of-limbal-niche-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Przedstawiamy technikę wytwarzania mikrokieszeni w membranach elektroprzędzonych, w których można badać zachowanie komórek. W szczególności opisujemy połączenie mikrostereolitografii i elektroprzędzenia w celu produkcji urządzeń z biomateriału rogówki PLGA (poli(laktyd-ko-glikolid)) wyposażonych w mikrocechy.

Połączenie mikrostereolitografii i elektroprzędzenia w celu wytworzenia membran wyposażonych we wnęki do regeneracji rogówki

W tym artykule opisujemy zasady projektowania i przeprowadzania wielokolorowego eksperymentu z wykorzystaniem myszy R26R-Confetti. Zapewniamy specjalny protokół śledzenia komórek nabłonka rogówki, który można modyfikować pod kątem innych interesujących tkanek.

Metoda śledzenia linii komórek rogówki przy użyciu wielokolorowych fluorescencyjnych myszy reporterowych

Przykład terapii genowej adenowirusa w ludzkich rogówkach z hodowlą narządów cukrzycowych jest przedstawiony w kierunku normalizacji opóźnionego gojenia się ran i znacznie zmniejszonej ekspresji markerów nabłonkowych komórek macierzystych w tych rogówkach. Opisano również optymalizację tego procesu w kulturach nabłonka rąbka włokanego wzbogaconych komórkami macierzystymi.

Adenowirusowa terapia genowa w keratopatii cukrzycowej: wpływ na gojenie się ran i ekspresję markerów komórek macierzystych w rogówkach i komórkach nabłonka rąbka ludzkiego hodowanych w narządach

Poniższy artykuł przedstawia łatwą, powtarzalną technikę skutecznego tworzenia trwałego mysiego modelu niedoboru rąbków komórek macierzystych (LSCD). Ten model zwierzęcy jest przydatny w testowaniu i porównywaniu skuteczności leczenia chorób rąbkowych komórek macierzystych.

Prosta mechaniczna procedura powodująca niedobór rąbkowych komórek macierzystych u myszy

Odsłonięta normalna powierzchnia oka składa się z rogówki i spojówki. Komórki nabłonkowe, komórki kubkowe i komórki odpornościowe są obecne w spojówce. W tym miejscu opisano nieinwazyjną technikę cytologii wyciskowej z wykorzystaniem urządzenia do cytologii wyciskowej i cytometrii przepływowej do analizy komórek odpornościowych w spojówce.

Nieinwazyjny sposób izolowania i fenotypowania komórek ze spojówki

Ten protokół wprowadza prostą dwuetapową metodę różnicowania komórek macierzystych nabłonka rąbka rogówki od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach hodowli wolnej od kseno- i komórek karmiących. Przedstawione tu metody hodowli komórkowych umożliwiają opłacalną produkcję na dużą skalę komórek o jakości klinicznej, mających zastosowanie w terapii komórkami rogówki.

Wydajne i skalowalne ukierunkowane różnicowanie klinicznie kompatybilnych komórek macierzystych nabłonka rąbka rogówki od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Gruczoł łzowy (LG) ma dwa typy komórek wyrażających aktynę α mięśni gładkich (αSMA): komórki mioepitelialne (MEC) i perycyty. MEC są pochodzenia ektodermalnego, znajdują się w wielu tkankach gruczołowych, podczas gdy perycyty to komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych pochodzenia endodermalnego. Protokół ten izoluje MEC i perycyty od mysich LG.

Izolacja komórek mioepitelialnych z dorosłych mysich gruczołów łzowych i podżuchwowych

Prezentowany tutaj jest protokół izolacji i amplifikacji tlenowych i fakultatywnych beztlenowych mysich bakterii komensalnych spojówek przy użyciu unikalnego wymazu z oka i etapu wzbogacania opartego na hodowli z późniejszą identyfikacją za pomocą metod mikrobiologicznych i spektrometrii mas MALDI-TOF.

Izolacja komensalna spojówek i identyfikacja u myszy

Ten protokół opisuje metodę wywoływania dokładnego i powtarzalnego uszkodzenia rogówki i rąbków w modelu mysim. Protokół jest korzystny, ponieważ pozwala na równomierne rozłożenie uszkodzenia silnie zakrzywionej rogówki i rąbka myszy.

Indukcja alkaliów rogówki i rąbka za pomocą techniki stempla i trepanacji w modelu mysim

Opracowaliśmy szczurzy model ciężkiego zapalenia rogówki poprzez łyżeczkowanie nabłonka rogówki w połączeniu ze szwami rogówkowymi. W badaniu oceniano wzorce zapalenia rogówki, proliferację nabłonka i zmiany w rąbkowych komórkach macierzystych w stanach zapalnych.

Ustalenie modelu ciężkiego zapalenia rogówki u szczurów na podstawie łyżeczkowania nabłonka rogówki w połączeniu ze szwami rogówkowymi

Przedstawiamy tutaj protokół umożliwiający uzyskanie wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek z całych rogówek myszy poprzez sekwencyjne trawienie kolagenazą A i trypsyną. Metoda ta daje żywotne pojedyncze komórki o wysokiej integralności RNA, co sprawia, że są kompatybilne z dalszymi zastosowaniami, takimi jak sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek czy cytometrprzepływowy y.

Protokół do pobierania zawiesiny jednokomórkowej z rogówek myszy

Poznaj metodę izolacji i identyfikacji komórek niszy rąbka ramiennego człowieka wykorzystującą sekwencjonowanie pojedynczych komórek. Technika ta wspiera badania nad regeneracją rogówki i leczeniem niedoboru komórek macierzystych.

Izolacja i identyfikacja komórek niszy rąbka ramiennego

Przeglądaj więcej filmów