Izolacja i identyfikacja komórek niszy rąbka ramiennego

Nasze badania koncentrują się na rekonstrukcji potrzeb rąbka w celu leczenia niedoboru rąbków komórek macierzystych oraz przywrócenia wzroku pacjenta. Próbujemy odpowiedzieć na pytanie, czy rąbkowe komórki macierzyste są kluczowymi komórkami wspierającymi funkcję rąbkowych komórek macierzystych, a jeśli tak, to jak to działa. Ostatnie badania wykazały, że łączący przeszczep mezenchymalnych komórek macierzystych ze szpiku kostnego zapobiegał niedoborowi rąbkowych komórek macierzystych w żywych poparzonych oczach.

Jedną z technologii wykorzystywanych obecnie do rozwoju naszych badań technologicznych jest sekwencjonowanie pojedynczych komórek, które może analizować kluczowe działania szlaku sygnałowego na poziomie pojedynczej komórki w celu scharakteryzowania rąbkowych komórek macierzystych. Chociaż RNC mają potencjał, aby stać się ważnym narzędziem klinicznym w przyszłości, ich charakterystyka wzrostu nie została szczegółowo zbadana. Biorąc pod uwagę ich obiecujące zastosowania naukowe i kliniczne, konieczne jest podsumowanie izolacji, oczyszczania, identyfikacji i charakterystyki RNC.

Wykonaj izolację komórek niszy rąbka (LNC) podczas pracy w sterylnych warunkach na ultra czystym stole warsztatowym. Pobrać tkankę rąbka z pożywki do przechowywania rogówki w okresie pośrednim. Za pomocą sterylnego okrągłego ostrza chirurgicznego zeskrob i usuń tęczówkę i śródbłonek wokół rogówki.

Następnie sterylnym okrągłym ostrzem chirurgicznym pokrój tkankę rąbka na 12 równych kawałków, pozostawiając tylko jeden milimetr tkanki po obu stronach rogówki i twardówki. Następnie przenieś 12 kawałków tkanki rąbka na 35-milimetrową płytkę hodowlaną i dodaj jeden mililitr kolagenazy A, aby całkowicie zanurzyć tkanki w płytce. Trawić tkanki, inkubując płytkę hodowlaną w inkubatorze komórkowym o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 18 godzin.

Rozmrozić żel matrycowy lub macierz błony podstawnej w lodówce ustawionej na cztery stopnie Celsjusza. Przygotuj wysterylizowaną torbę zawierającą 200 mikrolitrów i jeden mililitr końcówek, 15-mililitrową probówkę wirówkową i sześciodołkową płytkę i umieść worek w temperaturze minus 20 lub minus 80 stopni Celsjusza na 20 minut. Po wyjęciu końcówek, probówki wirówkowej i sześciodołkowej płytki z agregatu chłodniczego, przystąp do wykonywania kolejnych kroków na ultra czystym stole warsztatowym.

Za pomocą wstępnie schłodzonej końcówki o pojemności 200 mikrolitrów odpipetuj 50 mikrolitrów rozmrożonej matrycy membrany podstawnej do jednego mililitra MESCM i delikatnie wymieszaj. Używając wstępnie schłodzonej końcówki o pojemności jednego mililitra umieszczonej w pipecie, przenieś powstałą 5% matrycę membrany podstawnej do pojedynczego dołka wstępnie schłodzonej sześciodołkowej płytki hodowlanej. Delikatnie potrząśnij sześciodołkową płytką poziomo przed umieszczeniem jej w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na około godzinę, aby przygotować płytkę hodowlaną pokrytą 5% matrygelem.

Po 18-godzinnym trawieniu pobierz strawioną kolagenazę A tkankę rąbkową, w większości zawierającą małe widoczne skupiska. Pracując pod mikroskopem stereoskopowym, użyj końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby odłączyć klastry od niestrawionych tkanek twardówki. Zanurz oderwane klastry w 0,25% trypsyny EDTA na 35-milimetrowej płytce hodowlanej i inkubuj płytkę przez 15 minut.

Następnie dodaj jeden mililitr MESCM z 10% serum nokautującego na płytkę, aby ugasić trawienie komórek. Delikatnie pipetować zawiesinę w górę i w dół za pomocą jednomililitrowej końcówki pipety, aby rozbić klastry na pojedyncze komórki. Przenieś zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i odwiruj ją w temperaturze 200G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Nie naruszając osadu komórkowego, ostrożnie usunąć supernatant i dodać jeden mililitr MESCM w celu ponownego zawieszenia komórek. Używając jednomililitrowej końcówki do pipety, pipetuj zawartość w górę iw dół dwa do trzech razy, aby upewnić się, że cała osadka jest ponownie zawieszona w MESCM, zbierz 20 mikrolitrów z zawiesiny do zliczenia komórek. Następnie, za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra, przenieś zawiesinę komórek na 5% płytkę sześciodołkową pokrytą matrycą membrany podstawnej, dodaj MESCM, aby całkowita objętość w studzience wynosiła 2,5 mililitra, delikatnie potrząśnij sześciodołkową płytką w poziomie, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek.

Po zobrazowaniu komórek przenieś je do inkubatora do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zademonstrowany protokół z powodzeniem trawił tkankę brzegu rogówki i twardówki, generując skupiska, które można było uwidocznić pod mikroskopem. Zgodnie z przewidywaniami, grona przypominały kształtem gąsienicę.

Pierwotne LNC rosły powoli i wymagały około 12 dni na hodowlę. LNC od pierwszego do ósmego przejścia potrzebowały około trzech dni na przejście, ale tempo wzrostu LNC po przejściu dziewiątym znacznie spadło. Morfologicznie LNC miały kształt wrzeciona i były okrągłe w przejściu zero.

Po przejściu trzecim miały one kształt wrzeciona o jednakowych rozmiarach. Liczba podwojeń komórek, czyli NCD, reprezentowała tempo wzrostu LNC. Krzywe NCD i akumulatywne NCD ujawniły, że LNC rosły najszybciej od pasażu trzeciego do pasażu piątego.

Aby zidentyfikować komórki niszy rąbka rąbka lub LNC przez barwienie immunofluorescencyjne, dodaj jeden mililitr 0,25% trypsyny EDTA na studzienkę do LNC hodowanych na 5% pokrytej matryżelem sześciodołkowej płytce, trawić komórki, inkubując płytkę przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Ugasić trawienie, dodając jeden mililitr surowicy nokautującej zawierającej MESCM do zawiesiny komórkowej. Przenieś zawiesinę komórek do probówki wirówkowej i odwiruj ją w temperaturze 200G przez pięć minut, a następnie ostrożnie zasysaj supernatant, ponownie zawieś osad w jednym mililitrze MESCM.

Następnie, za pomocą cytofugi, nałóż 80 mikrolitrów zawiesiny komórek równomiernie na cztery szkiełka mikroskopowe zgodnie z instrukcją producenta. Napraw komórki 4% paraformaldehydem przez około 10 minut. Następnie przepuszczaj komórki na szkiełkach za pomocą 0,2%Triton X 100 i PBS przez 15 minut.

Zablokuj komórki 2% albuminą surowicy bydlęcej na godzinę przed inkubacją z przeciwciałami pierwszorzędowymi na wytrząsarce przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji usunąć niezwiązane przeciwciała, przemłukując szkiełka PBST trzy razy przez pięć minut każde. Następnie należy inkubować próbkę z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę przed przemyciem wszelkich niezwiązanych przeciwciał, jak wykazano wcześniej.

Przeciwbarwić jądra za pomocą DAPI o stężeniu pięciu mikrogramów na mililitr. Po uszczelnieniu szkiełek należy wykonać obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Za pomocą zestawu do izolacji RNA wyekstrahuj całkowite RNA z LNC zgodnie z instrukcjami producenta.

Następnie, używając komplementarnego DNA o dużej pojemności lub zestawu do transkrypcji CDNA, dokonaj odwrotnej transkrypcji od jednego do dwóch mikrogramów RNA. Przygotuj 20 mikrolitrów roztworu zawierającego 2,5 mikrolitra CDNA, 0,8 mikrolitra odpowiedniego startera genetycznego, 10 mikrolitrów uniwersalnej mieszanki wzorcowej PCR i 6,7 mikrolitra podwójnie destylowanej wody. Następnie należy przeprowadzić ilościową reakcję łańcuchową polimerazy w odpowiednich warunkach.

Na koniec zastosuj porównawczą technikę CT, aby zbadać względną ekspresję genów. Podwójne barwienie immunologiczne LNC czwartego pasażu wyraźnie ujawniło, że komórki te były konsekwentnie panCK ujemne, Vim dodatnie, CD90 dodatnie, CD105 dodatnie, SCF dodatnie i PDGFR dodatnie.