Ukierunkowana metabolomika rzadkich komórek pierwotnych

Głównym celem mojego laboratorium jest utrzymanie zdrowego metabolomicznego podciągania komórek macierzystych wraz z wiekiem, aby uniknąć nowotworów hematologicznych, a robimy to poprzez wykonywanie interwencji dietetycznych. Tak więc, w szczególności, jesteśmy zainteresowani zrozumieniem, w jaki sposób metabolity pochodzenia dietetycznego regulują łodygę, a także metabolity wewnątrzkomórkowe, jak regulują los komórek macierzystych. Komórki macierzyste oparte na hemacie są bardzo rzadką subpopulacją, co oznacza, że zawsze stajemy przed wyzwaniem, że nie mamy wystarczającej ilości materiału do przeprowadzenia naszych eksperymentów.

Ale teraz, dzięki ustanowieniu metod jednokomórkowych, a także metod o niskim wkładzie wejściowym, zdobyliśmy nową wiedzę na temat tego, w jaki sposób te komórki macierzyste są regulowane. Hematopoetyczne komórki macierzyste to bardzo rzadka subpopulacja, a na dodatek są bardzo małe. Teraz, dzięki opracowanym przez nas metodom, takim jak na przykład metabolomika o niskich nakładach opartych na specyfikacji masy, możemy teraz wykryć setki metabolitów przy bardzo małej liczbie komórek.

To pozwoliło nam zrozumieć, jaka jest rola niektórych metabolitów w regulacji komórek macierzystych. W przeszłości analiza metabolomiczna rzadkich komórek pierwotnych wymagała wielu myszy oraz dni pracy i przygotowania próbek. Dzięki naszemu nowemu protokołowi potrzebujemy mniej myszy i mniej czasu.

Dodatkowo zmniejszyliśmy liczbę ręcznych kroków, dzięki czemu cały protokół staje się bardziej niezawodny. Na przyszłość zaplanowaliśmy dostosowanie naszego protokołu o niskim nakładzie wejściowym, aby umożliwić dodatkową analizę w rzadkich komórkach pierwotnych, na przykład nieukierunkowaną metabolomikę i lipidomikę. Na początek umieść sitko o wielkości 70 mikronów na 50-mililitrowej probówce wirówkowej i zwilż je PBS.

Po wyizolowaniu śledziony od myszy w celu wytworzenia zawiesiny jednokomórkowej, przepuść śledzionę przez siatkę za pomocą podpórek pod kciuki tłoka strzykawki i 30 mililitrów zimnego PBS. Odwirować filtrat o sile 300 G przez pięć minut i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze buforu do lizy chlorku amonu i potasu i inkubować przez dwie minuty w temperaturze pokojowej.

Po lizie dodaj 50 mililitrów zimnego PBS do probówki. Następnie odwirować i wyrzucić supernatant przed ponownym zawiesieniem osadu w świeżo przygotowanym koktajlu przeciwciał. Przenieść zawiesinę komórek do pięciomililitrowej rurki faksowej i inkubować przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności.

Po inkubacji dodać trzy mililitry zimnego PBS do probówki, a następnie odwirować i wyrzucić supernatant przed ponownym zawiesieniem osadu w jednym mililitrze buforu do re-zawiesiny zimnego faksu. Przefiltruj komórki przez rurkę faksu z nasadką filtra. Na początek dodaj 30 gramów chlorku sodu do sześciu litrów dejonizowanej wody w zbiorniku z płynem osłonowym i potrząśnij zbiornikiem, aby rozpuścić sól.

Następnie podłącz zbiornik do sortera komórek. Włącz sortowanie komórek. Uruchom system fluidyki i poczekaj, aż fluidyka się zrównoważy.

Ustaw opóźnienie upuszczania. Aby przygotować roztwór podstawowy ekstraktu drożdżowego, ponownie zawiesić jedną porcję ekstraktu drożdżowego węgla 13 w 7,5 mililitra ultraczystej wody i 2,5 mililitra metanolu. Następnie, aby przygotować bufor ekstrakcyjny, dodaj 10 mikrolitrów roztworu podstawowego ekstraktu drożdżowego węgla 13 do 10 mililitrów acetonitrylu i dobrze wymieszaj.

Dodać 25 mikrolitrów buforu ekstrakcyjnego do każdego dołka 96-dołkowej płytki PCR i przykryć studzienki pokrywką. Umieść płytkę na sortowniku komórek, aby zebrać posortowane komórki. Sortuj 5 000 zdarzeń z każdej populacji Alexa Fluor 647 dodatnich i PE ujemnych do pierwszych czterech dołków.

Następnie posortuj 5 000 zdarzeń z każdej populacji PE dodatniej i Alexa Fluor 647 ujemnej do następnych czterech dołków. Następnie, w przypadku hematopoetycznych komórek macierzystych, sortuj 5 000 zdarzeń populacji PE-Cy7 o niskim PE dodatnim, APC-Cy7, Brilliant Violet 605 dodatnim i Brilliant Violet 421 ujemnym do pierwszego dołka, a następnie sortuj 5 000 zdarzeń populacji PE-Cy7 low, PE dodatniej, APC-Cy7 dodatniej, Brilliant Violet 421 dodatniej i Brilliant Violet 605 ujemnej do następnego dołka. W przypadku próbek szczątków wybierz zdarzenia zbyt małe, aby reprezentować nienaruszone komórki na podstawie sygnałów rozproszenia do przodu i na boki.

Następnie włącz instrument LC-MS, umieść płytkę próbną w automatycznym samplerze instrumentu. Otwórz oprogramowanie kompatybilne z LC-MS i przygotuj urządzenie do analizy. Uruchomić co najmniej cztery próbki procesowe ślepej próby lub próbki pulowe w celu zrównoważenia kolumny i mieszaniny testowej LC w celu sprawdzenia wydajności chromatograficznej.

Upewnij się, że początkowe i maksymalne ciśnienie wsteczne jest odpowiednio mniejsze niż 150 i 400 barów. Następnie upewnij się, że czasy przechowywania mieszczą się w przedziale jednej minuty. Następnie sprawdź, czy dolina między leucyną a izoleucyną w dodatnim przejściu od 132 do 86 jest mniejsza niż 20% wysokości szczytu.

Na koniec upewnij się, że różnica w czasie przechowywania od AMP do ADP wynosi od 1,5 do 1,9 minuty, a od ADP do ATP od 1,1 do 1,5 minuty. Po potwierdzeniu parametrów eksperymentalnych należy skonfigurować przebieg z ślepą próbą procesu lub próbką puli, aby zminimalizować przenoszenie z mieszanki testów LC, a następnie próbki testowe w kolejności losowej. Sortowanie faksowe umożliwia izolację czystych populacji różnych typów komórek z tej samej zawiesiny komórkowej.

Różnice metaboliczne między typami komórek z tej samej tkanki zostały zachowane za pomocą protokołu CMS komórki faksowej. W przypadku hematopoetycznych komórek macierzystych i multipotencjalnych komórek progenitorowych komórki sześciu myszy musiały wygenerować sześć próbek, co doprowadziło do większej zmienności w każdej grupie w porównaniu z komórkami B i T, które zostały posortowane z tej samej lustrzanej śledziony. Próbki szczątków reprezentujące próbne próby kontrolne procesu wyraźnie oddzielono od próbek zawierających ekstrakty komórkowe.

Mapa cieplna przedstawiająca informacje o względnych poziomach metabolitów w różnych typach komórek jest pokazana tutaj.