Name: Ukierunkowana metabolomika rzadkich komórek pierwotnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Poznaj ukierunkowaną metabolomikę rzadkich komórek pierwotnych, w tym komórek macierzystych krwi. Ta metoda umożliwia ilościowe oznaczanie metabolitów z zaledwie 5000 komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować ośrodku dla zwierząt Instytutu Immunobiologii i Epigenetyki im. Maxa Plancka za dostarczenie zwierząt wykorzystywanych w tym badaniu.

Hodowla i hodowla wszystkich myszy użytych do tego protokołu została przeprowadzona w konwencjonalnym obiekcie dla zwierząt w Instytucie Immunobiologii i Epigenetyki im. Maxa Plancka (MPI-IE) zgodnie z przepisami władz lokalnych (Regierungspräsidium Freiburg). Myszy zostały poddane eutanazji z użyciem CO2 i zwichnięcia szyjki macicy przez personel przeszkolony w ramach FELASA B zgodnie z wytycznymi i przepisami zatwierdzonymi przez komitet ds. dobrostanu zwierząt MPI-IE i władze lokalne. Nie przeprowadzano żadnych eksperymentów na zwierzętach, a myszy były pozbawione obciążeń zdrowotnych.
UWAGA: Wysoce czułe metody analityczne, takie jak metoda LC-MS stosowana w tym protokole, mają potencjał do wykrywania nawet bardzo drobnych zanieczyszczeń w próbce. Dlatego niezwykle ważne jest, aby zminimalizować takie zanieczyszczenia. Najważniejszym środkiem jest noszenie czystych rękawiczek za każdym razem, gdy dotyka się czegokolwiek, co ma kontakt z próbkami. Obejmuje to na przykład przygotowanie i płynu osłonowego, etykietowanie probówek z próbkami oraz czyszczenie sprzętu laboratoryjnego. Ponadto w miarę możliwości należy używać jednorazowych przyborów laboratoryjnych. Naczynia szklane należy przed użyciem spłukać rozpuszczalnikami klasy LC-MS. Czyste środowisko pracy dodatkowo przyczynia się do zmniejszenia zanieczyszczeń.
1. Ogólne przygotowania
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy wzorca wewnętrznego: Przygotować 6 mg/ml chlorofenyloalaniny (CLF) i 6 mg/ml kwasu aminotereftalowego (ATA) w 30% v/v 2-propanolu w ultraczystej wodzie.</li>
	<li>Przygotować bufor do rezaspensji FACS: Dodać 0,9 g NaCl, 99,5 ml ultraczystej wody i 0,5 ml roztworu podstawowego wzorca wewnętrznego. Schłodzić do temperatury 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj płyn osłonowy: W zbiorniku z płynem osłonkowym rozpuść 30 g NaCl w 6 l wody dejonizowanej i podłącz do sortera komórek. 
	UWAGA: Stężenie NaCl w płynie osłonkowym zostało zoptymalizowane, aby umożliwić odchylanie kropel w sortowniku, które jest tak samo wytrzymałe, jak w przypadku stosowania PBS jako płynu osłonkowego, a jednocześnie zminimalizować negatywny wpływ na wykrywanie metabolitów przez LC-MS12. Niższe stężenia NaCl są korzystne dla wykrywania metabolitów, ale pogarszają niezawodne sortowanie komórek.</li>
</ol>
2. Izolacja limfocytów B i T ze śledziony
<ol>
	<li>Wstępnie schłodzić 90 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na mysz w lodówce lub na lodzie do temperatury 4 °C. Wstępnie schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C.</li>
	<li>Izolacja śledziony 
	UWAGA: Szczególnie ważna jest szybka praca, na lodzie i z zimnymi (4 °C) podczas izolacji komórek i następujących etapów barwienia. W przeciwnym razie profil metaboliczny komórek może ulec znacznej zmianie.
	<ol>
		<li>Przygotować 1,5 ml PBS w probówce reakcyjnej o pojemności 2 ml na lodzie.</li>
		<li>Poddaj mysz eutanazji myszy C57BL6/J zgodnie z wytycznymi i metodami zatwierdzonymi przez władze lokalne.</li>
		<li>Sterylizuj futro 70% etanolem.</li>
		<li>Otwórz brzuch nożyczkami i usuń śledzionę za pomocą drobnych kleszczy bez pękania narządu. Natychmiast umieścić śledzionę w zimnym PBS (4 °C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytwarzanie zawiesiny jednokomórkowej
	<ol>
		<li>Umieść sitko o pojemności 70 μm na probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i zwilż je PBS. Przepuścić śledzionę przez siatkę, używając podpórki kciuka tłoka strzykawki i 30 ml zimnego PBS (4 °C)</li>
		<li>Wirować przy 300 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad w 1 ml buforu do lizy ACK i inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej (RT; 20 °C).</li>
		<li>Dodać 50 ml zimnego PBS (4 °C). Wirować przy 300 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie FACS
	<ol>
		<li>Przygotować koktajl przeciwciał w 500 μl zimnego PBS (4 °C) na mysz: CD3-PE (1:200), B220-A647 (1:200).</li>
		<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy w koktajlu przeciwciał. Przenieść do probówki FACS o pojemności 5 ml. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
		<li>Dodać 3 ml zimnego PBS (4 °C). Wirować przy 300 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 1 ml zimnego buforu do sporządzania zawiesiny FACS (4 °C). Przefiltruj komórki przez rurkę FACS z nasadką filtrującą. Komórki są gotowe do sortowania w oparciu o cytometrię przepływową.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Izolacja HSC i MPP od szpiku kostnego
<ol>
	<li>Wypreparuj i wyizoluj szpik kostny. 
	UWAGA: Niezwykle ważne jest, aby pracować szybko i utrzymywać izolowane kości i komórki w niskiej temperaturze (4 °C) podczas całej procedury, aby umożliwić dokładne wyniki. Ponadto, aby zminimalizować sygnały tła, pracuj i korzystaj z czystej przestrzeni i sprzętu laboratoryjnego.
	<ol>
		<li>Eutanazja myszy odbywa się zgodnie z wytycznymi i metodami zatwierdzonymi przez władze lokalne.</li>
		<li>Rozpyl 70% etanolu na dolną część myszy.</li>
		<li>Wypreparuj nogi i kolce za pomocą nożyczek. Wykonaj nacięcie na plecach i przedłuż nacięcie wokół brzucha. Oderwij skórę od tylnych kończyn</li>.
		<li>Rozerwij lub odetnij tylne kończyny i upewnij się, że nogi zawierają kość piszczelową, kość udową i staw biodrowy.</li>
		<li>Weź nożyczki i przytnij je blisko kręgosłupa, aż zostaną całkowicie usunięte.</li>
		<li>Rozłóż nogi i kolce na płytkach 6-dołkowych zawierających zimny PBS (4 °C) i trzymaj płytki na lodzie.</li>
		<li>Oczyść kość udową, piszczel, staw biodrowy i kręgi z tkanek miękkich za pomocą skalpela i nożyczek.</li>
		<li>Oczyszczone kości rozdrobnić moździerzem i tłuczkiem w 5 ml zimnego PBS (4 °C).</li>
		<li>Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o pojemności 40 μm do probówki o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Powtarzaj kroki 3.1.8-3.1.9, aż kości staną się całkowicie białe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Liza erytrocytów:
	<ol>
		<li>Odwirować zebraną zawiesinę komórkową o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 1 ml zimnego buforu ACK (4 °C). Inkubować przez 5 minut na lodzie.</li>
		<li>Dodać zimny PBS (4 °C), aby zatrzymać reakcję (opcjonalnie).</li>
		<li>Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uszczuplenie rodu: 
	UWAGA: Aby wzbogacić komórki ujemne (Lin-) o linii ujemnej, użyto zestawu do selekcji ujemnej dla komórek CD4.
	<ol>
		<li>Przygotuj koraliki magnetyczne:
		<ol>
			<li>Dodaj 500 μl kulek do probówek do mikrowirówek o pojemności 2 ml. Umieść probówki na magnesie i wyrzuć supernatant.</li>
			<li>Przemyć kulki 1 ml zimnego PBS (4 °C) i wyrzucić supernatant.</li>
			<li>Dodać 500 μl zimnego PBS (4 °C) i utrzymywać kulki w chłodzie (4 °C).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Inkubować komórki z 500 μl koktajlu linii (50 μl przeciwciała dostarczonego przez zestaw + 450 μl PBS) przez 25 minut (wstrząsanie, 4 °C) w ciemności.</li>
		<li>Przemyć komórki zimnym PBS (4 °C).</li>
		<li>Odwirować probówkę o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Zawiesić komórki w 1000 μl zimnego PBS (4 °C) i przenieść zawiesinę komórek do roztworu kulek.</li>
		<li>Inkubować przez 15 minut na obracającym się kole w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Umieść rurki na magnesie i poczekaj, aż roztwór się usunie. Przenieść supernatant do świeżej probówki FACS.</li>
		<li>Umyj koraliki 500 μl PBS.</li>
		<li>Umieść rurki na magnesie i poczekaj, aż roztwór się usunie.</li>
		<li>Przenieść supernatant do świeżej probówki FACS.</li>
		<li>Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie dla FACS
	<ol>
		<li>Przygotować 300 μl mieszanki przeciwciał na mysz w zimnym PBS (4 °C).</li>
		<li>Mieszanka przeciwciał dla komórek macierzystych/progenitorowych: HSC: CD4(1:1000)/ CD8a(1:1000)/ B220(1:1000)/ Ter119(1:500)/ Gr-1(1:1000)/ CD11b - PeCy7(1:1000), c-Kit - PE(1:1000), Sca1 - APC-Cy7(1:500), CD48 - BV421(1:1000), CD150 - BV605(1:300)</li>
		<li>Inkubować komórki przez 40 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Umyć 1 ml zimnego PBS (4 °C). Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu do reprodukcji FACS i przefiltrować komórki przez probówkę FACS z nasadką filtrującą.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Sortowanie FACS
<ol>
	<li>Skonfiguruj sortowanie komórek.
	<ol>
		<li>Włóż końcówkę dyszy 70 μm. Aktywuj lasery 405 nm, 488 nm, 561 nm i 633 nm.</li>
		<li>Ustaw tryb sortowania na 4-kierunkową czystość: maska plonu 0, maska czystości 32, maska fazy 0</li>
		<li>Ustaw częstotliwość opadania na 90 400 Hz i dostosuj amplitudę oraz opóźnienie spadku zgodnie z instrukcjami producenta. Ustaw napięcie płyty na 5000 V.</li>
		<li>Zdefiniuj bramki sortujące zgodnie z instrukcjami producenta.
		<ol>
			<li>W przypadku wszystkich typów komórek najpierw wybierz pojedyncze komórki na podstawie sygnału rozproszenia do przodu i sygnału rozproszenia bocznego, a następnie wybierz na podstawie barwienia specyficznego dla typu komórki.</li>
			<li>W przypadku komórek B wybierz populację AF647-dodatnią, PE-ujemną.</li>
			<li>W przypadku limfocytów T wybierz populację PE-dodatnią, AF647-ujemną.</li>
			<li>W przypadku HSC wybierz populację PE-Cy7-niską, PE-dodatnią, APC-Cy7-dodatnią, BV605-dodatnią, BV421-ujemną.</li>
			<li>W przypadku MPP wybierz populację PE-Cy7-niską, PE-dodatnią, APC-Cy7-dodatnią, BV421-dodatnią, BV605-ujemną.</li>
			<li>W przypadku próbek szczątków wybierz zdarzenia, które są zbyt małe, aby reprezentować nienaruszone komórki na podstawie sygnału rozproszenia do przodu i rozproszenia bocznego. Typowe wykresy FACS przedstawiające te strategie bramkowania są pokazane na Rysunek 2 i <silna klasa="xfig">Rysunek 3.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dostosuj natężenie przepływu, aby uzyskać mniej niż 15 000 zdarzeń/s.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj talerz zbiorczy
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy ekstraktu drożdżowego: Zawiesić 1 porcję 13C ekstraktu drożdżowego w 7,5 ml ultraczystegoH2Oi 2,5 ml metanolu.</li>
		<li>Przygotować bufor ekstrakcyjny: Dodać 10 μl 13C roztworu podstawowego ekstraktu drożdżowego do 10 ml acetonitrylu i wymieszać.</li>
		<li>Przygotować płytkę zbiorczą: Dodać 25 μl buforu ekstrakcyjnego do każdego dołka 96-dołkowej płytki PCR, która zostanie użyta do pobrania próbki. Aby zminimalizować parowanie, przykryj studzienki pokrywkami PCR (paski pocięte w singlety).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj sortowanie komórek.
	<ol>
		<li>W razie potrzeby otwórz studzienki zbiorcze, aby zebrać posortowane komórki i zamknij je tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować parowanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jeżeli próbki nie mogą być natychmiast zmierzone, należy je przechowywać w szczelnie zamkniętych pojemnikach w temperaturze -80 °C przez kilka dni. Po rozmrożeniu próbki należy poddać sonikacji przez 5 minut, aby zapewnić całkowite ponowne zawieszenie metabolitów.</li>
</ol>
5. Pomiar LC-QQQ-MS
<ol>
	<li>Przygotowanie rozpuszczalników LC
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy kwasu medronowego (100 mM): Rozpuścić 17,6 mg kwasu medronowego w 1 ml ultraczystegoH2O.</li>
		<li>Przygotować bufor A: Rozpuścić 1,92 g węglanu amonu w 1 l ultraczystegoH2Oi dodać 50 μl roztworu podstawowego kwasu medronowego.</li>
		<li>Przygotuj bufor B: Wymieszaj 50 ml buforu z 450 ml acetonitrylu.</li>
		<li>Przygotuj mieszankę testową LC: Wymieszaj po 1 ppm leucyny, izoleucyny, AMP, ADP i ATP w 80:20 acetonitryl: ultraczysty H2O. 
		UWAGA: Zapas kwasu medronowego można przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy; inne mogą być przechowywane w RT przez 2 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zaprogramuj metodę LC-QQQ-MS
	<ol>
		<li>Zoptymalizuj ustawienia MS specyficzne dla związku (np. energię zderzenia) zgodnie z instrukcjami producenta. W przypadku przyrządów z serii Agilent 6495 należy skorzystać z ustawień w Tabeli Uzupełniającej 1.</li>
		<li>Zoptymalizuj ustawienia MS specyficzne dla źródła zgodnie z instrukcjami producenta. W przypadku przyrządów z podgrzewanym źródłem ESI JetStream należy stosować następujące parametry: temperatura gazu: 240 °C, przepływ gazu: 15 l/min, nebulizator: 50 psi, temperatura gazu w osłonie: 400 °C, przepływ gazu w osłonie: 11 l/min, napięcie kapilary: 2000 V, napięcie dyszy: 300 V.</li>
		<li>Zoptymalizuj ustawienia optyki jonowej zgodnie z instrukcjami producenta. W przypadku instrumentów Agilent z optyką jonową iFunnel należy stosować następujące parametry: wysokociśnieniowe RF dodatnie: 110 V, wysokociśnieniowe RF ujemne: 90 V, niskociśnieniowe RF dodatnie: 80 V, niskociśnieniowe RF ujemne: 60 V.</li>
		<li>Zaprogramuj gradient LC: 0 min, 95% B, 150 μL/min; 18 min, 55% B, 150 μL/min; 19 min, 30% B, 150 μL/min; 21,5 min, 30% B, 150 μL/min; 22 min, 95% B, 150 μL/min; 22,7 min, 95% B, 200 μL/min, 23,5 min, 95% B, 400 μl/min; Czas postoju 28 min. Temperatura kolumny: 35 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skonfiguruj instrument LC-MS.
	<ol>
		<li>Podłączyć kolumnę chromatograficzną do komory kolumny o regulowanej temperaturze.</li>
		<li>Podłącz i wyczyść wszystkie linie.</li>
		<li>Uruchom co najmniej 4 ślepe próbki lub próbki zbiorcze, aby zrównoważyć kolumnę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom mieszanie testu LC, aby sprawdzić wydajność chromatograficzną. Upewnij się, że spełnione są następujące kryteria. Jeśli nie, wyczyść przyrząd lub rozwiąż problemy z nim przed uruchomieniem próbek.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że ciśnienie początkowe wynosi <150 bar, a maksymalne ciśnienie przeciwne wynosi <400 bar.</li>
		<li>Upewnij się, że czasy przechowywania mieszczą się w oknie ±1 min w następujący sposób: izoleucyna 6,0 min, leucyna 6,4 min, AMP 9,5 min, ADP 11,2 min i ATP 12,7 min.</li>
		<li>Upewnij się, że dolina między leucyną a izoleucyną w przejściu +132->86 znajduje się < 20 % wysokości piku.</li>
		<li>Upewnij się, że różnica w czasie przechowywania AMP do ADP wynosi od 1,5 do 1,9 minuty, a różnica w czasie przechowywania od ADP do ATP wynosi od 1,1 do 1,9 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfigurowanie listy roboczej
	<ol>
		<li>Zacznij od ślepej próbki, aby zminimalizować przenoszenie z mieszanki testowej LC.</li>
		<li>Uruchom próbki w kolejności losowej.</li>
		<li>Zakończ ślepą próbką, aby oczyścić kolumnę do przyszłych eksperymentów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Wstępne przetwarzanie danych w automRm
UWAGA: Poniższe kroki omawiają konwersję z .d do .mzML w msconvert, przygotowanie metabdb, ładowanie danych i modeli oraz metabdb, a także ogólne strategie ręcznego przeglądu szczytów.
<ol>
	<li>Konwertuj surowe dane z formatu .d na format .mzML za pomocą ProteoWizard20 z następującymi ustawieniami: precyzja kodowania binarnego: 32-bitowa, MS Levels 1-2, Zaznaczono indeks zapisu, Wybrano opcję Użyj kompresji zlib.</li>
	<li>Początek R.</li>
	<li>Zainstaluj automRm21 zgodnie z dokumentacją pakietu (wymagane tylko raz przed pierwszym użyciem).</li>
	<li>Uruchom graficzny interfejs użytkownika automRm w R: automRm::automrm_gui()</li>
	<li>Przetwarzaj partię plików .d w zakładce Process > Process Batch.
	<ol>
		<li>Wybierz plik zawierający informacje o metabolitach .xlsx. Ten plik musi być zgodny z metodą LC-QQQ-MS.</li>
		<li>wybrać. Plik RData przechowujący model uczenia maszynowego pobierania szczytowego.</li>
		<li>wybrać. Plik RData zawierający model uczenia maszynowego raportowania szczytowego.</li>
		<li>Wybierz folder projektu zawierający pliki .mzML.</li>
		<li>Rozpocznij wstępne przetwarzanie danych, klikając przycisk Przetwarzaj wsad.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu przetwarzania wstępnego otwórz peakoverview.pdf, aby sprawdzić poprawność wykrywania pików chromatograficznych. Opcjonalnie załaduj plik automRmdata_Review.RData z karty Review (Przegląd) graficznego interfejsu użytkownika automRm, aby ręcznie zmodyfikować filtrowanie szczytów i integrację szczytów.</li>
	<li>Otwórz peakinfo.xlsx z folderu projektu i sprawdź dane.
	<ol>
		<li>Sprawdź sygnał wzorca wewnętrznego 13C w zakładce 13CArea: Upewnij się, że nie ma systematycznych różnic w wartościach intensywności między grupami eksperymentalnymi oraz między próbkami komórek a próbkami szczątków. Jeśli takie różnice występują, do późniejszej analizy należy używać tylko danych z kart NormArea lub NormHeight; w przeciwnym razie użyj danych z kart RawArea lub RawHeight.</li>
		<li>Sprawdź natężenie sygnału wewnętrznych wzorców ATA i CLF w zakładce RawArea. Upewnij się, że nie ma systematycznych różnic w intensywności któregokolwiek ze związków między grupami eksperymentalnymi.</li>
		<li>Dla każdego metabolitu należy porównać intensywność sygnału próbek zawierających komórki z próbkami szczątków z tej samej zawiesiny komórkowej. Należy użyć odpowiedniego testu statystycznego w celu zidentyfikowania metabolitów, w których próbki zawierające komórki mają większą intensywność niż próbki szczątków. W późniejszej analizie danych należy uwzględnić tylko metabolity, które pomyślnie przeszły ten test.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Low-Input Metabolic Studies in Mice Cell Types

<ol><li>Jang, C., Chen, L., Rabinowitz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+and+isotope+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolomics and isotope tracing.</a> Cell. 173 (4), 822-837 (2018).</li>
<li>Lu, W., Su, X., Klein, M. S., Lewis, I. A., Fieh, O., Rabinowitz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite+measurement%3A+Pitfalls+to+avoid+and+practices+to+follow%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).</li>
<li>Buescher, J. M., Czernik, D., Ewald, J. C., Sauer, U., Zamboni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-platform+comparison+of+methods+for+quantitative+metabolomics+of+primary+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cross-platform comparison of methods for quantitative metabolomics of primary metabolism.</a> Analytical Chemistry. 81 (6), 2135-2143 (2009).</li>
<li>Sastre Toraño, J., Ramautar, R., De Jong, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+capillary+electrophoresis+for+the+life+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">Advances in capillary electrophoresis for the life sciences.</a> Journal of Chromatography B. 1118-1119, 116-136 (2019).</li>
<li>Žuvela, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Column+characterization+and+selection+systems+in+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Column characterization and selection systems in reversed-phase high-performance liquid chromatography.</a> Chemical Reviews. 119 (6), 3674-3729 (2019).</li>
<li>Standard sample preparation and shipping procedures. Metabolon Inc. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.metabolon.com/qp-content/uploads/2020/06/Standard-Sample-Preparation-and-Shipping-Procedure-SSGv2.0.pdf">https://www.metabolon.com/qp-content/uploads/2020/06/Standard-Sample-Preparation-and-Shipping-Procedure-SSGv2.0.pdf</a> (2023).</li>
<li>Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K. -Y., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+characterization+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell characterization and isolation.</a> Methods in Molecular Biology. 750, 47-59 (2011).</li>
<li>Cabezas-Wallscheid, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+regulatory+networks+in+HSCs+and+their+immediate+progeny+via+integrated+proteome%2C+transcriptome%2C+and+DNA+methylome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of regulatory networks in HSCs and their immediate progeny via integrated proteome, transcriptome, and DNA methylome analysis.</a> Cell Stem Cell. 15 (4), 507-522 (2014).</li>
<li>Belmonte, M., Kent, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+to+maintain+single+functional+mouse+hematopoietic+stem+cells+in+vitro+without+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol to maintain single functional mouse hematopoietic stem cells in vitro without cell division.</a> STAR Protocols. 2 (4), 100927(2021).</li>
<li>Devilbiss, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+profiling+of+rare+cell+populations+isolated+by+flow+cytometry+from+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Metabolomic profiling of rare cell populations isolated by flow cytometry from tissues.</a> eLife. 10, 61980(2021).</li>
<li>Schönberger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+omics+analysis+reveals+a+non-classical+retinoic+acid+signaling+axis+that+regulates+hematopoietic+stem+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Multilayer omics analysis reveals a non-classical retinoic acid signaling axis that regulates hematopoietic stem cell identity.</a> Cell Stem Cell. 29 (1), 131-148 (2022).</li>
<li>Schönberger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC-MS-based+targeted+metabolomics+for+FACS-purified+rare+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">LC-MS-based targeted metabolomics for FACS-purified rare cells.</a> Analytical Chemistry. 95 (9), 4325-4334 (2023).</li>
<li>Link, H., Kochanowski, K., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+allosteric+protein-metabolite+interactions+that+control+enzyme+activity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of allosteric protein-metabolite interactions that control enzyme activity in vivo.</a> Nature Biotechnology. 31 (4), 357-361 (2013).</li>
<li>Binek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+has+a+significant+impact+on+the+cellular+metabolome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry has a significant impact on the cellular metabolome.</a> Journal of Proteome Research. 18 (1), 169-181 (2018).</li>
<li>Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sheath+fluid+impacts+the+depletion+of+cellular+metabolites+in+cells+afflicted+by+sorting+induced+cellular+stress+%28SICS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS).</a> Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 99 (9), 921-929 (2021).</li>
<li>Llufrio, E. M., Wang, L., Naser, F. J., Patti, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+cells+alters+their+redox+state+and+cellular+metabolome%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+biology%22%5BJournal%5D)">Sorting cells alters their redox state and cellular metabolome.</a> Redox biology. 16, 381-387 (2018).</li>
<li>Zhang, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid-GPRC5C+signalling+promotes+dormancy+in+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid-GPRC5C signalling promotes dormancy in haematopoietic stem cells.</a> Nature Cell Biology. 24 (7), 1038-1048 (2022).</li>
<li>Zafeiriadou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism-related+gene+expression+in+circulating+tumor+cells+from+patients+with+early+stage+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Metabolism-related gene expression in circulating tumor cells from patients with early stage non-small cell lung cancer.</a> Cancers. 14 (13), 3237(2022).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+classification+of+circulating+tumor+cells+as+a+biomarker+for+metastasis+and+prognosis+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Metabolic classification of circulating tumor cells as a biomarker for metastasis and prognosis in breast cancer.</a> Journal of Translational Medicine. 18 (1), 59(2020).</li>
<li>Chambers, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cross-platform+toolkit+for+mass+spectrometry+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics.</a> Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).</li>
<li>Eilertz, D., Mitterer, M., Buescher, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((automRm%3A+An+R+package+for+fully+automatic+LC-QQQ-MS+data+preprocessing+powered+by+machine+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">automRm: An R package for fully automatic LC-QQQ-MS data preprocessing powered by machine learning.</a> Analytical Chemistry. 94 (16), 6163-6171 (2022).</li>
<li>Han, W., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+and+minimizing+batch+effects+in+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Evaluating and minimizing batch effects in metabolomics.</a> Mass Spectrometry Reviews. 41 (3), 421-442 (2022).</li>
<li>Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferences+and+contaminants+encountered+in+modern+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry.</a> Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).</li>
<li>Kuonen, F., Touvrey, C., Laurent, J., Ruegg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc+block+treatment%2C+dead+cells+exclusion%2C+and+cell+aggregates+discrimination+concur+to+prevent+phenotypical+artifacts+in+the+analysis+of+subpopulations+of+tumor-infiltrating+CD11b%2B+myelomonocytic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Fc block treatment, dead cells exclusion, and cell aggregates discrimination concur to prevent phenotypical artifacts in the analysis of subpopulations of tumor-infiltrating CD11b+ myelomonocytic cells.</a> Cytometry. Part A The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (11), 1082-1090 (2010).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments. 41, 1546(2010).</li>
<li>Broadhurst, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+considerations+for+the+use+of+system+suitability+and+quality+control+samples+in+mass+spectrometry+assays+applied+in+untargeted+clinical+metabolomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies.</a> Metabolomics. 14 (6), 72(2018).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Najważniejszymi krokami dla pomyślnego wdrożenia ukierunkowanej metabolomiki przy użyciu tego protokołu są: 1) solidna strategia barwienia i bramkowania, która zapewni czyste populacje komórek, 2) precyzyjna obsługa objętości cieczy, 3) odtwarzalny czas wszystkich etapów eksperymentalnych, w szczególności wszystkich etapów poprzedzających ekstrakcję metabolitów. Idealnie byłoby, gdyby wszystkie próbki należące do jednego eksperymentu były przetwarzane i mierzone w jednej partii, aby zminimalizować efekty partii22. W przypadku większych eksperymentów sugerujemy zebranie ekstraktów komórkowych w temperaturze -80 °C, a następnie zmierzenie wszystkich ekstraktów w jednej partii.
Podczas pracy z próbkami o niskim wkładzie należy położyć nacisk na czyste obchodzenie się ze wszystkimi materiałami, które są używane w trakcie eksperymentów23. Typowe zanieczyszczenia to resztki buforu, detergenty i produkty do pielęgnacji skóry. Najważniejszym środkiem minimalizującym zanieczyszczenie jest stosowanie odpowiednich rękawic przez cały czas trwania eksperymentu. 
Aby zminimalizować potencjalne zmiany w składzie metabolitów spowodowane narażeniem komórek na warunki niefizjologiczne, kluczowe znaczenie ma przygotowanie próbek na lodzie i przy użyciu zimnych odczynników (4 °C). Ponadto, bycie tak szybkim, jak to możliwe przed etapem FACS, poprawi jakość pomiaru2. Wskazane czasy barwienia przeciwciał są tak krótkie, jak to możliwe, aby zapewnić dobrą skuteczność barwienia. Dodatkowy etap blokowania niespecyficznego wiązania przeciwciał z receptorami Fc za pomocą przeciwciał Fc-block może być dodany przed procedurą barwienia FACS24,25. Zapobiega to zanieczyszczeniu docelowych populacji komórek i jest szczególnie wskazane podczas pracy z zawiesinami komórek, które zawierają wiele typów komórek o wysokim poziomie receptora Fc (takich jak monocyty lub makrofagi) lub komórek, które były hodowane bez surowicy. Wydłuży to jednak całkowity czas obsługi o 10-15 minut, a zatem może dodać do wyników dodatkową niefizjologiczną zmienność.
Dzięki zastosowaniu dynamicznych metod MRM w nowoczesnych spektrometrach masowych, wszystkie metabolity wymienione w ustawieniach specyficznych dla związku mogą być rejestrowane za pomocą jednego wstrzyknięcia. Ograniczenie liczby metabolitów docelowych pozwala na implementację opisanego protokołu na starszych spektrometrach masowych oraz przyspiesza wstępne przetwarzanie i analizę danych.
Pewien poziom sygnału tła w danych LC-MS jest nieunikniony. W związku z tym należy dołożyć wszelkich starań, aby zidentyfikować te metabolity, które można wykryć powyżej tła. Zdarzenia sortowania, które są zbyt małe, aby reprezentować nienaruszone komórki (szczątki), generują odpowiednie próbki ślepe procesu, które reprezentują intensywność sygnału tła zależną od matrycy. Ponadto normy wewnętrzne pozwalają na identyfikację problematycznych próbek, które powinny zostać wyłączone z dalszej analizy danych26. Oba środki zapewnienia jakości działają najlepiej, jeżeli dostępna jest wystarczająco duża liczba powtórzeń. Zaleca się użycie co najmniej sześciu powtórzeń na grupę.

Metabolizm to niezbędny proces biologiczny, który zachodzi we wszystkich żywych komórkach. Procesy metaboliczne obejmują rozległą sieć reakcji biochemicznych, które są ściśle regulowane i wzajemnie połączone, umożliwiając komórkom wytwarzanie energii i syntezę niezbędnych biomolekuł1. Aby zrozumieć funkcję sieci metabolicznych, naukowcy mierzą poziomy małocząsteczkowych produktów pośrednich w komórkach. Te produkty pośrednie służą jako ważne wskaźniki aktywności metabolicznej i mogą ujawnić krytyczne informacje na temat funkcji komórkowych.
Spektrometria mas (MS) jest najpopularniejszym wyborem do specyficznego wykrywania metabolitów w złożonych próbkach1,2. Magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) ma zalety w bezwzględnej kwantyfikacji związków i wyjaśnianiu struktury, ale stwardnienie rozsiane często może rozdzielić więcej składników w złożonych mieszaninach, takich jak płyny biologiczne lub ekstrakty komórkowe. Najczęściej MS łączy się z wcześniejszym oddzieleniem związku za pomocą elektroforezy kapilarnej (CE), chromatografii gazowej (GC) lub chromatografii cieczowej (LC)3. Wybór platformy separacji zależy przede wszystkim od zakresu docelowych metabolitów i rodzaju próbki, a w warunkach rzeczywistych od dostępności maszyn i wiedzy specjalistycznej. Wszystkie trzy platformy separacji mają szeroki i nakładający się na siebie zakres odpowiednich metabolitów, ale mają różne ograniczenia. Krótko mówiąc, CE może oddzielać tylko naładowane cząsteczki i wymaga dużej wiedzy specjalistycznej, aby wdrożyć solidną analizę dużej liczby próbek4. GC jest ograniczony do cząsteczek, które są wystarczająco małe i niepolarne, aby odparować przed rozkładem3. Biorąc pod uwagę wszystkie dostępne na rynku kolumny LC, dowolne dwa metabolity mogą być oddzielone za pomocą tej technologii5. Jednak wiele metod LC wykazuje mniejszą zdolność rozdzielczą niż metody CE lub GC o podobnej długości.
Typowa ilość materiału wyjściowego do pomiarów metabolomicznych wynosi zazwyczaj od 5 x 10 5 do 5 x 107 komórek na próbkę, 5-50 mg mokrej tkanki lub 5-50 μL płynu ustrojowego6. Jednak uzyskanie takich ilości materiału wyjściowego może być trudne podczas pracy z komórkami pierwotnymi rzadkich typów komórek, takich jak na przykład hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) lub krążące komórki nowotworowe. Komórki te są często obecne w bardzo małej liczbie i nie można ich hodować bez naruszenia krytycznych cech komórkowych.
HSC i multipotencjalne komórki progenitorowe (MPP) są najmniej zróżnicowanymi komórkami układu krwiotwórczego i stale wytwarzają nowe komórki krwi przez całe życie organizmu. Regulacja hematopoezy ma znaczenie kliniczne w stanach takich jak białaczka i niedokrwistość. Pomimo swojego znaczenia, HSC i MPP należą do najrzadszych komórek w układzie krwiotwórczym. Za pomocą jednej myszy można zazwyczaj odizolować około 5000 HSCs7,8,9. Ponieważ tradycyjne metody metabolomiki wymagają większej ilości materiału wejściowego, łączenie komórek wielu myszy było często konieczne do analizy rzadkich typów komórek10,11.
Tutaj naszym celem było opracowanie protokołu, który umożliwia pomiar metabolitów w zaledwie 5000 komórkach na próbkę, aby umożliwić generowanie danych metabolomicznych z HSC pojedynczego myszy12. Jednocześnie metoda ta pozwala na wygenerowanie wielu powtórzeń z jednej myszy w celu uzyskania liczniejszych typów komórek, takich jak limfocyty. Takie podejście zmniejsza liczbę zwierząt potrzebnych do danego projektu, przyczyniając się w ten sposób do "3R" (redukcja, wymiana, udoskonalenie) doświadczeń na zwierzętach.
Metabolity w komórkach mogą mieć bardzo wysokie tempo rotacji, często rzędu sekund13. Jednak przygotowanie próbek do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) może zająć godziny, a samo sortowanie FACS może zająć od kilku minut do godzin, co prowadzi do potencjalnych zmian w metabolomie spowodowanych warunkami niefizjologicznymi. Niektóre odczynniki stosowane w tym protokole (takie jak bufor do lizy chlorku amonu i potasu [ACK]) mogą mieć podobne działanie. Warunki te mogą powodować stres komórkowy i wpływać na poziomy i proporcje metabolitów w komórkach, prowadząc do niedokładnych lub tendencyjnych pomiarów metabolizmu komórkowego14,15,16. Zmiany metaboliczne spowodowane przygotowaniem próbki są czasami określane jako artefakty sortowania. Długie protokoły trawienia i ostre odczynniki, które mogą być wymagane do wytworzenia zawiesin jednokomórkowych z twardych lub twardych tkanek, mogą pogorszyć ten problem. To, jakie zmiany mogą wystąpić, prawdopodobnie zależy od typu komórki i warunków przetwarzania. Dokładny charakter zmian pozostaje nieznany, ponieważ nie można zmierzyć stanu metabolicznego niezakłóconych komórek w żywej tkance.
Protokół przedstawiony tutaj zawiera kilka kluczowych różnic w porównaniu z tradycyjnymi metodami, a mianowicie użycie 5 g/L NaCl jako płynu osłonowego, sortowanie bezpośrednio do bufora ekstrakcyjnego, wstrzykiwanie dużych objętości próbek na chromatografię cieczową z hydrofilową interakcją chromatograficzną ze spektrometrią mas (HILIC-MS) i wykorzystanie ukierunkowanej kwantyfikacji, rygorystyczne stosowanie wewnętrznych standardów i kontroli tła (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Protokół ten ma potencjał, aby w dużym stopniu zachować różnice między typami komórek oraz między leczeniem farmakologicznym a kontrolą nośnika12. Nawet w przypadku hodowanych komórek wypada korzystnie w porównaniu z alternatywnymi podejściami, takimi jak bardziej ugruntowane wirowanie i ręczne usuwanie supernatantu. Jednak ze względu na to, że artefakty sortowania mogą nadal występować, dane należy interpretować z ostrożnością. Pomimo tego ograniczenia, protokół stanowi znaczącą poprawę w dziedzinie profilowania metabolicznego, pozwalając na dokładniejsze i bardziej kompleksowe pomiary metabolizmu komórkowego w rzadkich komórkach pierwotnych12.
Możliwość precyzyjnego pomiaru szerokich profili metabolicznych w rzadkich komórkach pierwotnych otwiera drzwi do nowych eksperymentów w badaniach biomedycznych z udziałem tych komórek. Na przykład wykazano, że regulacja za pośrednictwem metabolizmu w HSC wpływa na zdolność do samoodnawiania się w stanie spoczynku, co ma wpływ na niedokrwistość i białaczkę11,17. W krążących komórkach nowotworowych pochodzących od pacjenta wykazano różnice w ekspresji genów metabolicznych między guzem a sąsiednimi komórkami18,19. Protokół ten pozwala teraz naukowcom na systematyczne badanie tych różnic na poziomie metabolicznym, który jest ogólnie uważany za bliższy fenotypowi komórkowemu niż ekspresji genów.

<table><tbody><tr><td>13C Ekstrakt drożdżowy</td><td>Roztwory izotopowe</td><td>ISO-1</td><td></td></tr><tr><td>40 i mikro; m sitko komórkowe</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl, klasa LC-MS</td><td>VWR</td><td>83640.32</td><td></td></tr><tr><td>ACK bufor do lizy</td><td>Gibco</td><td>104921</td><td>Alternatywnie: Lonza, Cat# BP10-548E</td></tr><tr><td>Difosforan adenozyny (ADP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>Monofosforan adenozyny (AMP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1752</td><td></td></tr><tr><td>Trifosforan adenozyny (ATP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Węglan amonu, klasa HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/3686/50</td><td></td></tr><tr><td>Atlantis Premier Kolumna BEH Z-HILIC (100 x 2,1 mm, 1,7 i mikro; m)</td> <td>Wody</td><td>186009982</td><td></td></tr><tr><td>B220-A647</td><td>Invitrogen</td><td>103226</td><td></td></tr><tr><td>B220-PE/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>103222</td><td>RRID:AB_313005</td></tr><tr><td>CD11b-PE/Cy7</td><td>101216 BioLegend</td><td></td><td>RRID:AB_312799</td></tr><tr><td>CD150-BV605</td><td>115927 BioLegend</td><td></td><td>RRID:AB_11204248</td></tr><tr><td>CD3-PE</td><td>Invitrogen</td><td>12-0031-83</td><td></td></tr><tr><td>CD48-BV421</td><td>103428 BioLegend</td><td></td><td>RRID:AB_2650894</td></tr><tr><td>CD4-PE/Cy7</td><td>100422</td><td>BioLegend RRID:AB_2660860</td><td></td></tr><tr><td>CD8a-PE/Cy7</td><td>100722</td><td></td><td>RRID:AB_312761</td></tr><tr><td>cKit-PE</td><td>105808 BioLegend</td><td></td><td>RRID:AB_313217</td></tr><tr><td>Zestaw nietkniętych komórek CD4 myszy Dynabeads&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11415D</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria III</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gr1-PE/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>108416</td><td>RRID:AB_313381</td></tr><tr><td>Folia termozgrzewalna</td><td>Neolab</td><td>Jul-18</td><td></td></tr><tr><td>Isoleucine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>58880</td><td></td></tr><tr><td>JetStream ESI Źródło</td><td>Agilent</td><td>G1958B</td><td></td></tr><tr><td>Leucine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>Kwas Medronowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9508-1G</td><td></td></tr><tr><td>Metanol, klasa LC-MS</td><td>Carl Roth</td><td>HN41.2</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fluka</td><td>31434-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Sca1-APC/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>108126</td><td>RRID:AB_10645327</td></tr><tr><td>TER119-PE/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>116221</td><td>RRID:AB_2137789</td></tr><tr><td>Potrójny kwadrupolowy spektrometr masowy</td><td>Agilent</td><td>6495B</td><td></td></tr><tr><td>Twin.tec PCR płytka 96-dołkowa osłona LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>30129512</td><td></td></tr> Autosampler Termostat <tr><td>kolumnowy UHPLC</td><td>Agilent</td><td>G7157B</td> Pompa UHPLC Agilent G7116B <td></td></tr><tr><td>Pompa UHPLC</td><td>Agilent</td><td>G7120A</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termostat do próbek UHPLC</td><td>Agilent</td><td>G4761A</td><td></td></tr></tbody></table>

ukierunkowana metabolomika rzadkich komórek pierwotnych

Targeted Metabolomics on Rare Primary Cells

Funkcja komórkowa zależy krytycznie od metabolizmu, a funkcja podstawowych sieci metabolicznych może być badana poprzez pomiar małych cząsteczek pośrednich. Jednak uzyskanie dokładnych i wiarygodnych pomiarów metabolizmu komórkowego, szczególnie w rzadkich typach komórek, takich jak hematopoetyczne komórki macierzyste, tradycyjnie wymagało łączenia komórek od wielu zwierząt. Protokół umożliwia teraz naukowcom pomiar metabolitów w rzadkich typach komórek przy użyciu tylko jednej myszy na próbkę, przy jednoczesnym generowaniu wielu powtórzeń dla bardziej licznych typów komórek. Zmniejsza to liczbę zwierząt, które są potrzebne do danego projektu. Przedstawiony tutaj protokół obejmuje kilka kluczowych różnic w porównaniu z tradycyjnymi protokołami metabolomicznymi, takimi jak użycie 5 g/l NaCl jako płynu osłonowego, sortowanie bezpośrednio do acetonitrylu i wykorzystanie ukierunkowanej kwantyfikacji z rygorystycznym zastosowaniem wewnętrznych wzorców, co pozwala na dokładniejsze i bardziej kompleksowe pomiary metabolizmu komórkowego. Pomimo czasu potrzebnego na izolację pojedynczych komórek, barwienie fluorescencyjne i sortowanie, protokół może w dużym stopniu zachować różnice między typami komórek i leczeniem farmakologicznym.

Sortowanie FACS umożliwia izolację czystych populacji różnych typów komórek z tej samej zawiesiny komórkowej (Rysunek 2 i Rysunek 3). Specyficzność tej metody opiera się na barwieniu różnych typów komórek za pomocą specyficznych markerów powierzchniowych (na przykład limfocytów B i limfocytów T ze śledziony) lub specyficznych kombinacji markerów powierzchniowych (na przykład HSC i MPP). Barwienie markerów wewnątrzkomórkowych zazwyczaj wymaga permeabilizacji błony komórkowej. Może to prowadzić do wycieku metabolitów, w związku z czym ten rodzaj barwienia nie nadaje się do zastosowania w niniejszym protokole.
LC zapewnia rozdział metabolitów przed ich detekcją za pomocą MS (Rysunek 4). Metabolity eluują z kolumny HILIC w przybliżeniu według polarności, przy czym związki mniej polarne eluują wcześniej, a metabolity bardziej polarne później. Natężenie sygnału jest określone przez ilość docelowego metabolitu w próbce oraz specyficzny dla danego metabolitu czynnik odpowiedzi. W konsekwencji natężeń sygnałów nie można w sposób znaczący porównywać pomiędzy różnymi metabolitami, a jedynie dla jednego metabolitu w różnych próbkach. Trzy piki wyróżnione na Rysunku 4 reprezentują: 1: niacynamid, który jest wykrywany zarówno w debris, jak i w ekstrakcie komórkowym, choć na różnych poziomach; 2: acetylokarnitynę, wykrywaną niemal wyłącznie w ekstraktach komórkowych; oraz 3: kwas aminotereftalowy jako standard wewnętrzny, który jest wykrywany na tym samym poziomie w próbkach debris i ekstraktach komórkowych.
Różnice metaboliczne pomiędzy typami komórek z tej samej tkanki zostają zachowane przy zastosowaniu połączonego protokołu FACS-LC-MS (Rysunek 5). W przypadku komórek HSC i MPP wymagane było użycie komórek od 6 myszy w celu uzyskania 6 próbek, co doprowadziło do większej zmienności wewnątrz każdej grupy w porównaniu z limfocytami B i T, które zostały posortowane z tej samej śledziony mysiej. Próbki debris, reprezentujące próbki kontrolne tła procesu, są wyraźnie oddzielone od próbek zawierających ekstrakty komórkowe. W obrębie próbek debris widoczne jest wyraźne rozdzielenie dwóch eksperymentów, co podkreśla różnicę w środowisku metabolicznym, w którym komórki znajdowały się przed sortowaniem. Po przedstawieniu danych na zgrupowanej mapie ciepła (Rysunek 6) widoczne stają się dodatkowe informacje, takie jak względne poziomy metabolitów w poszczególnych próbkach.
<img alt="Schemat sortowania i barwienia komórek z analizą FACS i HILIC-MS w przebiegu eksperymentalnym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65690/65690fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przegląd kluczowych etapów przedstawionego protokołu. Ta rycina została przedrukowana za zgodą Schoenbergera i wsp.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65690/65690fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schematy cytometrii przepływowej; sortowanie komórek; wykresy FSC/SSC; analiza limfocytów B i T; bramkowanie pojedynczych komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65690/65690fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Izolacja czystych populacji limfocytów B i limfocytów T ze śledziony. Zdarzenia odpowiadające komórkom i detrytusowi wyłoniono na podstawie sygnałów rozproszenia światła w przód (FSC) i rozproszenia światła pod kątem (SSC). Limfocyty B i limfocyty T wyselekcjonowano na podstawie sygnałów barwienia specyficznych dla typu komórki. Rysunek został opracowany za zgodą Schoenbergera i wsp.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65690/65690fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Cytometria przepływowa; wykresy FSC/SSC; sortowanie komórek; pojedyncze komórki; debris; lineage negative; HSC; analiza MPP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65690/65690fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Izolacja HSC i MPP z szpiku kostnego. Zdarzenia reprezentujące komórki i debris zostały wyselekcjonowane na podstawie sygnałów rozproszenia światła w przód (FSC) i rozproszenia bocznego (SSC). Populacje HSC i MPP wyselekcjonowano na podstawie wieloetapowych sygnałów barwienia specyficznego dla typów komórek. Rycina została opracowana za zgodą Schoenberger i wsp.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65690/65690fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Chromatogram HPLC, wykresy A i B, identyfikacja piku; analiza rozdzielania związków, czas retencji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65690/65690fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Przykładowe chromatogramy. Próbki zawierające (A) 5000 HSC i (B) 5000 zdarzeń z frakcji debris z tego samego sortowania. Należy zauważyć, że osie w obu panelach mają tę samą skalę. Wyróżnione metabolity to: 1: nikotynamid, 2: acetylokarnityna, 3: kwas aminotereftalowy (ATA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65690/65690fig04large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres PCA: grupowanie typów komórek; analiza danych i redukcja wymiarowości; eksperymenty 1 i 2." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65690/65690fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Analiza głównych składowych (PCA) profili metabolicznych różnych typów komórek oraz próbek tła z resztek komórkowych z tych samych eksperymentów. Obserwuje się wyraźne oddzielenie różnych organów od próbek tła z resztek komórkowych każdego z organów. Ponadto typy komórek są wyraźnie rozdzielone w obrębie komórek każdego organu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65690/65690fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Diagram mapy ciepła; analiza metabolitów, eksperymenty 1 i 2, wyróżniająca zmienność metabolitów komórkowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65690/65690fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Mapa ciepła przedstawiająca metabolity zmierzone w różnych typach komórek oraz odpowiadających im kontrolnych próbkach tła (debris). Brakujące wartości uzupełniono połową wartości minimalnej tego samego metabolitu we wszystkich próbkach. Do celów wykresowania dane zostały znormalizowane do wartości maksymalnej oddzielnie w każdym wierszu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65690/65690fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Tabela zawiera ustawienia specyficzne dla związków w odniesieniu do wybranych metabolitów, w tym czas retencji (RT), polarność (Pol), m/z prekursora (Q1), m/z fragmentu (Q3) oraz energię kolizyjną (CE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65690/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Tutaj prezentujemy protokół do dokładnego i niezawodnego pomiaru metabolitów w rzadkich typach komórek. Udoskonalenia techniczne, w tym zmodyfikowany płyn osłonkowy do sortowania komórek i generowanie odpowiednich próbek ślepych, umożliwiają kompleksową ocenę ilościową metabolitów przy wkładzie zaledwie 5000 komórek na próbkę.

Ukierunkowana metabolomika rzadkich komórek pierwotnych

Cellular function critically depends on metabolism, and the function of the underlying metabolic networks can be studied by measuring small molecule ...

Głównym celem mojego laboratorium jest utrzymanie zdrowego metabolomicznego podciągania komórek macierzystych wraz z wiekiem, aby uniknąć nowotworów hematologicznych, a robimy to poprzez wykonywanie interwencji dietetycznych. Tak więc, w szczególności, jesteśmy zainteresowani zrozumieniem, w jaki sposób metabolity pochodzenia dietetycznego regulują łodygę, a także metabolity wewnątrzkomórkowe, jak regulują los komórek macierzystych. Komórki macierzyste oparte na hemacie są bardzo rzadką subpopulacją, co oznacza, że zawsze stajemy przed wyzwaniem, że nie mamy wystarczającej ilości materiału do przeprowadzenia naszych eksperymentów.Ale teraz, dzięki ustanowieniu metod jednokomórkowych, a także metod o niskim wkładzie wejściowym, zdobyliśmy nową wiedzę na temat tego, w jaki sposób te komórki macierzyste są regulowane. Hematopoetyczne komórki macierzyste to bardzo rzadka subpopulacja, a na dodatek są bardzo małe. Teraz, dzięki opracowanym przez nas metodom, takim jak na przykład metabolomika o niskich nakładach opartych na specyfikacji masy, możemy teraz wykryć setki metabolitów przy bardzo małej liczbie komórek.To pozwoliło nam zrozumieć, jaka jest rola niektórych metabolitów w regulacji komórek macierzystych. W przeszłości analiza metabolomiczna rzadkich komórek pierwotnych wymagała wielu myszy oraz dni pracy i przygotowania próbek. Dzięki naszemu nowemu protokołowi potrzebujemy mniej myszy i mniej czasu.Dodatkowo zmniejszyliśmy liczbę ręcznych kroków, dzięki czemu cały protokół staje się bardziej niezawodny. Na przyszłość zaplanowaliśmy dostosowanie naszego protokołu o niskim nakładzie wejściowym, aby umożliwić dodatkową analizę w rzadkich komórkach pierwotnych, na przykład nieukierunkowaną metabolomikę i lipidomikę. Na początek umieść sitko o wielkości 70 mikronów na 50-mililitrowej probówce wirówkowej i zwilż je PBS.Po wyizolowaniu śledziony od myszy w celu wytworzenia zawiesiny jednokomórkowej, przepuść śledzionę przez siatkę za pomocą podpórek pod kciuki tłoka strzykawki i 30 mililitrów zimnego PBS. Odwirować filtrat o sile 300 G przez pięć minut i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze buforu do lizy chlorku amonu i potasu i inkubować przez dwie minuty w temperaturze pokojowej.Po lizie dodaj 50 mililitrów zimnego PBS do probówki. Następnie odwirować i wyrzucić supernatant przed ponownym zawiesieniem osadu w świeżo przygotowanym koktajlu przeciwciał. Przenieść zawiesinę komórek do pięciomililitrowej rurki faksowej i inkubować przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności.Po inkubacji dodać trzy mililitry zimnego PBS do probówki, a następnie odwirować i wyrzucić supernatant przed ponownym zawiesieniem osadu w jednym mililitrze buforu do re-zawiesiny zimnego faksu. Przefiltruj komórki przez rurkę faksu z nasadką filtra. Na początek dodaj 30 gramów chlorku sodu do sześciu litrów dejonizowanej wody w zbiorniku z płynem osłonowym i potrząśnij zbiornikiem, aby rozpuścić sól.Następnie podłącz zbiornik do sortera komórek. Włącz sortowanie komórek. Uruchom system fluidyki i poczekaj, aż fluidyka się zrównoważy.Ustaw opóźnienie upuszczania. Aby przygotować roztwór podstawowy ekstraktu drożdżowego, ponownie zawiesić jedną porcję ekstraktu drożdżowego węgla 13 w 7,5 mililitra ultraczystej wody i 2,5 mililitra metanolu. Następnie, aby przygotować bufor ekstrakcyjny, dodaj 10 mikrolitrów roztworu podstawowego ekstraktu drożdżowego węgla 13 do 10 mililitrów acetonitrylu i dobrze wymieszaj.Dodać 25 mikrolitrów buforu ekstrakcyjnego do każdego dołka 96-dołkowej płytki PCR i przykryć studzienki pokrywką. Umieść płytkę na sortowniku komórek, aby zebrać posortowane komórki. Sortuj 5 000 zdarzeń z każdej populacji Alexa Fluor 647 dodatnich i PE ujemnych do pierwszych czterech dołków.Następnie posortuj 5 000 zdarzeń z każdej populacji PE dodatniej i Alexa Fluor 647 ujemnej do następnych czterech dołków. Następnie, w przypadku hematopoetycznych komórek macierzystych, sortuj 5 000 zdarzeń populacji PE-Cy7 o niskim PE dodatnim, APC-Cy7, Brilliant Violet 605 dodatnim i Brilliant Violet 421 ujemnym do pierwszego dołka, a następnie sortuj 5 000 zdarzeń populacji PE-Cy7 low, PE dodatniej, APC-Cy7 dodatniej, Brilliant Violet 421 dodatniej i Brilliant Violet 605 ujemnej do następnego dołka. W przypadku próbek szczątków wybierz zdarzenia zbyt małe, aby reprezentować nienaruszone komórki na podstawie sygnałów rozproszenia do przodu i na boki.Następnie włącz instrument LC-MS, umieść płytkę próbną w automatycznym samplerze instrumentu. Otwórz oprogramowanie kompatybilne z LC-MS i przygotuj urządzenie do analizy. Uruchomić co najmniej cztery próbki procesowe ślepej próby lub próbki pulowe w celu zrównoważenia kolumny i mieszaniny testowej LC w celu sprawdzenia wydajności chromatograficznej.Upewnij się, że początkowe i maksymalne ciśnienie wsteczne jest odpowiednio mniejsze niż 150 i 400 barów. Następnie upewnij się, że czasy przechowywania mieszczą się w przedziale jednej minuty. Następnie sprawdź, czy dolina między leucyną a izoleucyną w dodatnim przejściu od 132 do 86 jest mniejsza niż 20% wysokości szczytu.Na koniec upewnij się, że różnica w czasie przechowywania od AMP do ADP wynosi od 1,5 do 1,9 minuty, a od ADP do ATP od 1,1 do 1,5 minuty. Po potwierdzeniu parametrów eksperymentalnych należy skonfigurować przebieg z ślepą próbą procesu lub próbką puli, aby zminimalizować przenoszenie z mieszanki testów LC, a następnie próbki testowe w kolejności losowej. Sortowanie faksowe umożliwia izolację czystych populacji różnych typów komórek z tej samej zawiesiny komórkowej.Różnice metaboliczne między typami komórek z tej samej tkanki zostały zachowane za pomocą protokołu CMS komórki faksowej. W przypadku hematopoetycznych komórek macierzystych i multipotencjalnych komórek progenitorowych komórki sześciu myszy musiały wygenerować sześć próbek, co doprowadziło do większej zmienności w każdej grupie w porównaniu z komórkami B i T, które zostały posortowane z tej samej lustrzanej śledziony. Próbki szczątków reprezentujące próbne próby kontrolne procesu wyraźnie oddzielono od próbek zawierających ekstrakty komórkowe.Mapa cieplna przedstawiająca informacje o względnych poziomach metabolitów w różnych typach komórek jest pokazana tutaj.

targeted-metabolomics-on-rare-primary-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Nieukierunkowana metabolomika dostarcza hipotezy generującej migawkę profilu metabolicznego.  Protokół ten zademonstruje ekstrakcję i analizę metabolitów z komórek, surowicy lub tkanki.  Szereg metabolitów jest badany za pomocą ekstrakcji ciecz-faza cieczowa, ultraprzepływowej chromatografii cieczowej/spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS) w połączeniu z oprogramowaniem do analizy różnicowej.

Nieukierunkowana metabolomika ze źródeł biologicznych przy użyciu ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (UPLC-HRMS)

Profilowanie metabolitów było cennym atutem w badaniach nad metabolizmem w zdrowiu i chorobie. Wykorzystując chromatografię cieczową z fazami normalnymi sprzężoną ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości ze zmianą polaryzacji i szybkim cyklem pracy, opisujemy protokół analizy polarnego składu metabolicznego materiału biologicznego z wysoką czułością, dokładnością i rozdzielczością.

Strategia dla wrażliwej, wielkoskalowej metabolomiki ilościowej

Ten artykuł opisuje metodę badania metabolizmu komórkowego w złożonych społecznościach wielu typów komórek, wykorzystując kombinację śledzenia stabilnych izotopów, sortowania komórek w celu izolowania określonych typów komórek oraz spektrometrii mas.

Metoda pomiaru metabolizmu w posortowanych subpopulacjach złożonych zbiorowisk komórkowych za pomocą śledzenia stabilnych izotopów

Kompetencja metaboliczna systemów in vitro jest kluczowym wymogiem dla biotransformacji i dystrybucji leków i substancji toksycznych. W niniejszym protokole opisano zastosowanie referencyjnych sond metabolicznych do oceny metabolizmu fazy I w hodowlach komórkowych.

Spektrometria mas i podejścia oparte na luminogenice w celu scharakteryzowania kompetencji metabolicznych fazy I kultur komórkowych in vitro

Ten protokół ma na celu odzyskanie i przygotowanie rzadkich komórek docelowych z mieszaniny z komórkami tła niebędącymi celem, do molekularnej charakterystyki genetycznej na poziomie pojedynczej komórki. Jakość DNA jest równa jakości pojedynczych komórek niepoddanych działaniu metody i pozwala na zastosowanie pojedynczych komórek (zarówno w oparciu o badania przesiewowe, jak i analizę celowaną).

Wstępne wzbogacanie komórek docelowych i amplifikacja całego genomu w celu dalszej charakterystyki pojedynczej komórki

Przedstawiony tutaj protokół opisuje platformę do identyfikacji małych cząsteczek w leczeniu chorób wątroby. Przedstawiono szczegółowy opis szczegółowy różnicowania iPSC w komórki o charakterystyce hepatocytów na płytkach 96-dołkowych oraz wykorzystania komórek do badań przesiewowych w poszukiwaniu małych cząsteczek o potencjalnej aktywności terapeutycznej.

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych do odkrywania leków

Tutaj prezentujemy protokół izolacji komórek białaczkowych od szpiku kostnego chorych na białaczkę i analizy ich stanu metabolicznego. Ocena profilu metabolicznego komórek białaczki pierwotnej może pomóc w lepszym scharakteryzowaniu zapotrzebowania na komórki pierwotne i może prowadzić do bardziej spersonalizowanej medycyny.

Ocena profilu metabolicznego komórek białaczki pierwotnej

Manuskrypt przedstawia pobieranie próbek ludzkich guzów mózgu na miejscu za pomocą mikroekstrakcji w fazie stałej, a następnie ich profil biochemiczny w kierunku odkrycia biomarkerów.

Pobieranie próbek i ekstrakcja guzów mózgu na miejscu do analizy metabolomicznej i lipidomicznej

Ten protokół opisuje procedury izolowania wysokiej jakości jąder z zamrożonych wysp trzustkowych naczelnych innych niż ludzkie do użycia w jednojądrowym jednoczesnym sekwencjonowaniu RNA i sekwencjonowaniu ATAC, przy jednoczesnym zachowaniu dużej frakcji cytozolowej do analiz metabolomicznych z tych samych próbek.

Przygotowanie zamrożonych wysepek płodowych naczelnych innych niż ludzie do połączonego sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder i sekwencjonowania ATAC oraz metabolomiki masowej

Protokół ten ma na celu zachowanie metabolitów komórkowych dla jednokomórkowej spektrometrii mas (SCMS) poprzez połączenie płukania lotnego roztworu soli, szybkiego hartowania ciekłym azotem, liofilizacji i przechowywania w temperaturze -8 °C. Wykazano, że hartowanie ciekłym azotem jest niezbędne do utrzymania profili metabolitów, podczas gdy długotrwałe przechowywanie w chłodni powinno być zminimalizowane, aby zapobiec zmianom metabolicznym.

Przygotowanie próbek do badań metabolomicznych spektrometrii mas pojedynczych komórek: połączone mycie, hartowanie, suszenie i przechowywanie komórek

Poznaj ukierunkowaną metabolomikę rzadkich komórek pierwotnych, w tym komórek macierzystych krwi. Ta metoda umożliwia ilościowe oznaczanie metabolitów z zaledwie 5000 komórek.

Ukierunkowana metabolomika rzadkich komórek pierwotnych

Przeglądaj więcej filmów